CN1296475C - 一种碱性低温蛋白酶及其制备方法 - Google Patents
一种碱性低温蛋白酶及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1296475C CN1296475C CNB2005100626001A CN200510062600A CN1296475C CN 1296475 C CN1296475 C CN 1296475C CN B2005100626001 A CNB2005100626001 A CN B2005100626001A CN 200510062600 A CN200510062600 A CN 200510062600A CN 1296475 C CN1296475 C CN 1296475C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liquid
- enzyme
- damping fluid
- tris
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种碱性低温蛋白酶及其制备方法，涉及一种细菌和从细菌得到的蛋白酶。提供一种从南极深海泥样获得并经分离成为纯培养物的菌株海杆菌属R2、从R2菌株得到的碱性低温蛋白酶及其制备方法。保藏编号为CCTCC NO：M205002。其步骤为粗酶液制备：将菌株R2活化后接于培养基，培养至指数生长期，再转接于培养基中，加氨苄青霉素和天冬酰胺，培养，发酵，离心；粗酶液加硫酸铵离心取上清，离心取沉淀，在缓冲液中透析；酶液离心，冷冻干燥，再上样洗脱，收集酶活性部分冷冻干燥；重溶于缓冲液中并透析，上样洗脱，合并活性部分，冷冻干燥；样品溶于缓冲液中并透析分离纯化，收集有活力部分冷冻干燥，即为纯酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌和从细菌得到的蛋白酶，尤其是涉及一种从海杆菌属(Marinobactersp.)R2菌株和从该细菌得到的碱性低温蛋白酶及其制备方法。
背景技术
已有的碱性蛋白酶可从多种途径获得，其中由微生物获得碱性蛋白酶以及碱性蛋白酶在洗涤剂等行业的应用已有一些报道，例如1913年Rohm首先将胰岛蛋白酶用于洗涤浸泡剂，1945年Dr.Jaag(瑞士)等发现了微生物碱性蛋白酶。而用于洗涤剂的碱性蛋白酶商品也越来越多，例如美国GENENCOR国际公司的Properase CT，丹麦NOVO公司的Savinase 4.OT碱性低温蛋白酶等。公告号为CN1109750C的专利提供一种新型碱性低温蛋白酶、制造方法、应用和产生该蛋白酶的微生物，涉及一种新的黄杆菌属未知种菌株YS9412-130，由该菌株或其突变体产生的新型碱性低温蛋白酶，该蛋白酶在低温条件下具有低活化能和高活性比，能有效降解蛋白类；酶基因编码由792个核苷酸组成，与丝氨酸蛋白酶有不同程度的同源性，但不同于已有丝氨酸蛋白酶家族，属一种新生型丝氨酸蛋白酶家族。
发明内容
本发明旨在提供一种从南极深海泥样获得并经分离成为纯培养物的菌株海杆菌属(Marinobacter sp.)R2。
本发明的另一目的在于提供一种从海杆菌属R2菌株得到的碱性低温蛋白酶及其制备方法。
本发明所说的菌株海杆菌属(Marinobacter sp.)R2于2005年1月5日保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M205002。样品的来源为南极深海900米深处的泥样。菌株的筛选分离和培养方法为将泥样用灭菌海水按10、100、1000的稀释倍数稀释后，涂布于筛选培养基，于20℃培养一周，挑选出具有透明圈的单菌落，进一步划线分离，取单菌落镜检为纯种后于一70℃超低温冰箱中保藏。所说的培养基如下：
1、改良的2216E培养基：蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，自然陈海水，pH7～8。
2、MM培养基：(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，琼脂1.5％～2.0％，蒸馏水配制。
3、酪蛋白培养基：KH2PO40.04％，Na2HPO40.1％，NaCl0.01％，ZnSO40.002％，CaCl20.0002％，酪素0.4％，酪素水解氨基酸0.005％，琼脂1.5％～2.0％，蒸馏水，pH7.0～7.2。
4、筛选培养基：脱脂奶粉1％，酵母膏0.2％，琼脂粉1.5％，自然陈海水，pH7～8。
5、发酵培养基：酪蛋白1％，酵母膏0.2％，KH2PO40.04％，Na2HPO40.1％，ZnSO40.002％，CaCl20.0002％，自然陈海水，pH7～8。
菌株海杆菌属R2经下列方法鉴定后属于海杆菌属(Marinobacter sp.)的一个新种。
1、16S rDNA序列分析结果表明R2菌株属于海杆菌属(Marinobacter sp.)。
2、DNA-DNA杂交实验结果显示，菌株R2的基因组DNA与Marinobacter，hydrocarbonoclasticus同源性仅为70％。
3、形态学特征及抗性试验：油镜下观察，R2细胞呈杆状，单个排列。革兰氏染色为阴性，菌体大小为10～15μm×2～3μm。菌落呈圆形，表面粗糙无光泽，边缘隆起，有明显的皱褶，颜色为乳白色，不透明。在酪蛋白培养基平皿上可产生明显的透明圈。抗生素抗性实验表明R2菌株对氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素均具有抗性。
本发明所说的菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶具有以下酶学性质：
