CN1311256A - 甲状旁腺激素衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
甲状旁腺激素PTH(1－34)衍生物,具有如下结构:PTH(1－34)－Asp－Asp－Asp－Asp－Lys其N－端15个氨基酸为SVSEIQLMHNLGKHL,C－端一个氨基酸为K,分子量为4700道尔顿,等电点pI6.0。其制备方法包括:合成对应于PTH(1－34)－Asp－Asp－Asp－Asp－Lys四个重复片段的cDNA;将所述cDNA在大肠杆菌细胞中表达;分离纯化菌体中的PTH(1－34)衍生物。本发明的PTH(1－34)衍生物表达量高、纯度高、具有完全的天然甲状旁腺激素生理活性。
Description
本发明属于生物制药领域，具体涉及甲状旁腺激素衍生物及其制备方法。
骨的新陈代谢，包括成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨裂解再吸收两个方面，是成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨裂解再吸收的一个动态平衡过程。老年人特别是停经后的妇女，由于骨再吸收活动超过骨形成活动，造成大量的骨质流失，易患骨质疏松症，在臀部、手腕、脊椎骨处常发生骨折。另一方面，绝经后妇女由于雌激素减少和肠道对钙吸收能力下降，致使骨骼中的矿物质减少而成为骨质疏松症的高发病群。现行的治疗骨质疏松症的药物，包括补钙、维生素D、二磷酸盐、降钙素、氟化物、雌激素及其衍生物等，主要是通过抑制破骨细胞的活性，减缓骨质的分解而减少骨质流失，达到缓解骨质疏松症。
甲状旁腺激素(PTH)，是调节骨细胞新陈代谢的重要因子，既可刺激破骨细胞的增殖及其对老化骨质的分解，又具有促进成骨细胞合成新骨的作用。甲状旁腺激素可以激活成骨细胞的活性，分解吸收老化骨质，增加骨质量及骨质密度。此外，甲状旁腺激素可以促进肾小管细胞对钙离子的再吸收，激活肾脏产生1α羟化酶，后者使维生素D3转化为1α,25(OH)2维生素D3，从而促进小肠上皮细胞对钙离子的吸收，为成骨细胞合成新骨提供物质保障。因此，甲状旁腺激素可能成为治疗骨质疏松症的理想药物。
天然甲状旁腺激素含84个氨基酸，简称PTH(1-84)，其N-端1-34个氨基酸片段是天然PTH的活性部分。天然甲状旁腺激素由甲状旁腺分泌，当其进入血液内后，很快代谢为N-端1-34氨基酸片段，后者与PTH受体结合发挥生物学作用。人工合成的甲状旁腺激素N-端1-34氨基酸片段PTH(1-34)，其生物学活性强于天然甲状旁腺激素。应用基因工程技术，对PTH(1-84)进行突变及缺失研究，发现PTH N-端25-34氨基酸片段是PTH与其受体的结合功能域，而PTH N-端1-6氨基酸片段则是PTH的活性部位。PTH N-端1-34个氨基酸片段，具有完全的天然甲状旁腺激素的生理活性。
甲状旁腺激素PTH(1-84)及其衍生物PTH(1-34)，应用基因工程技术，在CHO细胞、大肠杆菌和酵母菌等系统均可得到表达，但表达量不高，且均为融合蛋白表达，并易发生降解。融合蛋白需要通过蛋白酶或化学裂解，专一性不高，后续纯化困难，难于获得均一的目的蛋白产物。
本发明的目的是提供一种可用基因工程生产、表达量高、纯度高、具有完全的天然甲状旁腺激素生理活性的PTH(1-34)衍生物。
本发明的另一个目的是提供这种PTH(1-34)衍生物的制备方法。
本发明所提供的甲状旁腺激素PTH(1-34)衍生物具有如下结构：
PTH(1-34)-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys其N-端15个氨基酸为S V S E I Q L M H N L G K H L,C-端一个氨基酸为K，分子量为4700道尔顿，等电点pI6.0。
本发明所提供的甲状旁腺激素PTH(1-34)衍生物的制备方法包括以下步骤：
(1)合成对应于PTH(1-34)-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys四个重复片段的cDNA；
