CN1296413A - 调节应答于基因毒物的细胞因子释放的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了以前未知的、应答于基因毒物的细胞因子释放机制,以及以该机制为基础的治疗和诊断的方法和技术。该机制涉及DNA－蛋白激酶对损伤DNA的识别和随后的能导致细胞因子释放的底物磷酸化。本发明介绍了调节DNA－蛋白激酶活性并因而调节应答于基因毒物的细胞因子释放的方法。本发明还公开了检测DNA－蛋白激酶活性的试验,后者可用于监测这种调节作用。

Description

调节应答于基因毒物的细胞因子释放的组合物和方法
                相关临时申请的交叉引用本申请根据35 USC§119(e)要求1998年2月4日提交的美国临时专利申请No.60/073,640的优先权。
                      发明领域
本发明涉及细胞因子和基因毒物。更具体地说，本发明涉及能控制例如调节细胞在应答于接触一种或多种基因毒物时的细胞因子释放的组合物和方法。
                      发明背景
A．基因毒物
本领域众所周知，基因毒物是能直接或间接导致或诱导DNA损伤的那些化合物或处理如热或辐射。这种损伤可导致突变、细胞周期停止和/或细胞死亡。这种损伤可以是针对核酸碱基或针对糖-磷酸骨架，或者可以是DNA链的单链或双链断裂。突变在发生时，它是DNA序列中的遗传改变，或是能导致细胞功能遗传改变的DNA修饰图谱。
基因毒物被发现在环境中为天然组分如紫外线或电离辐射、或食物中的天然污染物如黄曲霉毒素、或人为的污染如香烟或工业烟雾中的苯并芘。基因毒物也可用于药学和健康相关的目的。例如，许多抗癌的放疗和化疗是基因毒物。与此类似，紫外线是人和动物接触最多的基因毒物，它可用于有益的目的如制革。此外，光或电离辐射可与光敏感的药物组合使用，用于皮肤病学和抗癌治疗以及用于血液灭菌。
对基因毒物的生物应答之一是细胞周期的停止，从而为进行DNA修复提供足够的时间。这种修复可能成功也可能不成功，它依赖于以下因素：细胞中的DNA修复酶的水平、DNA损伤的程度和类型等等。细胞周期的停止在防止由不经修复的细胞分裂导致的遗传物质急性损伤中起重要作用。如果损伤是不可修复的，细胞就启动凋亡应答，即细胞程序性死亡途径。这种能够导致细胞周期停止和/或凋亡的细胞内分子信号的一般过程最近已由P.Herrlich,C.Blattner,A.Kneber,K.Bender和H.Rahmsdorf在“基因表达诱导中的基因毒物的核和非核靶，酵母、啮齿类动物、人和植物中的共有原则”，Biolongical Chemistry，378卷，1217-1229页，1997；和J.Y.J.Wang在“针对DNA损伤的细胞应答”，《当代细胞生物学评论》，10卷，240-247页，1989进行了综述。
B．基因毒物的长期影响…DNA的突变
基因毒物的长期影响是DNA中的突变，这发生在DNA修复不成功时。这些突变是DNA序列中可遗传的改变，并且是人类致癌过程中的一个基本因素。并不清楚从突变固定即DNA改变的永久建立到癌症发展的所有步骤。多数人类癌症的一个特征是在与基因毒物接触和癌症发展的时间之间有一个长期的、多年的潜伏期。事情的确是这样，尽管突变在接触基因毒物后就迅速固定。被称为肿瘤起始的含有突变细胞的组织的正在进行的改变受到基因毒物诱导的细胞因子的促进，导致肿瘤的出现。
C．基因毒物的短期影响…细胞因子的释放
基因毒物在动物和人中的一个重要的短期影响是系统性的并涉及组织应答包括红斑、炎症、发烧、抗原特异的免疫抑制和其他生理影响。这些影响由细胞因子介导(综述见T.Luger和T.Schwarz，“上皮细胞来源的细胞因子”，Skin Immune System,J.D.Bos编辑，CRC Press Inc.,Boca Raton,Fla,1990,pp257-291)。本发明与这些以细胞因子为基础的针对基因毒物的应答一致。
本领域众所周知，细胞因子是大的多种多样的蛋白家族，它们由一个细胞释放，影响其他细胞和/或其自身的活性。细胞因子的水平通常受到对细胞功能干扰的应答的调节，并用来调节与基因毒物接触后组织、器官系统和全部有机体的应答和稳态。
已知细胞因子不是单个释放，而是以群体方式释放，从而产生对一种基因毒物应答的特征性名单。例如，由阳光中紫外线(基因毒物)引起的晒伤同时诱导：(a)能导致发烧的白介素-1(IL-1)的表达，(b)能活化肝功能的白介素-6(IL-6)，(c)能诱导炎症的肿瘤坏死因子(TNFα)，它能引起局部的抗原特异性的免疫抑制和激活潜伏的病毒，(d)能诱导抑制性T细胞的白介素-10(IL-10)，(e)细胞间粘附分子1(ICAM-1)的短暂降低接着增加，ICAM-1控制淋巴细胞的浸润，以及(f)γ干扰素(IFN-γ)的降低，IFN-γ调节免疫应答以及多种其他细胞分子。
至于细胞外信号，最重要的细胞因子是TNFα和IL-1，因为它们不仅能产生它们自身的生理应答，而且能诱导其他远距离的细胞表达细胞因子。控制由基因毒物产生的这种以细胞因子为基础的细胞外信号是本发明的主要目的之一。
细胞因子作用的最普通的机制是通过它们从一个细胞释放并迁移到其他细胞。但在某些场合，一种细胞因子可通过展示在损伤细胞表面来影响细胞外信号。相应地，用于此处，术语“细胞因子释放”和“细胞因子产生”被用来包括细胞因子从一个细胞实际释放和在细胞表面的细胞外展示一种细胞因子所产生的细胞外信号。这些术语也被用来广泛地包括任何能导致细胞外细胞因子信号增加的细胞机制，包括但不限于一种细胞因子的从头合成、前体加工、细胞内运输、细胞外解离和表面展示。
D．本领域对基因毒物作用机制的误解(1)错误的严格二分理论
直至今天，本领域的技术人员仍认为，DNA的损伤导致细胞周期的立即停止，后者能导致与基因毒物接触后DNA突变的固定或细胞凋亡应答。这个原理已由L.H.Hartwell和M.B.kastan在“细胞周期控制和癌症”，《科学》266卷，1821-1828页，1994中介绍。
另一方面，细胞因子的诱导被认为是细胞膜损伤而产生的结果，即因细胞核移出的靶损伤而产生的结果。该原理已由P.Bamer和M.Karin在“核因子к6：慢性炎症疾病中的关键转录因子”《新英格兰医学杂志》336卷，1066-1071页中介绍。
如下文的讨论，与本发明一致，已经发现这种观点，即在(a)导致细胞内信号的DNA(核)损伤的影响与(b)导致细胞外信号的膜(胞质)损伤之间存在严格的区分，是不正确的。事实上，基因毒物接触造成的DNA损伤也可通过细胞因子的产生而导致细胞外信号。
而且，也与本发明一致，已经发现通过这种机制产生细胞因子需要DNA的蛋白激酶。结果，基因毒物接触引起的细胞因子产生可通过控制DNA一蛋白激酶的水平和/或活性来控制。这种控制机制是高效的，但以前没有被了解和应用。
(2)导致错误的严格二分理论的证据
传统上认为细胞因子的诱导仅是因为细胞膜的改变，这种观点的证据非常有力。已经建立了导致能激活细胞因子基因表达的几种蛋白活化的途径。所有这些途径都由位于细胞外膜的蛋白激酶开始，并且这些蛋白激酶多数与一种跨膜蛋白的胞质内部分有关，而这种跨膜蛋白的细胞外部分是一种细胞受体(Y.Devary，R.Gottlieb，T.Smeal和M.Karin在“哺乳动物紫外线应答由Src酪氨酸激酶引发”《细胞》71卷，1081-1091页，1992中综述)。
这些蛋白激酶被细胞膜上的事件激活，离开细胞核，活化另外的胞质激酶，后者积聚成基因活化因子如AP-1和NFкB的磷酸化系统。这些修饰或释放的基因活化因子的DNA结合位点通常见于细胞因子编码基因的启动子区域。例如，很多这种结合位点见于TNFα基因的启动子序列，如S.Takashiba,L.Shapira，S.Amar和T.Van Dyke在“人TNFα启动子区域的克隆和分析”《基因》131卷，307-308页，1993中的介绍。因此可以这样假定，这些膜激活因子与其细胞因子基因启动子区域上的结合位点的结合通过这样一种途径，即细胞膜上改变导致细胞因子表达的改变。
严格二分理论的进一步的证据来自最近的一些报道，它们证明基因毒物例如UV能直接使细胞表面受体三聚体化并激活能启动据推测能导致信号传导和基因表达的级联反应的激酶。见I.Warmuth,H.Harth,M.Matsui,N.Wang和V.De Leo，“紫外线辐射诱导表皮生长因子受体的磷酸化”《癌症研究》54卷，374-376页，1994；和C.Rosette和M.Karin，“紫外线和渗透压：通过多种生长因子和细胞因子受体激活JNK级联反应”《科学》274卷，1194-1197页，1996。
