CN1302904A - 高密度生物芯片的制作装置和制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高密度生物芯片的制作装置和制作方法,具体是高密度生物芯片制作中的核心装置——高密度芯片点样针的设计和制作,及用其制备高密度生物芯片的技术,所设计点样针的尖端面为平面,中心制有凹陷,在针尖端杆体上轴向开有通槽,通槽底端与凹陷相通,构成虹吸通道。本发明可以用于高密度基因芯片、蛋白芯片等各种生物芯片的制作。具有点样密度高、均匀性好、储液量大、耐用性强的优点。

Description

高密度生物芯片的制作装置和制作方法

本发明属于高密度生物芯片制作技术领域，尤其是高密度生物芯片点样针的制作技术。

生物芯片是近年来国际上出现的一类高新生物技术产品，它包括基因芯片、蛋白芯片和芯片上的实验室等用生物或生化样品制成的芯片产品。在生物芯片中基因芯片或称DNA微点阵(DNA Microarray、DNA Chip)是目前技术上相对比较成熟、使用最多、经济效益最好的一种生物芯片。基因芯片具体是指将成千上万个DNA样品按一定序列点置于固相载体上，从而制成含有成千上万个DNA样品的基因芯片。固相载体目前使用最多的是玻璃片、硅片、金片，也有报导用陶瓷片，统称为载片。基因芯片及技术以其快速、大量、准确的特性为生命科学、医学科学、农业及生物学领域的研究，特别是对人类后基因组时代、基因功能的研究提供了革命性的手段。

在基因芯片的制作技术方面，目前已被采用的有接触面点样法、喷墨法、分子印章法、原位合成法等。在这些方法中，接触面点样法是国际上目前采用的最多方法，也是本发明作为应用实例主要讨论的方法。此法的主要原理是将一针形采样点样装置(芯片点样针)通过点样固定架安装于可以X、Y、Z三维移动的自动操作臂上，芯片点样针摄取DNA溶液点置于载片表面。重复上述过程成千上万次，就可以将成千上万个DNA样品点置于载片上，从而制成的含有成千上万个DNA样品的基因芯片。目前的技术已可以将10000多个DNA样品点置于3cm²范围内，现在的发展趋势之一是制作更高密度的基因芯片。

芯片点样针是制作高密度基因芯片的关键部件，基因芯片上点样的质量、大小、密度很大部分取决于点样针的设计和精细度。目前国际上主要采用的有实心点样针和利用虹吸原理的各种点样针。实心点样针是一种传统的方法，其原理是利用点样针针尖表面的附着力沾取样品溶液，然后与载片表面接触将样品液置于载片表面。这种针尖经济耐用，不足之处是总的点相对较小、取样量小，每次取样只能点置一次，因此不利于大规模的快速生产。另外，由于每点一次都需取一次样，而每次的取样量也会变化，因而影响点样大小的均匀性和质量。

另一种点样针是利用虹吸原理设计的。这种点样针克服了实心点样针取样小的缺点，一次可摄取相对较多的样品溶液，目前已有公开的点样针有以下几种。

Brown等人(US Pat 5807522和6110426)描述的点样针，以实心圆锥形为基础，在针的尖端由下而上将针尖切一细长的切缝，这一切缝将针尖完全分为两部分，中间的缝隙便形成了虹吸槽，也将这种针称为镊子形点样针。这一结构的缺陷是：将原已很细小的针尖分成更小的两部分，因此针尖易损坏，另外这种中劈的点样针所点样品的大小变化较大，特别是最初几点与最后几点在大小上的变化可达40-50％。

Martinsky(US Pat 6101946)描述了一种与Brown类似针尖下端完全劈开的点样针及点样针固定框架，此点样针虽采用了方形扁平的针尖，但仍未解决针尖易损伤的缺陷。

Roach等人(US Pat 5770151)描述了一种中空圆管形的虹吸点样针，其在侧壁上开有虹吸缝(侧劈)，这一设计提高了取样量和一次吸液的点样次数。不足之处是吸液后最初几次点样极易扩散形成大斑点，样点均匀性较差，且易形成中空样点，不利于制备高密度的芯片。

Don等人(2000,PCT Pat w000/01798)描述了一种圆锥形中空两用点样针，此针可利用虹吸原理取样和点样，也可利用液压泵来吸取和点置样品。此针的使用使自动机械臂的设计复杂化，并且对于圆锥形中空管道中样品的清洗增加了设备的复杂性。

本发明的目的是提供一种新型点样针以克服上述点样针和芯片制作技术上的缺陷，提高基因芯片的制作效率和密度。

本发明所叙述的基因芯片制作方法是利用所设计的点样针，通过溶液的虹吸原理吸取样品溶液，然后由三维移动的自动臂将点样针移动到载片上方，通过与载片表面接触的方式将样品按预先设计的排列点置于载片表面。本发明所设计的点样针的针体为多边棱柱体，针尖的端面为平面，中心制有圆形凹陷，针体下端轴向开有2-6个缝隙槽，各缝隙槽在轴心相通，槽底端至针尖凹陷的上方与凹陷相通。另外，点样针上端可以设置有多边柱形的架托，以利于将点样针固定于自动臂固定架上的托架上。

