JP2002502820A

JP2002502820A - 遺伝子毒性エージェントへの反応によるサイトカインの放出を調節する組成物及び方法

Info

Publication number: JP2002502820A
Application number: JP2000530217A
Authority: JP
Inventors: ヤロッシュ、ダニエル・ビー
Original assignee: アプライド・ジェネティクス・インコーポレーテッド・ダーマティクス
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1999-02-04
Publication date: 2002-01-29
Also published as: CA2319567A1; EP1052998A4; CN1296413A; IL137253A0; AU2494499A; EP1052998A1; WO1999039720A1

Abstract

(57)【要約】遺伝子毒性エージェントへの反応によるサイトカイン放出の未知の機構、及びこの機構に基づく治療及び診断法及び技術を開示する。この機構は、ＤＮＡプロテインキナーゼによる損傷を受けたＤＮＡの認識、及び、これに続く基質のリン酸化を含み、サイトカインの放出を導く。ＤＮＡプロテインキナーゼの活性及び遺伝子毒性エージェントへの反応によるサイトカインの放出を調調節する方法を開示する。この調節をモニターするのに使用することのできるＤＮＡプロテインキナーゼ活性のためのアッセイもまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連仮出願の相互参照本出願は、１９９８年２月４日に出願された、米国仮特許出願第６０／０７３
，６４０号のＵＳＣ第１９９条（ｅ）に基づく権利を請求する。

【０００２】

【発明の分野】

本発明は、サイトカイン及び遺伝子毒性エージェントに関する。より特定する
と、本発明は、一つ以上の遺伝子毒性エージェントへの暴露による細胞からのサ
イトカインの放出を制御することのできる、例えば、調節することのできる、組
成物及び方法に関する。

【０００３】

【発明の背景】

Ａ．遺伝子毒性エージェント当技術分野に周知のように、遺伝子毒性エージェントとは、直接又は間接的に
、ＤＮＡに損傷を生じるか又は誘導する、化学物質、又は、熱又は放射線のよう
な処理である。このような損傷は、突然変異、細胞周期の停止、及び／又は細胞
死を導き得る。損傷は、核酸塩基又は糖−リン酸骨格に生じ得るか、又は、ＤＮ
Ａ鎖の１本鎖又は２本鎖の破壊であり得る。突然変異が生じるとき、それは、細
胞機能の遺伝的な変化を導くＤＮＡ配列又はＤＮＡ修飾パターンの遺伝的変化で
あり得る。

【０００４】遺伝子毒性エージェントは、紫外線又は電離放射線のような天然成分として、
又は、アフラトキシンのような、食品中の天然汚染物として、又は、タバコの煙
中又は産業排気中のベンゾ［ａ］ピレン類のような人為的汚染環境中に見出され
る。遺伝子毒性エージェントは、薬物学的及び健康に関連する目的のためにも使
用することができる。例えば、多くの抗ガン放射線療法及び化学療法は、遺伝子
毒性エージェントである。同様に、ヒト及び動物が最もしばしば曝される遺伝子
毒性エージェントである紫外線は、日焼けのような有益な目的の為に使用するこ
とができる。加えて、光線又は電離放射線は、皮膚病学及び抗ガン治療のため及
び血液の滅菌のために、光線に感受性のある薬物と組み合わせることができる。

【０００５】遺伝子毒性エージェントに対する生体の反応の一つは、ＤＮＡ修復を行うため
に、細胞周期を停止することである。このような修復は、細胞内のＤＮＡ修復酵
素の濃度、ＤＮＡ損傷の程度及び種類などによって成功したり又は成功しなかっ
たりする。細胞周期の停止は、修復しない細胞分割の結果である遺伝物質への急
性損傷を防ぐための重要な役割をもたらす。損傷が修復不能である場合、細胞が
細胞死応答、すなわち、プログラムされた細胞死への経路を取る。細胞周期の停
止及び／又は細胞死を導く細胞内での分子信号の一般的なプロセスは、最近、Ｐ
．Ｈｅｒｒｌｉｃｈ、Ｃ．Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ａ．Ｋｎｅｂｅｌ、Ｋ．Ｂｅｎｄ
ｅｒ、及びＨ．Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ、“Ｎｕｃｌｅａｒａｎｄｎｏｎ−ｎｕ
ｃｌｅａｒｔａｒｇｅｔｓｏｆｇｅｎｏｔｏｘｉｃａｇｅｎｔｓｉｎ
ｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｈ
ａｒｅｄｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｉｎｙｅａｓｔ，ｒｏｄｅｎｔｓ，ｍａｎ
ａｎｄｐｌａｎｔｓ，”ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７
８巻、１２１７頁乃至１２２９頁、１９９７年、及び、Ｊ．Ｙ．ＪＷａｎｇ、
“ＣｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏＤＮＡｄａｍａｇｅ”、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、１０巻、２
４０頁乃至２４７頁、１９９８年で検討されている。

【０００６】Ｂ．遺伝子毒性エージェントの長期的作用−ＤＮＡの変異遺伝子毒性エージェントの長期的作用は、ＤＮＡの変異であり、これは、ＤＮ
Ａ修復が不成功の場合に生じる。これらの変異は、ＤＮＡ配列の遺伝的な変化で
あり、ヒトの発ガンの行程での不可欠な要素である。これらの行程の全てが、突
然変異の固定、すなわち、ＤＮＡ変化の永久的な確立からガンの進行を導くわけ
ではない。遺伝子毒性エージェントへの暴露とガンの進行の間の長く、何年にも
わたる、潜伏期が存在することが、ヒトのほとんどのガンでの特徴である。変異
は、遺伝子毒性への暴露後すぐに固定されるという事実にもかかわらず、これは
真実である。腫瘍促進（ｔｕｍｏｒｐｒｏｍｏｔｉｏｎ）とよばれる、変異し
た細胞を含む組織の変化の進行は、遺伝子毒性エージェントにより誘導されるサ
イトカインの放出により促進され、腫瘍の発現を導く。

