CN1301642C - 卵母细胞玻璃化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低温储藏的新方法，该方法基于通过将含有生物样品的玻璃化溶液的小微滴与一个非常冷的固体表面直接接触而达到的非常快的冷却速率。
Description
本发明要求2000年1月4日提交的第60/174383号和60/174424号和2000年6月30日提交的第60/215433号美国专利申请的优先权，上述专利申请披露的内容结合于此作为参考。
本发明的背景技术
1.本发明所属技术领域
本发明涉及一种生物样品的低温保藏方法。尤其涉及一种基于快速冷却率的溶液中的生物样品低温保藏的方法，而快速冷却率是通过将溶液中的小滴与一个极冷的固体表面接触来获得的。现已发现该低温保藏方法特别适用于卵母细胞和胚胎的低温保藏，尤其是哺乳动物胚胎的低温保藏。
2.相关背景技术
常常有人欲将生物样品长时间保存，例如，当某种样品欲在以后用于某种特殊的目时，这就需要将其长时间保存。遗憾的是，正如本领域普通技术人员所认识到的，采用目前现有的技术进行生物样品的冰冻、低温储藏和解冻常常不是最理想的，原因在于这些方法保存的生物样品的生物活性常常明显下降。由于某种生物技术的实际应用要求长时间地储藏某些细胞，这样，越来越需要一种新的用以保藏生物样品尤其是细胞材料的方法，这样该材料的生物功能在加温后仍被保留。生物材料保存的特殊需要来源于体外胚胎生产和核移植中的种质(germ plasma)的保藏。
对于储藏许多动物种类的卵母细胞和胚胎，人们所付出的努力越来越多。这些努力缘自于人类的许多愿望，包括但不限于：保存数量不断下降的动物品种，通过体外授精技术繁殖动物以增加遗传的多样性并克服不育的问题，克隆具有较高经济价值的动物。随着对卵母细胞保存兴趣的不断增加，人们越来越意识到现阶段的生物保存技术不足以保存许多动物种类的卵母细胞。例如，众所周知牛的卵母细胞对低温非常敏感。尽管许多研究小组做了很多努力(参见Palasz et al.，Biotechnol.Adv.14：127-149(1996))，牛卵母细胞的保存仍是一项艰巨的任务。仅有为数不多的文章报告了来自于低温储藏的卵母细胞发育成胚泡然后发育成小牛，并且效率很低(Fuku et al.，Cryobiology 29：485-492(1992)；Hamano et al.，Theriogenology 38：1085-1090(1992)；Otoi et al.，Theriogenology 38：711-719(1992)；Otoi et al.，J Reprod.Dev.41：361-366(1995)；Suzukiet al.，Cryobiology 33：515-524(1996)；Kubota et al.，Mol.Reprod.Dev.51：281-286；Vajta et al.，Mol.Reprod.Dev.51：53-58(1998))。
已有报道报告受精过程可由于低温保护剂的影响而受到损害。许多报告声称目前正在使用的低温保护剂提高浓度后的对卵母细胞将具有高毒性，且对随后的卵母细胞和胚胎的发育也有负面影响(Martino et al.，Mol.Reprod.Dev.45：503-512(1996)；Palasz et al.，Biotechnology advances 14：127-149(1996)；Parks et al.，Theriogenology 37：59-73(1992)；Schellander et al.，Theriogenology 42：909-915；Vajta et al.，Embryo Transfer newsletter 15：12-18(1997))。还有一些报道报告了与低温储藏的冷却有关的卵母细胞的毒性(Parks et al.，Theriogenology 37：59-73(1992))。例如，众所周知暴露于低温下会导致减数分裂的纺锤体解聚(Parks et al.，Theriogenology 37：59-73(1992)；Peura et al.，Theriogenology 51：211(1999)(摘要))。以前用冷冻/解冻的成熟卵母细胞所做的实验同新鲜的卵母细胞相比，其去核率明显下降(Kubota et al.，Mol.Reprod.Dev.51：281-286(1998))。
现在的努力已经集中在通过改进低温保藏技术提高储藏的卵母细胞的生存率上。依据Martino等人的报告(Martino et al.，Biol.Reprod.54：1059-1069(1996))，这些努力已经集中在对比不同的低温保护剂(Otoi et al.，Theriogenology 40：801-807(1993)；Dinnyeset al.，Cryobiology 31：569-570(1994))和不同的冷冻方式(Lira etal.，Theriogenology 35：1225-1235(1991))，或相关的玻璃化方法上(Otoi et al.，Theriogenology 40：801-807(1993)；Otoi et al.，Cryobiology 37：77-85(1998))。
“低温保藏”是指在水的凝固点以下的温度储藏生物材料，这样生物材料不会分解。“玻璃化”是指生物材料冷却的一个过程，应用低温保护剂(可使水不结冰的化学试剂)可阻止冷却过程中冰的形成，使温度达到摄氏-100度或更低，这样，含有生物材料的溶液可达到其玻璃转换温度，在该温度下分子停止彼此间相对运动。本领域公认冰的形成会破坏生物材料，原因是冰的形成会将物质挤压到残留的未冷冻溶液的收缩穴里。当冷却继续进行时，超过80％的组织的体积会转变成冰，细胞挤压变形超出能够恢复的界限。在玻璃化过程中，流动的水分子在深度冷却时保持它们自有的任意排列方式。没有其它化学试剂或细胞成分的干扰。成功的玻璃化技术利用超冷却法，即冷却到低于冷冻保护性溶液的凝固点以下而不结冰。低温保护剂在高浓度时一般对细胞有毒害作用。快速冻结被认为是通过降低低温保护剂的浓度来完成的，其对防止冰结晶的形成是必须的，从而使组织在非毒性浓度的低温保护剂中保存。