1、菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶的最适反应温度为20℃，在15～25℃范围内酶活力高，表现出明显的低温蛋白酶特性。菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶在0～20℃内活力较为稳定，30℃下保温24h后酶活降为8.3％，40℃保温1h后酶活剩余7.6％，50℃以上10min基本丧失全部活力，符合低温蛋白酶对热敏感的特性。Ca2+在一定程度上提高了酶的稳定性。
2、菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶的最适pH为9～10，属于碱性蛋白酶。
3、菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶能够降解胰凝乳蛋白酶的特异性底物N-Succ-(Ala)2-Pro-Phe-pNA和N-Succ-(Ala)2-Pro-Leu-pNA，具有类胰凝乳蛋白酶活性。
4、螫合剂EDTA和丝氨酸蛋白酶专一抑制剂Phenylmethylsufonyl fluoride(PMSF)、4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride(AEBSF)对菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶显示出较强的抑制作用，而半胱氨酸蛋白酶专一抑制剂E-64和天冬氨酸蛋白酶专一抑制剂pepstatin A对此酶均无抑制作用。表明菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶。
5、高浓度的变性剂，包括十二烷基硫酸钠(SDS)，尿素，盐酸胍，二巯基丁二醇(DTT)，巯基乙醇对菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶均有较为明显的抑制作用。
6、Ca2+、Mn2+、Cu2+对菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶有较为明显的激活作用，而Cd2+、Co2+则能抑制酶活。
本发明所说的菌株海杆菌属R2碱性低温蛋白酶的制备方法步骤为：
1)粗酶液制备：将菌株R2用无机盐培养基进行活化后转接于液体酪蛋白培养基中，在5～30℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，在液体发酵培养基中加入氨苄青霉素，在5～25℃温度下振荡培养，1～4天后加入天冬酰胺，继续振荡培养至培养基中的固体酪蛋白颗粒消失且培养液呈淡乳黄色即为产酶高峰期，将发酵液离心，取上清，得粗酶液；
2)粗酶液加硫酸铵至30％～40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至70％～80％饱和度，离心取沉淀，在Tris-HCl缓冲液中透析过夜；
3)将透析过后的酶液离心，上清液用冷冻干燥进行浓缩，再上样于已用Tris-HCl缓冲液预平衡过的DEAE-52柱，洗脱，收集酶活性部分冷冻干燥；
4)把冷冻干燥后的酶粉重溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，然后上样于用同一缓冲液平衡的Sephadex G-75柱，并用相同的缓冲液洗脱，合并活性部分，冷冻干燥；
5)将冻干后的样品溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，再分离纯化，收集有活力部分冷冻干燥，即为纯酶。
在步骤1)中，活化菌种时的无机盐培养基选自MM培养基：(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO4 0.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，琼脂1.5％～2.0％，蒸馏水配制。发酵时加入氨苄青霉素终浓度为0.05％，天冬酰胺的终浓度为0.005％。
在步骤3)中，所说的洗脱采用含0～2mol/L NaCl线性梯度的Tris-HCl缓冲液洗脱。
在步骤5)中，所说的分离纯化时所用的缓冲液采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0～9.0。所说的分离纯化采用电泳纯化，电泳纯化的条件为：分离胶浓度14％，柱高5cm，电压300V；浓缩胶浓度为4％，柱高1cm，电压240V。
蛋白酶活力测定采用Folin酚试剂显色法进行。
菌株海杆菌属R2所产碱性低温蛋白酶的特性及优点是：
1、R2菌株所产生的蛋白酶属于碱性低温蛋白酶，其最适反应温度为20℃，是现有低温蛋白酶中最低的，具有良好的应用价值。
2、大多数的蛋白酶能被Cu2+、Ag+、Pb2+抑制，而菌株R2所产的蛋白酶不但对Ag+、Pb2+不敏感，反而能被Cu2+激活，表明该酶具有特殊的机制。
3、R2菌株对多种抗生素具有抗性，这一点在应用中尤其具有优势，因为在发酵中加入抗生素可以抑制其他菌的污染，从而简化步骤，节约成本。
4、R2菌株可以在常温下直接发酵产生低温蛋白酶，但低温下发酵的活力更高。这一特性在实际应用中也可以节约能源、设备等成本投入。
具体实施方式
实施例1