【０００７】Ｃ．遺伝子毒性エージェントの短期的作用−サイトカインの放出動物及びヒトでの遺伝子毒性エージェントの重要な短期的作用の一つは、全身
的であり、紅斑、炎症、熱、抗原特異性免疫抑制、及び他の身体的作用を含む。
これらの作用は、サイトカインにより媒介される（例えば、Ｔ．Ｌｕｇｅｒ及び
Ｔ．Ｓｃｈｗａｒｚ、“Ｅｐｉｄｅｒｅｍａｌｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｃ
ｙｔｏｋｉｎｅｓ”、ＳｋｉｎＩｍｍｕｎｅＳｙｓｔｅｍ、Ｊ．Ｄ．Ｂｏｓ
編集、ＣＲＣＰｒｅｓｓＩｎｃ．、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、Ｆｌａ．、１９
９０年、２５７頁乃至２９１頁を参照のこと）。本発明は、これらのサイトカイ
ンに基づく遺伝子毒性エージェントに対する反応に関する。

【０００８】本技術分野において、サイトカインは、一つの細胞から放出され、他の細胞及
び／又はその細胞の活性に影響する、多数で、そして変形した種類のタンパク質
である。サイトカインの濃度は、細胞機能の原因に対応して調節されることがし
ばしばであり、そして、遺伝子毒性エージェントに曝された組織、器官系、及び
有機体全体の反応及びホメオスタシスを調整するのに役立つ。

【０００９】サイトカインは、個々に放出されることは分かっていない。むしろ、それらは
、遺伝子毒性エージェントへの特徴的な反応内容を形成する群として放出される
。例えば、太陽のＵＶ（遺伝子毒性エージェント）による日焼けは、同時に（ａ）熱を引き起こすインターロイキン−１（ＩＬ−１）の発現、（ｂ）肝臓機能を
流動化（ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ）するインターロイキン−６（ＩＬ−６）、（ｃ）
炎症を誘導し、局部的な抗体特異的免疫抑制を導き、そして潜伏性ウイルスを活
性化させる、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、（ｄ）サプレッサーＴ細胞を誘導す
るインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、（ｅ）リンパ球の侵入を制御する細
胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）の瞬時の減少及びそれに続く増加、及び、（ｆ
）免疫反応及び多くの他のサイトカインを調節するインターフェロンγ（ＩＦＮ
γ）の減少、を誘導する。

【００１０】細胞外シグナリングという語において、最も重要なサイトカインは、ＴＮＦα
及びＩＬ−１であるが、これは、それら自身生理的な反応を生じさせることがで
きるのみだけでなく、他の離れた細胞からのサイトカインの発現を誘導すること
ができるためである。遺伝子毒性エージェントにより引き起こされる、サイトカ
インをベースとする細胞外シグナリングを制御することは本発明の第一の目的の
一つである。

【００１１】サイトカインの作用の最も共通な機能は、細胞からの放出と、他の細胞への移
動である。しかし、サイトカインは、損傷を受けた細胞の表面に配置されること
により細胞外シグナリングに作用する場合もある。したがって、本明細書におい
て、「サイトカイン放出」及び「サイトカイン生成」という節は、細胞からのサ
イトカインの実際の放出による細胞外シグナリング及び細胞表面でのサイトカイ
ンの細胞外への配置による細胞外シグナリングの両方を含む。これらの語は、デ
ノボ合成、前駆体プロセッシング、細胞内輸送、細胞外放電（ｅｘｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｒｄｉｓｃｈａｒｇｅ）、及びサイトカインの表面配置を含み、これ
らに制限されない、細胞外サイトカインシグナリングの増大をもたらす細胞機構
のいずれをも含むように広範に解釈される。

【００１２】Ｄ．遺伝子毒性エージェントの作用機構についての当技術分野の誤解（１）誤った厳密な二分法理論今日まで、当業者は、ＤＮＡに対する損傷は、細胞周期の突然の停止に相当し
、これはＤＮＡの変異の固定又は遺伝子毒性エージェントへの暴露に続く細胞死
反応を導き得ると考えていた。この理論は、Ｌ．Ｈ．Ｈａｒｔｗｅｌｌ及びＭ．
Ｂ．Ｋａｓｔａｎにより“Ｃｅｌｌｃｙｃｌｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｃ
ａｎｃｅｒ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６巻、１８２１頁乃至１８２８頁、１９９
４年に見受けられる。

【００１３】一方、サイトカインの誘導は、細胞膜への損傷、すなわち、細胞核から除去さ
れた標的への損傷の結果起こるものと考えられていた。この理論は、Ｐ．Ｂａｒ
ｎｅｓ及びＭ．Ｋａｒｉｎの“Ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ κＢ：ａｐｉ
ｖｏｔａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｃｈｒｏｎｉ
ｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｓ”、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、３３６巻、１０６６頁乃至１０７
１頁に見受けられる。

【００１４】以下に記載するように、本発明に従うと、この考え、すなわち、（ａ）細胞内
シグナリングを導くＤＮＡ（核）への損傷及び（ｂ）細胞外シグナリングを導く
膜（細胞質）への損傷の影響での間での厳密な二分法が存在するという考えが誤
りであることが明らかになった。実際、遺伝子毒性エージェントへの暴露により
引き起こされたＤＮＡの損傷は、サイトカインの生成を経て細胞外シグナリング
を導く。

【００１５】さらに、本発明によると、この機構によるサイトカインの生成は、ＤＮＡプロ
テインキナーゼを要求することが見出された。その結果として、遺伝子毒性エー
ジェントへの暴露により生じるサイトカインの生成は、ＤＮＡプロテインキナー
ゼのレベル及び／又は活性を制御することにより制御することができる。この制
御機構は、高度に有効であり、以前は知られておらず、従って使用されていない
。