可以相信玻璃化技术的瓶颈之一是目前的玻璃化方案中卵母细胞冷却率的“不足”(Vajta et al.，Embryo Thansfer newsletter 15：12-18(1997))。为了克服这个难题，提出了只用少量溶液的几种方法。
被称为“最小滴玻璃化”的方法已经使牛和猪的卵母细胞低温保藏取得了突破性结果(参见Arav A.，Vitrification of oocyte andembryos(卵母细胞和胚胎的玻璃化)，In：Lauria A，Gandolfi F(eds.)，New trends in embryo transfer(胚胎移植的新趋势)，Cambridge，England：Portland Press，255-264(1992))。在“最小滴玻璃化”方法中，少量的溶液被置于一个特殊的冷冻台上，此冷冻台可快速冷却。遗憾的是，人们发现这个方法对于保存大量卵母细胞不方便。
其它的玻璃化技术已有报道。利用将几微升玻璃化溶液加载到玻璃毛细管中(Dinnyes et al.，Cryobiology 31：569-570(1994))，或装入开放拉制的塑料吸管中(Vajta et al.，Mol.Reprod.Dev.51：53-58(1998))，然后迅速投入液氮中的方法已经成功地在牛卵母细胞玻璃化中进行了试验。同样成功的玻璃化是通过用一个小圈插入含有卵母细胞的玻璃化溶液来完成的(Lane et al.，Theriogenology51：167(1999)(摘要))。然而，还未发现这些技术具有所推测的高效率，因为将一个暖的物体投入到液氮中会引起液体沸腾，短时间内在物体周围会产生一个氮蒸气的隔离层。
为了降低蒸汽隔离层对有效玻璃化干扰的可能性，有人提出将含有卵母细胞的玻璃化溶液直接滴入液氮中。已有报告表明这种技术比前面的玻璃化技术更有效(Riha et al.，Zivoc.Vir.36：113-120(1991)；Papis et al.，Theriogenology 51：173(1999)(摘要)；Yanget al.，Theriogenology 51：178(1999)(摘要))，推测其原因是消除了蒸汽隔离层的影响。然而，这一技术又遇到玻璃化卵母细胞恢复的问题。
一些研究小组曾报道通过在液氮辅助下用冷却的金属面使生物材料低温保藏获得成功的改进。据称这种金属面比在最小滴玻璃化方法中应用的冷冻台可提供更有效的热传导并进一步提高冷却率。果蝇胚胎置于冷却金属面之上的金属栅格里可被成功地保存起来(Steponkus et al.，Nature 345：170-172(1990))。此外，还未发现目前现有的应用冷却金属面的技术适用于大量卵母细胞的保存。
当前，由于保存的卵母细胞地存活受到限制并且现有技术比较繁琐，牛的体外胚胎繁殖和核移植实验依赖采集新鲜的卵母细胞。这对大多数研究小组来说都的主要的限制因素，对有效地进行实验的计划和组织是一个障碍。
因此需要一种改进的生物材料保存方法，尤其是对保存卵母细胞和其它易损细胞有效的方法。该方法应允许对生物材料进行无菌处理并可长时间保持其生物活性和发育能力。
发明内容
本发明提供了一种用于生物材料玻璃化的方法，所述方法包括：将含有生物材料的离散的，平均体积为10μl或更小的玻璃化溶液的微滴与温度在-150℃至-180℃的基本固定的固体低温表面接触，所述表面具有的热传导率在20℃时大于10W/(m·k)，并将冻结的微滴从所述表面移除。
优选地，其中所述生物材料是一个细胞。或者，其中所述生物材料是一个牛卵母细胞。或者，其中所述生物材料是牛卵母细胞发育的一个胚胎。
优选地，一种用于生物材料玻璃化的方法，其中
(a)将生物材料悬浮于低温保护性平衡溶液中，所述低温保护性平衡溶液具有的低温保护剂的浓度低于足以防止冰的形成至低温保护性平衡溶液的玻璃转换温度的浓度；
(b)用玻璃化溶液漂洗平衡的生物材料，所述玻璃化溶液具有的低温保护剂的浓度足以防止冰的形成至玻璃化溶液的玻璃转换温度；以及
(c)将用所述玻璃化溶液漂洗的所述生物材料以玻璃化溶液微滴形式滴落到一个固体表面上，所述固体表面为热传导率大于10W/(m.k)的金属，并且其已预先被冷却到-150℃至-180℃；
(d)收集所述经冷冻的含有玻璃化的生物材料的微滴，其中所述生物材料在解冻后保持了形态学和成活力。
优选地，其中所述玻璃化的生物材料是一个牛卵母细胞。或者是牛卵母细胞发育的一个胚胎。
优选地，其中所述玻璃化的牛卵母细胞是在一个加有胎牛血清的KSOM培养系统里与卵丘细胞共同培养的。
本发明提供了一种低温保藏生物材料，尤其是卵母细胞、胚胎、和其它细胞性物质的新颖方法。本发明的发明人已发现生物材料的低温保藏可通过以下步骤来完成：将材料混入包含玻璃化溶液的液体的小微滴中，再将含有玻璃化液体的生物材料与具有良好热传导性的很冷的表面直接接触。所有这些步骤组合在一起可产生非常高的冷却率。
对于卵母细胞的保存、前面讨论的困扰现有技术的问题，本发明都提供了非常好的效果。改进的卵母细胞保存方法既提高了卵母细胞的生存率又在很大程度上提高了支持核移植胚胎发育的能力。这一改进水平显然是不可预料的，同以前的报告相比效率增加了十倍(Peura et al.，Theriogenology 51：211(1999)(摘要))。
本发明的方法，称为“固体表面玻璃化”或“SSV”方法，结合了上面所描述的微滴技术的无容器玻璃化和冷金属表面技术的增加热交换的优点。此外，清洁的金属表面使小滴的处理可以无菌化。
