CN1313603C

CN1313603C - 抗人卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞系及其单克隆抗体和应用

Info

Publication number: CN1313603C
Application number: CNB2004100803529A
Authority: CN
Inventors: 冯捷; 钱和年; 崔恒; 付天云; 成夜霞; 程洪艳; 叶雪; 李小平; 姚煜; 昌晓红
Original assignee: Peking University Peoples Hospital
Current assignee: Peking University Peoples Hospital
Priority date: 2004-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2007-05-02
Anticipated expiration: 2024-09-30
Also published as: CN1609203A

Abstract

本发明属于生物技术及细胞工程领域。涉及一种单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立方法及所建立的细胞系，其主要技术特征为以人卵巢癌组织标本制备可溶性免疫原，免疫BALB/c小鼠，运用杂交瘤技术经融合、筛选、反复克隆化，获得能稳定分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。该杂交瘤细胞系命名为BUPH:OVCAMab，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.1225。本发明也公开了用该细胞系制备单克隆抗体OVCAMab及抗体提纯方法。该抗体在放免显像中可应用于卵巢癌的早期诊断、体内定位、复发检测及转移灶的发现等。

Description

抗人卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞系及其单克隆抗体和应用

技术领域

本发明属于生物技术及细胞工程领域，涉及分泌抗人卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞系，及其分泌的单克隆抗体，以及所述单克隆抗体的应用，尤其是在放射免疫显像中的应用。

背景技术

卵巢癌发病率在我国占妇科恶性肿瘤第三位，死亡率却高居首位。由于其起病隐匿，就诊时多属晚期，即使治疗获得完全缓解也常复发。早期诊断、及时治疗；及早发现复发及复发部位，选择合适的再治疗时机，为改善预后的关键因素。单克隆抗体由于是针对一个抗原表位的抗体，具有很高特异性，可以特异性识别相应抗原，将单克隆抗体作为载体，连接放射性核素、毒素、化疗药物或效应细胞，在肿瘤的导向诊断或导向治疗中具有巨大潜力。为了提高卵巢癌的诊断和术后复发的诊断准确率，提高卵巢癌的治疗水平，改善卵巢癌的预后，世界各国的科学家们致力于卵巢癌单克隆抗体的研制，并取得了一定的成果。

1969年Levi MM等(Antigenicity of a papillary cystadenocarcinoma tissuehomogenate and its fractions.Am J Obstet Gynecol 1969，105：856)首先报道了卵巢上皮性癌肿瘤相关抗原后，免疫血清学检测引起了人们的重视。1982年Bast(Lancet，1982，第8卷第1期，第999页)首先制备出了卵巢癌单抗OC125，OC125的特异性较好，应用最广泛，多应用于血清学检测。美国FDA于1992年批准上市的用于卵巢癌放免显像的药盒有¹¹¹In-B72.3，Labetuzu-mab(CEA-Cide)正在进行放免显像II期临床试验，尚有一些单抗放免显像处于研究阶段。其中¹¹¹In-OC₁₂₅研究得较多，其敏感性为86％-89％，特异性为75％～89％。国内山东大学齐鲁医院用抗CEA单抗进行卵巢癌患者放免显像的研究，取得较好结果。国内尚无卵巢癌放免显像药盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种分泌抗卵巢癌单克隆抗体的新的杂交瘤细胞系，该细胞系命名为BUPH:OVCAMab，已经由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.1225。

本发明的另一目的是提供上述细胞系分泌的抗卵巢癌单克隆抗体OVCAMab及其酶切片段OVCAMabF(ab’)₂，所述OVCAMab为IgG1亚类，对卵巢癌抗原有较强的亲和力和特异性。

本发明的另一目的是提供上述抗体及其片段的放射免疫显像试剂盒，其中所述抗体及其片段用¹³¹I、^99mTc、¹¹¹In标记后，可以用于卵巢癌的放射免疫显像，对卵巢癌进行术前诊断、肿瘤定位及检测复发。所述试剂盒中还可以含有其它试剂，例如稀释剂、缓冲液等。