【００１６】（２）誤った厳密な二分法理論へ導く証拠サイトカインの誘導は細胞膜の変異にのみに基づくという従来の考え方の証拠
は、非常に強力である。サイトカイン遺伝子発現を活性化することのできるいく
つかのタンパク質の活性化を導く経路が確立されている。これらの経路は、すべ
て細胞外膜に位置するプロテインキナーゼに始まり、そして、これらのプロテイ
ンキナーゼのほとんどが、外部が細胞受容体である膜内外のタンパク質の内部の
細胞質部分に関する（Ｙ．Ｄｅｖａｒｙ、Ｒ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、Ｔ．Ｓｍｅａ
ｌ及びＭ．Ｋａｒｉｎ、“Ｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｕｌｔｒａｖｉｏｌｅ
ｔｒｅｓｐｏｎｓｅｉｓｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙａｃｔｉｖａｔｉｏ
ｎｏｆＳｒｃｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｓ”、Ｃｅｌｌ、７１巻、
１０８１頁乃至１０９１頁、１９９２年を参照のこと）。

【００１７】これらのプロテインキナーゼは、細胞核から離れた細胞膜において活性化され
、そして付加的な細胞質キナーゼを活性化するが、これはＡＰ−１及びＮＦκＢ
のような遺伝子活性因子系のリン酸化をもたらす。これらの修飾された又は放出
された遺伝子活性化因子のＤＮＡ結合部位は、サイトカインをコードする遺伝子
のプロモーター領域に見出されることがしばしばである。例えば、Ｓ．Ｔａｋａ
ｓｈｉｂａ、Ｌ．Ｓｈａｐｉｒａ、Ｓ．Ａｍａｒ、及びＴ．ＶａｎＤｙｋｅら
、“Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｕ
ｍａｎＴＮＦα ｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎ”、Ｇｅｎｅ、１３１巻、
３０７頁及び３０８頁、１９９３年に記載されているように、ＴＮＦα遺伝子の
プロモーター配列に、これらの結合部位の多くが見出されている。したがって、
これらの膜活性化因子をサイトカイン遺伝子のプロモーター領域のそれらの結合
部位に結合することが、細胞膜での変化による、サイトカイン発現の変化をもた
らす経路であると仮定されている。

【００１８】さらに、厳密な二分法理論の証拠は、ＵＶのような遺伝子毒性エージェントが
、直接細胞表面受容体を三量化することができ、シグナルの変換及び遺伝子発現
を導くと仮定されるカスケードを開始するキナーゼを活性化することを示す最近
の報告に由来する。例えば、Ｉ．Ｗａｒｍｕｔｈ、Ｈ．Ｈａｒｔｈ、Ｍ．Ｍａｔ
ｓｕｉ、Ｎ．Ｗａｎｇ、及びＶ．ＤｅＬｅｏ、“Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｒ
ａｄｉａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆ
ｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ
”、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、５４巻、３７４頁乃至３７６頁、１９９
４年、及びＣ．Ｒｏｓｅｔｔｅ及びＭ．Ｋａｒｉｎ、“Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ
ｌｉｇｈｔａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｏｆｔｈｅＪＮＫｃａｓｃａｄｅｔｈｒｏｕｇｈｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｓ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻、１１９４頁乃至１１９７頁、１９９６年を参
照のこと。

【００１９】しかし、最強の証拠は、紫外線（ＵＶ）照射に続く熟知されたサイトカイン放出系に由来する。例えば、Ｔ．Ｓｃｈｗａｒｚ及びＴ．Ｌｕｇｅｒ、“ＥｆｆｅｃｔｏｆＵＶｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｏｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅ
ｌｌｃｙｔｏｋｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻、１乃至１３頁、１９８９年。ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ−１及びＩＦＮγのような多くのサイトカインは、細胞をＵＶへ曝すと同時に、遺伝子発現レベル及び放出が変化することが知られている
。

【００２０】この系を使用し、（ａ）遺伝子活性化が、完全に膜に依存するかを明確に示し、及び（ｂ）サイトカイン遺伝子活性化の標的としてＤＮＡを除去することを考
えるための実験を行った。例えば、Ｙ．Ｄｅｖａｒｙ、Ｃ．Ｒｏｓｅｔｔｅ、Ｊ．ＤｉＤｏｎａｔｏ及びＭ．Ｋａｒｉｎ“ＮＦκＢａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂ
ｙｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｌｉｇｈｔｉｓｎｏｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｏｎａｎｕｃｌｅａｒｓｉｇｎａｌ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１巻、１
４４２頁乃至１４４５頁、１９９３年、及びＭ．Ｓｉｍｏｎ、Ｙ．Ａｒａｇａｎ
ｅ、Ａ．Ｓｃｈｗａｒｚ、Ｔ．Ｌｕｇｅｒ、及びＴ．Ｓｃｈｗａｒｚ、“ＵＶＢ
ｌｉｇｈｔｉｎｄｕｃｅｓｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ κＢ（ＮＦκ
Ｂ）ａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｆｒｏｍｃｈｒｏｍ
ｏｓｏｍａｌＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｃｅｌｌ−ｆｒｅｅｃｙｔｏｓ
ｏｌｉｃｅｘｔｒａｃｔｓ”、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１０２巻、４２２頁乃至４２７頁、１９９４
年を参照のこと。

【００２１】これらの広く引用された実験においては、細胞を脱核（核を除くために化学的
及び物理的に処理される）し、そして得られる細胞質にＵＶを照射したものもあ
る。核（及びゲノムＤＮＡ）が存在しないにもかかわらず、遺伝子転写エンハン
サーＮＦκＢの活性化を検出した。