本发明提供的一种用于卵母细胞低温保藏的方法，优选地，其中玻璃化溶液是由一种细胞内低温保护剂如乙二醇、一种大分子如聚乙烯吡咯烷酮、一种糖如海藻糖以及一种表面活性剂如牛血清白蛋白组成的。
本发明提供的一种用于卵母细胞低温保藏的方法，优选地，其中平衡溶液是由一种细胞内低温保护剂如乙二醇、一种基础培养液如TCM199以及一种在室温下具有表面活性剂作用的大分子如胎牛血清白蛋白或牛血清白蛋白组成的。
本发明提供的一种用于卵母细胞低温保藏的方法，优选地，进一步包括在解冻之前储存该收集的冷冻微滴至少三周。
本发明提供的一种用于卵母细胞低温保藏的方法，优选地，进一步包括在用平衡溶液平衡之前部分或全部除去卵丘细胞。
本发明提供的一种用于卵母细胞低温保藏的方法，优选地，其中所述低温保护剂在所述微滴内提高所述玻璃化状态的玻璃转变温度足以防止冰的形成。
本发明提供的一种用于卵母细胞低温保藏的方法，优选地，进一步包括在接近生理学温度的39℃下解冻玻璃化的卵母细胞微滴持续3分钟。
本发明提供的一种用于卵母细胞低温保藏的方法，优选地，其中所述卵母细胞为非人类哺乳动物的卵母细胞。
本发明提供的一种用于卵母细胞低温保藏的方法，优选地，其中微滴的体积为1-10μl。更优选地，其中微滴的体积为1μl。
本发明的另一方面还提供了一种用于非人类哺乳动物的卵母细胞体外受精的方法，该方法包括根据本发明的用于卵母细胞低温保藏的低温保护的方法，以及进一步包括使该解冻的非人类哺乳动物的卵母细胞在体外受精。
本发明的再一方面还提供了一种用于在体外制备非人类哺乳动物的胚胎细胞的方法，所述方法包括根据本发明的用于非人类哺乳动物的卵母细胞体外受精的方法，其中对所述受精的解冻非人类哺乳动物的卵母细胞进行孵育以形成胚胎。
本发明提供的一种用于在体外制备非人类哺乳动物的胚胎细胞的方法，优选地，其中孵育是用KSOM和胎牛血清培养基通过卵丘细胞共同培养。
本发明的又一方面还提供了一种根据本发明的用于卵母细胞低温保藏的方法在制备低温保藏的哺乳动物卵母细胞中的应用。
本发明提供了一种低温保藏生物材料，尤其是卵母细胞、胚胎、和其它细胞性物质的新颖方法。本发明的发明人已发现生物材料的低温保藏可通过以下步骤来完成：将材料混入包含玻璃化溶液的液体的小微滴中，再将含有玻璃化液体的生物材料与具有良好热传导性的很冷的表面直接接触。所有这些步骤组合在一起可产生非常高的冷却率。
对于卵母细胞的保存、前面讨论的困扰现有技术的问题，本发明都提供了非常好的效果。改进的卵母细胞保存方法既提高了卵母细胞的生存率又在很大程度上提高了支持核移植胚胎发育的能力。这一改进水平显然是不可预料的，同以前的报告相比效率增加了十倍(Peura et al.，Theriogenology 51：211(1999)(摘要))。
本发明的方法，称为“固体表面玻璃化”或“SSV”方法，结合了上面所描述的微滴技术的无容器玻璃化和冷金属表面技术的增加热交换的优点。此外，清洁的金属表面使小滴的处理可以无菌化。
本发明的固体表面玻璃化方法可用于低温保藏各种类型活的细胞和组织，包括但不限于脊椎动物和非脊椎动物种类以及植物的细胞和组织。当溶液中低温保护剂的浓度允许发生玻璃化过程时，此方法可与本领域普通技术人员熟知的各种低温保护剂溶液组合一起应用，优选对生物材料的生物活性要没有负面影响。
本发明的一个实施例提供了一种生物材料玻璃化的方法，该方法由以下步骤组成：(1)将生物材料悬浮于低温保护性平衡介质中，该介质的浓度低于足以防止冰的形成至低温保护性平衡介质的玻璃转变温度；(2)用玻璃化溶液漂洗平衡的生物材料，玻璃化溶液所具有的低温保护剂浓度足以防止冰的形成至玻璃化介质的玻璃转变温度；(3)将玻璃化溶液微滴中经玻璃化溶液漂洗的生物材料滴落到一个具有良好热传导性的固体表面上，该固体表面已经预先被冷却到大约-150℃至-180℃。“良好的热传导性”是指金属的热传导性。优选的热传导率是在20℃时大于大约10W/(m-k)，更好是大于大约25W/(m-k)，再好的是大于大约40W/(m-k)，最好是大于大约55W/(m-k)。“微滴”是指含有10微升或更少溶液的一个小滴。优选微滴体积是4微升或更少，更好的是3微升或更少，最好的是1微升或更少。
本发明的另一个实施例提供了一种悬浮于玻璃化溶液中低温保藏生物材料的改进方法，其中所述的改进包括将含有生物材料的玻璃化溶液的微滴与具有-150℃至-180℃温度的固体表面接触，该表面具有良好的热传导性。本发明的另一个实施例提供了一个悬浮于玻璃化溶液中的生物材料低温保藏的改进方法，其中所述的改进包括将含有生物材料的玻璃化溶液的微滴与具有-150℃至-180℃温度的固体表面接触，该表面具有的热传导率在20℃时大于大约10W/(m-k)。
采用本发明的玻璃化技术保存的样品可被加温，通过将玻璃化小滴直接滴入温暖的(大约39℃)缓冲液(0.3M prehalose溶液)中几分钟(大约3分钟)，加或不加糖或其它渗透性活性剂，而对其生物活性没有明显的有害影响。
本发明尤其适用于解决研究者所面临的在卵母细胞的可用性和季节性品质变化方面波动的干扰。此外，通过成功的低温保藏卵母细胞可以促进濒危动物和家畜种类的保存。本发明对现有技术的改进至少在于以下几方面：(1)消除了大多数现有技术中使用的容器壁的隔离影响；(2)与固体表面直接接触消除了投入液态低温气体(如氮气)的样品周围低温气体的隔离影响，并提供了更好的热传导性及其后更有效的玻璃化。本发明在保存卵母细胞方面的效率高于其它任何文献记载的方法，而且可以相信使用起来更便宜。
一个优选的实施例是，玻璃化/解冻的卵母细胞作为受体可成功地用于高级的胚泡发育的体细胞核移植。这一发现对核移植研究和实践具有重要意义。