但最有力的证据来自研究得最彻底的系统---紫外线(UV)辐射后细胞因子释放。见T.Schwarz和T.Luger，“UV辐射对表皮细胞因子产生的影响”《Journal of Photochemistry and Photobiology，B：Biology》4卷，1-13页，1989。许多细胞因子如IL-1、IL-6、IL-10、TNFα、ICAM-1和IFNγ已知在UV处理后的同时，其基因表达(转录)和释放的水平会改变。
利用该系统，进行了一些实验，这些实验被认为能(a)最终证明基因活化完全依赖于细胞膜上的事件，并(b)排除DNA作为细胞因子活化的一个靶。见Y.Devary,C.Rosette,J.Didonato和M.KariN,“NFкB被紫外线激活不依赖于核信号”《科学》261卷，1442-1445页，1993和M.Simon,Y.Aragane,A.Schwarz,T.Luger和T.Schwarz，“在无细胞细胞质中UVB光诱导核因子кB(NFкB)不依赖于染色体DNA损伤”，《Joumal of Investigative Dermatology》102卷，422-427页，1994。
在这些被广泛引用的实验中，细胞被无核化(化学和物理处理以除去核)，产生的胞质体用UV辐射。尽管没有核(和基因组DNA)，仍然检测到基因转录增强子NFкB的活化。
也许正因为如此，这些实验在本领域的技术人员中导致了一个广泛的共识，即基因毒物处理后细胞因子基因表达的诱导不依赖于DNA损伤，而完全依赖于细胞膜上的事件。例如，G.Vilie,A.Tanew-Ilitschew和R.Tyrrell在“UVA辐射产生的氧化压力对人皮肤成纤维细胞中NFкB的活化”，Photochemistry and Photobiology，62卷，463-468页，1995，中总结道：“但是，NFкB在去核细胞中的UVC辐射依赖的活化是事实，而UVB辐射依赖的活化显示在无核细胞抽提物中发生。因此至少对于这两种处理物，核不参与活化途径”。
还存在一些证据表明，DNA损伤可能是诱导细胞因子基因表达的起始事件。这些报告显示：细胞因子基因表达的剂量应答关系在DNA修复缺陷的细胞中转变成针对较低的基因毒物剂量(见B.Stein，H.Rahmsdorf. A.Steffen,M.Litfin和P.Herrlich，“UV诱导的DNA损伤是Ⅰ型人免疫缺陷病毒、胶原酶c-fos和金属硫蛋白的UV诱导表达中的一个中间步骤”《分子和细胞生物学》，9卷，5169-5181页，1989)；和通过给予外源DNA修复酶增强DNA修复能力可减少细胞因子表达和释放(D.YAROSH,L.Alas,J.Kibitel,A.O'Connor,F.Carrier和A.Fomace，“UV-DNA中的环丙烷嘧啶二聚体诱导能激活人免疫缺陷病毒启动子的可溶性介导物的释放”，Journal of InvestigativeDermatology，100卷，790-794页，1993)。
但是，在本发明之前，人们并没有认识到基因毒物产生的DNA损伤可以转变成细胞因子基因表达活化的生化机制，这是在本领域的技术人员中很容易发现的缺点。例如，Herrlich、Blattner、Knebel、Bender和Rahmsdorf于1997年在《生物化学》、上文的1223页中写道：“综上所述，酵母与哺乳动物细胞一样，具有DNA损伤依赖的转录调控途径。依据酵母遗传学，其组分都已得到了很好的描述，但损伤识别和信号的本质还不清楚”。与此类似，Stephen Jackson于1997年在“DNA依赖的蛋白激酶”《国际生化和细胞生物学杂志》29卷935-938页的第937页中写道：“而且，通过激发蛋白激酶磷酸化级联反应，很可能DNA-PK的活化能诱导细胞DNA损伤信号途径，后者与转录、凋亡和细胞周期机制密切相关。但迄今为止，还没有获得在信号传导中起作用的直接证据”。甚至在更近一些时候，Jean Wang于1998年在《当代细胞生物学评论》(上文)的242页中写道：“UV应答可由胞质膜介导。UV诱导的损伤(环丁烷二聚体和其他光诱导物)是否能在哺乳动物细胞中产生激活Rad3/ATM样蛋白的信号是未知的。”Herrlich和Rahmosdorf实验室在1998年在C.Blattner,Klaus Bender,Peter Herrlich和Hans Rahmsdorf的“Photoproducts in transcriptionally active DNAinduce signal transduction to the delayed U.V.-responsive genes forcollagenase and metallothionein”《癌基因》16卷2827-2834页中的第2832页中重复了他们1997年的观点：“仍不清楚转录基因中DNA损伤怎样进行来诱导信号转导。”
没有一种生化机制---关键的连接，有关DNA损伤可能是细胞因子基因表达的起始事件的数据大多都被忽视了。而且，不认识到这种机制，这种机制的控制甚而细胞因子释放的控制很明显是不可能的。本发明为本领域提供这些缺少的要素。
发明简述
根据上面的观点，本发明的一个目标是提供在与基因毒物接触后控制(调节)细胞因子释放的方法和组合物。
本发明的一个具体的目标是在当基因毒物是紫外线---人和动物最常接触的基因毒物时提供这样的方法和组合物，这种控制(调节)涉及减少细胞因子应答于这种基因毒物的释放。
本发明的进一步的具体的目标是在当基因毒物是一种用于癌症治疗的化学治疗试剂或放射治疗试剂时提供这样的方法和组合物，同样，控制(调节)涉及减少细胞因子的释放。
本发明的一个进一步的目标是使接受器官移植和正在接受免疫抑制药物以防止移植排斥的个体降低对基因毒物(例如紫外线辐射)的敏感性。
本发明的另一个具体的目标是在当基因毒物是一种免疫抑制试剂时提供这样的方法和组合物，而且控制(调节)涉及增加细胞因子应答于该基因毒物的释放。
本发明的另一个目标是确定需要调节其DNA-蛋白激酶的水平和/或活性以调节该个体对一种或多种基因毒物的应答的个体。与此目标相关，本发明的一个进一步的目标是确定其水平和/或活性需要这种调节的特定DNA-蛋白激酶。
本发明的一个进一步的目标是提供确定一种免疫抑制试剂是否以一种水平给药的方法，其中该水平可提供足以影响应答于基因毒物的细胞因子释放的DNA-蛋白激酶活性的所需降低或增加。
本发明的另一个目标是提供检测DNA-蛋白激酶活性的改进试验。
本发明通过以下发现来完成上述和其他目标：DNA-蛋白激酶、一组能识别DNA中的改变如双链断裂的酶和能磷酸化其他蛋白和/或其自身的酶在应答于基因毒物的细胞因子释放中起作用。具体地说，已经发现，一种或多种蛋白激酶对于接触基因毒物后细胞因子基因的转录和/或翻译来说是需要的。
用于此处，“DNA-蛋白激酶”是通过磷酸化其他蛋白和/或其自身来对DNA结构或构象的改变进行应答的蛋白和蛋白复合物家族的成员。该酶家族的特征已由S.Jin,S.Inoue和D.Weaver在“DNA依赖的蛋白激酶的功能”，《癌症探索》，29卷，221-261页，1997年中综述。
在此之前，这些酶仅被认为参与(1)免疫感受态细胞尤其是那些需要涉及双链DNA断裂的基因重排的细胞的形成，(2)DNA中双链断裂的修复，和(3)DNA损伤后细胞周期的调节和凋亡应答。这些联系已由M.Hoekstra在“ATM蛋白激酶家族对DNA损伤和细胞周期检查点调节的应答”，《现代遗传学和发育学评论》7卷，170-175页，1997年中综述。
很明显，就UV---最广泛存在的基因毒物而言，DNA-蛋白激酶家族中没有成员已知与UV诱导的细胞释放细胞因子有关。如上所述，本领域的技术人员所持的观点，即细胞因子基因表达受膜相互作用控制，使这些DNA-蛋白激酶不会被认为参与能导致细胞因子释放的信号传导级联反应。
例如，在上面引用的综述中，M.Hoekstra在第170页中写道：“在本文中，我讨论了PIK激酶(P13-激酶-相关蛋白激酶)家族作为细胞周期调节的传感器的特征。”在另一个例子中，Hosoi等在其标题为“一种磷脂酰肌醇-3激酶的抑制剂---渥曼青霉素诱导辐射抗性的DNA合成和使细胞对博来霉素和电离辐射敏感”，《国际癌症杂志》78卷，642-547页，1998的文章中证明，渥曼青霉素是一种DNA-蛋白激酶的抑制剂，但把渥曼青霉素对细胞因子的所有影响都归结为膜结合的磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3)的抑制。在他们文章的第645页，这些作者写道：“渥曼青霉素抑制通过使P13激酶失活来抑制细胞因子/趋化因子介导的信号传导途径…”。
