CN101363020B - 将多种细胞有序粘附至同一基底设定位置处的装置及粘附方法 - Google Patents

Abstract

一种将多种细胞粘附至同一基底设定位置处的装置及及制法和用途，包括：上表面蒸镀钛/铬粘附层和金层的基底，下表面具有至少一组微凹槽单元的经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章；印章上凹槽槽端处设有与相应凹槽相通的垂向通孔；印章下表面贴覆于基底金层之上可逆结合形成封闭的管道；在封闭管道形成10min内，向印章的中间、第二和第五凹槽中通FN；随后向第一、第三、第四和第六凹槽通EG6，1～3h后，中间、第二和第五凹槽内的金层上形成细胞外基质蛋白，第一、第三、第四和第六凹槽内的金层及周围形成惰性单分子膜层。本发明将多种细胞可调有序地粘附于同一基底，可用于了解药物对不同种细胞的作用和用于药物筛选。

Description

将多种细胞有序粘附至同一基底设定位置处的装置及粘附方法

技术领域

本发明涉及一种将多种细胞有序粘附至同一基底上的装置及粘附方法，特别涉及一种以有序可控方式将多种细胞粘附到同一基底上的装置及粘附方法。

背景技术

在细胞生物学、组织生物学的基础研究领域，以及生物医学工程和基于细胞和细胞之间作用的药物检测的应用性研究中，往往需要在同一表面固定两种或多种细胞。近来，已经有相关方法的一些方法报道。

例如在文献1：Chiu，D.T.；Jeon，N.L.；Huang，S.；Kane，R.S.；Wargo，C.J.；Choi，I.S.；Ingber，D.E.；Whitesides，G.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000，97，(6)，2408-2413中，Whitesides实验小组公开了一种运用三维结构的微流管道在同一表面固定多种细胞，而且可以形成由多种细胞组成的复杂图案的方法。这种方法首先制备出三维结构的聚二甲基硅氧烷“印章”，然后在“印章”与细胞培养盘基底结合后，往不同的管道入口通入不同的细胞，这样不同种细胞被运送到基底的不同位置，待培养一段时间后，细胞长满，就可以出现设计好的图案。但是，这种方法得到的粘附了多种细胞的基底，在实验过程中如果把含有三维结构的聚二甲基硅氧烷“印章”拿开，粘附在管道中的细胞会自由爬动，使得固定的细胞图案被破坏。另一方面，如果始终不能去掉“印章”，不同种细胞间不能够相互作用，不利于进一步研究细胞间的相互作用。此外，这种方法将多种细胞粘附到基底上时，需要复杂的微加工方法。

在文献2：Yousaf，M.N.；Houseman，B.T.；Mrksich，M.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001，98，(11)，5992-5996中，Mrksich实验小组公开了一种非接触式、在同一表面固定两种不同细胞的方法。此方法首先运用微接触印刷技术把一种细胞固定在表面，然后运用电化学技术改变表面没有粘附细胞的区域化学组成，从而可以固定第二种细胞。这种方法的优点是需要很少的物理操作，缺点是需要复杂的化学合成。

在文献3：Li，Y.，Bo，Y.，Ji，H.，Han，D.，Chen，S.，Tian，F.，Jiang，X.，Angew.Chem.Int.Ed.，2007，46(7)，1094-1096中，蒋兴宇研究小组结合纳米尺度的自组装单分子膜、电化学以及微流控技术，把本来不能使细胞粘附的基底表面某些区域选择性“活化”，使得不同种细胞在指定空间粘附。该小组同时申请专利，申请号为200710098280.4(其在先申请号200610089251.7，在先申请日为2006.08.11)的申请构建了一种将多种细胞粘附到同一基底上的装置及粘附方法；但是它的不足之处在于把不同种细胞要有序粘附在同一表面，需要长时间的电化学解吸附过程，不利于此方法的推广。

本申请人的申请号为200710117815.8，申请日2007年6月25日的发明专利申请构建了将多种细胞以有序阵列方式粘附到同一基底上的装置及粘附方法，此方法过程简单，但无法构建连续距离变化的有序多细胞排列。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术在将多种细胞粘附到同一基底表面时，操作复杂，不能很好的控制粘附的细胞的运动，使得固定的细胞图案被破坏或是根本不能相互作用，从而提供一种将多种细胞有序粘附至同一基底设定位置处的装置及粘附方法，其装置结构简单和易操作，能够有效控制不同种细胞间的间隔距离，并且可以控制不同种细胞间的运动，便于研究不同种细胞间相互作用。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供的将多种细胞粘附至同一基底设定位置处的装置，包括：