以前，Lim等人(Lim et al.，Theriogenology 35：1225-1235(1991))依照冷冻/解冻成熟牛卵母细胞的IVF方法得到了胚泡阶段的胚胎。从那时起，有多个研究小组研究了牛卵母细胞低温保藏的可能性。然而，卵母细胞的存活和其后的胚泡发育保持在0-10％的低水平(Fuku et al.，Cryobiology 29：485-492(1992)；Otoi et al.，Theriogenology 38：711-719(1992)；Otoi et al.，J.Reprod.Dev.41：361-366(1995)；Otoi et al.，Theriogenology 40：801-807(1993)；Dinnyes et al.，Cryobiology 31：569-570(1994)；Otoi et al.，Cryobiology 37：77-85(1998)；Lim et al.，Theriogenology 37：351-361(1992)；Schellander et al.，Theriogenology 42：909-915(1994))。为数不多的研究(Hamano et al.，Theriogenology 38：1085-1090(1992)；Otoi et al.，Theriogenology 38：711-719(1992)；Suzuki et al.，Cryobiology 33：515-524(1996)；Kubota et al.，Mol.Reprod.Dev.51：281-286(1998)；Vajta et al.，Mol.Reprod.Dev.51：53-58(1998))用冷冻-解冻的牛卵母细胞进行胚胎转移已得到了怀孕或出生的结果。令人鼓舞地是，近来玻璃化技术的发展相当大地提高了成功率，据报道，来源于玻璃化成熟牛卵母细胞IVF的胚泡成功率最高可达25％(Vajta et al.，Mol.Reprod.Dev.51：53-58(1998))；和30％(Papiset al.，Theriogenology 51：173(1999)(摘要))。可以相信这些成功率的提高归功于卵母细胞玻璃化过程中冷却率的提高(Vajta et al.，Embryo Transfer newsletter 15：12-18(1997))。然而，根据本发明的方法，低温保藏之后卵母细胞形态学上完整率可高达86％，远远超过以前的结果。
本发明一个优选的实施例提供了一个低温保藏悬浮于玻璃化溶液中卵母细胞的改进方法，其中所述的改进包括将含有卵母细胞的玻璃化溶液的微滴与温度在-150℃至-180℃的固体表面接触，该表面具有良好的热传导性。本发明的另一个实施例提供了一个低温保藏悬浮于玻璃化溶液中卵母细胞的改进方法，其中所述的改进包括将含有卵母细胞的玻璃化溶液的微滴与温度在-150℃至-180℃的固体表面接触，该表面具有的热传导率在20℃时大于大约10W/(m-k)。
本发明的另一个优选的实施例提供了一个卵母细胞玻璃化的方法，该方法由以下步骤组成：(1)将生物材料悬浮于低温保护性平衡介质中，低温保护剂的浓度低于足以防止冰的形成至低温保护性平衡介质的玻璃转变温度；(2)用玻璃化溶液漂洗平衡的卵母细胞，玻璃化介质所具有的低温保护剂浓度足以防止冰的形成至玻璃化介质的玻璃转变温度；(3)将玻璃化溶液微滴中玻璃化溶液漂洗的卵母细胞滴落到一个具有良好热传导性的固体表面上，这个固体表面已经预先被冷却到大约-150℃至-180℃。用于玻璃化的卵母细胞的卵丘细胞在卵母细胞被置于低温保藏液之前可部分地(除了里面的3-5层)或全部地被去除。解冻的玻璃化卵母细胞可以按照技术人员的需要使用，例如，在核移植克隆技术中使用。
本发明的另一个实施例提供了一个提高胚泡发育率的方法。本发明的发明人已经发现在一个加有BSA限定的KSOM培养系统中，通过与卵丘细胞共同培养可明显提高玻璃化卵母细胞的单性生殖发育。本发明的发明人已经发现应用此技术的单性生殖发育可将胚泡发育率提高到32％。
附图简要说明
图1是本发明的固体表面玻璃化(SSV)装置的剖面示意图。
本发明详述
本发明披露了一种低温保藏生物样品，尤其是细胞类物质的新方法，此方法保存的物质在加温后其生物功能性仍被保留。特别是本发明揭示了一个玻璃化和解冻卵母细胞和胚胎的方法。此外本发明还揭示了将体细胞核移植到预先玻璃化的卵母细胞中的方法。
采取本发明低温保藏哺乳动物的卵母细胞可为核移植和体外胚胎生产提供一个稳定的物质来源。本发明提供了一种有效的玻璃化方法以便低温保藏牛卵母细胞用于单性生殖活化、体外受精和核移植的研究和实践。
在本发明的一个优选实施例中，将体外成熟的牛卵母细胞置于39℃加有20％胎牛血清(FBS)的TCM 199的4％亚乙基二醇(EG)里12-15分钟，然后再转移到玻璃化溶液中(35％EG，5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，TCM 199中的0.4M海藻糖和20％FBS)。卵母细胞的玻璃化是以微滴的形式置于预先冷却(-150℃)的金属表面(固体表面玻璃化或SSV)上来完成的。将玻璃化的微滴储藏在液氮里并可立即解冻，或储存2-3周或根据需要储藏更长的时间。
本发明者已经注意到依照本发明对于处理过的用含有BAS或FBS的KSOM培养9-10天的卵母细胞，其玻璃化/解冻的卵母细胞直接的存活率在77％和86％之间。已注意到对于核移植来说，玻璃化卵母细胞支持胚胎的发育与新鲜的卵母细胞相当。
当未将其本身限制于任何特殊的理论时，本发明者揭示出牛卵母细胞玻璃化后相对高的冷冻存活率和胚胎发育可由几个因素导致。固体金属表面玻璃化方法通过与微滴结合就可能获得高冷却率，通过与金属表面直接接触提高热交换率。通过将玻璃化样品直接滴入温暖的溶液中卵母细胞的加温是一样快的。
