CN1320107C - 一种昆虫病原线虫共生菌的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种昆虫病原线虫共生菌的分离方法，将昆虫病原线虫在无菌环境下，用消毒剂进行体表消毒，然后用无菌水冲洗，将消毒过的昆虫病原线虫直接散布在NBTA培养基平板上，在一定条件下培养，释放出共生菌，形成蓝绿色菌落，菌落周围培养基中的染料被吸收变为黄色，经反复纯化，得到昆虫病原线虫共生菌。本方法简单方便，杂菌较少，分离得到的是初生型共生菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种昆虫病原线虫共生菌分离的方法，具体说是嗜线虫致病杆菌的分离方法。
背景技术
随着全社会环保意识的日益增强，化学农药大量使用带来的环境污染、生态平衡破坏等副作用受到各国的高度重视，控制全球化合物的生物积聚的呼吁越来越强烈，化学农药的生产、使用面临严峻的挑战。因此，对害物高效、对非靶标生物及环境安全的“生物合理农药”(Biorational pesticides)或“环境相容性农药”(Environment acceptablepesticides)的研究开发工作正方兴未艾的开展起来，成为一个最诱人的领域。创制新型“生物合理农药”的一条重要途径是研究和开发生物源农药，这是因为生物源农药在生物体内、环境中容易降解，对人畜、天敌等非靶标生物比较安全，对环境友好，它能较好地符合有害生物综合治(IPM)原则中对农药的要求。因此，随着生物技术的发展，生物源农药，特别是微生物源农药的研究开发与利用日益受到重视。
昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematode)是昆虫的专化性寄生天敌，一般专指斯氏线虫科(Steinernematidae)的斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫科(Heterohabditidae)的异小杆属(Heterohabditis)种类，是一类重要的生物防治因子。二属分别与嗜线虫致病杆菌属(Xenorhabdus)和发光杆菌属(Photorhabdus)共生，共同作用杀死寄主昆虫。这两类线虫由于杀虫能力强，是最具应用潜力的昆虫病原线虫。它们之间的共生关系可以概括为：共生菌存在于线虫的肠道内，线虫携带共生菌进入寄主昆虫体内，将共生菌释放到昆虫的血腔中；共生菌在昆虫血腔内繁殖，产生毒素和抑菌物质，使昆虫忠败血症，一般在48小时内死亡；共生菌分解营养物质，提供线虫繁殖发育所需的营养；同时共生菌产生的抗生素能抑制其它杂菌的污染，为线虫的生长发育繁殖提供理想的环境。作为一种生物杀虫剂，昆虫病原线虫寄主范围广泛，具主动搜索能力，对土栖性、钻蛀性与隐蔽性害虫有特殊防效，对人畜安全，不污染环境，亦不会产生抗性，并可工厂化生产，因此已广泛应用于防治农林及牧草等害虫，已引起国内外众多学者及商业部门的高度重视，其应用规模逐渐扩大，全球约15家公司进行昆虫病原线虫的商品化生产。然而成功地利用线虫防治农林及牧草等害虫仅是极少数昆虫，应用面积有限，限制其发展的主要因素是：①较高的生产成本；②难以将害虫控制到经济阈值水平之下；③施用后持效性差；④难以如化学农药一样常温下保存和运输，不具备内吸作用，不能叶面喷施；⑤受环境因子特别是温度和太阳辐射的影响较大，因此它的应用范围受到了限制。这使得在昆虫病原线虫致病性中起关健作用的共生细菌的研究日益受到重视；另外，由于Bt的大量使用和转Bt杀虫晶体蛋白(ICPs)基因cry抗虫植物的大面积种植，害虫对Bt及转基因抗虫植物的抗性不断增大，寻找新的杀虫蛋白和杀虫基因成为当务之急。
昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，兼性厌氧、化能异养，革兰氏染色阴性。包括致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus)，分别与斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫共生。在自然界，此类细菌存在于三龄侵染期线虫的肠道内，随着线虫对昆虫的侵染，共生菌被携带到昆虫体内并释放到寄主血腔中，共生菌大量繁殖，产生毒素和抑菌物质，与线虫共同作用，杀死寄主昆虫；另外，共生菌也能分解昆虫组织，为线虫和共生菌的生长和繁殖提供营养。昆虫病原线虫共生细菌Xenorhabdus和Photorhabdus能产生多种代谢产物。