制备粗酶液，将保藏的菌株R2用无机盐培养基进行活化后转接于液体酪蛋白培养基中，培养基选自MM培养基：(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，琼脂2.0％，蒸馏水配制。在20℃的条件下振荡培养至指数生长期。将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，并且加入氨苄青霉素，终浓度为0.05％，在15℃温度下振荡培养，2天后加入天冬酰胺，天冬酰胺的终浓度为0.005％，继续振荡培养，观察培养基中的固体酪蛋白颗粒降解情况，颗粒消失且培养液呈淡乳黄色即为产酶高峰期。将发酵液离心，取上清，得粗酶液。在粗酶液中加硫酸铵至32％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至75％饱和度，离心取沉淀，在Tris-HCl缓冲液中透析过夜。将透析过后的酶液离心，上清液用冷冻干燥进行浓缩，然后上样于已用Tris-HCl缓冲液预平衡过的DEAE-52柱，用含0～2mol/L NaCl线性梯度的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集酶活性部分冷冻干燥。把冷冻干燥后的酶粉重溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，然后上样于用同一缓冲液平衡的Sephadex G-75柱，并用相同的缓冲液洗脱，合并活性部分，冷冻干燥。将冻干后的样品溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，分离纯化时所用的缓冲液采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0。利用SDS-PAGE制备电泳仪进行分离纯化。电泳纯化的条件为：分离胶浓度14％，柱高5cm，电压300V；浓缩胶浓度为4％，柱高1cm，电压240V。洗脱液为Tris-HCl缓冲液。收集有活力部分冷冻干燥，即为纯酶。蛋白酶活力的测定采用Folin酚试剂显色法进行。
实施例2
与实施例1类似，其区别在于制备粗酶液时，培养基选自MM培养基：(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％琼脂1.5％，蒸馏水配制。在15℃的条件下振荡培养至指数生长期。将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，并加入氨苄青霉素，在25℃温度下振荡培养，3天后加入天冬酰胺，在粗酶液中加硫酸铵至35％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至72％饱和度，离心取沉淀，在Tris-HCl缓冲液中透析过夜。将冻干后的样品溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，分离纯化时所用的缓冲液采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5。
实施例3
与实施例1类似，其区别在于制备粗酶液时，培养基选自MM培养基：(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，琼脂1.8％，蒸馏水配制。在5℃的条件下振荡培养至指数生长期。将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，并加入氨苄青霉素，在20℃温度下振荡培养，1天后加入天冬酰胺，在粗酶液中加硫酸铵至30％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至80％饱和度，离心取沉淀，在Tris-HCl缓冲液中透析过夜。将冻干后的样品溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，分离纯化时所用的缓冲液采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，pH9。
实施例4
与实施例1类似，其区别在于制备粗酶液时，培养基选自MM培养基：(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，琼脂1.5％，蒸馏水配制。在25℃的条件下振荡培养至指数生长期。将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，并加入氨苄青霉素，在30℃温度下振荡培养，4天后加入天冬酰胺，在粗酶液中加硫酸铵至36％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至77％饱和度，离心取沉淀，在Tris-HCl缓冲液中透析过夜。将冻干后的样品溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，分离纯化时所用的缓冲液采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8。
实施例5
与实施例1类似，其区别在于制备粗酶液时，培养基选自MM培养基：(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，琼脂1.7％，蒸馏水配制。在30℃的条件下振荡培养至指数生长期。将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，并加入氨苄青霉素，在5℃温度下振荡培养，3天后加入天冬酰胺，在粗酶液中加硫酸铵至40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至70％饱和度，离心取沉淀，在Tris-HCl缓冲液中透析过夜。将冻干后的样品溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，分离纯化时所用的缓冲液采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5。
Claims (1)
1.一种从海杆菌属菌株R2得到的碱性低温蛋白酶的制备方法，海杆菌属(Marinobactersp.)菌株R2已于2005年1月5日保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M205002，其特征在于其步骤为：