【００２２】おそらく、これらの実験は、当業者の間で、遺伝子毒性エージェント処理に続く
サイトカイン遺伝子発現の誘導は、ＤＮＡ損傷に依存せず、そして細胞膜に完全
に依存しているという広範な考えを導くことは、驚くべきことではない。例えば
、Ｇ．Ｖｉｌｅ、Ａ．Ｔａｎｅｗ−Ｉｌｉｔｓｃｈｅｗ及びＲ．Ｔｙｒｒｅｌｌは、“ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦκＢｉｎｈｕｍａｎｓｋｉｎ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｂｙｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ
ｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙＵＶＡｒａｄｉａｔｉｏｎ”、ＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、６２巻、４６３頁乃至４６８頁、１９９５年には、「しかし、ＵＶＣ照射に依存するＮＦκＢの活性化は、
脱核された細胞でも生じ、ＵＶＢ照射に依存する活性化も、核の存在しない細胞抽出物において生じることが示された。したがって、少なくとも、これらの二つの物質では、核は、活性経路に含まれないことが明らかである。」と要約されてい
る。

【００２３】ＤＮＡ損傷は、サイトカイン遺伝子発現の誘導を開始する事象であり得る証拠が存在する。これらの報告は、ＤＮＡ修復が不十分である細胞内での遺伝子毒性
エージェントの量を低くするように移動するという、サイトカイン遺伝子発現の
用量依存性の関係を示す（Ｂ．Ｓｔｅｉｎ、Ｈ．Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ、Ａ．Ｓｔ
ｅｆｆｅｎ、Ｍ．Ｌｉｔｆｉｎ、及びＰ．Ｈｅｒｒｌｉｃｈ、“ＵＶ−ｉｎｄｕ
ｃｅｄＤＮＡｄａｍａｇｅｉｓａｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｔ
ｅｐｉｎＵＶ−ｉｎｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎ
ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１、ｃｏｌｌａ
ｇｅｎａｓｅｃ−ｆｏｓａｎｄｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ”、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、９巻、５１６９
頁乃至５１８１頁、１９８９年参照）、及び外因性ＤＮＡ修復酵素の運搬による
ＤＮＡ修復の増加が、サイトカインの発現又は放出を減少する（Ｄ．Ｙａｒｏｓ
ｈ、Ｌ．Ａｌａｓ、Ｊ．Ｋｉｂｉｔｅｌ、Ａ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｆ．Ｃａｒｒ
ｉｅｒ、及びＡ．Ｆｏｒｎａｃｅ、“Ｃｙｃｌｏｂｕｔａｎｅｐｙｒｉｍｉｄ
ｉｎｅｄｉｍｅｒｓｉｎＵＶ−ＤＮＡｉｎｄｕｃｅｒｅｌｅａｓｅ
ｏｆｓｏｌｕｂｌｅｍｅｄｉａｔｏｒｓｔｈａｔａｃｔｉｖａｔｅｔ
ｈｅｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｐｒｏｍ
ｏｔｅｒ”、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１００巻、７９０頁乃至７９４頁、１９９３年）。

【００２４】しかし、本発明がなされる以前は、遺伝子毒性エージェントにより生じたＤＮ
Ａ損傷がサイトカイン遺伝子発現の活性化（当業者により容易に認識される欠損
）に翻訳される認知された生化学的機構は存在しなかった。例えば、Ｈｅｒｒｌ
ｉｃｈ、Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｋｎｅｂｅｌ、Ｂｅｎｄｅｒ、及びＲａｈｍｓｄｏ
ｒｆは、１９９７年に、ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（前出）の
１２２３頁に、「結論として、酵母は、哺乳類細胞での転写抑制のＤＮＡ損傷に
依存する経路を共有する。成分は、酵母の遺伝子のために、よりよく特徴付けら
れる。それにもかかわらず、損傷の認識及びシグナリングの性質は、理解されて
いない。」と記載している。同様に、ＳｔｅｐｈｅｎＪａｃｋｓｏｎは、１９９７年に、“ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ”、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、２９巻、９３５頁乃至９３８頁におい
て、９３７頁に、「さらに、プロテインキナーゼリン酸化カスケードを誘発する
ことにより、ＤＮＡ−ＰＫ活性化は、細胞ＤＮＡ損傷シグナリング経路を誘導し
、これは、転写、細胞死、及び細胞周期機構に影響を与えることが可能である。しかし、シグナリングにおける役割の直接の証拠が示されていない。」さらに、よ
り最近では、ＪｅａｎＷａｎｇが、１９９８年に、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ（前出）、２４２頁において、「ＵＶ
反応は、原形質膜により媒介され得る。ＵＶ誘導障害（シクロブタン二量体及び
他のフォトアダクツ（ｐｈｏｔｏａｄｄｕｃｔｓ））は、哺乳細胞においてＲａ
ｄ３／ＡＴＭ様のタンパク質を活性化するシグナルを生成し得るかどうかは知ら
れていない。」と記載している。Ｈｅｒｒｌｉｃｈ及びＲａｈｍｓｄｏｒｆ実験
室は、１９９７年の当業界の見方を１９９８年に、Ｃ．Ｂｌａｔｔｎｅｒ、Ｋｌ
ａｕｓＢｅｎｄｅｒ、ＰｅｔｅｒＨｅｒｒｌｉｃｈ、及びＨａｎｓＲａｈ
ｍｓｄｏｒｆ、“Ｐｈｏｔｏｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎａｌｌｙａｃｔｉｖｅＤＮＡｉｎｄｕｃｅｓｉｇｎａｌｔｒａｎ
ｓｄｕｃｔｉｏｎｔｏｔｈｅｄｅｌａｙｅｄＵ．Ｖ．−ｒｅｓｐｏｎｓ
ｉｖｅｇｅｎｅｓｆｏｒｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅａｎｄｍｅｔａｌｌ
ｏｔｈｉｏｎｅｉｎ”、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１６巻、２８２７頁乃至２８３４頁
に繰り返しており、２８３２頁には、「転写された遺伝子中のＤＮＡ障害をシグ
ナル変換に導くプロセスが知られていない」ことが記載されている。