到目前为止，已从共生菌中分离鉴定出30多种生物活性成分，这些代谢产物不仅具有多种化学结构，而且在医疗卫生和农业上具有广泛的生物活性，如抑菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒活性。特别是从P.luminescens W14中分离出一种外毒素蛋白复合体，对鳞翅目，鞘翅目、蜚蠊目和膜翅目等几个目的多种害虫均表现出很高的口服杀虫活性，毒性与Btδ-内毒素相当；杀虫基因转入烟草、玉米和水稻后，对烟草天蛾幼虫和玉米根叶甲幼虫具有较强的致死和抑制生长作用；杀虫蛋白基因在大肠杆菌细胞内也得到了有效表达。为生物农药的开发和抗虫基因工程提供了新的微生物杀虫资源和杀虫基因。昆虫病原线虫共生菌已成为一类新型的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。
近年来，昆虫病原线虫共生菌的生理代谢特征成为国际上研究的热点。
从昆虫病原线虫与其共生菌的关系来看，线虫的杀虫活性主要是共生菌起作用；而共生菌是以线虫为介体，线虫侵染寄主昆虫后，将共生菌释放到血淋巴中，共生菌在血淋巴中大量繁殖，产生毒素和线虫共同作用杀死昆虫。毒素的作用部位是血淋巴，因而共生菌均有较高的注射活性，经口毒性可能是一种特殊情况。大多数菌株无经口毒性，作为杀虫剂开发利用的价值较低。要挖掘共生菌杀虫活性的应用潜力，还需进行广泛的高毒力菌株的筛选。
共生菌的分离方法主要是从线虫侵染致死的大蜡螟中分离，即把感染了昆虫病原线虫死后24h的昆虫尸体经体表消毒后用灭菌剪刀剪开背线(勿触破肠道)将昆虫血淋巴涂布于NBTA培养基上，以分离共生菌，或者虫体用酒精浸后，在酒精灯上点燃，然后在进一步分离。利用这种方法分离时易污染，杂菌较多。
发明内容
本发明针对从线虫侵染致死的大蜡螟中分离共生菌的方法易污染，杂菌较多的问题，提供一种采用从线虫中直接分离共生菌的方法。
本发明的技术解决方案是，一种昆虫病原线虫共生菌的分离方法，其特征在于，将昆虫病原线虫在无菌环境下，用消毒剂进行体表消毒，然后用无菌水冲洗，将消毒过的昆虫病原线虫直接散布在NBTA鉴别培养基平板上，所述的NBTA鉴别培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、TTC 0.04g、BTB 0.025g、水1000ml、PH 7.2～7.4；培养条件为，28℃、黑暗条件下培养3-5d，线虫释放出共生菌，形成蓝绿色菌落，周围培养基中的染料被吸收变为黄色，经反复纯化，得到昆虫病原线虫共生菌。
本方法简单方便，杂菌较少，分离得到的是初生型共生菌。
具体实施方式
为了清楚的理解本发明，以下结合实施例详细叙述本发明的直接从昆虫病原线虫中分离共生菌的方法，本发明不限于这些实施例。
将昆虫病原线虫Steinernema sp(该线虫从陕西杨陵筛选获得，经鉴定为斯氏线虫Steinernema sp)在无菌环境下，用消毒剂进行体表消毒，然后用无菌水冲洗，将消毒过的昆虫病原线虫直接散布在NBTA培养基平板上，在一定条件下培养，释放出共生菌，形成蓝绿色菌落，周围培养基中的染料被吸收变为黄色，经反复纯化，得到共生菌，经鉴定并命名为Xenorhabdus nematophilus YL001。
其中所述的NBTA培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、TTC 0.04g、BTB 0.025g、水1000ml、PH 7.2～7.4。
实施例1：
1、首先用0.1％甲醛溶液将侵染期昆虫病原线虫(IJs)浸泡消毒3次，每次30min，每次消毒完后用无菌水冲洗；
2、随后用0.1％乙汞硫代水杨酸钠将线虫浸泡30min，消毒完后用无菌水冲洗3次；
3、最后将消毒过的侵染期线虫加到NBTA鉴别培养基平板上；
4、将NBTA鉴别培养基平板在28℃黑暗条件下培养3-5d，3-5d内线虫释放出共生菌，形成蓝绿色菌落，经反复纯化，得到昆虫病原线虫共生菌。
5.共生菌的鉴定：通过形态及生理生化特征鉴定，确定共生菌为Xenorhabdusnematophilus YL001。
表1 Steinernema sp共生菌的形态特征
| Steinernema sp共生菌 | ||
| I型 | II型 | |
| 革兰氏反应细胞形状细胞大小鞭毛芽孢蛋白质内含体 | G-杆状0.5×1.3～1.7×9.5周生无有 | G-杆状0.6×1.1～1.0×6.7无无无 |
表2 Steinernema sp共生菌的主要生化特征
| 生化特征 | Steinernema sp共生菌 | |
| I型 | II型 | |