根据第一目的，通过杂交瘤技术以卵巢浆液性乳头状囊腺癌组织的新鲜标本处理后的可溶性成分作为免疫原建立保藏号为CGMCC No.1225的杂交瘤细胞系。其特征为：系免疫后的BALB/c雌鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交形成的鼠鼠杂交瘤细胞，有93条染色体；能在体外长期生长和稳定传代；能稳定分泌与卵巢癌相关抗原结合的抗体；经检测流行性出血热病毒、呼肠孤病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、仙台病毒、鼠痘病毒、鼠腺病毒、鼠肺炎病毒、鼠白血病等8种鼠源病毒及支原体均阴性。杂交瘤细胞的染色体核型见以下附图1。

根据第二目的，用上述细胞系制备抗卵巢癌单克隆抗体OVCAMab，其中第一种方法为小鼠腹水法制备抗卵巢癌单克隆抗体OVCAMab，并酶切制备相应酶切片段OVCAMabF(ab’)₂，OVCAMab为IgG1亚类，效价2×10⁵，相对亲和常数为1.90±0.53×10⁸，经33％饱和硫酸铵粗提及阴离子交换柱提纯活性保留，酶切片段F(ab’)₂活性保留。第二种方法为体外无血清培养法制备OVCAMab，培养上清抗体效价1×10³，经rProtein A及阴离子交换柱提纯活性保留。经酶切制备相应酶切片段OVCAMab F(ab’)₂，活性保留。

根据第三目的，用化学反应将上述OVCAMab或酶切片段OVCAMab F(ab’)₂与金属鏊合剂结合后，通过间接标记法及预定位方法标记^99mTc、¹³¹I、¹¹¹In等及其它放射性核素，结合稀释剂、缓冲液等试剂，组成放射免疫显像试剂盒。所述金属鏊合剂可以是环二乙基三胺五乙酸或2-亚氨噻吩盐酸盐。

附图说明

图1为BUPH:OVCAMab杂交瘤细胞染色体核型的照片。

具体实施方式

一、实施例1-建立细胞系

1.抗原制备

手术室无菌留取卵巢浆液性乳头状囊腺癌之新鲜组织标本，超净台内无菌盐水清洗，去除血性物，称取22克，剪碎，置于50ml无菌塑料离心管中，加入30ml无菌生理盐水，-20℃冻存。反复冻融3次后，匀浆器1,000转/分钟，匀浆1分钟；超声破碎(A20)10分钟；4℃10,000g，离心60分钟；取上清，-20℃冻存。将此卵巢癌粗提抗原称为OVCA抗原。该抗原与抗CEA抗体ELISA反应阴性(北京生物制品研究所试剂盒)，与抗aFP抗体(长春生物制品研究所)免疫双扩散反应阴性。

2.抗原免疫

6～8周BALB/c小雌鼠(医科院动物所)数只，每只皮下注射上述OVCA抗原200μg加完全福氏佐剂，进行基础免疫。3周后，脾内注射上述OVCA抗原73μg，进行第二次免疫。之后2天及5天，分别腹腔注射上述OVCA抗原730μg，进行第三、四次免疫。

3.杂交瘤细胞的制备

1)饲养细胞的制备

以BALB/c老雌鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c老雌鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640培养液6～8ml，反复冲洗，回收冲洗液，1,000转/分，离心5分钟，留沉淀，用含20％小牛血清或胎牛血清的RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度1×10⁵个/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃，5％CO₂培养过夜。

2)免疫脾细胞的制备

小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640培养液洗1次，注射器针芯研磨后，过不锈钢筛网，制成细胞悬液后计数，取1.8×10⁸个，RPMI 1640培养液洗涤2次，用于细胞融合。

3)骨髓瘤细胞

小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(NS-1)(医科院基础所)经8-氮杂鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，1,000转/分钟，离心5分钟，弃上清，用RPMI 1640培养液重悬细胞后计数，取1.8×10⁷个(活细胞＞95％)，用RPMI 1640培养液洗涤2次，用于细胞融合。

4)细胞融合及HAT选择杂交瘤

将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶10比例混合，在50ml塑料离心管内用RPMI1640培养液洗1次，1,200转/分钟，离心8分钟。弃上清，用滴管吸出残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在室温下，30秒内加入预热的1ml含5％二甲基亚砜的50％聚乙二醇(Merck，分子量4000)，边加边搅拌，作用90秒，每隔2分钟加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml预热的RPMI1640培养液，终止聚乙二醇作用。