这段背景领域的陈述在图1中用图示来表示，其中上部带点的盒显示DNA损伤导致DNA-蛋白激酶活化的传统途径，该激酶磷酸化关键的蛋白底物，而后者导致由于细胞内信号产生的细胞周期停止和细胞凋亡。在另一方面，细胞因子释放在本领域以前被归结为下面带点的盒中的途径，其中基因毒物影响细胞膜和/或细胞膜受体，后者活化一种脂和蛋白激酶级联反应，而后者又导致细胞因子基因表达和细胞外细胞因子释放。
图2显示了与本发明一致的基因毒物应答途径。图1和图2的主要区别是，图1中现有技术的图示没有区别早期和晚期事件，即发生在与基因毒物接触3小时以内的事件(早期事件)和发生在接触6小时或更晚的事件(晚期事件)。这种时间划分是形成本发明的基础的发现的一个重要方面。
图2中途径与图1中途径更重要的区别是，图2包括将细胞因子的产生视为由于基因毒物对DNA损伤而导致的影响之一，这种产生导致了如下的生物学影响如红班、抗原特异性免疫抑制、黑素原生成和晒黑。基因毒物的这种细胞因子产生影响在图2的右手盒的右下部显示，并且如该盒中所指出的，该影响依赖于至少一种DNA-蛋白激酶的活化。
不同基因毒物产生的不同类型的DNA损伤活化不同类型的DNA-蛋白激酶。例如，双链断裂活化通常已知为DNA-PK和ATM的DNA-蛋白激酶，而UV在DNA中诱导的光产物活化通常已知为FRAP的DNA-蛋白激酶。在全世界的不同实验室中正在进行的研究将有望鉴别适合于这种模式的其他形式的DNA损伤和DNA-蛋白激酶家族的成员，而本发明将同样可应用于这些随后的DNA损伤/DNA-蛋白激酶组分。
如图2所阐明的，本发明所依据的共同方面是(1)DNA-蛋白激酶是识别DNA改变的中心，和(2)下游蛋白的磷酸化导致细胞因子基因表达，即细胞因子基因的转录和/或翻译。基于该发现，应答于基因毒物的细胞因子产生可通过调节一种或多种DNA-蛋白激酶的水平或活性来控制。
这种调节可用如下方法来完成：(1)使用一种或多种抑制剂来抑制一种或多种DNA-蛋白激酶的活性，(2)提高或降低参与产生一种或多种DNA-蛋白激酶的基因的转录和/或翻译，和/或(3)通过诸如向激酶提供较高水平的与其反应的损伤DNA或较高水平的被其磷酸化的底物来提高一种或多种DNA-蛋白激酶的活性。
在本发明的一种特殊应用中，抑制DNA-蛋白激酶的化合物如纳巴霉素被用于阻断基因毒物对细胞因子的诱导。其他DNA-蛋白激酶的抑制剂包括焦磷酸、渥曼青霉素、6-二甲基胺嘌呤、吡啶酮衍生物OK-1035和单链DNA，如S.P.Lees-Miller在“DNA依赖的蛋白激酶，DNA-PK：10年及无止境的观察”《生化和细胞生物学》74卷，503-512页，1996中的介绍。
接触基因毒物可能是意外的，例如在日常生活中与环境污染物或日光接触。接触也可能是有意的、是有害的副作用，例如在有目的的日光浴或癌症的放疗或化疗时。细胞因子的诱导可能是不想要的，因为它们是免疫抑制性、炎症性、活化病毒、引起不想要的色素形成、斑痕疙瘩、粘附或疤痕、或其他与基因毒物接触的原发或副发结果。
本发明的这些方面的特殊例子包括在护肤和防晒化妆品以及用来防止阳光和污染物对DNA损伤的不想要的副作用例如红班、炎症、免疫抑制、潜伏的疱疹感染的活化、蛋白酶(例如胶原酶和金属硫蛋白)的活化和皮肤癌的药物产品中掺入一种或多种DNA-蛋白激酶抑制剂如纳巴霉素或纳巴霉素样化合物。
DNA-蛋白激酶抑制剂例如纳巴霉素或纳巴霉素样化合物也可用于与癌症化疗药物或放疗方法联合使用，来降低与这些治疗相关的副作用，例如发烧、红班、恶心、呕吐、头疼、发冷和不正常色素生成。在本发明的这些应用中，DNA-蛋白激酶抑制剂优选在与基因毒物如阳光、空气污染物、化疗或电离辐射接触的相近时间给药，更优选在接触前的30分钟至1小时给药。
本发明也可用于在移植时防止免疫移植疗法的主要有害副作用。器官移植在引入耐受性非常好的免疫抑制化合物如环孢霉素后已变得非常普遍。但是，这种免疫抑制疗法的一个主要得副作用是使病人在皮肤暴露于阳光时增加了发生皮肤癌的危险性。见M.Glover,C.Proby和I.Leigh，“直肠移植病人中的皮肤癌”《Cancer Bulletin》45卷，220-224页，1993年。
因为环孢霉素提供免疫抑制的机制是干扰钙神经素，它并不阻断UV-B接触后的细胞因子释放。见A.Marionnet,Y.Chardonnet,J.Viac和D.Schmitt，“正常和转化的角质细胞培养物对环孢霉素A和紫外线B辐射的白介素-1和肿瘤坏死因子α应答和分泌的差异”《实验皮肤学》6卷，22-28页，1997年。因此，环孢霉素并没有DNA-蛋白激酶抑制剂如纳巴霉素在皮肤暴露于阳光时阻断UV-诱导细胞因子的有益作用。
本发明介绍了以下内容，在维持所需的免疫抑制状态来进行器官移植时，一般来说，接触基因毒物的器官，特别是暴露于阳光的皮肤应用一种DNA-蛋白激酶抑制剂如纳巴霉素在接触基因毒物前、同时、或之后进行处理，以防止基因毒物引起的癌症。当DNA-蛋白激酶抑制剂自身是一种能抑制移植排斥的免疫抑制剂(例如纳巴霉素)时，该抑制剂可以与或不与其他免疫抑制剂和/或其他类型的药物或处理一起使用。在这种情况下，同时考虑其抑制移植排斥的能力和其抑制应答于基因毒物接触的细胞因子产生的能力来选择免疫抑制剂的给药过程和剂量水平。
本发明的其他应用包括在基因毒物处理后能增加DNA-蛋白激酶的活性以增加细胞因子诱导的化合物(此后称为“DNA-蛋白激酶增强剂”)。这样某些基因毒物处理被用来诱导免疫抑制应答。例如，补骨脂素+光被用于皮肤移植和牛皮癣来诱导免疫抑制性细胞因子和抑制抗原特异性自身应答。对比图2中列出的机制，能增强DNA-蛋白激酶活性的化合物可使这些免疫抑制疗法更加迅速、有力和/或通用，如此来提高治疗的效果。这样，根据本发明，能增强DNA-蛋白激酶活性的化合物被用来同时或取代基因毒物来加强所需的免疫抑制应答。
例如，根据本发明的这些方面，一种或多种能象UV辐射DNA或短片段的双链DNA一样作用并因而能刺激DNA-蛋白激酶活性的化合物可在基因毒物处理时使用或取代基因毒物处理来刺激免疫抑制细胞因子的释放和提供对自身免疫应答相关疾病的缓解。这种化合物的例子包括结合了双链DNA和/或其同系物的脂或脂质体。
本发明的另一个应用是鉴定其一种或多种DNA-蛋白激酶的水平和/活性需要调节以调节其针对一种或多种基因毒物的应答(敏感性)的个体。根据本发明的这些方面，对患有由于一种基因毒物而产生不足或过量的细胞因子表达的疾病的病人的DNA-蛋白激酶活性和/或水平进行筛选来确定导致该病人症状的特殊DNA-蛋白激酶。例如，某些类型的皮炎如特应性皮炎、红斑狼疮和卟啉症是由于免疫系统对环境UV或污染过度反应引起的。通过在这些病人中筛选DNA-蛋白激酶活性，确定了可能从特殊的DNA-蛋白激酶抑制剂获得益处的病人。在本发明的这些应用中，从组织样品中制备细胞抽提物，并进行DNA-蛋白激酶试验。
例如，这种试验可是如下文实施例4中介绍的类型，其中抗体被用来免疫沉淀DNA-蛋白激酶，然后将沉淀的DNA-蛋白激酶接触不同类型的DNA损伤及其底物如p53蛋白。通过测量p53磷酸化的程度，就可以确定该DNA-蛋白激酶的活性。当与正常对照比较时，这些研究可确定是否有更多的DNA-蛋白激酶在疾病组织中表达或是否该DNA-蛋白激酶在这种组织中活性更高。此信息可随后用来诊断疾病和选择治疗性处理。
根据本发明的前面的各个方面，用来检测DNA-蛋白激酶水平/活性的试验需要确定，例如，一种药物的给药水平是否足以抑制或诱导细胞因子释放。如下文实施例4中的阐述，本发明提供了有效的试验来用于该目的，其中：(1)从受体中获取细胞样品，(2)从样品中获取含有DNA-蛋白激酶的制备物，(3)将该制备物与这种类型的激酶敏感的DNA损伤以及其合适的底物一起作用，并(4)将底物磷酸化水平用来测量激酶的水平/活性。
本发明的前述和其他方面将在下面与本发明的详细描述及其优选实施方案联系起来进一步详细讨论。
附图简述
图1是显示本领域以前对参与细胞对基因毒物应答途径的理解的流程图。如这里所显示的，基因毒物的DNA损伤被认为活化DNA-蛋白激酶，后者接着引起底物磷酸化，接着激发细胞周期停止和凋亡的细胞内事件。
图2是显示根据本发明的参与细胞对基因毒物应答途径的流程图。如这里所显示的，基因毒物对DNA的损伤活化DNA-蛋白激酶，后者接着使底物磷酸化，接着激发细胞因子的细胞外释放。
图3是DNA-蛋白激酶家族的树形图，已知的脂类与DNA-蛋白激酶的关系按照氨基酸序列的同源性进行显示。蛋白被分为具有脂类激酶活性和蛋白激酶活性。对于每种蛋白都显示了其名称和组织方式。细实条表示非同源区，而粗实条代表小的亚单位如Ku或FKBP蛋白结合的区域。空心粗条表示激酶活性位点区域，垂直的斑纹区域是显示DNA-蛋白激酶同源性的羧基末端。对于每种蛋白都显示了氨基酸的数目(已知的情况下)和与ATM蛋白的氨基酸序列的激酶区的相似百分数(相同或保守氨基酸取代)。该图绘自V.Zakian“ATM相关基因：它们告诉我们关于人类基因的什么？”《细胞》82卷，685-687页，1995年，和S.Jin,S.Inoue和D.Weaver“DNA依赖的蛋白激酶的功能”《癌症探索》29卷，22l-261页。