由于本发明所设计的芯片点样针采用多棱柱体结构，所开的虹吸缝隙槽底端不贯通，且与针尖端面的凹陷相通，使得针尖强度大大提高，针尖不易损伤，提高了点样针的耐用性，同时能增加溶液的摄取量，提高一次取液后的点样次数，并由虹吸缝槽来贯通于针尖，溶液在针尖处不会产生溢滴，故而所点样点无扩散，且大小均匀；另外，由于本发明所设计的点样针结构可使针尖做得很细小，所具有的优点使得本发明所设计的点样针点样密度大大提高，可以达到每平方厘米数万个点。

附图1为本发明所设计的芯片点样针的结构示意图，附图2为图1中A-A向剖视图，附图3为图1中B-B向的剖视图(二个缝隙槽)示意图，附图4为图3的另一种实例(三个缝隙槽)示意图，附图5为图3的又一种实例(四个缝隙槽)示意图，附图6为所设计针尖局部剖面放大示意图。附图7为所设计针尖端面C向示意图。图中1为针体架托，2为针体，3为(虹吸)缝隙槽，4为(针尖端面的)凹陷。

以下结合附图详细说明本发明的实施方案及芯片制作方案：

本发明所设计的点样针可用多种材料制成。如铝、铜、合金、不锈钢、钛合金等，这里的具体实例是由不锈钢400系列材料制备，采用激光器制作。在此叙述的实例中点样针的长度为3.5cm，直径为1.5mm。长度和直径的变化可根据实际的需要而变，其范围分别为长度1.5cm到5cm，直径0.8mm到3mm。

点样针以虹吸原理吸取样品液。点样针以带有凹陷口的针头部分浸入样品液，通过虹吸作用，样品液由凹陷口吸入，向上由凹陷口顶部进入虹吸缝隙槽。吸样完成后，点样针被移至载片表面上方，针尖与载片表面点触或接触，样品液由凹陷口释出，并点置载片表面。

参见附图7，针尖端面为周边相连的中凹多边形平面，在此实例中是六边形结构，但决不限于六边形结构。端面中心是一凹陷。本发明的特点是采用了周边相连的整体“环”形结构针尖，这一结构与已报导的中分镊尖形针头及圆形“侧劈”针头相比大大提高了针尖的坚固性和耐用性，这一点在以下的生物芯片制作过程中将被进一步论述。这一环形整体中凹结构的另一特点是点样时，样品液是从底部中心的凹陷口释出，而镊形点样针和圆形点样针样品液不仅从针底释出，也会从侧边的开口底部释出，其结果不仅改变了样品点的大小，也不利于高密度芯片的制作，而且样品点的大小和形状不均一。而本发明样品液是通过位于针尖中心的凹口释出，从而有效地克服了上述点样针的缺陷。

点样针的大小可随具体应用需要而变化，其针尖端面直径从8μm到500μm不等，而中间凹陷的直径相应可从5μm到350μm不等。

在比较优化的实例中，针尖端面的外径为10-100μm，中心凹陷的最大处直径为8-50μm，凹陷的深度为1mm，变化范围则可以从0.5mm到4mm。在此条件下芯片的密度可为25000点到10000个点/cm²。

虹吸缝隙槽的针体截面可以表现为十字形(附图5)、或一字形(附图3)、或人字形(附图4)等。外侧开口于柱体面，内部在柱体中心相通。虹吸槽向下延伸至凹陷上方与凹陷顶部相通。在此实例中缝隙槽的长度为3mm，根据实际的要求，可从2mm-8mm不等。其缝隙的宽度一般为20μm，根据要求可为15μm-350μm不等。

本发明利用虹吸缝隙的最大优点是增加虹吸力和样品液的摄取量，这一点在下面的论述中将进一步说明。

针体的尾部架托为两侧各有一突出的结构。为把点样针放置于固定架的托架时，这一突出将可托住点样针而不至滑脱。本发明采用多边形，如六边柱形针体。托架的孔洞也采用相应的多边形。这样点样针放于托架孔洞中，针体不会转动而使点样的位置比较准确。本发明以多边棱柱体为基本结构，在此实例中为六边棱柱，但决不限于六边棱柱。如三边、四边、五边棱柱等。

将点样针放置于固定架的托架上，建议托架上针孔数量为1-32个六边形孔洞，口的直径比点样针的外径略大0.01mm，并允许点样针能上下移动。在点样针尾部的针托是一突出的托，其外径大于点样针孔洞的直径，以托住点样针。将托架固定于一自动移动臂上，此自动臂有电脑控制的可以X,Y,Z三维方向移动，目前市场上已有数家厂商提供此类自动臂。在此建议的系统应具有以下的精密度和功能：

