CN102533613A - 一种防治根瘤线虫的菌株培养液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物制剂及其制备方法，更具体地说，是涉及一种防治根瘤线虫的菌株培养液及其制备方法。本发明提供了一种防虫效果好、环保型的防治根瘤线虫的菌株培养液及其制备方法。其主要组成为名称为Photorhabdustemperata.subsp.Temperate的菌株。昆虫病原性线虫(Heterorhabditisbacteriophora)先后经过粉碎、分离、接种培养、提取后得到所述的菌株培养液。本发明替代了现存的化学农药制剂。不只可以减少关于土壤的农药残留伤害，还因为土生菌种能生产杀线虫的物质，使用含有这种成分的培养液可以减轻根瘤线虫的伤害。
Description
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂及其制备方法，更具体地说，是涉及一种防治根瘤线虫的菌株培养液及其制备方法。
背景技术：
全世界广泛分布的对农作物产生伤害的植物寄生线虫就是根瘤线虫，对植物地上部分产生伤害或在土壤中栖息的同时对植物的根部进行伤害，特别是在国内，红薯根瘤线虫(Meloidogyne incognita)、花生根瘤线虫(Meloidogyne arenaria)、胡萝卜根瘤线虫(Meloidogynehapla)等作为对作物产生伤害的主要害虫被人们所熟知。
现阶段，根瘤线虫的防治方法有栽培防治、物理防治和化学防治。栽培防治中有新鲜水、休耕、干土、深耕、客土、水稻轮作栽培、抗病品种等，物理防治有热处理(蒸汽、干热、温汤浸法)、太阳能消毒等被使用着，化学防治有噻唑磷(线虫炭)等喷洒化学药剂来防治着线虫。栽培防治根据地区条件和栽培作物不同，有应用难和高费用的缺点，特别是抗病品种对作物有局限性，所以实用性很低。化学药剂的情况，防治效果高，但大部分为有机磷剂和氨基甲酸酯类在土壤中有残留时，毒性高，不只对环境有污染，对作物赖以生存的土壤中的有益微生物无分别的发挥杀菌作用，使得虫害加剧，是土壤变贫瘠的原因。
作为化学防治剂的代行方案，这种利用根瘤线虫天敌微生物，生化学剂和植物提取物的生物学方面的防治，它的研究活跃地进行中，到现在为止，已报告了的杀虫霉(Monacroporium thaumasium)在实际设施栽培地里使用效果极不好，对农家可普及的实用化也很艰难，还有，利用药用植物达到杀线虫效果的值得期待的研究也正在进行中，原料的收集很难，缺点就是还需依靠进口。
发明内容：
本发明就是针对上述问题，提供了一种防虫效果好、环保型的防治根瘤线虫的菌株培养液及其制备方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案，其主要组成为名称为Photorhabdus temperata.subsp.Temperate的菌株。
昆虫病原性线虫(Heterorhabditis bacteriophora)先后经过粉碎、分离、接种培养、提取后得到所述的菌株培养液。
具体的制备步骤为，
(1)粉碎、分离
将昆虫病原性线虫(Heterorhabditis bacteriophora)置于含链霉素0.06wt％的NaClO溶液中进行30～40min的消毒，每500～800只昆虫病原性线虫用300ppm的上述NaClO溶液；
消毒后用匀浆机将线虫全部磨碎，磨碎后的浆液置于琼脂培养基(MacConkey agar)中，将发出粉红色荧光的这部分细菌取出，置于NBTA培养基中进行二次分离，最后将围绕群体白带的绿色群体取出备用；
昆虫病原性线虫购自韩国庆尚南道晋州市国立庆尚大学。
(2)接种培养
将步骤(1)得到的菌种按2.0％的接种量接种到5wt％的YS培养基中，在25～35℃、250～350rpm的条件下培养3～5天，然后将培养基中的红色群体取出备用；
(3)提取
向步骤(2)得到的群体中加入2倍体积的2-异丙醇，用超声波处理1-2小时，在4℃下放置24小时，除去培养液其它多糖类物质；