图4是人角质细胞中TNFα蛋白表达的Western印迹。来自人细胞系HaCat的细胞用200J/m2UV-B辐射或用1ug/ml LPS处理，并在37℃温育24小时。制备抽提物，在15％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转至硝酸纤维素膜，用抗人TNFα的抗体进行印迹，并用ECL化学发光系统进行曝光。泳道为(1)辐射，(2)辐射并用2ng/ml纳巴霉素在辐射前30分钟开始处理，(3)用LPS处理，(4)用LPS和纳巴霉素处理；(5)鉴定用TNFα对照。
图5显示在存在或没有各种DNA-蛋白激酶抑制剂时暴露于UV后TNFα启动子对氯霉素乙酰转移酶(CAT)的诱导。XP12BE细胞缺乏核苷酸切割修复，用TNFcat转基因转染该细胞，形成能在TNFα启动子下表达CAT的XPTNF2细胞系。该细胞用DNA-蛋白激酶抑制剂在辐射前30分钟开始处理，然后暴露于100J/m2UV-B。18小时后，制备抽提物，并使用荧光氯霉素底物检测CAT活性。反应产物用薄层层析进行分离，并用UV-A进行显色。样品为(1)单独的底物；(2)未处理的细胞；(3)UV辐射的细胞；(4)用UV辐射和纳巴霉素处理的细胞；(5)单独用纳巴霉素处理的细胞；(6)未处理的细胞；(7)UV辐射的细胞；(8)UV辐射和渥曼青霉素处理的细胞；(9)未处理的细胞；(10)UV辐射的细胞；(11)UV辐射和星形孢菌素处理的细胞；(12)LPS处理的细胞；和(13)LPS和纳巴霉素处理的细胞。
图6显示LPS处理后TNFα启动子对氯霉素乙酰转移酶(CAT)的诱导。XPTNF2细胞按图5的介绍进行处理，除了用暴露于1ug/ml LPS代替UV。CAT活性从蛋白抽提物的量和在30分钟内形成的产物量进行计算，后者通过荧光薄层层析板计算机图象分析进行定量。
图7是人角质细胞中p70S6K磷酸化的Western印迹。来自人细胞系HaCat的细胞用100J/m2的UV-B辐射或用1ug/ml LPS进行处理，并在37℃温育24小时。制备抽提物，在10％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转至硝酸纤维素膜，用针对人p70S6K的丝氨酸和苏氨酸磷酸化形式的抗体进行印迹，接着用连接了辣根过氧化物酶的二抗作用，使用ECL化学发光系统进行曝光。泳道为：(1)未辐射，(2)辐射，(3)辐射并用2ng/ml纳巴霉素在辐射前30分钟开始处理，(4)用LPS处理，和(5)用LPS和纳巴霉素处理。
图8显示p53肽上的FRAP和ATM激酶活性。由人角质细胞系HaCat制备抽提物。将抽提物与抗FRAP(黑色条)或ATM(灰色条)的抗体一起温育，通过离心将与Protein G琼脂糖珠结合的抗体-激酶产物沉淀。将珠结合的FRAP激酶与FKBP蛋白混合，将FRAP和ATM都与p53蛋白一个肽部分一起温育。向这种混合物中加入各种DNA和抑制剂，如图所示。在30℃温育2小时后，将反应产物稀释8倍，加入ELISA板，用抗磷酸丝氨酸修饰的蛋白和磷酸苏氨酸修饰的蛋白的抗体以及碱性磷酸酶二抗和硝基酚磷酸底物一起显色。对照包括磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸牛血清白蛋白。磷酸化的蛋白用405nm处的光密度进行测量。
图9是显示不同纳巴霉素浓度对TNFcat表达的抑制水平的剂量应答曲线。CAT活性由乙酰化的氯霉素的级份按图5的介绍进行计算，并与无纳巴霉素时的活性进行比较。
上述图在此引入并作为本发明说明书、本发明的各个说明性的实施例以及具体叙述的一个组成部分，它们被用来解释本发明的原则。应当理解，这些图和说明是仅是解释性的，不是对本发明的限制。
发明详述及其优选实施方案
如上文所讨论的，本发明的关键方面是：(1)发现DNA-蛋白激酶在应答于基因毒物的细胞因子释放中起核心作用，和(2)应用该发现来通过给药DNA-蛋白激酶抑制剂(如果细胞因子释放将被降低)或增强剂(如果细胞因子释放将被增加)来调节细胞因子释放。
A．DNA-蛋白激酶
DNA-蛋白激酶开始是在缺少该酶家族的一个成员的活性的动物和人突变体中被认识到的。
患有SCID(严重的联合免疫缺陷疾病)的小鼠由于免疫球蛋白基因重排缺陷而不能产生完整的免疫系统，。这些小鼠被发现具有一种遗传突变，该突变使涉及双链DNA断裂的免疫球蛋白重排过程中的一种重要DNA-蛋白激酶活性失活。通过这种方式，免疫细胞发育中的中间过程、双链DNA的断裂，类似于DNA损伤。见S.Jackson的综述“DNA依赖的蛋白激酶”《国际生物化学和细胞生物学杂志》29卷，935-938页，1997年。
患有遗传疾病AT(共济失调-毛细血管扩张症)的病人具有肌肉控制丧失(共济失调)和异常的眼血管(毛细血管扩张症)以及易患血液癌症如淋巴瘤。这些病人具有被称为ATM(AT突变)的异常基因。
当这些疾病的SCID和ATM基因被分别克隆和它们的核苷酸序列被分析后，它们显示与3'-磷脂酰肌醇(3'-IP)激酶具有很高的同源性，该激酶是一个脂类家族而不是蛋白的激酶，如S.Jackson，上文的综述。这在开始时非常使人迷惑，因为没有脂类激酶活性可以用生化途径进行检测。现在人们认识到，尽管序列与3'-IP激酶同源，这些酶确实是蛋白激酶。
DNA-蛋白激酶在从酵母到人的所有真核有机体中被发现。每个细胞具有一种以上类型属于这个庞大的相似酶的家族的DNA-蛋白激酶。与DNA-蛋白激酶有关的氨基酸序列的家族包括与SCID突变、ATM、ATR、TEL1、MEC1、MEI41、FRAP、TOR1、TOR2和RAD3相关的原来的DNA-PKcs和Ku亚单位及其他，如Jin、Inoue和Weaver在1997年的综述，上文。该DNA-蛋白激酶家族及其序列同源性示于图3。正在进行研究以确定该家族的另外成员。
DNA-蛋白激酶一般包括两个亚单位，其中一个比另一个大得多。较小的亚单位在图3中没有显示。SCID和AT疾病都由编码较小亚单位的基因的突变产生。这些遗传突变以及能阻断DNA-蛋白激酶活性的抑制剂已被用来分析DNA-蛋白激酶具有的功能。
B．DNA-蛋白激酶抑制剂
如上文所讨论的，根据该方面，本发明涉及干扰一种或多种DNA-蛋白激酶活性的化合物，不管是通过直接使DNA-蛋白激酶的活性位点或多个位点失活，还是通过直接干扰DNA-蛋白激酶与DNA和/或DNA-蛋白激酶磷酸化的底物结合，或通过与DNA-蛋白激酶竞争结合DNA和/或底物，或通过干扰DNA-蛋白激酶的亚基的组装。
可用于本发明的实践的DNA-蛋白激酶抑制剂的例子包括纳巴霉素、焦磷酸、渥曼青霉素、6-二甲基胺嘌呤、OK-1035、星形孢菌素和单链DNA。这些抑制剂在与本发明已知的适当载体组合时，可用于以各种形式对受体进行给药，包括口服、注射和局部使用。给药的水平将依赖于特殊的受体、抑制剂和基因毒物，并可按照用于治疗性处理的标准医学实践来测定。
特别是，选择抑制剂给药的水平使其能被病人耐受并能达到足以降低DNA-蛋白激酶活性来减少细胞因子依赖于一种或多种基因毒物的表达的水平。细胞因子表达水平可使用本领域已知的标准技术进行测定。这样当剂量/给药途径不同时，合适的抑制剂剂量水平和给药方式可通过监测细胞因子依赖于基因毒物的表达来进行选择。例如，接触UV后可对接受了一种或多种DNA-蛋白激酶抑制剂的受体进行TNFα的水平进行监测。应当指出，当原初的细胞因子如TNFα在接触基因毒物后增加时，次生的细胞因子可能具有更复杂的动力学，例如应答于基因毒物如UV，干扰素γ的水平可能降低，ICAM-1的水平可能降低，接着升高。如果这样一种次生细胞因子被用来确定DNA-蛋白激酶抑制剂的剂量/给药方式，这些更复杂的动力学需要进行考虑，例如，可以选择的一种抑制剂水平是基因毒物接触后使干扰素γ活性的水平维持在一个预测的值上。
在本发明的特定优选实施方案中，抑制剂给药的水平/方式通过监测DNA-蛋白激酶的活性来进行选择，例如通过使用这里讨论的试验来监测DNA-蛋白激酶活性。根据这些实施方案，抑制剂给药的水平/方式被选择来使一种或多种DNA-蛋白激酶的活性产生一个实质上的降低(例如10％的降低，优选50％)。例如，FRAP活性的水平可以被监测和选择来减少细胞因子在接触一种或多种基因毒物时的释放。同样，UV接触可以是基因毒物，这时选择FRAP的水平来减少TNFα的释放。