高成功率也可归因于一些程序的改进，其中一些是基于其他人报告的近期进展(Vajta et al.，Mol.Reprod.Dev.51：53-58(1998))；Martino et al.，Biol.Reprod.54：1059-1069(1996)；Dinnyes et al.，Cryobiology 31：569-570(1994)；Otoi et al.，Cryobiology 37：77-85(1998)；Papis et al.，Theriogenology 51：173(1999)(摘要)；Vincentet al.，Cryo-Lett.8：356-361(1988))。需要明确的是，为了“逃脱”寒冷的破坏，本发明在快速冷却到玻璃化温度和/或从玻璃化温度迅速升温后，是在或接近生理温度时处理溶液中的卵母细胞。
众所周之，牛卵母细胞对寒冷非常敏感(Aman et al.，Biol.Reprod.50：103-110(1994)；Martino et al.，Mol.Reprod.Dev.45：503-512(1996)；Parks et al.，Theriogenology 37：59-73(1992))；据报道，不成熟的卵母细胞(GV阶段)比成熟的卵母细胞更敏感(Fukuet al.，Cryobiology 29：485-492(1992)；Lim et al.，Theriogenology 37：351-361(1992))。Park和Ruffing(Parks et al.，Theriogenology 37：59-73(1992))以及Aman和Park(Aman et al.，Biol.Reprod.50：103-110(1994))，温度冷却到25℃至4℃之间仅1分钟就会损伤中期II纺锤体。像本发明所描述的玻璃化技术，与冷冻方法相比，当卵母细胞暴露于寒冷的临界温度时可允许减少时间，因此对卵母细胞和体外生产的胚胎来说，玻璃化技术优于传统的冷冻方法(Palasz et al.，Biotechnol.Adv.14：127-149(1996)；Martino et al.，Biol.Reprod.54：1059-1069(1996)；Vajta et al.，Embryo TransferNewsletter 15：12-18(1997))。
本发明一个优选的实施例，牛卵母细胞或胚胎的低温储藏是依以下步骤进行的：
在室温或高于室温的生理温度下(如39℃)将卵母细胞或胚胎悬浮于包括4％亚乙基二醇或其它浓度适中的细胞内低温保护剂的平衡培养液中几分钟，该平衡培养液以基础培养液(TCM 199或相似溶液)加上20％胎牛血清，或牛血清白蛋白，或其它任何具有表面活性剂效应的大分子。经过此平衡阶段之后，卵母细胞或胚胎组以玻璃化溶液小滴至少漂洗两遍约几秒钟并滴到一个钢立方体的表面，或其它具有良好的热传导性的固体表面上，通过将其部分地浸入液氮或固氮或浸入其它冷却剂中，该表面已被冷却至大约-150℃C到-180℃或相似的零度以下温度，其中玻璃化溶液包括35％亚乙基二醇(或其它高浓度细胞内低温保护剂)，5％聚乙烯吡咯烷酮(或其它大分子物质)，在基质培养液中的0.4M海藻糖(或其它糖类物质)，和20％胎牛血清，或其它上面描述过的表面活性剂化合物。滴的大小优选为4μl或更小，更好的是3μl或更小，再好的是2μl或更小，最好是1μl或更小，从而允许其瞬间玻璃化。玻璃化小滴可用氮冷却的镊子或其它工具移入1-ml冷冻小瓶或其它适合的容器中。
图1是一个采用本发明的用于低温储藏的固体表面玻璃化设置10的剖面图。一个金属立方体15用金属箔20(例如铝箔)来覆盖，部分地浸入装在容器30里的液氮25中。将含有生物样品(例如卵母细胞)的玻璃化溶液微滴35滴到金属立方体15的表面40上，瞬间被玻璃化。
本发明者发现在单性生殖活化作用后，玻璃化之前卵母细胞周围少数卵丘(丘状)细胞的存在对卵裂和发育速度没有不利影响。尽管核移植实验要求去核之前去除卵丘细胞，但IVF之后，卵丘细胞的存在对获得高受孕率会是一个重要因素。玻璃化/解冻的卵母细胞似乎是更易损的，核移植操作之前去除卵丘细胞需更加小心。
尽管玻璃化卵母细胞的单性生殖活性与对照组相比可能降低，但通过改变培养条件可明显提高单性生殖的活性。例如，通过应用在加有FBS介质的KSOM里与卵丘细胞的共同培养，可进一步增加卵母细胞的单性生殖发育(胚泡发育率最高达32％)。
在氮容器气相储藏阶段，或储藏前后的处理过程中，如果发生温度波动，玻璃化会使体外受精的卵母细胞的发育下降。采用液相储藏可减少这种影响。研究表明任何发育能力的降低不是由于损害了受精作用所致(参见，Martino et al.，Theriogenology 37：59-73(1992)；Kubota et al.，Mol.Reprod.Dev.51：281-286(1998)，研究包括牛；相反的，请参看Ito et al.，Mol.Reprod.Dev.54：81-85(1999)，其中可见在小鼠身上冷冻导致多精入卵阻滞带的失败)。
核移植试验通常利用来自于体内或体外成熟的卵母细胞的受体细胞质。以前，本发明者已经证明冷冻-解冻的卵母细胞同来自于胚胎的卵裂球(囊胚细胞)一起可用于核移植，小牛就是经此过程生产的(Kubota et al.，Mol.Reprod.Dev.51：281-286(1998))。用于牛卵母细胞的这种低温保藏方法明显有助于对核移植的研究和实践，因它消除了季节性波动的影响，而取决于屠宰和卵母细胞运输的时间。
按照本发明披露的方法，绝大多数卵母细胞(大约94％)在玻璃化过程中将存活下来(这一比率与对照组没有不同)，这一比率明显高于早期完成的冷冻试验(参见Ito et al.，Mol.Reprod.Dev.54：81-85(1999)(62％)，和Kubota et al.，Mol.Reprod.Dev.51：281-286(1999)(74％))。成活的卵母细胞能有效地用于核移植过程中，在玻璃化-解冻的卵母细胞中未发现其去核率的降低。通过减少在临界温度区的暴露时间，玻璃化已被假定是有益的，原因在于将卵母细胞瞬间冷却到玻璃化状态使其没有时间产生纺锤体解聚作用(Vajtaet al.，Mol.Reprod.Dev.51：53-58(1998)；Martino et al.，Biol.Reprod.54：1059-1069(1996))。