一基底；所述基底的上表面上蒸镀有一钛粘附层或铬粘附层，该钛粘附层或铬粘附层上蒸镀有一金层；所述钛粘附层或铬粘附层的厚度为2～10nm；所述金层厚度为20～50nm；

一下表面上具有至少一组微凹槽单元的经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章；

所述微凹槽单元包括：

位于中间位置的直线型中间凹槽；

位于所述直线型中间凹槽一侧依次排列的第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽；所述第第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，所述第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽中的相邻凹槽之间的间距均为50～500μm；

位于所述直线型中间凹槽另一侧依次排列的第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽；所述第四凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，并且该第四凹槽中间段的远离直线型中间凹槽的一侧槽边自中间段端点开始，其长度每增加3～5mm，槽宽向远离直线型中间凹槽方向增加50～300μm，呈一阶梯状槽宽的凹槽中间段；所述第五凹槽和第六凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，并且该第五凹槽和第六凹槽的中间段分别为与所述第四凹槽的中间段的阶梯状边形状相同，槽宽相等的阶梯状凹槽中间段；所述第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中的相邻凹槽之间的间距为50～500μm；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的长度均在1.2～2.0cm范围内；所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第五凹槽、第六凹槽和第四凹槽的自中间段端点开始的第一段凹槽的宽度均在50～300μm范围内；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；

所述经氧化处理后的的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章的下表面贴覆于所述基底的金层之上，所述的直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽与所述基底的金层可逆结合形成封闭的管道；

和

在封闭的管道形成10min内，通过向所述中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽的流通管腔中通入浓度为20～200μg/ml细胞外基质蛋白的PBS磷酸盐缓冲液；随后向所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽的流通管腔中通入浓度为1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液；而于1～3h后，在所述中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽内的金层上形成的细胞外基质蛋白；在所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽内的金层表面上及周围形成由1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液构成的惰性单分子膜层；

所述的硫醇是六聚聚乙二醇链取代的甲硫醇化合物。

所述的硫醇是HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₆OH、HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₅OH、或HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₃OH。

所述的细胞外基质蛋白为纤维结合蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白。

所述的惰性单分子膜为通过在1～5mM的HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₆OH、HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₅OH或HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₃OH的PBS磷酸盐缓冲液中自组装在所述金层表面上的惰性单分子膜层。

本发明提供将多种细胞粘附至同一基底设定位置处的方法，包括如下的步骤：

1)在干净的玻璃基底上表面上先蒸镀一层钛粘附层或铬粘附层，然后再在所述的钛粘附层或铬粘附层上蒸镀一层金层；所述钛粘附层或铬粘附层的厚度为2～10nm；金层的厚度为20～50nm；

2)使用光刻技术，在一硅片上制备具有至少一组凸型条型微结构单元的图案，所述凸型条型微结构单元包括：

位于中间位置的直线型中间凸型条；

位于所述直线型中间凸型条一侧依次排列的第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条；所述第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，所述第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凸型条的方向倾斜；所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条中的相邻凸型条之间的间距均为50～500μm；

位于所述直线型中间凸型条另一侧依次排列的第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条；所述第四凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，并且该第四凸型条中间段的远离直线型中间凸型条的一侧边自中间段端点开始，其长度每增加3～5mm，其凸型条宽向远离直线型中间凸型条方向增加50～300μm，呈一阶梯状凸型条宽的凸型条中间段；所述第五凸型条和第六凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，并且该第五凸型条和第六凸型条的中间段分别为与所述第四凸型条中间段的阶梯状边形状相同，凸型条宽相等的阶梯状凸型条中间段；所述第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凸型条的方向倾斜；所述直线型中间凸型条、第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条的相邻凸型条之间的间距均为50～500μm；

所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条、第三凸型条、第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条的长度均在1.2～2.0cm范围内；所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条、第三凸型条、第五凸型条、第六凸型条和第四凸型条的自中间段端点开始的第一段凸型条的宽度均在50～300μm范围内；