1,000转/分钟，离心6分钟。弃上清，先用5ml含20％小牛血清的RPMI 1640培养液轻轻混悬，继加至30ml。加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO₂培养。共用2块板：N板和O板，每板设6孔Sp2/0(NS-1)细胞对照。

24小时后，以HAT选择培养液1/2换液，48小时后完全换液，每2～3天换液1次，维持培养2周后，改用HT培养液，再维持培养2周，改用RPMI 1640培养液。

4.抗体的检测

于融合后15天在杂交瘤细胞占据孔底1/3面积时，即开始用ELISA法检测特异性抗体，每2～3天检测一次。4℃，过夜包被OVCA抗原1μg/ml，阴性对照包被相同方法制备的正常卵巢组织可溶性抗原1μg/ml。次日加培养上清100μl，37℃，1小时，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶300)，37℃，1小时，每次加样前PBS洗板3次，显色，读A₄₉₀值。

第3次检测后N板及O板分别筛出2孔和5孔阳性孔，其A₄₉₀值均在0.4以上，逐渐扩大培养由96孔板移至24孔板，长满后再移至培养瓶中。

5.杂交瘤的克隆化和冻存

1)克隆化方案为有限稀释法

于克隆化前一天制备饲养细胞(方法同前述)，细胞浓度1×10⁵个/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃，5％CO₂培养过夜。

克隆化过程为：将培养的阳性孔细胞调细胞浓度为1×10³/ml，取0.1ml与9.9ml RPMI 1640培养液混匀，加入饲养细胞孔，100μl/孔，37℃，5％CO₂培养。4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加培养液至200μl/孔。第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。同法共进行3次克隆化，筛出A₄₉₀值在0.4以上的单克隆孔，第三次共筛出6孔，A₄₉₀值均在1.118～1.257。

2)杂交瘤细胞的冻存

细胞冻存液：50％小牛血清+40％RPMI 1640培养液+10％二甲亚砜

细胞冻存方法：1×10⁶个细胞悬于1ml含20％小牛血清的RPMI 1640培养液中，加入等量细胞冻存液，转移入冻存管，用棉垫包好放入-80℃低温冰箱，次日转入液氮中。第一次克隆化后即进行冻存及扩大培养后冻存共6支作为原始细胞；第三次克隆化后冻存10支；此后每1～2年复苏一次并进行有限稀释法克隆化，检测细胞的活性和ELISA法检测抗体效价，筛出A₄₉₀值高的孔扩大培养并冻存10支作为种子细胞。另培养并冻存10余支用于扩大培养制备抗体及其它研究。目前已进行克隆化10余次，能稳定分泌抗人卵巢癌单克隆抗体OVCAMab。

6.杂交瘤细胞的检定

经中国生物制品检定所检定，该杂交瘤细胞无支原体，无流行性出血热病毒、呼肠孤病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、仙台病毒、鼠痘病毒、鼠腺病毒、鼠肺炎病毒、鼠白血病病毒等8种鼠源病毒。该细胞系命名为BUPH:OVCAMab，已经由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.1225。附图1显示了所述杂交瘤细胞的核型，其有93条染色体。

二、实施例2-单克隆抗体制备及鉴定

1.采用小鼠腹水法生产单克隆抗体

BALB/c小鼠腹腔注射降植烷0.5ml，2周后腹腔注射2～3×10⁶上述杂交瘤细胞，密切观察动物的健康状况与腹水征象，7～10天后见腹水产生，待腹水尽可能多而小鼠频于死亡时，处死小鼠，75％酒精消毒腹部皮肤，切开皮肤，暴露腹膜，并用无菌剪剪开腹膜约0.5cm，用无菌滴管将腹水吸出，室温静置30分钟，1,000转/分，离心10分钟，收集上清。一般1只小鼠可获2～5ml腹水。

2.采用体外无血清培养法生产单克隆抗体

将在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中稳定生长的OVCAMab杂交瘤细胞接种到杂交瘤细胞无血清培养基(H-SFM，Invitrogen)中，接种密度1～10×10⁵个/ml，3～4天传代一次(离心换液)至细胞稳定生长。将细胞转接至加有H-SFM的1升Supper-spinner搅拌瓶中，接种密度1×10⁵个/ml，37℃，5％ CO₂培养，气泵供气速度1vvm，搅拌转速10转/分。4～7天收获上清500～800ml。追加培养基，继续培养重复收获。