X,Y轴向移动误差应小于3μm,Z轴方向的移动误差应小于5μm。自动系统应具有空气过滤系统，温度控制系统，和能放置1-10个96孔或384孔的标准样品液盘。最主要一点，这一系统应有足够的平台面积以放置400个生物和医学上所用的标准载片，自动臂的移动范围也应有效地覆盖这一面积。这样便可充分体现本发明所叙述点样针取样量大与点样次数多的特点。

自动点样系统将点样针移动于96孔或384孔的样品盘上方，垂直下降，置点样针尖部分于点样液，停顿1-2秒，使点样液通过虹吸原理进入虹吸槽。1-3倍的SSC溶液是应用最为普遍的样品溶液，此溶液含有足够的盐浓度，也不影响样品的虹吸作用。在此建议用发明人所提供的特殊点样液，使用这种点样液可有效的提高点样质量，如点的形状和均一性，以及DNA得附着量，本发明的一个显著特点是采用了多个虹槽，与单一虹吸槽的点样针相比，本发明的点样针可成倍提高样品液的吸取量。

样品的吸取过程完成后，自动移动臂将点样针移动到第一张载片上方，移动臂下降，使点样针与载片表面接触，接触的时间大约为0.02秒-0.08秒，具体的接触时间根据点样点的大小要求而变化。自动臂然后移动到第二张载片上点置样品，重复此过程直至点完所要求的载片数止。一般镊夹点样针一次取样可点50-100个载片，本发明的点样针由于样品的摄取量成倍的提高，所点的载片数量也相应增加。另外，本发明的点样针尖采用了中凹的环形结构，样品液也不会从两侧漏出，这样既减少了样品的点的大小，同时也节约了溶液的用量。生产基因芯片的载片一般采用多聚赖氨酸溶液以增加DNA载片上的附着力和附着量，本发明的点样针也可用于将DNA样品点置于纤维膜载片或其他固相载片上，这里建议用本发明人提供的经过特殊工艺处理的载片。这种在载片可有效的结合DNA，提高点样的均一性，另外，也可减少杂交过程中的非特异性信号。

当最后一张载片点完后，自动臂将点样针移动到清洗槽中清洗，一般用水清洗即可，也可用商品化超声清洗器清洗，清洗后用吸干器将点样针上多余的水分吸干，吸干器采用普通的吸干器即可。这样就可吸取第二个DNA样品，完成了第一个样品的全部点样过程，即在每张载玻片上点置了一个DNA样品，高密度的DNA芯片一般都含有数千至数万个DNA样品点，也就要重复上述过程成千上万次，为加速这一过程一般采用多个针头，如用2-32个针头，多针头同时取样以增加效率。

对含有1000个基因的中密度基因芯片来说，如用一个点样针点制200张芯片，每个点重复一次，这就意味着点样针要点40万次，一般点样针尖直径为100-150μm，即使使用高强度的不锈钢制作，这样微小的针尖也很脆弱。本发明的主要特点是采用了环形整体结构的设计，与中分的镊子形针尖相比，本发明的环形整体点样针大大提高了点样针的强度和耐用性，从而大大提高点样点的均一性及密度，也提高了基因芯片的制作质量和密度。

目前已有数家厂家提供能与本发明所述点样针相匹配的自动移动系统，如：Cartesian Technologies,Inc(USA),GeneMachine(USA)和Gentix(UK)(这几家公司在中国均设有代理商)，另外美国斯坦佛大学P.Brown教授实验室在网址上公布了供自己组装的自动系统。

Claims (7)

1、一种用于制作生物芯片的点样针，其特征在于，所述点样针的针体为多边棱拄体，针尖的端面为平面，中心制有圆形凹陷，针体下端轴向开有2-6个缝隙槽，各缝隙槽在轴心相通，且槽底端至针尖凹陷的上方，与凹陷相通。

2、根据权利要求1所述的点样针，其特征在于，在点样针的尾端侧壁上设置有多边柱形的突出架托。

3、根据权利要求2所述的点样针，其特征在于，点样针的针体长度为1.5-5cm，直径0.8-3cm；针尖端面的直径为8-400μm，中心凹陷的直径为5-350μm，凹陷深度为0.6-3.8mm；缝隙槽的长度为2-8mm，宽度为15-300μm。

4、根据权利要求3所述的点样针，其特征在于，点样针的针体长度为2.5-4cm，直径1-2cm；针尖端面的直径为10-300μm，中心凹陷的直径为6-200μm，凹陷深度为0.8-2.4mm；缝隙槽的长度为2-5mm，宽度为15-100μm。

5、根据权利要求4所述的点样针，其特征在于，点样针的针体为六棱拄体。

6、根据权利要求5所述的点样针，其特征在于，点样针针体下端轴向的缝隙槽为4个，其截面呈十字形排列。

7、根据权利要求1-6所述的任一种点样针，其特征在于，点样针的针体长度为3-3.8cm，直径1-1.6cm；针尖端面的直径为10-100μm，中心凹陷的直径为6-60μm，凹陷深度为1-2mm；缝隙槽的长度为2.5-4mm，宽度为15-50μm。

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