CN1300366A - 用于检测血清中抗体的指示条 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测病人血清中抗体的指示条(1),包括一个或几个区域(5),其中固定了一种或几种疾病的抗原。当加入病人血清时,相应抗原结合到相应于该疾病的抗体上,其中所述抗原在随后的反应中成为染色斑点而肉眼可见。为了不仅可测定所述抗体的性质,而且可测定所违抗体的数量,提供了另外的区域(6),其中按照不同浓度固定有人抗体。因此可经过评价产生的染色斑点来评价血清中的抗体浓度。
Description
本发明涉及用于检测病人血清中抗体的指示条，它具有一个或多个固定有一种或几种疾病抗原的区域。当加入病人血清时，各抗原结合到相应于该疾病的抗体上并使该抗体在随后反应中作为染色斑而可见。
这种用于试验的指示条也称为酶免疫测定，用于DE3346795Al中已知的抗体并形成权利要求1的前序部分。其中描述的试验用于疾病的血清学检测，如由病毒，细菌或类似病原体引起的感染。该试验利用了这样的事实：即，当存在疾病时，身体在其血清中形成相应于该病原体抗原的抗体(它们结合到抗原上并使其无害)。可间接推断如果可在该血清中成功地检测到该疾病特异性抗体，那么必然目前或者以前感染了该疾病。由于其操作机制，该试验属于所谓的间接测量方法，因为该试验不直接检测该病原体(抗原)，而是检测身体与该病原体反应产生的特异性抗体。
为了生产这种已知的测试条，应用抗原，即引起各种疾病的病原体的已知蛋白质并将其固定到几个测试区的固相上，特别是硝酸纤维素或聚酰胺薄片上。随后，使未被抗原占据的薄片上的吸收位置饱和。经过将病人血清滴到试验条上进行试验。在病人血清中存在的病原体特异性的抗体与沉积的病原体特异性抗原形成特异性的带，即所谓的抗原抗体反应，Ag-Ab-或者免疫反应。然后，在随后的反应中使抗原结合的抗体肉眼可见，例如经过用特异性的酶偶联物处理并随后加入偶联物中酶的底物和一种染色前体。在薄片上形成清楚可见并较好地附着在薄片上的有色斑点(称为“印迹”，在免疫反应后称为“免疫印迹”)。在每步上述处理步骤后添加一步洗涤步骤去掉多余的试剂。最后以肉眼评价薄片上的染色斑点。含有疾病前或疾病发作中的病原体特异性抗原的区域被染色，而其它区域未被染色。
上述方法和测试条可用于血清的定性检测，但不能定量某些病原体特异性的抗体(因此也不能定量疾病)。人们需要不仅知道现在存在或者过去存在的疾病，而且需要定量存在的抗体。这种知识可有助于了解疾病的严重性和急性程度。
因此本发明的目的是提供一种允许定量血液中存在的抗体的指示条。
为了达到该目的，根据本发明的指示条其特征在于提供固定有不同浓度的人对照抗体的添加区域。这些区域在免疫反应之后的随后的常规(酶)反应中根据存在的抗体数目被染色。经过比较添加区域与抗原区域的颜色(深度)，不仅可测定疾病的类型，而且可定量血清中的抗体，即该疾病的严重性和急性程度。
本发明利用的惊人发现是，染色反应不仅标记了待测液体固定于固相上的含有病人病原体特异性抗体的区域，而且在固相上使用了对照抗体。酶-底物染色反应使病人抗体和对照抗体的染色深度均增加。由于将不同浓度的对照抗体加入到试验条的固相上且酶-底物染色反应形成作为参照抗体各浓度之特征的染色斑点，因而产生了颜色比较标准且由此产生了固定于固相上的抗体浓度的比较标准。经过比较标准区的染色强度与试验区的染色强度可直接测定抗体的量。如果在两个区域存在相同量的抗体则颜色深度相同。如果病人抗体的颜色深度位于沉积的对照抗体浓度的两个染色深度之间，那么病人抗体的量相应于两个浓度之间的一个值。因此，可以监测免疫性，即对病原体的获得性免疫，并测定潜伏疾病的状态或严重性，如传染病，自体免疫疾病，例如，风湿症，过敏反应，肿瘤等。