【００２５】重要なつながりである生化学的機構なしに、ＤＮＡ損傷がサイトカイン遺伝子
発現の誘導を開始する事象であり得るというデータは、大きく無視されていた。
さらに、機構の知識なしに、機構の制御、従って、サイトカイン放出の制御が不
可能であることは明白である。本発明は、これら当技術分野において見落とされ
ていた要素を提供する。

【００２６】

【発明の要約】

上記のように、本発明の目的は、遺伝子毒性エージェントに曝されたときのサ
イトカインの放出を制御（調節）するための方法及び組成物を提供することであ
る。

【００２７】本発明の目的を特定すると、遺伝子毒性エージェントが、人及び動物が暴露さ
れる最も通常の遺伝子毒性エージェントである紫外線光線である場合の方法及び
組成物を提供し、及び、制御（調節）には、遺伝子毒性エージェントに対するサ
イトカインの放出を減少させることを含む。

【００２８】さらに、本発明の目的を特定すると、遺伝子毒性エージェントが、ガン治療に
使用される化学療法又は放射線療法エージェントである、方法及び組成物を提供
し、制御（調節）は、サイトカインの放出の減少を含む。

【００２９】さらに、本発明の目的は、臓器移植を受け、及び移植拒否を避けるために免疫
抑制剤を投与されている人の遺伝子毒性エージェント（例えば、紫外線照射）へ
の感受性を減少することである。

【００３０】本発明の追加の特定の目的は、遺伝子毒性エージェントが、免疫抑制剤であり
、制御（調節）は、遺伝子毒性エージェントに対してサイトカインの放出を増加
させることを含む。

【００３１】本発明の付加的な目的は、一つ以上の遺伝子毒性エージェントに対する個体の
反応（感受性）を調節するために、一つ以上のＤＮＡプロテインキナーゼのレベ
ル及び／又は活性を調節する必要のある個体を同定することである。この目的に
関連し、本発明のさらなる目的は、このような調節に必要のあるレベル及び／又
は活性である特定のＤＮＡプロテインキナーゼ又はキナーゼ類を同定することで
ある。

【００３２】本発明のさらなる目的は、免疫抑制剤が、遺伝子毒性エージェントに対するサ
イトカイン放出に作用するのに十分なＤＮＡプロテインキナーゼ活性における望
ましい減少又は増加をもたらすレベルで投与されるかどうかを決定するための方
法を提供する。

【００３３】本発明の追加の目的では、ＤＮＡプロテインキナーゼ活性のレベルの改良され
たアッセイを提供する。

【００３４】本発明は、ＤＮＡプロテインキナーゼ、ＤＮＡ中の、例えば、二本鎖の破壊な
どの変化を認識し、他のタンパク質及び／又は自身をリン酸化する種類の酵素が
、遺伝子毒性エージェントに反応してサイトカインを放出する役割を果たすとい
う発見を経て、上記及び他の目的を達成した。特に、一つ以上のＤＮＡプロテイ
ンキナーゼが、遺伝子毒性エージェントに曝された後のサイトカイン遺伝子の転
写及び／又は翻訳に必要とすることを発見した。

【００３５】本明細書において、「ＤＮＡプロテインキナーゼ」は、他のタンパク質及び／
又は自身をリン酸化することにより、ＤＮＡ構造又はコンフォメーションに変化
を引き起こすタンパク質及びタンパク質複合体の一連のファミリーである。これ
らの酵素のファミリーの特徴は、Ｓ．Ｊｉｎ、Ｓ．Ｉｎｏｕｅ及びＤ．Ｗｅａｖ
ｅｒらにより、“ＦｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＤＮＡＤｅｐｅｎｄｅ
ｎｔＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅ”、ＣａｎｃｅｒＳｕｒｖｅｙｓ、２９
巻、２２１頁乃至２６１頁、１９９７年で検討されている。

【００３６】これまで、これらの酵素は、（１）二本鎖ＤＮＡ破壊を含む遺伝子の再配列を
要求する免疫担当細胞の形成、（２）ＤＮＡ中の二本鎖破壊の修復、及び（３）
細胞周期の調整及びＤＮＡ損傷に対応する細胞死にのみ関与した。これらの関連
は、Ｍ．Ｈｏｅｋｓｔｒａにより“ＲｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏＤＮＡｄａｍ
ａｇｅａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅｃｈｅ
ｃｋｐｏｉｎｔｓｂｙｔｈｅＡＴＭｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｆ
ａｍｉｌｙ”、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、７巻、１７０頁乃至１７５頁、１９９７年で検討さ
れている。

【００３７】重要なことに、最も遍在する遺伝子毒性エージェントである、ＵＶ光線に関し
、ＤＮＡプロテインキナーゼのファミリーのいずれもが、細胞からＵＶ誘導され
たサイトカインの放出に関与しない。上記のように、サイトカイン遺伝子発現が
膜相互作用により制御されているという当業者の考えは、サイトカイン放出を導
くシグナル変換カスケードへ関与するものの中から、これらのＤＮＡプロテイン
キナーゼを除いた。

【００３８】例えば、上記に引用した考えのように、Ｍ．Ｈｏｅｋｓｔｒａは、１７０頁に
、「この文章において、著者は、細胞周期調整のためのセンサーとしてのＰＩＫ
キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼに関連した放出プロテインキナーゼ）ファミリーメ
ンバーの特徴を議論する。」と記載している。他の例では、Ｈｏｓｏｉらが、“
Ａｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｉｓｉｔｏｌ３−ｋｉｎａｓｅｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒｗｏｒｔｍａｎｎｉｎｉｎｄｕｃｅｓｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔ
ａｎｔＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓｃｅｌ
ｌｓｔｏｂｌｅｏｍｙｃｉｎａｎｄｉｏｎｉｚｉｎｇｒａｄｉａｔｉ
ｏｎ”、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ、
７８巻、６４２頁乃至６４７頁、１９９８年に、ウォルトマニンは、ＤＮＡプロ
テインキナーゼの阻害剤であるが、サイトカインについてのウォルトマニンの影
響は、膜結合フォスフォチジルイニシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３）の阻害に
起因することが例示されている。この文献の６４５頁に、著者は、「ウォルトマ
ニンは、ＰＩ３−キナーゼの不活性化によりサイトカイン／ケモカイン−媒介シ
グナル変換経路を阻害する・・・」と記載している。