与新鲜卵母细胞的对照组的比率相比，本发明可提供高融合率，高卵裂率和高胚泡发育率。就本发明者所知，本发明是第一个提出使用低温保藏的卵母细胞作为体细胞核供体的受体，并具有较高的胚泡发育率。同新鲜的受体细胞质相比，早期尝试的开放式牵拉吸管细胞质玻璃化并将其用于卵裂球细胞核移植实验中导致了胚泡发育率的明显降低(34.5％比9.1％)(Peura et al.，Theriogenology 51：211(1999)(摘要))。
简而言之，本发明的低温保藏法可保存卵母细胞，由此获得高的解冻存活百分比，并在活化后显示出高的卵裂率。这种卵母细胞在单性生殖活化作用之后，通过体外受精和核移植，能够发育成在形态上品质良好的胚泡。同对照组以新鲜的卵母细胞作为核受体相比，使用玻璃化-解冻的MII卵母细胞作为核受体，在体细胞核移植的胚胎中可以看到发育比率相似。所产生的核移植的胚胎可用于生产后代。
为了更清楚地说明本发明，下面结合用于同一目的的普通材料和方法给出以下实施例。下列实施例是非限制性的，仅代表本发明的不同方面和特征。
具体实施方式
材料和方法
1.卵母细胞的来源
牛的卵巢是从屠宰场采集的，从成熟开始在大约37℃至39℃的成熟培养基里19小时。根据其形态选择成熟的卵丘卵母细胞复合体。成熟后被低温储藏20-23个小时用于核移植、单性生殖活化和体外受精试验。
2.玻璃化和解冻
用吸管吸上后，成熟的卵母细胞经短时间暴露于0.1％透明质酸酶(Sigma，St Louis，MO，Cat.No.H3506)被部分地(除了3-5内层)或全部地脱去它们的卵丘细胞。用含有Earle氏盐(Gibco，Paisley，Scotland，Cat.No.04101150H)加上20％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco，Hyclone，Cat.No.10099-41)的TCM 199漂洗卵母细胞3遍，然后悬浮于由TCM 199中4％(v/v)亚乙基二醇(EG，Sigma，Cat.No.E9129)加上20％ FBS组成的平衡培养液中在39℃培养12-15小时。平衡之后，5-10个卵母细胞一组的多个组以玻璃化溶液小滴的方式漂洗三遍，25-30秒，玻璃化溶液包括35％亚乙基二醇，5％聚乙烯吡咯烷酮(Sigma，Cat.No.P0930)，TCM 199中的0.4M海藻糖(Sigma，Cat.No.T0167)，和20％FBS。漂洗之后将卵母细胞组置于海藻糖溶液(控制溶液毒性)中，或滴在一个钢立方体的表面，此表面用铝箔覆盖并通过部分地浸入液氮中被冷却到大约-150℃到-180℃。
置于金属表面上的液滴其大小在1微升和2微升之间，并且瞬间被玻璃化。玻璃化小滴可用氮冷却的镊子或其它工具移入1ml冷冻小瓶中以便长期储藏(2-3周)，或将其滴入39℃的0.3M海藻糖溶液中3分钟即刻解冻。依据卵母细胞细胞膜的完整性和透明带来评价卵母细胞的存活率。存活的玻璃化-解冻的卵母细胞用于活化作用，体外受精，或核移植实验。
3.卵母细胞的单性生殖活化
由Susko-Parrish等人(Susko-Parrish et al.，Dev.Biol.166：729-739(1994))所描述的方法经过改进并应用于单性生殖活化。在体外成熟培养基(“IVM”)(对MII卵母细胞解冻后需加30分钟额外培养时间)中总计22小时之后，卵母细胞全部用吸管脱去卵丘细胞。卵母细胞在室温下暴露于钙离子载体A23187(Sigma，Cat.No.C7522)5分钟被活化，后在2.5mM 6-二甲氨基嘌呤(DMPA，Sigma，Cat.No.D2619)中培养3.5小时(Liu et al.，Mol.Reprod.Dev.49：298-307(1998))。将处理的卵母细胞漂洗后，再放入加有0.1％BSA(fraction V，Sigma，A941B)的KSOM中(Liu et al.，Mol.Reprod.Dev.49：298-307(1998))再培养48小时。培养环境包括湿润空气中的5％ CO2，或5％O2，5％CO2和90％N2，温度在39℃。记录形态学上的存活率以及分裂速率。所有分裂的胚胎在加有1％BAS的KSOM培养液中再培养7天。
4.体外受精和培养
玻璃化-解冻的卵母细胞和非玻璃化新鲜对照的卵母细胞用冰冻-解冻的单次射出的公牛精子受精。冰冻-解冻的精子用加有10mM咖啡因和4mg/ml BAS的改进Brackett-Oliphant(Liu et al.，Mol.Reprod.Dev.49：298-307(1998))培养液以离心的方法漂洗两次，然后再悬浮于受精培养液中(加有10μg/ml肝素和4mg/ml BAS的m-BO培养液)。将精子浓度调整到1×107/ml，随后将25个卵母细胞加入到100μl受精培养液液滴中。精子-卵母细胞孵育6小时后，将卵母细胞漂洗并置于加有0.1％BSA的KSOM培养液中在39℃，含有5％O2，5％CO2和90％N2的湿润环境下培养48小时。培育48小时后，用移液管使卵丘细胞脱离开IVF卵细胞并记录分裂率。分裂的胚胎在一个加有1％BSA的KSOM中，在5％O2，5％CO2和90％N2的环境下进一步培养7天。在整个培养过程中，培养液每两天更换一次。
5.核移植