DNA-蛋白激酶抑制剂可以连续或优选在病人接触基因毒物时给药。更优选，DNA-蛋白激酶抑制剂在与基因毒物接触前给药，例如在接触前30分钟，给药在接触时连续进行并在之后一段时间，例如接触后24小时继续。比在接触前、后、过程中给药少在本发明的实践中也可以，但不是优选。C．纳巴霉素
DNA-蛋白激酶活性的一种特别重要的抑制剂是纳巴霉素。这种抑制剂特异性地抑制FRAP的大小亚基的装配，如E.Brown,P.Beal,C.Keith,J.Chen,T.Shin和S.Schreiber的介绍“FRAP激酶活性在体内对p70S6激酶的控制”，《自然》277卷，441-446页，1995年。这些作者鉴定了能提供抗纳巴霉素抗性的突变FRAP，证明了这种药物的特异性。
与纳巴霉素相对，渥曼青霉素是另一种重要的DNA-蛋白激酶活性的抑制剂，它通过改变参与磷酸化的关键氨基酸来阻断FRAP，如M.Wymann,G.Bulgarelli-Leva,M.Zvelebil,L.Pirola，B.Vanhaesebroeck，M.Waterfield和G.Panayotou在“渥曼青霉素通过共价修饰lys-802使磷脂酰肌醇3激酶失活，lys-802是参与磷酸转移反应的一个残基”《分子和细胞生物学》16卷，1722-1733页，1996年中的介绍。
纳巴霉素今天在临床上被用来在移植过程中抑制免疫系统，因为它阻断了传统免疫细胞如T细胞的增殖，如M.Suthanthiran和T Strom在“免疫调节药物：在器官移植中使用的机制基础”《PediatricNephrology》11卷651-657页1997年。它还没有被用来与短期接触基因毒物一起使用，但已用于长期使用以保持移植物。很明显，接受免疫抑制治疗的病人包括接受纳巴霉素的病人被明确指示在免疫抑制治疗的全部时间内要避免接触基因毒物如阳光，这个时间可能并通常会持续数年。见M.Glover,C.Proby和I.Leigh，“直肠移植病人中的皮肤癌”《Cancer Bulletin》45卷220-224页，1993年。
目前，纳巴霉素正在临床试验的末期，并由Wyeth-AyerstLaboratories以Rapamune_的名称商业生产，该实验室是AmericanHome Products的一个分支。它可在治疗移植病人时单独或与低剂量的环孢霉素一起使用。
当通过口服途径进行给药时，常规的纳巴霉素剂量范围是每天2至5mg。当局部给药时，局部浓度为0.2％w/v的范围。当通过静脉途径给药时，最大耐受剂量为每公斤体重25mg的范围。在临床上，免疫抑制目的的剂量为每天每平方米皮肤0.5至25mg的范围。
具体地说，每m2体表面积大约21至25mg的纳巴霉素的使用剂量开始经静脉给药，如C.G.Groth，C.Brattstrom和L.Backman在“移植学中的新动向：怎样在临床移植中利用sirolimus潜力”《移植进展》30卷，4064-4065，1998年中和B.Kahan在“纳巴霉素：以250例处理的直肠同种异体移植受体为基础的使用的个人算法”《移植进展》30卷，2185-2188,1998年中的介绍。然后通过约1-7mg/m2调整的剂量来在随后的2-3个月中在全部血液中产生约10-15ng/ml的低浓度。但是，多数纳巴霉素集中在血红细胞中，纳巴霉素的血浆和组织浓度和代谢少于2 ng/ml，如D.Trepanier，H.Gallant，D.Legatt和R.Yatscoff在“纳巴霉素：分布、药代动力学和治疗范围的研究：最新”《临床生物化学》31卷，345-351页，1998中的介绍。
很明显，这种组织浓度不足以在接触基因毒物后调节DNA-蛋白激酶活性和调节应答于这种接触的细胞因子释放。这是因为需要高于2ug/ml(或约2nM)的浓度来使DNA-蛋白激酶具体地说是FRAP激酶基本失活。如下面实施例5所示，UV诱导TNFα对剂量少于2ug/ml的纳巴霉素不敏感。因此，根据本发明，目前使用的使全血达到10-30ug/ml水平的纳巴霉素给药不能在血浆或组织中达到足以使FRAP失活的纳巴霉素水平。
直至今日，纳巴霉素的推荐剂量仅仅是通过其防止移植器官的排斥的能力来测定，并不是根据其在基因毒物接触的非免疫细胞中抑制FRAP活性所需的剂量来确定。此外，这种剂量设计来用于延长的长期的使用，并不是用来对与基因毒物接触进行调节。
与纳巴霉素的这些以前的用途相对，根据本发明，纳巴霉素被用于通过在与基因毒物如UV接触之前和之后短时间内给药，来减少免疫抑制性细胞因子如IL-1、IL-6、IL-10、ICAM-1和TNFα的释放，而且，纳巴霉素以足以达到减少细胞因子释放的高水平的剂量进行使用，即用比用来防止移植排斥高的水平。因此，根据本发明，纳巴霉素被用来保护而不是抑制免疫系统，具体地说，是在接触基因毒物后保护免疫系统。
使用一种免疫抑制药物来保护免疫系统的思路很明显有违直觉并与现有领域的知识和实践相反。D.DNA-蛋白激酶增强剂
虽然本发明最普通的应用涉及细胞因子释放的减少，但在某些场合，需要增加这种释放，特别是，某些疗法涉及使用基因毒物处理来消除抗原特异性免疫应答(见下文)。
DNA-蛋白激酶活性的增强剂包括(1)双链DNA的短片段(例如具有小于25千碱基对长度的片段)，即具有能与DNA-蛋白激酶结合的末端的DNA的片段，(2)损伤的双链DNA，这种DNA可以是长链的或短链的，(3)在DNA-蛋白激酶的亚基已被用尽的情况为该亚基，(4)DNA-蛋白激酶磷酸化的底物，和(5)ATP。
DNA-蛋白激酶增强剂可以按上文中讨论的与DNA-蛋白激酶抑制剂相同的方式进行给药，除了以下内容，因为增强剂是生物活性的，因此应当使用能够保护增强剂的生物活性和将其传递到靶组织的载剂/载体。例如，在蛋白质的场合，局部给药可以使用一种脂质体传递系统进行给药。见Yarosh，美国专利No.5,190,762。
增强剂的剂量/方式可使用上面对抑制剂所讨论的相似方法进行测定。因此，增强剂通常在与基因毒物接触前给药，给药在接触过程中持续，并延续一段时间。同样，细胞因子的监测和/或DNA-蛋白激酶水平可用来确定用于具体受体、增强剂和基因毒物的合适剂量和方式。E．细胞因子释放的调节
如上文所讨论的，根据本发明，基因毒物接触后的细胞因子释放可通过抑制或增强DNA-蛋白激酶活性的方法进行减少或增加。在多数场合，细胞因子释放的减少是所需的，最普通的例子是减少作为UV接触结果的细胞因子释放。
另一个需要减少的例子是与癌症的化疗和放疗有关。许多化疗药物如卡氮芥和丝裂霉素C以及许多放疗如用X-射线处理都是基因毒性的。根据本发明，对正在进行这样的治疗的病人给予一种或多种DNA-蛋白激酶抑制剂来减少治疗的副作用。
对于本发明的其他应用，一种或多种抑制剂优选在一个疗程之前给药，给药过程持续并在该疗程之后延续一段时间，例如1天等。DNA-蛋白激酶抑制剂优选以这样一种方式传递，它们将到达在治疗中受到不想要的基因毒性损伤的组织。在化疗场合，DNA-蛋白激酶抑制剂通常以化疗试剂相同的方式给药，但它们也可特异性地针对化疗副作用最常见的位置，例如消化道(口服给药)、头皮(局部给药)、和/或化疗试剂注射的位点(局部或皮下给药)。相同类型的特殊给药也可用于放疗的场合。
正在经历移植排斥治疗的病人特别需要对抗基因毒物的保护，因为他们的免疫系统受到了抑制。如上文所讨论的，这些病人通常在暴露于阳光的皮肤上患有癌症，这种癌症的发作通常在开始治疗的几年之内。虽然DNA-蛋白激酶抑制剂具体地说是纳巴霉素被用于这种移植排斥疗法，但这些使用没有达到对抗基因毒性接触的保护。本发明介绍以下内容，DNA-蛋白激酶抑制剂应以与他们被用于移植领域不同形式和方法的形式和方法进行传递。
具体地说，这些抑制剂例如纳巴霉素应在基因毒性接触之前以及接触之后的较短时间进行给药。在免疫抑制药物的系统使用由于毒性而受到限制场合，DNA-蛋白激酶抑制剂的另外的局部施用将被用来缓解基因毒性接触的影响。具体地说，在暴露于阳光的场合，一种或多种抑制剂将被局部用于暴露于阳光的皮肤区域。剂量将调整到能抑制作为DNA损伤的结果的细胞因子释放，这意味着在接触基因毒性前后的短时间内，一种或多种DNA-蛋白激酶抑制剂如纳巴霉素的剂量水平将比移植排斥疗法的其他时间要高。
在某些场合，根据本发明，作为DNA-蛋白激酶抑制剂的一种或多种移植排斥药物如纳巴霉素或其类似物(例如SDZ RAD)被用来与一种或多种不是DNA-蛋白激酶抑制剂的移植排斥药物如环孢霉素A或子囊霉素一起使用。因为这两种类型的药物一般不会有重叠的毒性，这种联用可允许较大的灵活性，来达到免疫抑制的目的，并同时允许为病人提供对抗作为接触一种或多种基因毒物的结果的细胞因子产生。