【００３９】先行技術のこの記載は、図１に模式的に示されているが、上方の点線のボック
スは、ＤＮＡ損傷がＤＮＡプロテインキナーゼの活性化を導く従来の経路を示し
、キータンパク質基質をリン酸化し、次に、細胞外シグナリングにより、細胞周
期の停止及び細胞死を導く。一方、サイトカインの放出は、先行技術の下方の点
線のボックスの経路に影響し、遺伝子毒性エージェントが細胞膜及び／又は膜受
容体に作用し、脂質及びプロテインキナーゼカスケードを活性化し、次に、サイ
トカイン遺伝子発現及び細胞外サイトカイン放出を導く。

【００４０】図２は、本発明の遺伝子毒性反応経路を模式的に示す。図１と図２の第一の違
いは、図１の先行技術は、早期と後期の事象、すなわち、遺伝子毒性エージェン
トへの暴露３時間以内に生じる事象（早期の事象）と、暴露６時間以降に生じる
事象（後期の事象）を区別していないことである。この時間の次元は、本発明の
基礎を形成する発見の重要な観点である。

【００４１】図１と図２の経路でのさらにより基本的な違いは、図２は遺伝子毒性エージェ
ントによるＤＮＡの損傷を引き起こす影響の一つとしてサイトカインの生成を含
み、この生成は、紅斑、抗原特異的免疫抑制、メラニン形成、及び日焼けのよう
な生化学的影響を導くという事実である。この遺伝子毒性エージェントのサイト
カイン−生成への影響は、図２の右側のボックスの右下に示しており、このボッ
クスに示すように、この作用は、少なくとも一つのＤＮＡプロテインキナーゼの
作用による。

【００４２】異なる遺伝子毒性エージェントにより生じる、異なる種類のＤＮＡ損傷は、異
なる種類のＤＮＡプロテインキナーゼを活性化する。例えば、二本鎖の破壊は、
一般に、ＤＮＡ−ＰＫ及びＡＴＭとして知られているＤＮＡプロテインキナーゼ
を活性化し、ＤＮＡ中のＵＶ誘導されたフォトプロダクツは、ＦＲＡＰとして一
般に知られているＤＮＡプロテインキナーゼを活性化する。世界中の様々な実験
室において行われている研究は、このパターンに当てはまる他の形のＤＮＡ損傷
及び他の種類のＤＮＡプロテインキナーゼファミリーを同定することを予想して
いるが、本発明は、これらの続いて生じるＤＮＡ損傷／ＤＮＡプロテインキナー
ゼの組み合わせを同等に適用することができる。

【００４３】図２に示すように、本発明の基礎となる共通の特徴は、（１）ＤＮＡプロテイ
ンキナーゼは、変化したＤＮＡの認識の中心であり、そして（２）タンパク質の
下流のリン酸化は、サイトカイン遺伝子発現、すなわち、サイトカイン遺伝子の
転写及び／又は翻訳を導くことである。この発見に基づき、遺伝子毒性エージェ
ントに反応するサイトカインの生成は、一つ以上のＤＮＡプロテインキナーゼの
レベル又は活性化を調節することにより制御することができる。

【００４４】このような調節は、（１）一つ以上のＤＮＡプロテインキナーゼの活性を、一
つ以上の阻害剤を使用して阻害する、（２）一つ以上のＤＮＡプロテインキナー
ゼの生成に含まれる遺伝子の転写及び／又は翻訳を増大又は減少させる、及び／
又は（３）例えば、リン酸化を行う基質の高められたレベルに反応して及び／又
はともに、損傷されたＤＮＡのレベルを高めてキナーゼを提供することにより、
一つ以上のＤＮＡプロテインキナーゼの活性を高めることにより達成することが
できる。

【００４５】本発明の一つの特定の適用では、ラパマイシンのようなＤＮＡプロテインキナ
ーゼを阻害する化合物は、遺伝子毒性エージェントのようなサイトカインの誘導
を阻害するのに使用される。ＤＮＡプロテインキナーゼの他の阻害剤は、Ｓ．Ｐ
．Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒ、“ＴｈｅＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔ
ｅｉｎｋｉｎａｓｅ、ＤＮＡ−ＰＫ：１０ｙｅａｒｓａｎｄｎｏｅｎ
ｄｓｉｎｓｉｇｈｔ”、ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、７４巻、５０３頁乃至５１２頁、１９９６年に記載されているよ
うに、ピロリン酸塩、ウォルトマニン、６−ジメチルアミノプリン、ピリドン誘
導体であるＯＫ−１０３５、及び一本鎖ＤＮＡを含む。

【００４６】遺伝子毒性エージェントへの暴露は、環境汚染に曝すか、又は毎日の活性のあ
る太陽光に曝すように、故意でない場合もある。暴露は、故意の日焼け又はガン
の放射線療法又は化学療法のように、故意であり得、及び望ましくない副作用で
あり得る。サイトカインの誘導は、免疫抑制、炎症、ウィルスを活性化し、望ま
しくない色素沈着、ケロイド、癒着又は瘢痕、又は、遺伝子毒性エージェントの
暴露による他の一時的又は副作用を引き起こすために望ましくない。