1)粗酶液制备：将菌株R2用无机盐培养基进行活化后转接于液体酪蛋白培养基中，在5～30℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，并加入氨苄青霉素，在5～25℃温度下振荡培养，1～4天后加入天冬酰胺，继续振荡培养至培养基中的固体酪蛋白颗粒消失且培养液呈淡乳黄色即为产酶高峰期，将发酵液离心，取上清，得粗酶液，活化菌种时的无机盐培养基选自MM培养基：(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO40.7％，KH2PO4 0.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，琼脂1.5％～2.0％，蒸馏水配制，发酵时加入的氨苄青霉素终浓度为0.05％，天冬酰胺的终浓度为0.005％；
2)粗酶液加硫酸铵至30％～40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至70％～80％饱和度，离心取沉淀，在Tris-HCl缓冲液中透析过夜；
3)将透析过后的酶液离心，上清液用冷冻干燥进行浓缩，再上样于已用Tris-HCl缓冲液预平衡过的DEAE-52柱，采用含0～2mol/L NaCl线性梯度的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集酶活性部分冷冻干燥；
4)把冷冻干燥后的酶粉重溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，然后上样于用同一缓冲液平衡的Sephadex G-75柱，并用相同的缓冲液洗脱，合并活性部分，冷冻干燥；
5)将冻干后的样品溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，再分离纯化，收集有活力部分冷冻干燥，即为纯酶，分离纯化时所用的缓冲液采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0～9.0，分离纯化采用电泳纯化，电泳纯化的条件为：分离胶浓度14％，柱高5cm，电压300V，浓缩胶浓度为4％，柱高1cm，电压240V。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100626001A CN1296475C (zh) | 2005-03-28 | 2005-03-28 | 一种碱性低温蛋白酶及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100626001A CN1296475C (zh) | 2005-03-28 | 2005-03-28 | 一种碱性低温蛋白酶及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1670187A CN1670187A (zh) | 2005-09-21 |
| CN1296475C true CN1296475C (zh) | 2007-01-24 |
Family
ID=35041627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2005100626001A Expired - Fee Related CN1296475C (zh) | 2005-03-28 | 2005-03-28 | 一种碱性低温蛋白酶及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1296475C (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104946573B (zh) * | 2015-07-16 | 2017-11-10 | 青岛农业大学 | 一种产低温碱性蛋白酶的菌株 |
| CN114787195B (zh) * | 2019-12-27 | 2024-01-12 | 深圳市天道医药有限公司 | 一种肝素酶iii的制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1280186A (zh) * | 2000-08-15 | 2001-01-17 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种新型低温碱性蛋白酶、制造方法 、应用和产生该蛋白酶的微生物 |
-
2005
- 2005-03-28 CN CNB2005100626001A patent/CN1296475C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1280186A (zh) * | 2000-08-15 | 2001-01-17 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种新型低温碱性蛋白酶、制造方法 、应用和产生该蛋白酶的微生物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1670187A (zh) | 2005-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pathak et al. | Alkaline protease production, extraction and characterization from alkaliphilic Bacillus licheniformis KBDL4: a Lonar soda lake isolate | |
| Li et al. | Flocculation mechanism of the actinomycete Streptomyces sp. hsn06 on Chlorella vulgaris | |
| Ravindran et al. | Solid-state fermentation for the production of alkaline protease by Bacillus cereus 1173900 using proteinaceous tannery solid waste | |