在IVM中20小时后，分裂中期II的玻璃化-解冻的卵母细胞和对照的新鲜卵母细胞一样脱去了卵丘细胞以第一个极体的存在被挑选出来。用一个玻璃针刺穿透明带并把极体和周围的细胞质推出完成去核(Kubota et al.，Mol.Reprod.Dev.51：281-286(1998))。成功的去核用烟酸己可碱(Hoechst)33342对推出的细胞核进行荧光染色来证实。血清饥饿4-6天时，将29-31代的融合的纤维原细胞单个地移植到去核卵母细胞(细胞质)的卵周隙中。与对照的新鲜卵母细胞相对应，来自于玻璃化-解冻卵母细胞的胞质-纤维原细胞复合体融合，并在Zimmerman细胞融合介质(Zimmerman et al.，JMembrane.Biol.67：165-182(1982))中，用两个DC-脉冲(50V/mm，10μ-sec，分别为1sec)经一个BTX200电细胞操纵装置(San Diego，CA)以1-mm间隙电融合室来激活。随后将它们在加有10μg/ml环己酰亚胺(Sigma，Cat.No.C6255)和2.5μg/ml细胞松弛素D(Sigma，Cat.No.C8273)以及0.1％BSA的KSOM培养液中培育1小时，并在含有环己酰亚胺(10μg/ml)和BSA而没有细胞松弛素D的KSOM培养液中再培育4小时。活化后，将胚胎进一步在5％O2，5％CO2和90％N2的环境下在KSOM和0.1％BSA培养液中培育48小时。随后分裂的胚胎被选出，并在加有5％FBS的KSOM中的卵丘细胞单层上在5％CO2的空气的环境中再培育7天。在整个培养过程中，培养液每两天更换一次。将未分裂的卵细胞染色以检查未融合的胞质-纤维原细胞复合体比率。将形态学上高质量的核移植胚泡用VS3a方法玻璃化(Rall et al.，J.Reprod.Fertil.101：681-688(1994)；Dinnyes et al.，Mol.Reprod.Dev.53：318-324(1999))并储藏起来用于未来的胚胎转移目的。做为卵母细胞低温保藏过程的对照，将玻璃化-解冻组的用于核移植实验的一些卵母细胞以前面描述的方法(钙离子载体和DMAP)活化，并用与核移植胚胎相同的方法培育。
6.统计
所有的实验至少重复3遍。评估卵母细胞的发育且所有处理方法均采用卡方(Chi-Square)分析来比较。
实施例1
玻璃化卵母细胞的单性生殖发育
方案：将成熟的卵母细胞玻璃化-解冻并用上面所描述的方法进行单性生殖活化。未冷却时测试玻璃化溶液的毒性，低温保藏之前将卵丘细胞的存在与去除的影响进行比较。此外，在两个分开的试验中，分别在高浓度(20％)和低浓度(5％)O2含量环境中测试活化卵母细胞的培养情况。
结果：单性生殖活化试验的结果展示在表1和表2中。表1展示的是成熟的卵母细胞玻璃化后有和没有卵丘细胞在5％CO2空气环境中单性生殖发育结果的对比。
表1
玻璃化/解冻的成熟牛卵母细胞在
5％CO2 空气中
单性生殖发育情况
| 卵母细胞的处理 | 例数 | 卵母细胞存活率％ | 2a天的分裂率％ | 胚泡发育率(BL)7天 8天 9天％ | 胚泡扩展或孵化率％ |
| 玻璃化有卵丘细胞玻璃化无卵丘细胞未玻璃化 | 426847 | 86b79b100c | 64bc52b81c | 0b 8b 11b6b 6b 6b13b 17b 17b | 8b3b15b |
a基于存活的卵母细胞
b，c带有不同上标的组在同一纵列有显著性差异(P＜0.05)
表2总结了相同处理后胚胎在降低O2-含量(5％)的空气中培养的发育数据。卵母细胞的直接存活率(例如，解冻后在培育阶段开始前没有溶解)在78％和86％之间变化，但是在玻璃化之前，有或没有卵丘细胞的卵母细胞之间没有不同(P＞0.05)。
表2
玻璃化/解冻的成熟牛卵母细胞在
5％O2 ，5％CO2 和90％N2 的
环境中单性生殖发育情况
| 卵母细胞的处理 | 例数 | 卵母细胞存活率％ | 2a天的分裂率％ | 胚泡发育率(BL)7天 8天 9天％ | 胚泡扩展或孵化率％ |
| 玻璃化有卵丘细胞玻璃化无卵丘细胞只有溶液未玻璃化 | 1271188598 | 77b81b94c98c | 56bc56b69bc79c | 11bc 14bc 17bc3b 11b 16b16cd 23cd 30cd27d 32d 32d | 14bc11b25c26b |
a基于存活的卵母细胞
b，c，d带有不同上标的组在同一纵列有显著性差异(P＜0.05)
当进行回顾性对比时，与高O2水平(20％)处理相比，低O2环境培育造成较高的胚泡发育(P＜0.05)。在高O2试验中，活化的非冰冻对照组的分裂率明显高于玻璃化/解冻组(P＜0.05)，但胚泡发育无不同(P＞0.05)。在降低O2的实验中，玻璃化卵母细胞的分裂和发育低于对照组(P＜0.05)，然而，只有溶液处理组在这些参数上没有改变(P＞0.05)。在不考虑培育环境时，有或没有卵丘细胞的玻璃化卵母细胞发育的两者之间相比没有明显不同(P＞0.05)。来自于玻璃化和溶液处理组的胚泡形成似乎比新鲜对照组相比晚大约1天。来自于玻璃化卵母细胞其扩展和孵化的胚泡发育率明显低于对照组(P＜0.05)。
在本研究中，同对照组相比，玻璃化溶液的毒性测试(实施例1)显示出在卵裂和胚泡发育方面没有降低。我们早期的结果显示，对牛卵母细胞来说，亚乙基二醇毒性相对较低(Dinnyes et al.，Cryobiology 31：569-570(1994))，且据其他人报告，玻璃化前在低浓度低温保护剂溶液中逐步平衡是有益的(Papis et al.，Theriogenology 51：173(1999)(摘要))。使用相对低分子量和高穿透率的低温保护剂(亚乙基二醇)，一种粘性增加的化合物(聚乙烯吡咯烷酮)，和一种膜保护性糖(海藻糖)的混合物可确保即使短时间暴露于溶液中也会导致卵母细胞的玻璃化。一种相似的混合物已经成功地用于牛胚胎玻璃化中(Saha et al.，Cryobiology 33：291-299(1996))。在冷却之前解冻之后，很短的暴露于高浓度的亚乙基二醇中可降低其毒性影响。此外，在解冻过程中的毒性影响可采取直接稀释法将其降到最小。