接着将培养液置于离心分离机中，以12,000xg进行40分钟的离心分离，以GF/F滤纸(Whatman，直径
孔径0.7μm)滤去细胞后即得所述的菌株培养液。
步骤(1)中所述的琼脂培养基的组成及配比为，1L蒸馏水中，含蛋白胨17g，蛋白间质蛋白胨3g，乳糖酶10g，氯化钠5g，胆汁酸盐1.5g，细菌用琼脂13.5g，中性红0.03g，结晶紫0.001g；
NBTA培养基的组成及配比为，1L蒸馏水中，含牛肉膏3g，蛋白胨5g，细菌营养用琼脂15g，溴麝香草酚蓝0.025g，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)0.04g。
步骤(2)中的YS培养基的原料为食用油，卵黄粉，胆固醇，猪油，卵磷脂，全脂粉乳，氯化钠，磷酸二氢钾、酵母提取物中的一种以上。
步骤(3)中的2-异丙醇的温度为0～5℃。
本发明的有益效果：
本发明是以名称为Photorhabdus temperata.subsp.Temperate的菌株为主要成分的生物制剂，替代了现存的化学农药制剂。不只可以减少关于土壤的农药残留伤害，还因为土生菌种能生产杀线虫的物质，使用含有这种成分的培养液可以减轻根瘤线虫的伤害。
本发明制得的培养液在使用时可以分泌蒽醌，蒽醌对根瘤线虫有防治作用，其对根瘤线虫的根组织内抑制感染态和杀虫的效果都很明显。
本发明对红薯根瘤线虫(Meloidogyne incognita)，花生根瘤线虫(Meloidogyne arenaria)，胡萝卜根瘤线虫(Meloidogyne hapla)都具有防治作用。
附图说明：
图1为实施例1中经分离得到的培养液的菌落外观图。
图2为实施例1中最终产品的外观图。
具体实施方式：
实施例1
(1)粉碎、分离
将昆虫病原性线虫(Heterorhabditis bacteriophora)置于含链霉素0.06wt％的NaClO溶液中进行30min的消毒，每500只昆虫病原性线虫用300ppm的上述NaClO溶液；
消毒后用匀浆机将线虫全部磨碎，磨碎后的浆液置于琼脂培养基(MacConkey agar)中，将发出粉红色荧光的这部分细菌取出，置于NBTA培养基中进行二次分离，最后将围绕群体白带的绿色群体取出备用；
昆虫病原性线虫购自韩国庆尚南道晋州市国立庆尚大学。
(2)接种培养
将步骤(1)得到的菌种按2.0％的接种量接种到5wt％的YS培养基中，在25℃、250rpm的条件下培养4天，然后将培养基中的红色群体取出备用；
(3)提取
向步骤(2)得到的群体中加入2倍体积4℃的2-异丙醇，用超声波处理1-2小时，在4℃下放置24小时，除去培养液其它多糖类物质；
接着将培养液置于离心分离机中，以12,000xg进行40分钟的离心分离，以GF/F滤纸(Whatman，直径
孔径0.7μm)滤去细胞后即得所述的菌株培养液。
步骤(1)中所述的琼脂培养基的组成及配比为，1L蒸馏水中，含蛋白胨17g，蛋白间质蛋白胨3g，乳糖酶10g，氯化钠5g，胆汁酸盐1.5g，细菌用琼脂13.5g，中性红0.03g，结晶紫0.001g；
NBTA培养基的组成及配比为，1L蒸馏水中，含牛肉膏3g，蛋白胨5g，细菌营养用琼脂15g，溴麝香草酚蓝0.025g，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)0.04g。
步骤(2)中的YS培养基的原料为食用油，卵黄粉，胆固醇，猪油，卵磷脂，全脂粉乳，氯化钠，磷酸二氢钾、酵母提取物。
实施例2
为确定Photorhabdus temperata.subsp.temperata菌种的系统学的位置，把16S rRNA增幅到PCR来测定了盐基序列。