(2)将所述cDNA在大肠杆菌细胞中表达；
(3)分离纯化菌体中的PTH(1-34)衍生物。
图1是本发明制备方法的流程图。
下面对本发明进行详细描述。
本发明通过以下步骤制备PTH(1-34)衍生物：构建一个PTH(1-34)衍生物、即PTH(1-34)-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的基因工程表达体；克隆获得工程菌后，经发酵，收集菌体，破菌并后续分离纯化，制得一个具有天然甲状旁腺激素生理活性的、含39个氨基酸的小肽，即PTH(1-34)衍生物。
本发明先以人工合成DNA的方法，得到PTH(1-34)衍生物、即对应于PTH(1-34)-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys四个重复片段的cDNA(4PTH DNA)，应用基因重组技术，把此片段克入大肠杆菌细胞，经培养并诱导，获得了一个可溶性的蛋白质，其表达量为20％以上；离心收集菌体，破菌，离心收集上清液；经层流螯合(Streamline Chelating)扩张柱床分离后，以重组肠激酶酶切，经进一步纯化，得到PTH(1-34)-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，即PTH(1-34)衍生物，其纯度大于95％。该PTH(1-34)衍生物，经氨基酸序列分析，其N-端15个氨基酸为：
S V S E I Q L M H N L G K H LC-端一个氨基酸为K。经质谱分析，其分子量为4700道尔顿。经毛细管电泳等电聚焦检测，其等电点pI6.0。用切除卵巢的大鼠进行试验，表明其具有PTH(1-34)同样的生物学活性。
本发明的具体实施方案：
1．序列设计：用DNASTAR软件设计出PTH(1-34)衍生物的4个重复片段串联的新序列，对应的DNA片段称为4PTH DNA，氨基酸片段称为4PTH。
NdeⅠ
ACACATATGCACCACCACCACCACCACGGTCGTGACGACGACGACAAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTG
M H H H H H H G G D D D D K S V S E I Q L M H N L
GGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTTGATGATGACGAT
G K H L N S M E R V E W L R K K L Q D V H N F D D D D
AAGAGCGTAAGTGAGATCCAACTCATGCATAATTTGGGTAAGCACCTCAATAGCATGGAAAGGGTTGAGTGGTTGCGGAAG
K S V S E I Q L M H N L G K H L N S M E R V E W L R K
AAACTCCAAGATGTGCATAACTTCGACGATGACGATAAATCGGTGTCGGAGATACAGTTGATGCACAACTTAGGGAAACAT
K L Q D V H N F D D D D K S V S E I Q L M H N L G K H
TTGAACAGCATGGAGCGAGTAGAATGGCTCAGAAAAAAGTTACAGGATGTCCACAATTTTGATGACGATGACAAGAGTGTC
L N S M E R V E W L R K K L Q D V H N F D D D D K S V
AGTGAAATTCAATTAATGCACAATCTCGGCAAGCATCTTAATTCGATGGAGAGAGTGGAGTGGCTGAGGAAGAAGTTGCAA
S E I Q L N H N L G K H L N S M E R V E W L R K K L Q
GACGTACATAATTTCGATGATGATGATAAATAGGGATCCACA
Bam HⅠ
D V H N F D D D D K.