【００４７】本発明のこれらの観点における特定の例は、紅斑、炎症、免疫抑制、潜伏性ヘ
ルペス感染の活性化、プロテアーゼの活性化（例えば、コラゲナーゼ及びメタロ
チオネインプロテアーゼ）及び皮膚ガンのような、太陽及び汚染のＤＮＡへの損
傷の望ましくない副作用を防ぐために、一つ以上のＤＮＡプロテインキナーゼ阻
害剤、例えば、ラパマイシン又はラパマイシン様の化合物を、スキンケア又はサ
ンケア化粧品及び薬物製品に組み込むことを含む。

【００４８】ラパマイシン又はラパマイシン様化合物のようなＤＮＡプロテインキナーゼは
、ガン化学療法剤又は放射線療法と組み合わせても使用することができ、これは
、熱、紅斑、吐き気、嘔吐、頭痛、悪寒、色素異常のような、このような療法に
伴う副作用を減少する。本発明のこれらの適用において、ＤＮＡプロテインキナ
ーゼ阻害剤又は阻害剤類は、好ましくは、太陽光線、空気汚染、化学療法、又は
、イオン化照射のような遺伝子毒性エージェントへの暴露に時間的に近接して適
用し、最も好ましくは、暴露の前３０分乃至１時間である。

【００４９】本発明は、臓器移植における免疫抑制療法の最も有害な副作用を避けるために
も使用し得る。臓器移植は、シクロスポリンのような寛容な免疫抑制化合物の導
入を全く通常に行う。しかし、この免疫抑制療法の主な副作用は、これらの患者
の皮膚を太陽に曝すと皮膚ガンを起こすことである。Ｍ．Ｃｌｏｖｅｒ、Ｃ．Ｐ
ｒｏｂｙ、及びＩ．Ｌｅｉｇｈ“Ｓｋｉｎｃａｎｃｅｒｉｎｒｅｎａｌ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｐａｔｉｅｎｔｓ”、ＣａｎｃｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ、４５巻、２２０頁乃至２２４頁、１９９３年。

【００５０】シクロスポリンが免疫抑制をもたらす機構は、カルシニューリンとの相互作用
によるものなので、ＵＶ−Ｂ暴露に続くサイトカインの放出を妨害しない。Ａ．
Ｍａｒｉｏｎｎｅｔ、Ｙ．Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ、Ｊ．Ｖｉａｃ及びＤ．Ｓｃｈ
ｍｉｔｔ、“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｉｎ
ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ａｎｄｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏ
ｒ α ａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｔｏｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ−Ａａ
ｎｄｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔＢ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｂｙｎｏｒｍ
ａｌａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｃｕｌｔ
ｕｒｅｓ”、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、６巻、２２
頁乃至２６頁、１９９７年を参照のこと。このように、シクロスポリンは、太陽
に曝された皮膚でのＵＶ誘導サイトカインの誘導を阻害する、ラパマイシンのよ
うなＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤の有利な効果を有さない。

【００５１】本発明は、一般に、遺伝子毒性エージェントに曝された器官、及び特に、太陽
に曝された皮膚は、遺伝子毒性エージェントにより引き起こされるガンの誘導を
避け、臓器移植を維持するのに要求される免疫抑制の一般化された状態を維持す
るために、遺伝子毒性エージェントに曝される直前又は同時又は直後に、ラパマ
イシンのようなＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤で処理されるべきであることを
教示する。ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤自身が、移植拒否を抑制することの
できる免疫抑制剤（例えば、ラパマイシン）である場合、阻害剤は、他の免疫抑
制剤及び／又は他の種類の薬剤又は処理とともに又はなしに、使用することがで
きる。このような場合、免疫抑制剤の投与計画及び用量は、移植拒否を抑制し、
遺伝子毒性エージェントへの暴露に反応するサイトカインの生成を抑制する能力
の療法を考慮して選択される。

【００５２】本発明の他の使用は、遺伝子毒性エージェント処理後のサイトカインの誘導を
高めるために、ＤＮＡプロテインキナーゼの能力を増大させる化合物（以降、「
ＤＮＡプロテインキナーゼエンハンサー」という）を含む。したがって、遺伝子
毒性エージェントの処理は、免疫抑制反応を高めるために使用される場合がある
。例えば、免疫抑制サイトカインを誘導し、抗原特異性自動免疫反応を抑制する
ために、皮膚移植及び乾癬へソラレン＋光線を使用する。図２の機構を見ると、
ＤＮＡプロテインキナーゼの活性を高める化合物は、免疫抑制療法をより迅速に
、より強力に、及び／又はより均質のものにすることができ、そのため、治療の
効率を増大させる。したがって、本発明によると、ＤＮＡプロテインキナーゼの
活性を増大させる化合物は、所望の免疫抑制反応を高めるために、遺伝子毒性エ
ージェントとともに、又は遺伝子毒性エージェントの代わりに使用される。

【００５３】例えば、本発明の観点によると、ＵＶ照射されたＤＮＡ、又は二本鎖ＤＮＡの
短い片のように作用する一つ以上の化合物は、遺伝子毒性エージェント療法のと
き、又は、遺伝子毒性エージェント療法の代わりに使用され、免疫抑制サイトカ
インの放出を刺激し、そして、自動免疫反応に関連する疾病からの解放をもたら
す。このような化合物の例は、脂質又はリポソームに結合した二本鎖ＤＮＡ及び
／又はその同種物を含む。

【００５４】本発明のもう一つの適用は、一つ以上の遺伝子毒性エージェントへの個体の反
応（感受性）を調節するために、調節されたＤＮＡプロテインキナーゼの一つ以
上のレベル及び／又は活性を有することが必要な個体を同定することである。本
発明の観点によると、遺伝子毒性エージェントが不十分又は過剰のサイトカイン
発現を生じる疾病に見舞われている患者のＤＮＡプロテインキナーゼの活性及び
／又はレベルを、患者の症状に対応する特定のＤＮＡプロテインキナーゼを同定
することによりスクリーニングする。例えば、アトピー性皮膚炎、紅斑性狼瘡、
及びポルフィリン症のような皮膚病のいくつかは、環境のＵＶ光線又は汚染に免
疫系が過剰に反応することにより引き起こされる。ＤＮＡプロテインキナーゼ活
性についてこのような患者をスクリーニングすることにより、特定のＤＮＡプロ
テインキナーゼの阻害剤からの恩恵を受けるこれらの患者を同定することができ
る。本発明のこれらの適用は、細胞抽出物を組織サンプルから調製し、そしてＤ
ＮＡプロテインキナーゼアッセイを行う。