| Feby et al. | Sponge-associated bacteria of Lakshadweep coral reefs, India: resource for extracellular hydrolytic enzymes | |
| Wang et al. | Screening and characterization of the alkaline protease isolated from PLI-1, a strain of Brevibacillus sp. collected from Indonesia’s hot springs | |
| Cavello et al. | Study of the production of alkaline keratinases in submerged cultures as an alternative for solid waste treatment generated in leather technology | |
| Ferraz et al. | Xanthomonas axonopodis pv. eucalyptorum pv. nov. causing bacterial leaf blight on eucalypt in Brazil | |
| CN116121223A (zh) | 具有聚酯降解活性的酯酶突变体及其应用 | |
| CN1296475C (zh) | 一种碱性低温蛋白酶及其制备方法 | |
| Hashim et al. | Characterization of marine bioflocculant-producing bacteria isolated from Biofloc of Pacific Whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei culture ponds | |
| Alrumman et al. | Isolation of thermoalkalophilic-α-amylase producing bacteria and optimization of potato waste water medium for enhancement of α-amylase production | |
| CN108018276A (zh) | 一种深海细菌角蛋白酶及其编码基因、酶蛋白生产工程菌和应用 | |
| JP2013027374A (ja) | 乳脂肪分解能を有する南極産担子菌酵母及びその利用方法 | |
| Tanasupawat et al. | Characterization of Virgibacillus strain TKNR13-3 from fermented shrimp paste (ka-pi) and its protease production | |
| KR101509326B1 (ko) | 유기물 및 엔도설판 분해능이 우수한 미생물 제제 및 그 제조방법 | |
| Singh et al. | Optimization of fermentative production of keratinase by Bacillus subtilis strain S1 in submerged state fermentation using feather waste | |
| Narihiro et al. | Activity and phylogenetic composition of proteolytic bacteria in mesophilic fed-batch garbage composters | |
| Shahbazi et al. | A novel low molecular weight extracellular protease from a moderately halophilic bacterium Salinivibrio sp. strain MS-7: production and biochemical properties | |
| CN102031236A (zh) | 一种耐热N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96及其编码基因与应用 | |
| WO2006054595A1 (ja) | 新規な高アルカリプロテアーゼ及びその利用 | |
| Urzo et al. | Screening and identification of polyester polyurethane-degrading fungi | |
| Ravishankar et al. | Optimal conditions for production of extracellular alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis strain AKRS3 | |
| Yang et al. | Family-level diversity of extracellular proteases of sedimentary bacteria from the South China Sea | |
| Poomima et al. | A novel laccase producing Brevundimonas sp. MVSP from paper and pulp industry waste water | |
| CN102206657A (zh) | 一个基因及其在喹啉污染物处理上的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070124 Termination date: 20170328 |