3)用聚二甲基硅氧烷对步骤2)得到的具有至少一组凸型条型微结构单元的硅片进行翻膜，制得一与所述凸型条型微结构单元相对应的具有至少一组微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章；

所述微凹槽单元包括：

位于中间位置的直线型中间凹槽；

位于所述直线型中间凹槽一侧依次排列的第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽；所述第第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，所述第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽中的相邻凹槽之间的间距均为50～500μm；

位于所述直线型中间凹槽另一侧依次排列的第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽；所述第四凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，并且该第四凹槽的中间段远离直线型中间凹槽的一侧槽边自中间段端点开始，其长度每增加3～5mm，其槽宽向远离直线型中间凹槽方向增加50～300μm，呈一阶梯状槽宽的凹槽中间段；所述第五凹槽和第六凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，并且该第五凹槽和第六凹槽的中间段分别为与所述第四凹槽的中间段的阶梯状边形状相同，槽宽相等的阶梯状凹槽中间段；所述第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中的相邻凹槽之间的间距为50～500μm；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的长度均在1.2～2.0cm范围内；所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第五凹槽、第六凹槽和第四凹槽的自中间段端点开始的第一段凹槽的宽度均在50～300μm范围内；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；

然后将所制得的聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽单元的面朝上，在等离子清洗器中氧化2～5min，制成一下表面上具有至少一组微凹槽单元的经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章；

4)将步骤3)中的经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽单元的面朝下与步骤1)所述基底的金层进行可逆的接触性连接，形成封闭的流通管腔；

5)在封闭的流通管腔形成10min内，将浓度为20～200μg/ml细胞外基质蛋白的PBS磷酸盐缓冲液通入所述的中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽的流通管腔中；

随后，将浓度为1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液通入所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽的流通管腔中；

待1～3h后，所述中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽的基底的金层表面上吸附有细胞外基质蛋白；由于所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽管道中通入硫醇的PBS磷酸盐缓冲液具有高的浸润性，使得通入细胞外基质蛋白的PBS磷酸盐缓冲液的管道周围都被抗拒蛋白和细胞粘附的惰性单分子膜表面限制；而在所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽内的金层表面上及周围形成由1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液构成的惰性单分子膜层；

6)制备不同种的待粘附细胞的悬浮溶液，细胞密度为10⁶个/ml，然后将把含有不同种细胞的悬浮溶液通入中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽的流通管腔中，再放入细胞培养箱，在37℃，二氧化碳体积浓度5％，培养30～60min，所通入的细胞粘附在流通管腔内的金表面上；揭掉聚二甲基硅氧烷印章，将生长有细胞的金表面放入普通细胞培养液中，12～24h后，细胞在各自限定区域内生长，以完成多种细胞粘附于同一基底上，其中中间位置的细胞与一种细胞保持平行的等距离排列粘附，而与另一种细胞的间隔逐渐递增。

本发明提供将多种细胞粘附至同一基底设定位置处的方法，还可在不同种细胞有序固定在基底表面后，将电压为1.0～1.4V的电源的正极连接于细胞培养溶液中，负极连接于细胞粘附的基底的金表面上，进行电解吸，检测该不同种细胞之间的互相爬动；电解吸持续时间为30～60s。

所述步骤5)的细胞外基质蛋白为纤维结合蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白。

所述步骤5)的硫醇是六聚聚乙二醇链取代的甲硫醇化合物。

所述步骤5)的硫醇可以是HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₆OH、HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₅OH、或HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₃OH。

所述的惰性单分子膜层为通过在1～5mM的HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₆OH、HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₅OH或HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₃OH的PBS磷酸盐缓冲液中自组装在所述金层表面上的惰性单分子膜层。

本发明提供一种上述方法制得的粘附了多种细胞的基底，其允许粘附的细胞间通过分泌的可溶性生物分子相互作用。

本发明的这种粘附了多种细胞的基底可以用于药物筛选，在粘附的细胞培养的条件下加入待筛选的药物，与没有加入药物的样品进行比较，可以了解哪种药物可以影响这几种细胞之间的相互作用；或者进行电解吸，观察细胞的移动，从而为新药筛选，提供一种极为便利的方法。