根据本发明的这些方面，作为DNA-蛋白激酶抑制剂的移植排斥药物被以能至少提供一些免疫抑制的水平进行使用，更重要的是，以能抑制应答于基因毒物的细胞因子释放的水平和/或方式进行使用。两种类型的免疫抑制药物的相应数量可根据病人对药物的敏感性和达到所需的细胞因子释放的保护水平时所需的DNA-蛋白激酶抑制剂的数量为每个病人进行确定。
虽然本发明的最普通的应用是与降低细胞因子的产生有关，但在某些场合，本发明可用于增强应答于基因毒物的细胞因子产生。具体地说，本发明可用于治疗应答于免疫抑制基因毒物的多种疾病，包括自身免疫疾病。
例如，增强细胞因子产生可用于治疗牛皮癣，这是一种特征为角质细胞过量增生和T细胞浸润皮肤的疾病。两种常用于治疗这种疾病的基因毒物是煤焦油和补骨脂素+光。在每种场合，基因毒性治疗都导致能抑制T细胞活化的细胞因子释放，并因而缓解疾病症状。根据本发明，DNA-蛋白激酶增强剂被用来增加应答于基因毒物的细胞因子释放水平。
具体地说，一种或多种DNA-蛋白激酶增强剂恰好在给药免疫抑制性基因毒物之前或优选在给药时给予病人。使用这些增强剂能够允许减少所需给药的基因毒物的数量，并且在某些场合，增强剂单独或仅与少量基因毒物一起就能达到所需的免疫抑制细胞因子的释放。
其他可用这种方式进行处理的疾病包括特应性皮炎、红斑狼疮、关节炎和卟啉症。这些疾病每种都通过T细胞活化产生炎症。这种T细胞活化可以通过合适的免疫抑制细胞因子进行抑制。并且本发明的DNA-蛋白激酶增强剂能够在接触基因毒物时增加那些免疫抑制细胞因子的形成。
F．DNA-蛋白激酶活性水平试验
如下发现，即DNA-蛋白激酶是基因毒物与细胞因子释放之间的核心生物学联系，可以使那些激酶用作(1)个体对基因毒物的敏感性和(2)细胞因子释放的调节剂的有效性的检测点(生物学终点)。
因此，通过测量一个个体的DNA-蛋白激酶活性的水平，我们可以确定个体对能够产生该DNA-蛋白激酶应答的DNA损伤应答的基因毒物的敏感性的水平。例如，为测量对UV的敏感性，我们可测量FRAP活性的水平，而为测量对电离辐射(X射线)的敏感性，我们可以测量ATM活性的水平。测量到的高水平的DNA-蛋白激酶水平表明该个体将以低水平的细胞因子释放应答该试剂。
这两种情况都是不想要的，并且其鉴定都允许进行合适的诊断和/或治疗过程。具体地说，对于具有高水平的特殊DNA-蛋白激酶活性的个体，一种或多种该DNA-蛋白激酶的抑制剂可按上面的介绍用于调节该个体的对与该激酶有关的基因毒物的细胞因子应答。对于具有低水平的DNA-蛋白激酶活性的个体，进行进一步的诊断过程来确定该低水平活性的来源，例如可进行一种遗传筛选。这样一种DNA-蛋白激酶试验可为进行筛选提供基础，如果没有这种试验，将无法进行筛选。
至于细胞因子释放的调节剂的有效性，通过进行一种DNA-蛋白激酶活性的试验，我们可确定是否足够数量的DNA-蛋白激酶抑制剂或增强剂已给予了病人，并且剂量的调整、传递方式或传递方案可以调整到合适。
在病人正在使用一种为DNA-蛋白激酶抑制剂如纳巴霉素的免疫抑制试剂而经历免疫抑制疗程时，可以使用检测DNA-蛋白激酶活性的试验来获得所需的免疫抑制剂水平。具体地说，因为免疫抑制剂如纳巴霉素的复杂代谢和生物分布，亲本化合物的血液水平可能不代表亲本化合物及其代谢物的生物学效果。检测DNA-蛋白激酶活性的试验更能直接监测该化合物及其任何代谢物的生物学效果。
能用于本发明的实践的检测DNA-蛋白激酶活性水平的试验包括那些使用放射标记的ATP底物如32p-ATP、肽底物、凝胶电泳和放射自显影显示的试验。见诸如D.Price,J.Grove,V.Calvo,J.Avruch和B.Bierer，“纳巴霉素诱导的70 KD S6蛋白激酶的抑制”，《科学》257卷，973-977页，1992年。
下图4介绍了一种能避免使用放射性反应剂并能同时处理比Price等的方法更多的样品的优选试验。当用于测定一个受体的DNA-蛋白激酶水平时，该试验包括以下步骤：(1)从受体获得样品细胞，(2)使用抗DNA-蛋白激酶抗体从样品获得含有DNA激酶的制备物，(3)将该制备物与该激酶敏感的DNA损伤类型以及该激酶的合适底物作用，并(4)将底物的磷酸化水平用于测定该激酶的水平/活性。底物磷酸化的水平使用特异性针对在试验过程中被该DNA-蛋白激酶磷酸化的底物的抗体用标准的ELISA方法进行定量。
该试验的特异性和敏感性可通过改变或组合抗DNA-蛋白激酶抗体和/或进行试验中使用的底物的类型和/或浓度进行修改。具体地说，对多种激酶的DNA-蛋白激酶活性的水平，可以分别通过在步骤(2)和(3)形成抗DNA-蛋白激酶抗体和底物的混合物同时测定。该试验的敏感性可通过增加抗体和/或底物的浓度和/或反应时间来修改。
G．治疗组合物
本发明的DNA-蛋白激酶抑制剂可单独与适当的载剂配制，或者它们可相互和/或与其他药用成分如非DNA-蛋白激酶抑制剂的基因保护剂组合。其中一个这样的例子是局部配剂中纳巴霉素与一种或多种遮光剂如二氧化钛、和/或一种或多种DNA修复酶如T4核酸内切酶V的组合物，在接触一种或多种基因毒物如阳光中的UV之前、过程中或之后使用。在DNA修复酶的场合，将DNA修复酶包裹在脂质体中是一种优选的给药方法。见Yarosh，美国专利5,077,211、5,296,231和5,272,079。
在这样的配剂中，DNA-蛋白激酶抑制剂的水平按上面介绍的方法进行选择，例如使用一种DNA-蛋白激酶活性试验。配剂中的其他活性成分的水平一般相当于该成分自己使用时的水平。
在病人经历化疗的场合，本发明的DNA-蛋白激酶抑制剂例如渥曼青霉素可与一种基因毒性化疗试剂如丝裂霉素C进行组合而同时给药。
本发明的DNA-蛋白激酶增强剂也可单独与合适的载剂进行配制，或者它们可相互和/或与非DNA-蛋白激酶增强剂的药剂例如与基因毒物一起配制。一个例子是损伤的DNA、补骨脂素以及一种合适的载剂组合施用于牛皮癣病人的皮肤。
为了不受任何方式的限制，本发明将用下面的实施例作更全面的介绍。下面是各实施例常用的材料与方法。材料与方法细胞培养
人永生性HaCat细胞系来自Dr.Jonathan Garlick,Stony Brook的State University of New York。XPTNF2细胞系按照J.Kibitel,V.Hejmadi,L.Alas,A.O'Connor,B.Sutherland和D.Yarosh在“小鼠和人细胞中的UV-DNA损伤诱导肿瘤坏死因子α的表达”《Photochemistry andPhotobiology》67卷541-546页，1998年中的介绍，用pCATNF转染XP族的SV-40转化的成纤维细胞系XP12BE来制备。该细胞系通过小鼠TNFα启动子表达氯霉素乙酰转移酶基因。这些转化的细胞系在补加了10％新生牛血清和抗生素的Dulbecco's modified Eagle's培养基中在37℃在湿润的5％CO2温箱中培养。非转化的人角质细胞购自CloneticsCorporation，San Diego，California，并在补加了细胞的无蛋白角质细胞培养基中在37℃在湿润的5％CO2温箱中生长。药物和基因毒性处理
纳巴霉素、渥曼青霉素、星形孢菌素和脂多糖(LPS)来自SigmaChemical Company。这些药物按1000倍的浓度配制，并在使用前用培养基稀释。纳巴霉素、渥曼青霉素或星形孢菌素处理的细胞在UV辐射前预处理30分钟并在辐射后处理18小时。对于LPS处理，将LPS加入到细胞中在37℃处理1小时，然后细胞用新鲜培养基重新喂饲18小时。
UV由Westinghouse FS-40无滤光的日光灯以3.2J/m2/sec来提供。为进行UV辐射，将培养基除去，辐射细胞，然后用相同的培养基重新喂饲18小时。细胞抽提物和Western印迹
正常的人上皮角质细胞在10-cm板中培养至90％连汇，然后用药物和基因毒物处理。温育后，用含有十二烷基磺酸钠(SDS)的标准电泳缓冲液收集细胞，用一台Heat Systems Ultrasonic Sonicator以70％的功率超声2秒，在水中煮沸5分钟，在-70℃贮存。