| CatalaseOxidaseUreaseLecithinaseProtease：skim milk agarGelatinLipase：egg yolk agarTween 80Nitrate reductionIndole productionH2S production伏-普反应Hugh&Leifson-开管-闭管Starch hydrolysis-soluble苯丙氨酸脱氨酶色氨酸脱氨酶七叶灵水解三丁酸甘油酯柠檬酸盐 | ---+++------++----++ | ----w-+w----++----++ |
表3 Steinernema sp共生菌与Xenorhabdus属不同种特征的比较
| 特征 | Steinernema sp共生菌 | X.nematophilus | X.bovienii | X.poinarii | X.beddingii | X.japonica |
| 寄主线虫：S.carpocapsaeS.feltiae，S.intermediumS.affine， | +- | +- | -+ | -- | -- | -- |
| 特征 | Steinernema sp共生菌 | X.nematophilus | X.bovienii | X.poinarii | X.beddingii | X.japonica |
| S.krausseiS.glaseri，S.cubanumSteinernemaspp.(未鉴定)S.kushidai生长温度上限/℃致病性色素鞭毛胞内晶体BTB吸收CatalaseOxidaseUreaseLecithinaseLipaseProteaseNitratereduction苯丙氨酸脱氨酶色氨酸脱氨酶柠檬酸盐七叶苷水解 | ---37+灰白+++---+-+---+- | ---35+灰白+++---dd+-d-+- | ---32+黄色+++---d++-[-]++- | +--40+褐色+++----+w+-[-]-+d | -+-39+淡褐色++----d+w+--+w++ | --+35+黄褐色+++---d-+-dw--- |
注：+＝90-100％；[+]＝76-89％；d＝26-75％；[-]＝11-25％；-＝0-10％；w＝weak reaction；
实施例2：
1、用10％的次氯酸钠或1％的升汞将线虫浸泡30min，然后用无菌水冲洗3次；
2、将消毒过的线虫直接散布在NBTA鉴别培养基平板上；
3.将NBTA平板在28℃黑暗条件下培养3-5d，3-5d内线虫释放出共生菌，形成蓝绿色菌落，经反复纯化，得到昆虫病原线虫共生菌。经进一步鉴定，确定Steinernema sp共生菌为Xenorhabdus nematophilus YL001。
Claims (4)
1、一种昆虫病原线虫共生菌的分离方法，其特征在于，将昆虫病原线虫在无菌环境下，用消毒剂进行体表消毒，然后用无菌水冲洗，将消毒过的昆虫病原线虫直接散布在NBTA鉴别培养基平板上，所述的NBTA鉴别培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、TTC 0.04g、BTB 0.025g、水1000ml、PH 7.2～7.4；培养条件为，28℃、黑暗条件下培养3-5天，线虫释放出共生菌，形成蓝绿色菌落，周围培养基中的染料被吸收变为黄色，经反复纯化，得到昆虫病原线虫共生菌。
2、如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的消毒剂为甲醛、乙汞硫代水杨酸钠、次氯酸钠、氯化汞其中之一。
3、如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述甲醛浓度为0.1％，乙汞硫代水杨酸钠浓度为0.1％，次氯酸钠浓度为10％，氯化汞浓度为1％。
4、如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
首先用0.1％甲醛溶液将浸染期的昆虫病原线虫浸泡消毒3次，每次30min，每次消毒完后用无菌水冲洗；
随后用0.1％乙汞硫代水杨酸钠将线虫浸泡30min，消毒完后用无菌水冲洗3次，最后将消毒过的线虫加到NBTA鉴别培养基平板上进行分离，所述的NBTA鉴别培养基为：牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、TTC 0.04g、BTB 0.025g、水1000ml、PH 7.2～7.4；
将NBTA鉴别培养基平板在28℃黑暗条件下培养3-5天，3-5天内线虫释放出共生菌，形成蓝绿色菌落，周围培养基中的染料被吸收变为黄色，经反复纯化，即可得到昆虫病原线虫共生菌。
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