本发明还使得更好地追踪疾病的动态进展成为可能，因为经过测定按本发明提供的抗体浓度在培养一定时间后可定量测定针对特定病原体的药物效力和/或药物剂量。本发明还提供了定量检测体液中抗体的测量仪器，其中该仪器不仅能在任意地点和任意时间直接读数和通用，而且可廉价地制造。
为实施本发明，优选将特异性抗原(在试验条设计成用于检测一种疾病的情况下)或多种抗原(在试验条设计成用于检测几种疾病的情况下)加到固相上导致抗体结合到固相上。可将几种不同的抗原加到固相上以同时试验几种疾病，例如，不同的传染病。
根据本发明具有优势的实施方案，可加入具有相同亚型特定类型的对照抗体，例如，IgG,IgA,IgM等。以这种方式，该试验可定量检测具体疾病。换句话说，应用某种特定亚型的对照抗体提供检测该疾病的所需确定性标准。经过将标准与不同亚型特异性对照抗体进行比较，也可测定体液中存在的亚型特异性抗体类型。
根据本发明的另一实施方案，经过用诸如亚型特异性免疫球蛋白G型，A型或M型(IgG,IgA,IgM)等的酶偶联物处理固相可检测抗体和对照抗体。以这种方式，按所用的酶偶联物仅标记具有相同亚型特异性类型的那些抗体和对照抗体。经过使用相同亚型特异性类型的对照抗体和酶偶联物可测定待测体液中存在的抗体类型。
根据本发明的另一有优势的实施方案，使用酶底物沉淀染色，优选以四甲基联苯胺为基础的酶底物。这样不仅在标记抗体所在的那些区域，而且在标记的对照抗体所在的那些区域产生在固相上附着良好，稳定且具有高灵敏度的染色斑点。
抗原可以是有机物，特别是蛋白质，糖类，脂肪，核酸等，也可以是无机物。以这种方式，由异型有机和无机物质在体内产生的抗体可结合到固相上。因此，本发明的指示条可用于定量检测例如，针对化学品的免疫性和例如，由化学毒素引起的脓毒的过程。
根据本发明的另一具有优势的实施方案，可采用微量元素作为荧光或放射活性标记。以这种方式，可将试验条用于为测定所测抗体浓度的精确数值而特异性装备的实验室。经过使用分光光度计，电泳装置和/或放射测量装置可进行测量。
根据本发明的指示条的一个具有优势的实施方案，固相制成一种吸收薄片。吸收薄片的表面有利于吸收抗原和对照抗体。沉积物稳定以便本发明的测量条可在优选4℃的环境下储存几个月。
根据本发明的另一具有优势的实施方案，指示待测病原体名称，对照标记和其它标记的数据区可与反应区和/或对照区相联或印在其上。评价测量条时各反应区显示出染色，以便可直接测定一种待测疾病。而且也可直接测定该疾病的严重性，因为对照标记印在对照区上，它显示了加入到各对照区上的对照抗体的不同浓度。这可经过比较由酶底物染色反应引起的反应区的颜色深度与对照区的颜色深度来实现。
适合于检测几种不同病原体的根据本发明用于酶免疫测定的指示条的两个实施方案将在下面参照附图显示的实施方案进行详细描述。所有描述的和/或显示的特征单独或以任意组合代表发明的主体。
图1和2显示了根据本发明用于检测抗体的测量条的可能的实施方案。
根据本发明的测量条1在图1中显示且包括了可买到的具有0.45μm孔径的硝酸纤维素薄片材料2。外测边界线3和鉴定区4印在硝酸纤维素薄片2的测量条1的区域中。另外，排列在另一端的几个抗原区5和抗体区6分别印在左栏和右栏。此外，待测病原体的名称成排排列在左侧抗原区5上面，而指示不同浓度的对照标记，如字母A到H打印在右侧各抗体区6的上面。在待测的8种呼吸道病原体的举例性的实施方案中，左栏包括流感病毒A和B，腺病毒，肺炎支原体，百日咳博德特氏菌，副流感病毒1至3和柯萨奇病毒。
根据本发明的指示条可经过例如，将硝酸纤维素薄片2在磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)中润湿来制备。病原体特异性抗原的溶液使用可买到的蛋白质抗原按本领域已知的方式以5-15ng/μl的浓度制备。
硝酸纤维素薄片2随后夹在常规斑点印迹装置中，例如来自Hofer公司的“SlotBlotter”。