为进行Western印迹，将10ug的细胞抽提物与5ul含有染料的样品缓冲液混合，将混合物煮沸2分钟，并用集层缓冲液上样于标准的SDS-PAGE凝胶(Biorad mini Protean Ⅱ apparatus)。为进行p70S6KWestern，使用10％的SDS-PAGE，为进行TNFα Western，使用15％的SDS-PAGE。凝胶按每凝胶25mAmps进行，直至染料到达凝胶的底部。在一个Semi-phor装置(Hoefer Scientific Instruments,San Francisco，California)中以0.83mAmps/cm2电转印45分钟将蛋白转移至Immobilon P膜上。印迹用5％脱脂奶粉封闭，并用一抗在4℃结合过夜。对于p70S6K印迹，抗体针对在苏氨酸421和丝氨酸424磷酸化的形式(New England Biolabs)。然后洗涤印迹，并用辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体温育。印迹用ECL试剂盒(Amersham)显色，并用HyperfilmECL曝光。对于TNFα印迹，抗人TNFα的单克隆抗体来自BoehringerMannheim Biochemicals。然后洗涤印迹，并与偶联了生物素的羊抗鼠IgG温育，接着与链亲和素-辣根过氧化物酶温育，接着按上面的介绍用ECL显色。TNFcat试验
CAT试验按Kibitel等1998的介绍进行。简而言之，XPTNF2细胞用药物和基因毒物处理，温育18-24小时。通过三轮冻融和离心制备抽提物，将50ug的每种抽提物与5noml的BODIPY-氯霉素(MolecularProbes,Eugene,Oregon)和0.5mM的乙酰辅酶A(Sigma ChemicalCompany)混合。在37℃温育30分钟后，用冰冷的乙酸乙酯抽提反应产物，并用薄层色谱进行分析。用UV-A观察荧光底物和乙酰化产物，用计算机图象分析技术分析数字图象来计算乙酰化氯霉素的部分，并因而分析CAT活性。免疫沉淀和DNA-蛋白激酶活性试验
HaCat细胞在10cm的培养皿中生长至接近连汇。然后将它们用Heat Systems Ultrasonic microtip以70％的功率在TGN缓冲液(50mMTris，pH7.5，50mM磷酸甘油，150mM NaCl，10％甘油，1％Tween20,1mM DTT,0.5ul/ml Sigma P8340蛋白酶抑制剂混合物，2nMmicroclystin LR)中超声10秒。离心后，用相同的缓冲液将抽提物调整至lmg/ml蛋白，贮存于-70℃。为检测DNA-蛋白激酶活性，将1mg的HaCat抽提物在4℃与2ug的羊抗FRAP或抗ATM抗体(Santa CruzBiotechnology)温育2小时，然后与40 ul的Protein G PLUS-琼脂糖(Santa Cruz Biotechnology)混合，并在4℃搅拌过夜。
离心收集琼脂糖珠，用TGN缓冲液洗涤，接着用高盐缓冲液(100mMTris，pH7.4,500mM LiCl)洗涤,然后用PK缓冲液(25mMHEPES-KOH,pH7.9,50mM KCl，10mM MgCl2,1mM DTT,0.5ul/mlSigma P8340蛋白酶抑制剂混合物，2nM microclystin LR,200uMATP)洗涤，并重悬于50ul PK缓冲液。反应的修改包括0.5ugλ-DNA或用G15T杀菌灯以250J.m2的UV-C辐射的λ-DNA、和40 ng/ml的纳巴霉素。为起始反应，将2.6ug的FKBP(Sigma Chemical Company)加入FRAP反应，然后将50ug的p53肽(氨基酸1-393,Santa CruzBiotechnology)和1nmol的ATP加入所有的DNA-蛋白激酶反应。在30℃温育2小时后，通过离心从琼脂糖珠中分离反应产物。
将反应产物在标准ELISA包被缓冲液(1.9g/L Na2CO3,2.93g/LNaHCO3,0.1g/L硫柳汞)稀释8倍，并取200ul置于Immulon 2HB 96孔ELISA板(Dynex Technologies Inc.,Chantilly，Virginia)的孔中，在4℃温育过夜。洗涤孔，并用5％牛血清白蛋白在室温封闭60分钟。然后孔与10ml TBS/NonI(25ml/L 2M Tris pH8,30ml/L 5M NaCl，0.1％Nonidet P-40)中的2.5ul偶联了生物素的抗磷酸丝氨酸-BSA抗体和2.5ul偶联了生物素的抗磷酸苏氨酸-BSA的抗体(Sigma ChemicalCompany)的混合物在室温温育60分钟。洗涤孔，并与100ul的10mlTBS/NonI中的10ul链亲和素-碱性磷酸酶(Sigma Chemical Company)混合物在室温温育60分钟。洗涤板，用0.1M二乙醇胺pH10中的磷酸硝基苯磷酸显色，用微板检测仪在405nm读数。
                      实施例1
本实施例证明了，UV接触后，正常的人角质细胞表达TNFα，以及这种表达受纳巴霉素抑制。
来自HaCat细胞系的人角质细胞用来自FS40日光灯的200J/m2UV-B辐射。并行的培养物用纳巴霉素以2ng/ml在辐射前30分钟以及之后60分钟进行处理。在37℃温育24小时后，通过将它们刮入磷酸盐缓冲液并用一台超声仪(Heat SysTems Ultrasonicator)的小超声头以70％的最大功率对它们进行超声处理2秒钟来从这些细胞制备抽提物。
然后将10微克的蛋白上样于15％聚丙烯酰胺凝胶的每个孔并进行电泳。分离的蛋白用半干电转印洗脱到硝酸纤维纸上，并用抗人TNFα的抗体检测。使用人TNFα样品作为标准。
如图4所示，UV诱导TNFα，如泳道1中所见。2ng/ml的纳巴霉素抑制TNFα的表达，如泳道2中该条带的大大减少所见。与此相对，脂多糖(LPS)通过与细胞表面膜受体CD14的结合在不损伤DNA的情况下诱导TNFα。用1ug/ml LPS处理的细胞诱导TNFα(见泳道3)，而纳巴霉素对这种LPS诱导的TNFα没有影响(泳道3与泳道4的比较)。
                      实施例2
本实施例证明了，UV诱导的TNFαmRNA的表达受纳巴霉素抑制。
为证明这个原则，使用的人细胞携带了由肿瘤坏死因子α(TNFα)启动子控制下的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因组成的转基因。该系统已被用来研究那些能导致TNFα基因转录的刺激。CAT基因的转录很容易用一个通过薄层色谱检测氯霉素的乙酰化形式形成的简单酶学试验进行检测。这些试验的例子示于图5。
单独的底物示于泳道1，由未处理的细胞抽提物产生的背景乙酰化水平示于泳道2、6和9。TNFα启动子控制下的CAT表达由荧光氯霉素底物的乙酰化增加来反映，这在薄层层析试验中导致较快的迁移类型(从底部至顶部)。
TNFα受基因毒性处理如UV(泳道3、7和10)以及非基因毒性处理如用LPS处理(泳道12)诱导。UV诱导TNFα受纳巴霉素抑制(泳道5)，这证明DNA-蛋白激酶FRAP是DNA损伤至细胞因子TNFα基因表达的信号传导所必需。
与未处理的细胞相比，纳巴霉素单独没有影响(泳道4与泳道2比较)。TNFα诱导也被渥曼青霉素在500nM时抑制，这是抑制DNA-蛋白激酶的剂量(泳道8)，也被星形孢菌素在200nM时抑制(泳道11)，这是特异性抑制丝氨酸磷酸化的剂量，而后者又是DNA-蛋白激酶的特征性磷酸化类型。这些结果清楚地表明UV诱导的由TNFα启动子起始的表达一般都需要DNA-蛋白激酶，特别是FRAP激酶，并涉及丝氨酸残基的磷酸化。
与此相对，非基因毒物LPS对TNFα的诱导如图6的泳道12和13所示不受纳巴霉素的抑制。
总而言之，本实施例证明了，由UV-DNA损伤到TNFα转录的途径需要纳巴霉素敏感的DNA-蛋白激酶，而细胞膜或其他地方的非DNA损伤事件不涉及这种激酶。
                      实施例3
本领域众所周知，FRAP激酶活化的途径下游是p70S6K激酶的磷酸化，后者又磷酸化核糖体蛋白，并改变基因转录物的翻译。FRAP激酶的UV特异的活化的一种测量指标因此是p70S6K的磷酸化。本实施例使用这种测量指标来证明这种活化。
人角质细胞用2ng/ml的纳巴霉素预处理，然后用UV辐射或LPS处理，并按上面(见实施例1和材料与方法)的介绍进行抽提。将抽提物在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后在Western印迹中用对p70S6K的丝氨酸/苏氨酸磷酸化形式特异的抗体进行检测。作为一种上样控制，该聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝进行染色，以确定每个泳道上荷载的所有蛋白。
如图7所示，UV辐射增加了p70S6K的磷酸化(泳道1和2比较)，这种磷酸化被纳巴霉素预处理所阻断(泳道3)。与此相对，LPS诱导的p70S6K磷酸化(泳道4)相对说来对纳巴霉素不敏感(泳道4和5)。该图底部所示的荷载对照条带证明凝胶上荷载的蛋白相等。
                      实施例4
本实施例证明了损伤或断裂DNA对DNA-蛋白激酶活性的直接激活。