本发明提供的装置及方法，首先是在基底表面覆盖其上具有凹槽结构的聚二甲基硅氧烷印章，然后在相应管道中分别通入细胞外基质蛋白的PBS磷酸盐缓冲液和硫醇的PBS磷酸盐缓冲液，由于硫醇的PBS磷酸盐缓冲液具有高的浸润性，所以它会从所在凹槽的限制区域扩散出来，由于其扩散能力大于凹槽间的间隔，所以能够很好的限制住细胞粘附的区域，待单分子膜自主装完成后，在可粘附细胞的凹槽分别通入不同种细胞，细胞粘附后，把PDMS拿开，几种不同的细胞便有序的、距离可以人为连续调控的粘附在同一表面。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明利用表面化学和微流控的结合，来构筑复杂的细胞培养体系，可以让多种细胞在可调控的空间和时间，有序地在表面的粘附、生长。

2、在不同种细胞有序固定在表面后，也可以进行电解吸检测几种细胞之间互相爬动的影响

3、这几种细胞的密度和相间的距离可以精确调控，以便检测几种细胞之间的反应。因为可以控制细胞密度、几种细胞之间的间隔，所以分析的精度是前所未有。

4、在这种方法得到的粘附了多种细胞的基底为细胞生物学、组织生物学的基本研究提供了平台。高精度的在时间和空间上对细胞进行分析，同时，还可以作为基于细胞和细胞之间作用的药物检测，为发现药物和有毒物质的分析提供了新的途径。

5.可以让细胞之间仅仅通过溶液中的物质进行信号交换而相互作用；也可以让细胞直接接触进行信号交相互作用。

附图说明

图1为本发明的将多种细胞有序粘附至同一基底设定位置处的装置的结构示意图；

图2-1至图2-4为本发明将多种细胞有序粘附至同一基底设定位置处的步骤示意图。

具体实施方式

图1为本发明的将多种细胞有序粘附至同一基底设定位置处的装置的结构示意图，由图1可知，本发明提供的将多种细胞有序粘附至同一基底设定位置处的装置，包括：

一基底1；所述基底1为在干净的玻璃基底上表面上先蒸镀一层钛粘附层或铬粘附层，然后再在所述的钛粘附层或铬粘附层上蒸镀一层金层；所述钛粘附层或铬粘附层的厚度为2～10nm；金层的厚度为20～50nm；

一下表面上具有至少一组微凹槽单元的经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章2；结合图2-1所示，所述微凹槽单元包括：位于所述直线型中间凹槽一侧依次排列的第一凹槽21、第二凹槽22和第三凹槽23；所述第第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，所述第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽中的相邻凹槽之间的间距均为50～500μm；

位于所述直线型中间凹槽另一侧依次排列的第四凹槽24、第五凹槽25和第六凹槽26；所述第四凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，并且该第四凹槽的中间段远离直线型中间凹槽的一侧槽边自中间段端点开始，其长度每增加3～5mm，其槽宽向远离直线型中间凹槽方向增加50～300μm，为一呈阶梯状槽宽的凹槽中间段；所述第五凹槽和第六凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，并且该第五凹槽和第六凹槽的中间段分别为与所述第四凹中间段凹槽形状相同，槽宽相等的阶梯状凹槽；所述第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中的相邻凹槽之间的间距为50～500μm；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的长度均在1.2～2.0cm范围内；所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第五凹槽、第六凹槽和第四凹槽的自中间段端点开始的第一段凹槽的宽度均在50～300μm范围内；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；

把所制得的聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽单元的面朝上，在等离子清洗器中氧化2～5min，制成一下表面上具有至少一组微凹槽单元的经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章；

经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽单元的面朝下与所述基底1的金层进行可逆的接触性连接，形成封闭的流通管腔；

然后在10min内，将浓度为20～200μg/ml细胞外基质蛋白的PBS磷酸盐缓冲液通入所述的中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽流通管腔中；

随后，在第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽通入浓度为1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液；

待1～3h后，所述中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽的基底的金层表面上吸附有细胞外基质蛋白；

由于所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽管道中通入硫醇的PBS磷酸盐缓冲液具有高的浸润性，使得通入细胞外基质蛋白的PBS磷酸盐缓冲液的管道周围都被抗拒蛋白和细胞粘附的惰性单分子膜表面限制；

所述硫醇是六聚聚乙二醇链取代的甲硫醇化合物。

所述的硫醇可以是HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₆OH、HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₅OH、或HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₃OH。