该序列的特点如下：
1)基本序列为PTH(1-34)-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(PTH(1-34)DDDDK)，其中，Asp-Asp-Asp-Asp-Lys为肠激酶EK酶切位点。在PTH(1-34)后加Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，即为本发明所述PTH(1-34)衍生物：
S V S E I Q L M H N L G K H L N S M E R V E W L R K K L Q D V H NF D D D D K；
2)四个重复序列为四个基本序列相连；
3)采用大肠杆菌简并密码修改四个重复序列的对应cDNA，避免重复序列中碱基的过多重复，以保证重复序列的稳定性；
4)为了便于纯化及分离，在第一个重复序列的N-端加上EK识别位点及6个His,6个His及EK识别位点之间加两个Gly，最后一个重复序列后加大肠杆菌终止密码子TAG；
5)为了便于克隆，在6个His的5’-端加一个NdeⅠ酶切位点，最后一个重复序列的3’端加一个BamHⅠ酶切位点。
4PTH DNA委托上海生工基因工程公司合成。该序列克隆于载体PUCM-T，经DNA序列测定，与设计一致。
2．4PTH表达菌株的构建：
1)选用pGENS1为表达载体，该载体为依赖T7RNA聚合酶来表达的载体，其特征为：质粒复制子为E coli的coli E1，选择抗性标记为Ampr，转录启动子为T7噬菌体φ10基因的启动子，转录终止子为T7噬菌体φ10基因的终止序列，插入位点为NdeⅠ-BamHⅠ；
2)以NdeⅠ-BamHⅠ从PUCM-T质粒中切出4PTH DNA片段，克隆至pGENS1的NdeⅠ-BamHⅠ位点，构建重组质粒；
3)将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布含100ug/ml Amp的LB平板，挑取单菌落，抽提质粒经NdeⅠ-BamHⅠ酶切，筛选阳性克隆；所得克隆经DNA测序鉴定，与设计一致；
4)将上述重组阳性克隆所得质粒，转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，并涂布含100ug/ml Amp的LB平板，挑取单菌落，经发酵培养并加IPTG诱导后，SDS-PAGE检验，所得转化菌(4PTH工程菌)可溶性表达一种新的分子量为20,000道而顿的蛋白质，表达量为20％以上。
3．PTH(1-34)衍生物的获得
工程菌经发酵培养，收集菌体，破菌，取上清液。上清液过Ni(Ⅱ)-Streamline chelating柱，经洗涤后，洗脱，收集洗脱峰。洗脱液透析后，加重组肠激酶10-100ug/ml，反应5-20小时。反应液过Ni(Ⅱ)-ChelatingSepharose FF柱，洗涤，收集流出液，流出液经透析后，过CM-Sepharose FF柱，经洗脱后，取样分析，得到了PTH(1-34)衍生物，经SDS-PAGE和RP-HPLC检测，其纯度大于95％。
本发明的PTH(1-34)衍生物的性质
PTH(1-34)衍生物，经质谱检测其分子量为4705.2道尔顿，与理论预期值一致；等电点为pI5.9-6.0；
N-端15个氨基酸为：
S V S E I Q L M H N L G K H L
C-端一个氨基酸为K。
本发明方法构建的PTH(1-34)衍生物基因工程表达体表达量大，产生的PTH(1-34)衍生物纯度高，具有完全的天然甲状旁腺激素的生理活性。
体外试验表明，该PTH(1-34)衍生物刺激大鼠成骨细胞的生长。对切去卵巢的雌性大鼠，可增加肢长骨的重量；以豚鼠进行试验，表明所得PTH(1-34)衍生物无抗原性。
实施例1
按照本发明的方法构建4PTH表达菌，经发酵培养，离心收集菌体，破菌，离心取上清液。
上清液过以含10mM Na2HPO4、0.5M NaCl的缓冲液(pH 7.4)预平衡的Ni(Ⅱ)-层流螯合柱，以10mM Na2HPO4、0.3M NaCl缓冲液(pH 6.4)洗涤10倍柱体积后，以含10mM Na2HPO4、0.3MNaCl、10mM咪唑的缓冲液(pH 7.4)洗脱，收集洗脱峰。
洗脱液对缓冲液(10mM Na2HPO4、50mM NaCl、5mM CaCl2,pH 7.2)透析后，加重组肠激酶15ug/ml，反应12小时。
反应液过经缓冲液(10mM Na2HPO4、0.3M NaCl,pH 7.2)预平衡的Ni(Ⅱ)-Chelating Sepharose FF柱，以缓冲液(10mM Na2HPO4、0.3M NaCl，pH 6.2)洗涤，收集流出液。
流出液经缓冲液(20mM NaAc、50mM NaCl,pH 5.2)透析后，过经缓冲液(20mM NaAc、50mM NaCl,pH 5.2)预平衡的CM-Sepharose FF柱，经洗脱后，取样分析，得到了PTH(1-34)衍生物。