人角质细胞系HaCat抽提物中的ATM或FRAP通过与(1)抗ATM或FRAP的抗体以及(2)与琼脂糖珠偶联的免疫沉淀性抗抗体温育而免疫沉淀。
通过离心收集结合的ATM或FRAP，然后与一种衍生自p53蛋白的磷酸化底物肽混合，在FRAP的场合，与其小亚单位蛋白FKBP结合。在某些场合，将噬菌体λDNA、UV辐射的DNA或纳巴霉素加入到反应中。然后加入腺苷三磷酸，将反应物在30℃温育2小时。然后将反应产物结合于一个ELISA板，并用磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸特异的抗体进行检测。这些抗体结合通过(1)与碱性磷酸酶偶合的二抗和(2)硝基酚磷酸底物进行检测。所产生的黄颜色使用多孔板记录仪在405nm处通过光密度进行测量。
结果示于图8。如图中所示，p53肽的FRAP磷酸化被λ-DNA的加入所刺激，λ-DNA的较短大小代表了具有许多断裂末端的哺乳动物DNA(FRAP/FKBP/p53条与+DNA条比较)。但是，当加入的DNA首先用UV辐射以诱导光产物时，FRAP的活性要高得多(+DNA条与+UV-DNA条比较)。这种UV-DNA增强的磷酸化可通过与2ng/ml纳巴霉素共同温育而完全消除(+纳巴霉素条)。与此类似，ATM磷酸化的p53肽(ATM/p53条)及其磷酸化被λ-DNA的加入而刺激，后者的较短大小代表了断裂DNA。
                      实施例5
本实施例显示，纳巴霉素减少UV诱导的TNFα的能力是剂量依赖的。
用100J/m2 UV-B辐射以诱导TNFα启动子下的CAT基因表达的XPTNF2细胞与浓度不断增加的纳巴霉素一起温育。该启动子下的表达的抑制水平示于图9。
如这里所显示的，在纳巴霉素的水平低于2ng/ml时，这种DNA-蛋白激酶抑制剂的抑制效果检测不到。在2ng/ml时可以检测到抑制效果，在剂量提高时抑制效果也增加。
虽然这里已介绍和说明了本发明的特殊实施方案，但应当理解，可以在不偏离本发明的精神和范围的前提下对它们进行修改。
上面引用的各种参考文献的内容在此以参考文献的形式引入。

Claims (47)

1．对人进行处理以抑制由于接触基因毒物而产生的细胞因子释放的方法，所说的方法包括将一种DNA-蛋白激酶抑制剂以足以抑制细胞因接触基因毒物而产生的细胞因子释放的剂量给予所说的人。
2．权利要求1的方法，其中基因毒物是紫外线。
3．权利要求1的方法，其中基因毒物是一种化疗试剂或放疗试剂。
4．权利要求1的方法，其中DNA-蛋白激酶抑制剂是纳巴霉素。
5．权利要求1的方法，其中DNA-蛋白激酶抑制剂以足以抑制选自白介素-1、白介素-6、肿瘤坏死因子α、白介素-10和细胞间粘附分子1的至少一种细胞因子的释放的剂量进行给药。
6．对人进行处理以抑制由于接触基因毒物而产生的细胞因子释放的方法，所说的方法包括将一种DNA-蛋白激酶抑制剂以足以减少至少一种DNA-蛋白激酶的活性并因而抑制细胞因接触基因毒物而产生的细胞因子释放的剂量给予所说的人。
7．权利要求6的方法，其中基因毒物是紫外线。
8．权利要求6的方法，其中基因毒物是一种化疗试剂或放疗试剂。
9．权利要求6的方法，其中DNA-蛋白激酶抑制剂是纳巴霉素。
10．权利要求6的方法，其中DNA-蛋白激酶抑制剂以足以减少选自DNA-PK、ATM、ATR和FRAP的至少一种DNA-蛋白激酶的活性的剂量进行给药。
11．权利要求6的方法，其中DNA-蛋白激酶抑制剂抑制选自白介素-1、白介素-6、肿瘤坏死因子α、白介素-10和细胞间粘附分子1的至少一种细胞因子的释放。
12．修饰一种基因毒物的效果的方法，包括通过调节DNA-蛋白激酶活性来修饰由基因毒物的DNA损伤效果产生的细胞因子释放。
13．治疗一种基因毒物的副作用的方法，包括通过调节DNA-蛋白激酶活性来减少细胞因子释放并同时保留基因毒物的DNA损伤效果。
14．权利要求13的方法，其中副作用选自皮肤癌、红斑、病毒激活、炎症、发烧、恶心、呕吐、头疼、发冷、异常色素、脱发或其组合。
15．减少正在经历移植排斥治疗的病人的至少一种副作用的方法，包括：
(a)以第一种剂量水平给予一种能抑制移植排斥的化合物；并
(b)在病人接触基因毒物时给予另一个剂量的所说化合物，所说化合物是一种DNA-蛋白激酶抑制剂。
16．权利要求15的方法，其中化合物是纳巴霉素。
17．减少正在经历移植排斥治疗的病人的至少一种副作用的方法，包括：
(a)给予病人能抑制移植排斥的第一种化合物；并
(b)在病人接触基因毒物时给予病人第二种能抑制移植排斥的化合物，所说的第二种化合物是一种DNA-蛋白激酶抑制剂。
18．权利要求17的方法，其中第一种化合物是环孢霉素A。
19．权利要求17的方法，其中第二种化合物是纳巴霉素。
20．进行移植排斥治疗的方法，包括对需要这种治疗的病人以足以抑制因接触基因毒物而产生的细胞因子释放的剂量给予一种能抑制移植排斥的化合物，所说的化合物是一种DNA-蛋白激酶抑制剂。
21．权利要求20的方法，其中化合物是纳巴霉素。
22．进行移植排斥治疗的方法，包括对需要这种治疗的病人以足以同时控制移植排斥和抑制因接触基因毒物而产生的细胞因子释放的剂量给予一种化合物，所说的化合物是一种DNA-蛋白激酶抑制剂。
23．权利要求22的方法，其中化合物是纳巴霉素。
24．进行移植排斥治疗的方法，包括对需要这种治疗的病人以足以提供对移植排斥控制的剂量给予第一种化合物，并以足以同时提供对移植排斥的控制和抑制因接触基因毒物而产生的细胞因子释放的剂量给予第二种化合物，所说的第二种化合物是一种DNA-蛋白激酶抑制剂。
25．权利要求24的方法，其中第一种化合物是环孢霉素A。
26．权利要求24的方法，其中第二种化合物是纳巴霉素。
27．增强细胞因子释放的方法，包括(a)给予人的组织或器官至少一种基因毒物，并(b)以足以增强该组织或器官应答于该基因毒物的细胞因子释放的剂量将至少一种DNA-蛋白激酶增强剂给予所说的组织或器官。
28．权利要求27的方法，其中组织或器官正经受一种炎症疾病。
29．权利要求28的方法，其中组织或器官是皮肤，炎症疾病是牛皮癣，而基因毒物选自煤焦油和补骨脂素+光。
30．监测一种免疫抑制试剂给药于病人的方法，所说的免疫抑制剂是至少一种DNA-蛋白激酶的抑制剂，所说的方法包括：
(a)从病人获取一个细胞样品；并
(b)测定样品中所说的至少一种DNA-蛋白激酶的活性水平。
31．权利要求30的方法，包括根据步骤(b)的测定来调整免疫抑制剂的剂量、方案或传递途径中至少一个的进一步步骤。
32．权利要求30的方法，其中免疫抑制剂是纳巴霉素。
33．测定个体对一种或以上的基因毒物的敏感性的方法，包括：
(a)从个体获取一个细胞样品；并
(b)对所说的样品测定至少一种DNA-蛋白激酶的活性水平。
34．测定个体对一种基因毒物的敏感性的方法，包括：
(a)从个体获取一个细胞样品；并
(b)对所说的样品测定DNA-蛋白激酶的活性水平，其中DNA-蛋白激酶对所说的基因毒物产生的DNA损伤类型来说是特异的。
35．在一种生物样品中测定DNA-蛋白激酶活性的方法，包括：
(a)从该样品中分离DNA-蛋白激酶；
(b)将分离的激酶同时与该激酶敏感的DNA损伤以及该激酶能够磷酸化的底物作用；并
(c)测定底物磷酸化的水平，所说的水平是该激酶活性的指示。
36．权利要求35的方法，其中底物磷酸化的水平使用一种对该底物磷酸化形式特异的抗体进行测定。
37．含有一种DNA-蛋白激酶抑制剂和一种基因毒物的组合物。
38．权利要求37的组合物，其中基因毒物是一种化疗试剂。
39．权利要求37的组合物，其中基因毒物是煤焦油。
40．含有一种DNA蛋白-激酶抑制剂和补骨脂素的组合物。
41．含有一种DNA-蛋白激酶抑制剂和免疫抑制剂的组合物，其中免疫抑制剂不是一种DNA-蛋白激酶抑制剂。
42．权利要求41的组合物，其中DNA-蛋白激酶抑制剂是纳巴霉素，而非DNA-蛋白激酶抑制剂的免疫抑制剂是环孢霉素A。
43．含有一种DNA-蛋白激酶抑制剂和一种非DNA-蛋白激酶抑制剂的基因保护性试剂的组合物。
44．权利要求43的组合物，其中非DNA-蛋白激酶抑制剂的基因保护性试剂是一种遮光剂。
45．权利要求43的组合物，其中非DNA-蛋白激酶抑制剂的基因保护性试剂是一种DNA修复酶。
46．权利要求43的组合物，其中DNA-蛋白激酶抑制剂是纳巴霉素。
47．减少对病人给药或传递化疗或放疗的副作用的方法，包括将一种DNA-蛋白激酶抑制剂给予病人的消化道、头皮或化疗或放疗给药或传递的位置中的至少一处。
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