所述细胞外基质蛋白为纤维结合蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白。

所述的惰性单分子膜层为通过在1～5mM的HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₆OH、HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₅OH或HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₃OH的PBS磷酸盐缓冲液中自组装在所述金层表面上的惰性单分子膜层。

实施例1、

请参见图2-1、图2-2、图2-3和图2-4：

1)在一干净的玻璃载波片1(厚度0.15mm)表面蒸镀10nm(2～10nm均可)的钛粘附层，然后再在钛粘附层上蒸镀40nm(20～50nm均可)厚的金层，制得基底1；

把制得的基底1切成2x2cm²的小块，用乙醇的水溶液(浓度为：50％～100％)浸泡，再用氮气吹干备用；

2)使用光刻技术，在一硅片上刻制具有至少一组凸型条型微结构单元的图案，其制做步骤为：首先用作图软件L-edit设计出所要图形七条并排的凸型线，该七条并排的凸型线构成一组凸型条型微结构单元，包括：

位于中间位置的直线型中间凸型条；

位于所述直线型中间凸型条一侧依次排列的第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条；所述第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，所述第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凸型条的方向倾斜；所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条中的相邻凸型条之间的间距均为50～500μm；

位于所述直线型中间凸型条另一侧依次排列的第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条；所述第四凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，并且该第四凸型条的中间段远离直线型中间凸型条的一侧边自中间段端点开始，其长度每增加3～5mm，其凸型条宽向远离直线型中间凸型条方向增加50～300μm，为一呈阶梯状凸型条宽的凸型条；所述第五凸型条和第六凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，并且该第五凸型条和第六凸型条的中间段分别为与所述第四凸型条阶梯状边形状相同，凸型条宽相等的阶梯状凸型条；所述第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凸型条的方向倾斜；

所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条、第三凸型条、第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条的长度均在1.2～2.0cm范围内；所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条、第三凸型条、第五凸型条、第六凸型条和第四凸型条的自中间段端点开始的第一段凸型条的宽度均在50～300μm范围内；

3)然后打印为分辨率为3600dpi的胶片；接着再涂胶(SU-8系列负胶)，利用甩胶机均匀地将光刻胶，涂在硅片基底上，经高温烘烤硬化后，把胶片垂直放在涂有光刻胶的基板上，显影曝光后就在涂有光刻胶的硅片上制成了所述具有至少一组凸型线型微结构单元；

4)用聚二甲基硅氧烷(PDMS)对步骤3)得到的凸型线型微结构单元进行翻膜，得到一与上述微结构相对应的、具有凹型图案的PDMS印章；然后在图案中各凹槽的端点处打孔，使其上下表面连通，再把印章有凹型图案的面向上，在等离子清洗器中氧化2min，形成具有亲水表面的PDMS印章；

5)将步骤4)中的印章取出后，把有凹型图案的面向下与步骤2)的硫醇化的基底接触，形成封闭的管腔；然后在封闭的管腔形成10min内把100μg/ml细胞外基质蛋白(纤维结合蛋白(fibronection))的PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.4)通入中间凹槽、第三凹槽和第四凹槽流通管腔中通入，随后，在第一凹槽、第二凹槽、第五凹槽和第二凹槽通入浓度为1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液；让凹槽中所含溶液的分子在基底表面吸附1h；

6)制备不同种的粘附细胞——Hela细胞、MDCK细胞和NIH 3T3细胞的悬浮溶液，细胞密度均为106个/ml，然后将NIH 3T3细胞的悬浮溶液通入中间管腔中，把Hela细胞的悬浮溶液通入第三管腔中，把MDCK细胞的悬浮溶液通入第四管腔中，放入细胞培养箱，于37℃、二氧化碳浓度5％(体积浓度)，培养40min，细胞粘附在管腔内的金表面上；把PDMS印章揭掉，把长有细胞的金表面放入普通细胞培养液(胎牛血清浓度10％)中，12h后，细胞就会长满各自的限定区域，得到一粘附了三种细胞的基底。

实施例2、

1)在一干净的玻璃载波片(厚度0.15mm)表面蒸镀5nm(2～10nm均可)的铬粘附层，然后再在铬粘附层上蒸镀20nm(20～50nm均可)厚的金层，制得基底1；