经SDS-PAGE和RP-HPLC检测，所得的PTH(1-34)衍生物纯度大于95％。样品经质谱检测，分子量为4705.2道尔顿；经毛细管等电聚焦检测，其等电点为pI5.94。用大鼠成骨细胞进行试验，所得的PTH(1-34)衍生物刺激大鼠成骨细胞的生长，与PTH(1-34)标准品相当。以豚鼠进行试验，表明所得PTH(1-34)衍生物无抗原性，与PTH(1-34)一致。
实施例2
工程菌经发酵培养，收集菌体，破菌，取上清液。
上清液过经缓冲液A(50mM Na2HPO4、0.5M NaCl,pH 7.8)预平衡的Ni(Ⅱ)-层流螯合柱，经缓冲液B(10mM Na2HPO4、0.1M NaCl,pH 6.2)洗涤后，以缓冲液C(10mM NaAc、0.3M NaCl,pH 4.0)洗脱，收集洗脱峰。
洗脱液对缓冲液D(50mM Na2HPO4、100mM NaCl,2mM CaCl2 pH 7.8,)透析后，加重组肠激酶10ug/ml，反应5-20小时。
反应液过经缓冲液A预平衡的Ni(Ⅱ)-Chelating Sepharose FF柱，以缓冲液B洗涤，收集流出液，流出液经缓冲液E(10mM NaAc,50mM NaCl,DH 5.0)透析后，过经缓冲液E预平衡的CM-Sepharose FF柱，经洗脱后，取样分析，得到PTH(1-34)衍生物。经SDS-PAGE和RP-HPLC检测，其纯度大于95％。
实验例1
PTH(1-34)衍生物的生物学活性
按美国专利US No.5714349的方法，用大鼠头盖骨细胞测定PTH(1-34)衍生物对cAMP生成量(腺苷酸环化酶活性)的影响，以30分钟内产生cAMP的nmol表示。结果见表1。
表1 PTH(1-34)衍生物对cAMP生成量(nmol)时影响
上述结果表明，PTH(1-34)和PTH(1-34)衍生物两者的生物学活性一致。
实验例2 PTH(1-34)衍生物的实验治疗效果
按美国专利US No.6025467的方法，采用切除卵巢大鼠骨质疏松模型，测定皮下注射PTH(1-34)衍生物和PTH(1-34)(1-10nmol/kg)后股骨骨密度的变化情况。结果，PTH(1-34)衍生物组给药后的骨密度由对照组的0.36g/cm2提高到0.39g/cm2，增幅达8.3％；PTH(1-34)的增幅为8.4％，两者相当。
关于微生物保藏的说明
本发明中用于产生PTH(1-34)衍生物的菌株Escherichia coli DH5α/4PTH于2000年3月1日保藏于武汉大学中国典型培养物中心，保藏号为CCTCCNo,M200004。
Claims (5)
1．甲状旁腺激素PTH(1-34)衍生物，所述PTH(1-34)衍生物的结构为
PTH(1-34)-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys其N-端15个氨基酸为S V S E I Q L M H N L G K H L,C-端一个氨基酸为K，分子量为4700道尔顿，等电点pI6.0。
2．甲状旁腺激素PTH(1-34)衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)合成对应于PTH(1-34)-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys四个重复片段的cDNA；
(2)将所述cDNA在大肠杆菌细胞中表达；
(3)分离纯化菌体中的PTH(1-34)衍生物。
3．如权利要求2所述的方法，其中步骤(1)合成的序列具有如下特点：基本序列PTH(1-34)-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys中的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys为肠激酶EK酶切位点；四个重复序列相连；采用大肠杆菌简并密码修改四个重复序列的对应cDNA；第一个重复序列的N-端加上EK识别位点及6个His,6个His及EK识别位点之间加两个Gly，最后一个重复序列后加大肠杆菌终止密码子TAG；6个His的5’-端加一个NdeⅠ酶切位点，最后一个重复序列的3’端加一个BamHⅠ酶切位点。
4．如权利要求2所述的方法，其中步骤(2)选用pGENS1为表达载体；将所述cDNA克隆至pGENS1的NdeⅠ-BamHⅠ位点；构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆；将所述重组阳性克隆所得质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，所得转化菌可溶性表达分子量为20,000道而顿的蛋白质。
5．如权利要求2所述的方法，其中步骤(3)的分离纯化采用金属螯合剂扩张柱床层析、肠激酶酶切、金属螯合层析和阳离子交换层析。
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