实施例2
受精的玻璃化/解冻卵母细胞的体外发育
方案：玻璃化-解冻的卵母细胞按以上描述的方法在体外受精。基于实施例1的结果，玻璃化之前卵丘细胞仅部分地被去除。对照的卵母细胞用hylauronidase处理，它们周围的卵丘细胞层在受精前同样部分地被去除。玻璃化的卵母细胞既可立即解冻，也可储藏在液氮容器内几天或几周。受精的合子进一步在低O2含量环境中培养。
结果：体外受精的新鲜卵母细胞与玻璃化/解冻的卵母细胞的发育对比如表3所示。经过玻璃化，卵母细胞的直接存活率(85％比93％对照)略有下降。存活卵母细胞的卵裂率并无明显不同(58％比69％，P＞0.05)，然而，玻璃化卵母细胞的胚泡发育率明显低于对照组(20％比35％，P＜0.05)。此外，延长卵母细胞的储藏时间会导致胚泡发育率的进一步降低(11％比20％，P＜0.05)。对扩展和孵化阶段而言，经玻璃化的卵母细胞的发育无明显降低(12％比19％，P＞0.05)。然而，低温储藏卵母细胞对孵化率有消极影响(6％比19％，P＜0.05)。
表3
玻璃化/解冻的成熟牛卵母细胞体外
受精后体外发育情况
| 卵母细胞的处理 | 例数 | 卵母细胞存活率％ | 2a天的分裂率％ | 胚泡发育率(BL)7天 8天 9天％ | 胚泡扩展或孵化率％ |
| 玻璃化/解冻玻璃化/储藏/解冻/未玻璃化 | 17525898 | 85bc81b98cd | 58b62b69b | 15c 19c 20c6b 11b 11b24cd 33d 35d | 12bc6b19c |
a基于存活的卵母细胞
b，c，d带有不同上标的组在同一纵列有显著性差异(P＜0.05)
实施例3
用玻璃化/解冻的卵母细胞克隆胚胎的发育
方案：玻璃化-解冻的卵母细胞被去核，作为受体细胞质用于体细胞核移植。将玻璃化的细胞质与新鲜细胞质的去核，融合，卵裂和胚泡发育率进行对比。作为玻璃化和培养系统的对照组，一些玻璃化-解冻的卵母细胞被单性生殖性地活化并进一步培养。最初两天合子在低O2含量环境中培养，随后在高O2含量环境中与卵丘细胞再共同培养7天。
结果：使用玻璃化卵母细胞与新鲜卵母细胞作为胞质来源的核移植试验数据展示在表4。
表4
来源于新鲜的或玻璃化/解冻的受体卵母细胞的牛核移植胚胎
体外发育情况
| 受体卵母细胞/处理 | 例数 | 卵母细胞存活率％ | 2a天的分裂率％ | 胚泡发育率(BL)a7天 8天 9天％ | 胚泡扩展或孵化率％ |
| 玻璃化/NT新鲜/NT玻璃化/活化 | 106106109 | 62b74b- | 85b90b56c | 17b 21b 27b22b 28b 29b25b 30b 32b | 20bc22b10c |
a基于融合的胚胎或活化的卵母细胞
b，c带有不同上标的组在同一纵列有显著性差异(P＜0.05)
大多数卵母细胞(252/269，94％)在玻璃化过程中存活下来。新鲜的卵母细胞与玻璃化的卵母细胞相比，其去核率没有不同(分别是142/163，87％比127/139，91％；P＞0.05)。从新鲜的或玻璃化/解冻的卵母细胞获得的细胞质的融合率(74％比62％；P＞0.05)也无不同。其后的胚胎发育到卵裂(90％比85％)，胚泡(29％比27％)或孵化的胚泡阶段(22％比20％)统计学上均无差异(P＞0.05)。单性生殖活化的玻璃化/解冻的卵母细胞其卵裂率明显低于核移植胚胎(P＜0.01)，然而，到胚泡阶段的发育率(32％)没有区别。单性生殖活化后到达扩展或孵化阶段的卵母细胞率比核移植后的要低(10％)。
虽然本发明已经参照优选的实施例进行了说明，但是对于本领域技术人员来说，在不偏离本发明附加的权利要求确定的精神和范围的情况下，可以容易地对上述实施方案进行多种修改和/或改进。这里引用的所有文件整体合并于此。
Claims (8)
1.一种用于生物材料玻璃化的方法，所述方法包括：将含有生物材料的离散的，平均体积为10μl或更小的玻璃化溶液的微滴与温度在-150℃至-180℃的基本固定的固体低温表面接触，所述表面具有的热传导率在20℃时大于10W/(m·k)，并将冻结的微滴从所述表面移除。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料是一个细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料是一个牛卵母细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料是牛卵母细胞发育的一个胚胎。
5.根据权利要求1所述的方法，其中
(a)将生物材料悬浮于低温保护性平衡溶液中，所述低温保护性平衡溶液具有的低温保护剂的浓度低于足以防止冰的形成至低温保护性平衡溶液的玻璃转换温度的浓度；
(b)用玻璃化溶液漂洗平衡的生物材料，所述玻璃化溶液具有的低温保护剂的浓度足以防止冰的形成至玻璃化溶液的玻璃转换温度；以及
(c)将用所述玻璃化溶液漂洗的所述生物材料以玻璃化溶液微滴形式滴落到一个固体表面上，所述固体表面为热传导率大于10W/(m·k)的金属，并且其已预先被冷却到-150℃至-180℃；
(d)收集所述经冷冻的含有玻璃化的生物材料的微滴，其中所述生物材料在解冻后保持了形态学和成活力。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述玻璃化的生物材料是一个牛卵母细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述玻璃化的生物材料是牛卵母细胞发育的一个胚胎。
8.根据权利要求3或6所述的方法，其中所述玻璃化的牛卵母细胞是在一个加有胎牛血清的KSOM培养系统里与卵丘细胞共同培养的。
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