把制得的基底1切成2x2cm²的小块，用乙醇的水溶液(浓度为：50％～100％)浸泡，再用氮气吹干备用；

2)使用光刻技术，在一硅片上刻制具有至少一组凸型条型微结构单元的图案，其制做步骤为：首先用作图软件L-edit设计出所要图形七条并排的凸型线，该七条并排的凸型线构成一组凸型条型微结构单元，包括：

位于中间位置的直线型中间凸型条；

位于所述直线型中间凸型条一侧依次排列的第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条；所述第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，所述第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凸型条的方向倾斜；所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条中的相邻凸型条之间的间距均为50～500μm；

位于所述直线型中间凸型条另一侧依次排列的第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条；所述第四凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，并且该第四凸型条的中间段远离直线型中间凸型条的一侧边自中间段端点开始，其长度每增加3～5mm，其凸型条宽向远离直线型中间凸型条方向增加50～300μm，为一呈阶梯状凸型条宽的凸型条；所述第五凸型条和第六凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，并且该第五凸型条和第六凸型条的中间段分别为与所述第四凸型条阶梯状边形状相同，凸型条宽相等的阶梯状凸型条；所述第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凸型条的方向倾斜；

所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条、第三凸型条、第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条的长度均在1.2～2.0cm范围内；所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条、第三凸型条、第五凸型条、第六凸型条和第四凸型条的自中间段端点开始的第一段凸型条的宽度均在50～300μm范围内；

3)然后打印为分辨率为3600dpi的胶片；接着再涂胶(SU-8系列负胶)，利用甩胶机均匀地将光刻胶，涂在硅片基底上，经高温烘烤硬化后，把胶片垂直放在涂有光刻胶的基板上，显影曝光后就在涂有光刻胶的硅片上制成了所述具有至少一组凸型线型微结构单元；

4)用聚二甲基硅氧烷(PDMS)对步骤3)得到的凸型线型微结构单元进行翻膜，得到一与上述微结构相对应的、具有凹型图案的PDMS印章；然后在图案中各凹槽的端点处打孔，使其上下表面连通，再把印章有凹型图案的面向上，在等离子清洗器中氧化2min，形成具有亲水表面的PDMS印章；

5)将步骤4)中的印章取出后，把有凹型图案的面向下与步骤2)的硫醇化的基底接触，形成封闭的管腔；然后在10min内把50μg/ml细胞外基质蛋白(纤维结合蛋白(fibronection))的PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.4)通入中间凹槽、第三凹槽和第四凹槽流通管腔中通入，随后，在第一凹槽、第二凹槽、第五凹槽和第二凹槽通入浓度为1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液；让凹槽中所含溶液的分子在基底表面吸附1h；

6)制备不同种的粘附细胞——Hela细胞和NIH 3T3细胞的悬浮溶液，细胞密度均为106个/ml，然后把Hela细胞的悬浮溶液通入第三和四管腔中，将NIH 3T3细胞的悬浮溶液通入中间管腔中，放入细胞培养箱，于37℃、二氧化碳浓度5％(体积浓度)，培养40min，细胞粘附在管腔内的金表面上；把PDMS印章揭掉，把长有细胞的金表面放入普通细胞培养液(胎牛血清浓度10％)中，24h后，细胞就会长满各自的限定区域，得到一粘附了两种细胞的基底。

实施例3

将实施例1或实施例2得到的粘附了多种细胞的基底浸入普通细胞培养液(胎牛血清浓度10％)；在溶液处通正电极，在硫醇化的基底的金表面通负电极，电压为1.4V，通电时间为30s，进行一次电化学解析附，指定图案以外的金表面区域的硫醇解析附，重新变为可以吸附蛋白质和细胞的表面层，粘附在指定图案内的细胞就可以自由移动了。

另外，本发明所述的凸型条型微结构单元的凸型条还可以根据需要，在最外侧的凸型条的外侧增加与之形状相同且平行的凸型条；所述的微凹槽单元的凹形槽也可以根据需要，在最外侧的凹形槽外侧增加与之形状相同且平行的凹形槽。

Claims (5)

1.一种将多种细胞粘附至同一基底设定位置处的装置，包括：

一基底；所述基底的上表面上蒸镀有一钛粘附层或铬粘附层，该钛粘附层或铬粘附层上蒸镀有一金层；所述钛粘附层或铬粘附层的厚度为2～10nm；金层的厚度为20～50nm；