随后，将150μl稀释的蛋白质抗原溶液(相应于大约500ng到1.5μg蛋白质)加入到与硝酸纤维素薄片2左栏相联的抗原区5上。然后将人抗体溶液以均匀增加的浓度加入到硝酸纤维素薄片2右栏抗体区6上。
经过一段时间使蛋白质和人抗体溶液吸收后，在PBS缓冲液中洗涤硝酸纤维素薄片2。
然后用奶粉溶液处理硝酸纤维素薄片以饱和薄片上所有未占据的吸收区。
然后将硝酸纤维素薄片2在PBS缓冲液中连续洗涤3次并随后在室温下真空干燥。
随后将根据本发明的测量条1在边界线3外侧取出。以这种方式形成的测量条1与干燥剂一起融合在薄片上并储存于4℃备用。
医生或实验室可使用测量条，例如，经过用上述奶粉溶液开始处理测量条1以便更新。待试验的病人血清用已知方法在奶粉溶液中稀释并加入到测量条上。它引起的免疫反应是，血清中存在的病原体特异性抗体与左栏中的抗原区沉积的抗原形成特异性带。
吸去未结合的血清组份并使用常规PBS Tween去污剂洗涤测量条1三次。
该步骤之后用任意类型的抗人免疫球蛋白酶偶联物培养，从而标记病原体特异性抗体。酶偶联物的加入也标记加入到测量条右侧的不同人抗体浓度。
接着进行用PBS Tween去污剂的洗涤步骤，其中PBS Tween去污剂更换三次。然后用蒸馏水再漂洗薄片一次以去除去污剂。
经过每薄片使用1mg可买到的以四甲基联苯胺为基础的底物产生染色斑，该底物可从Kirke-Gaard和Perry公司以产品编号50-77-02获得。
用蒸馏水彻底漂洗测量条1终止染色过程。
对于8种呼吸道病原体的实施方案，测量条1左栏排列的抗原区5表现出不同的染色斑，其深度取决于血清中存在的各病原体特异性抗体的数量。测量条1右栏排列的抗体区6表现出颜色深度均匀增加的染色斑，它由不同浓度的所加人抗体产生。
病人血清中存在的抗体量的结果及由此得到的疾病状态的结果可从测量条1左栏区域5和右栏区域6的颜色深度之间的肉眼颜色比较得出。如果左侧抗原区5的一个或几个颜色，例如标记的“腺病毒”区，与右侧抗体区6的一个颜色，例如对照标记F区，相同，那么病人血清中存在的腺病毒抗体浓度与颜色深度具有相应增加的抗体区6的抗体浓度相对应。如果左侧区5的一个颜色深度，例如标记的“HSV”区，介于两个相邻右侧区6的各颜色深度，例如对照标记D和E区，之间，那么病人血清中的单纯疱疹病毒抗体浓度值介于相应区域6D和F的两个浓度之间。
图2显示了一种极窄的测量条，它包括上下排列的鉴定区4a及几个抗原区5和抗体区6。在该实施方案中，抗原区5和抗体区6特别小，例如5×3mm，使得进行试验时只需极少量的病人血清。待测病原体的名称印在各抗原区5上面，各对照标记，例如字母A至D之一表示不同的浓度，“-”表示对照检验区(无抗体)可印在各抗体区6上面。
Claims (6)
1、一种用于检测病人血清中抗体的指示条(1)，包括一个或几个区域(5)，其中固定了一种或几种疾病的抗原，其中当加入病人血清时相应抗原结合相应于该疾病的抗体，且其中这些抗体在随后的反应中成为染色斑点而肉眼可见，其特征在于添加具有以不同浓度固定的人对照抗体的区域(6)。
2、根据权利要求1的指示条，其特征在于将至少一种特异性抗原加入到作为固定对照抗体之装置的固相(2)上。
3、根据权利要求1或2的指示条，其特征在于加入的对照抗体具有相同亚型特异性类型，如IgG,IgA,IgM等。
4、根据权利要求1至3之一的指示条，其特征在于使用酶偶联物进行随后的反应。
5、根据权利要求1至4之一的指示条，其特征在于优选使用以四甲基联苯胺为基础的酶底物作为随后的沉淀染色反应中的底物。
6、根据权利要求1至5之一的指示条，其特征在于在随后的反应中使用荧光或放射活性标记物质，其中在后一种情况中“染色斑点”位于非光学光谱范围内。
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