16S rRNA的盐基序列测定中，利用ABI PRISM BigDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems)进行循环测序后以ABI PRISM 310 Genetic Analyaer(Applied Biosystemo)测定了盐基序列。通过上述实验得到的16S rRNA盐基序列的相同性是利用DDBJ/NCBI/RDP/GeneBank database的BLAST program来对照调查的，各盐基序列的排序(alignment)是利用Clustal Xalgorithm算法进行排序的，示意图的制作是以依据近邻结合法确定了系统学的位置。上述菌种通过16S rRNA的基因分析出的盐基序列结果显示与Photorhabdus temperata.subsp.Temperata有100％的相同性。
实施例3
对红薯根瘤线虫(Meloidogyne incognita)，花生根瘤线虫(Meloidogyne arenaria)，胡萝卜根瘤线虫(Meloidogyne hapla)的防治效果进行了检定，检定是在室内培养皿中检定的。
试验区为实施例1制得的菌株培养液，菌株培养液中，蒽醌浓度为1wt％-5wt％；对照区为阿维菌素乳油，型号为EC：0.025％，阿维菌素的浓度为5wt％；比较区为经灭菌处理过的蒸馏水。检定结果见表1。
由表1可知，实施例2制备的菌株培养液对三种线虫都有很强的杀虫效果。
Claims (6)
1.一种防治根瘤线虫的菌株培养液，其特征在于，其主要组成为名称为Photorhabdus temperata. subsp. Temperate的菌株。
2.一种权利要求1所述的防治根瘤线虫的菌株培养液的制备方法，其特征在于，昆虫病原性线虫(Heterorhabditis bacteriophora)先后经过粉碎、分离、接种培养、提取后得到所述的菌株培养液。
3.根据权利要求2所述的防治根瘤线虫的菌株培养液的制备方法，其特征在于，具体的制备步骤为，
（1）粉碎、分离
将昆虫病原性线虫(Heterorhabditis bacteriophora)置于含链霉素0.06wt%的NaClO溶液中进行30～40min的消毒，每500～800只昆虫病原性线虫用300ppm的上述NaClO溶液；
消毒后用匀浆机将线虫全部磨碎，磨碎后的浆液置于琼脂培养基（MacConkey agar）中，将发出粉红色荧光的这部分细菌取出，置于NBTA培养基中进行二次分离，最后将围绕群体白带的绿色群体取出备用；
（2）接种培养
将步骤（1）得到的菌种按2.0%的接种量接种到5wt%的YS培养基中，在25～35℃、250～350rpm的条件下培养3～5天，然后将培养基中的红色群体取出备用；
（3）提取
向步骤（2）得到的群体中加入2倍体积的2-异丙醇，用超声波处理1-2小时，在4℃下放置24小时，除去培养液其它多糖类物质；
接着将培养液置于离心分离机中，以12,000xg进行40分钟的离心分离，以GF/F滤纸滤去细胞后即得所述的菌株培养液。
4.根据权利要求3所述的防治根瘤线虫的菌株培养液的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的琼脂培养基的组成及配比为，1L蒸馏水中，含蛋白胨17g，蛋白间质蛋白胨3g，乳糖酶10g，氯化钠5g，胆汁酸盐1.5g，细菌用琼脂13.5g，中性红0.03g，结晶紫0.001g；
NBTA培养基的组成及配比为，1L蒸馏水中，含牛肉膏3g，蛋白胨5g, 细菌营养用琼脂15g，溴麝香草酚蓝0.025g，2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）0.04g。
5.根据权利要求3所述的防治根瘤线虫的菌株培养液的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的YS培养基的原料为食用油，卵黄粉，胆固醇，猪油，卵磷脂，全脂粉乳，氯化钠，磷酸二氢钾、酵母提取物中的一种以上。
6.根据权利要求3所述的防治根瘤线虫的菌株培养液的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的2-异丙醇的温度为0～5℃。
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