一下表面上具有至少一组微凹槽单元的经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章；

所述微凹槽单元包括：

位于中间位置的直线型中间凹槽；

位于所述直线型中间凹槽一侧依次排列的第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽；所述第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，所述第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽中的相邻凹槽之间的间距均为50～500μm；

位于所述直线型中间凹槽另一侧依次排列的第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽；所述第四凹槽中间段靠近直线型中间凹槽的一侧槽边与所述直线型中间凹槽平行，并且该第四凹槽中间段远离直线型中间凹槽的一侧槽边自中间段端点开始，其长度每增加3～5mm，其槽宽向远离直线型中间凹槽方向增加50～300μm，呈一阶梯状槽宽的凹槽中间段，第四凹槽中间段中槽宽最窄的一段凹槽称为第一段凹槽；所述第五凹槽中间段和第六凹槽中间段分别为与所述第四凹槽中间段的阶梯状边形状相同，槽宽相等的阶梯状凹槽；所述第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的长度均在1.2～2.0cm范围内；所述第四凹槽的自中间段端点开始的第一段凹槽宽度、直线型中间凹槽宽度、第一凹槽宽度、第二凹槽宽度、第三凹槽宽度、第五凹槽宽度和第六凹槽宽度均在50～300μm范围内；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；

所述经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章的下表面贴覆于所述基底的金层之上，所述的直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽与所述基底的金层可逆结合形成封闭的管道；

然后在封闭的管道形成的10min内，通入所述的中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽流通管腔中的浓度为20～200μg/ml细胞外基质蛋白的PBS磷酸盐缓冲液；随后通入所述 第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽的浓度为1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液，而于1～3h后在所述中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽内的金层上形成的细胞外基质蛋白；在所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽内的金层表面上及其周围的由1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液形成的惰性单分子膜层；所述的硫醇是六聚乙二醇链取代的硫醇化合物；

所述的六聚乙二醇链取代的硫醇化合物是HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₆OH、HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₅OH或HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₃OH。

2.按权利要求1所述的将多种细胞粘附至同一基底设定位置处的装置，其特征在于，所述的细胞外基质蛋白为纤维结合蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白。

3.一种将多种细胞粘附至同一基底设定位置处的方法，包括如下的步骤：

1)在干净的玻璃基底上表面上先蒸镀一层钛粘附层或铬粘附层，然后再在所述的钛粘附层或铬粘附层上蒸镀一层金层；所述钛粘附层或铬粘附层的厚度为2～10nm；金层的厚度为20～50nm；

2)使用光刻技术，在一硅片上刻制具有至少一组凸型条型微结构单元的图案，其制作步骤为：首先用作图软件L-edit设计出所要图形七条并排的凸型线，该七条并排的凸型线构成一组凸型条型微结构单元，包括：

位于中间位置的直线型中间凸型条；

位于所述直线型中间凸型条一侧依次排列的第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条；所述第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条的中间段与所述直线型中间凸型条平行，所述第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凸型条的方向倾斜；所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条和第三凸型条中的相邻凸型条之间的间距均为50～500μm；

位于所述直线型中间凸型条另一侧依次排列的第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条；所述第四凸型条中间段靠近直线型中间凸条的一侧条边与所述直线型中间凸型条平行，并且该第四凸型条中间段的远离直线型中间凸型条的一侧条边自中间段端点开始，其长度每增加3～5mm，凸型条宽向远离直线型中间凸型条方向增加50～300μm，为一呈阶梯状凸型条宽的凸型条，第四凸型条中间段中宽度最窄的一段凸型条称为第一段凸型条；所述第五凸型条中间段和第六凸型条中间段分别为与所述第四凸型条阶梯状边形状相同，凸型条宽相等的阶梯状凸型条；所述第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凸型条的方向倾斜；

所述直线型中间凸型条、第一凸型条、第二凸型条、第三凸型条、第四凸型条、第五凸型条和第六凸型条的长度均在1.2～2.0cm范围内；所述第四凸型条的自中间段端点 开始的第一段凸型条宽度、直线型中间凸型条宽度、第一凸型条宽度、第二凸型条宽度、第三凸型条宽度、第五凸型条宽度和第六凸型条宽度均在50～300μm范围内；