3.单克隆抗体的鉴定

1)单克隆抗体特异性的鉴定

各种组织的石蜡切片，采用常规免疫组织化学染色程序进行免疫染色，一抗为上述产生的腹水单抗，二抗为羊抗鼠IgG，再加辣根过氧化物酶标记的鼠PAP复合物(北京生物制品研究所)，DAB显色，光镜下观察。卵巢上皮癌43例中31例阳性，阳性率75.6％，卵巢良性肿物8例中1例阳性，阳性率为12.5％，正常卵巢10例均阴性。

2)单克隆抗体效价测定及相对亲和力测定

以间接ELISA法检测，腹水抗体效价2×10⁵，相对亲和常数1.90±0.53×10⁸。无血培养上清抗体效价1×10³。

3)单克隆抗体Ig类与亚类的鉴定

取浓缩25倍的杂交瘤细胞无血清培养上清，与羊抗鼠IgG1、IgG2α、IgG2β、IgG3、IgM抗血清亚类抗体(中国医学科学院基础研究所)行免疫双扩散，证实该单克隆抗体为IgG1亚类。

4.单克隆抗体的纯化

①腹水法制备OVCAMab经33％饱和硫酸铵粗提及阴离子交换柱提纯，活性保留，相应酶切片段OVCAMab F(ab’)₂活性保留。

②体外无血清培养法制备OVCAMab经Streamline rProtein A亲和层析进行抗体捕获，Q-Sepharose Fast Flow精细纯化，浓缩至8mg/ml，活性保留，相应酶切片段OVCAMab F(ab’)₂活性保留。

三、实施例3-单克隆抗体放射免疫显像

1.¹³¹I标记OVCAMab进行患者放免显像

采用改良氯胺T法对OVCAMab进行¹³¹I标记，过Sephadex G50，收集标记抗体峰。纸层析法测定放化纯度及标记率，细胞结合分析法测定标记后抗体活性。

腹腔给药：¹³¹I-OVCAMab 2mg溶于500ml生理盐水中，经腹腔导管于20分钟内滴入腹腔。于注药后24、48、72及96小时用γ照相机高能准直器显像。同时用计算机定量记录各重要脏器、盆腔肿块及肿块旁组织的放射强度，用于计算肿瘤与非肿瘤组织放射强度的比值(T/NT)。用¹³¹I放射免疫显像试剂对卵巢癌患者显像，患者放免显像敏感性94.7％，特异性87.9％。

2.^99mTc-OVCAMab荷瘤裸鼠放射免疫显像，

采用改进预氯化亚锡法对OVCAMab进行^99mTc标记。对荷瘤裸鼠经腹腔注射0.15mg^99mTc-OVCAMab，18小时后，γ照相机进行显像。同时用计算机定量记录各重要脏器、盆腔肿块及肿块旁组织的放射强度，用于计算T/NT。结果荷卵巢癌裸鼠显像清晰，小至0.5cm的微小病灶即可检出，显像位置与病灶位置对应关系好。

3.预定位显像

将环二乙基三胺五乙酸(cyclic diethylenetriamine pentaacetic acid，cDTPA)与卵巢癌单抗OVCAMab进行偶联，Sephadex分离纯化。将偶联物cDTPA-OVCAMab经腹腔注入荷人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型体内，48小时后，经腹腔注入还原^99mTc，6小时后显像。显像后，体外称重并测量瘤及其他正常组织放射性活性，计算T/NT。结果肿瘤组织对肌肉组织的T/NT值为19.3±1.2。

Claims

1.一种抗人卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞系，其特征在于所述细胞系的保藏号为CGMCC No.1225。

2.权利要求1所述细胞系分泌的单克隆抗体，所述抗体为IgG1亚类。

3.用于诊断卵巢癌的放射免疫显像试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其中还包括金属鏊合剂，稀释剂，缓冲液以及可用于放射免疫显像的放射性核素。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其中金属鏊合剂为环二乙基三胺五乙酸或2-亚氨噻吩盐酸盐。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其中放射性核素为^99mTc、¹³¹I或¹¹¹In。

7.如权利要求2所述的单克隆抗体在制备卵巢癌的治疗性药物中的应用。