然后打印为分辨率为3600dpi的胶片；接着再涂胶，利用甩胶机均匀地将光刻胶，涂在硅片基底上，经高温烘烤硬化后，把胶片垂直放在涂有光刻胶的基板上，显影曝光后就在涂有光刻胶的硅片上制成了所述具有至少一组凸型线型微结构单元；

3)用聚二甲基硅氧烷对步骤2)得到的具有至少一组凸型条型微结构单元的硅片进行翻膜，制得到一与所述凸型条型微结构单元相对应的具有至少一组微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章；

所述微凹槽单元包括：

位于中间位置的直线型中间凹槽；

位于所述直线型中间凹槽一侧依次排列的第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽；所述第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽平行，所述第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽和第三凹槽中的相邻凹槽之间的间距均为50～500μm；

位于所述直线型中间凹槽另一侧依次排列的第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽；所述第四凹槽中间段靠近直线型中间凹槽的一侧槽边与所述直线型中间凹槽平行，并且该第四凹槽中间段的远离直线型中间凹槽的一侧槽边自中间段端点开始，其长度每增加3～5mm，槽宽向远离直线型中间凹槽方向增加50～300μm，为一呈阶梯状槽宽的凹槽中间段，第四凹槽中间段中槽宽最窄的一段凹槽称为第一段凹槽；所述第五凹槽中间段和第六凹槽中间段分别为与所述第四凹槽中间段凹槽梯形边形状相同，槽宽相等的阶梯状凹槽；所述第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的中间段之外的两端部段向远离直线型中间凹槽的方向倾斜；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的长度均在1.2～2.0cm范围内；所述第四凹槽的自中间段端点开始的第一段凹槽宽度、直线型中间凹槽宽度、第一凹槽宽度、第二凹槽宽度、第三凹槽宽度、第五凹槽宽度和第六凹槽宽度均在50～300μm范围内；

所述直线型中间凹槽、第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽和第六凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；

然后把所制得的聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽单元的面朝上，在等离子清洗器中氧化2～5min，制成一下表面上具有至少一组微凹槽单元的经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章；

4)将步骤3)中的经氧化处理后的具亲水表面的聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹槽 单元的面朝下与步骤1)所述基底的金层进行可逆的接触性连接，形成封闭的流通管腔；

5)然后在流通管腔形成10min内，将浓度为20～200μg/ml细胞外基质蛋白的PBS磷酸盐缓冲液通入所述的中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽流通管腔中；随后，在第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽通入浓度为1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液；待1～3h后，所述中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽的基底的金层表面上吸附有细胞外基质蛋白；而在所述第一凹槽、第三凹槽、第四凹槽和第六凹槽内的金层表面上及周围形成由1～5mM硫醇的PBS磷酸盐缓冲液构成的惰性单分子膜层；所述的硫醇是六聚乙二醇链取代的硫醇化合物；

6)制备不同种的待粘附细胞的悬浮溶液，细胞密度为10⁶个/ml，然后将含有不同种细胞的悬浮溶液通入中间凹槽、第二凹槽和第五凹槽的流通管腔中，再放入细胞培养箱，在37℃，二氧化碳体积浓度5％，培养30～60min，所通入的细胞粘附在流通管腔内的金表面上；揭掉聚二甲基硅氧烷印章，将生长有细胞的金表面放入普通细胞培养液中，12～24h后，细胞在各自限定区域内生长，以完成多种细胞粘附于同一基底上，其中中间位置的细胞与一种细胞保持平行的等距离排列粘附，而与另一种细胞的间隔逐渐递增；

所述的六聚乙二醇链取代的硫醇化合物是HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₆OH、HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₅OH或HS(CH₂)₁₁(OCH₂OCH₂)₃OH。

4.按权利要求3所述的将多种细胞粘附至同一基底设定位置处的方法，其特征在于，还包括：在不同种细胞有序固定在基底表面后，将电压为1.0～1.4V的电源的正极连接于细胞培养溶液中，负极连接于细胞粘附的基底的金表面上，进行电解吸，检测该不同种细胞之间的互相爬动。

5.按权利要求3所述的将多种细胞粘附至同一基底设定位置处的方法，其特征在于，所述步骤5)的细胞外基质蛋白为纤维结合蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白。 

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