【００５５】例えば、アッセイは、以下の実施例４に記載される型であり得、ＤＮＡプロテ
インキナーゼを免疫沈降するために、抗体を使用し、そして、次に沈殿されたＤ
ＮＡプロテインキナーゼを、ｐ５３タンパク質のような基質とともに、種々のＤ
ＮＡ損傷に曝す。ｐ５３のリン酸化の程度を測定することにより、一つのＤＮＡ
プロテインキナーゼ活性を決定する。正常な対照と比較すると、これらの研究は
、病気の組織に、より多くのＤＮＡプロテインキナーゼが発現されているか、又
は、このような組織ではＤＮＡプロテインキナーゼの活性がより高いかを決定す
る。次に、この情報を、病気の診断及び治療法の選択に使用することができる。

【００５６】本発明の種々の前記の観点にしたがうと、ＤＮＡプロテインキナーゼレベル／
活性のためのアッセイは、例えば、薬剤が、サイトカインの放出を阻害する又は
誘導するのに十分なレベルで投与されているかを決定するのに要求される。以下
の実施例４に示すように、本発明は、この目的のために、（１）細胞のサンプル
を、目的物から得、（２）ＤＮＡプロテインキナーゼを含む調製物をこのサンプ
ルから得、（３）調製物をキナーゼ（類）に適する基質（類）とともに、感受性
のあるキナーゼ（類）の種類のＤＮＡ損傷に曝し、そして（４）基質（類）のリ
ン酸化のレベルを、キナーゼ（類）のレベル／活性を測定する方法として使用す
る効率的なアッセイを提供する。

【００５７】本発明の上記及び他の観点は、さらに、本発明の詳細な説明及び好ましい態様
と組み合わせて以下に詳細に論じられる。

【００５８】

【発明の詳細な説明及びその好ましい態様】

上記のように、本発明の重要な観点は、（１）ＤＮＡプロテインキナーゼは、
遺伝子毒性エージェントに反応して細胞によりサイトカインの放出を制御する役
割を果たすという発見、及び（２）この発見を、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害
剤（サイトカインの放出が減少されるべきである場合）又はエンハンサー（サイ
トカイン放出が増加されるべきである場合）の投与を経て、サイトカイン放出を
調節するために適用すること、である。

【００５９】Ａ．ＤＮＡプロテインキナーゼＤＮＡプロテインキナーゼは、当初は、このファミリーの酵素の一つの活性が
欠けている、動物及びヒト突然変異により認識された。

【００６０】ＳＣＩＤ（重篤複合免疫不全）のマウスは、免疫グロブリン遺伝子の再配列の
不全のために、完全な免疫系を生成できない。これらのマウスは、二本鎖ＤＮＡ
破壊を含む免疫グロブリン遺伝子の再配列の工程に欠かせないＤＮＡプロテイン
キナーゼ活性を不活化した、遺伝的変異を有することが発見された。この方法で
、免疫細胞の発達の中間である、二本鎖の破壊は、ＤＮＡの損傷に似ている。Ｓ
．Ｊａｃｋｓｏｎ、“ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａ
ｓｅ”、ｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、２９巻、９３５頁乃
至９３８頁、１９９７年を参照のこと。

【００６１】遺伝病であるＡＴ（毛細管拡張性運動失調）の患者は、リンパ腫のような血液
ガンの傾向とともに、筋肉の制御不能（運動失調）、及び異常な眼の血管（毛細
管拡張）を有する。これらの患者は、ＡＴＭ（ＡＴ変異）といわれる異常な遺伝
子を有する。

【００６２】これらの患者のＳＣＩＤ及びＡＴＭ遺伝子を、それぞれ、クローン化し、そし
てその核酸配列を分析すると、Ｓ．Ｊａｃｋｓｏｎら（前出）に見受けられるよ
うに、それらは、プロテインキナーゼではなく、脂質キナーゼの一種である、３
’−ホスホチジルイノシトール（３’−ＰＩ）キナーゼと最も相同性が高いこと
が明らかとされた。当初、脂質キナーゼ活性は、生化学的に検出できなかったの
で、非常に困難であった。現在では、３’−ＰＩキナーゼを相同性を有する配列
であるにもかかわらず、これらの酵素が、真のプロテインキナーゼであると認識
されている。

【００６３】ＤＮＡプロテインキナーゼは、酵母からヒトまでのすべての真核生物において
見受けられる。各細胞は、同様の酵素の多数のファミリーから生じる、一種以上
のＤＮＡプロテインキナーゼを有する。Ｊｉｎ、Ｉｎｏｕｅ、及びＷｅａｖｅｒ
ら、１９９７年（前出）に記載されているように、ＤＮＡプロテインキナーゼに
関するアミノ酸配列は、他のもののなかでも、初めのＤＮＡ−ＰＫ_ｃｓ、ＳＣＩ
Ｄ変異に関するＫｕサブユニット、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＴＥＬ１、ＭＥＣ１、ＭＥ
Ｉ４１、ＦＲＡＰ、ＴＯＲ１、ＴＯＲ２、及びＲＡＤ３を含む。ＤＮＡプロテイ
ンキナーゼのファミリー及びその配列相同性は、図３に示されている。研究は、
ファミリーの追加のメンバーを同定するために継続されている。

【００６４】ＤＮＡプロテインキナーゼは、通常、二つのサブユニットからなり、一つは、
他方よりも大きい。小さいほうのサブユニットは、図３には示していない。ＳＣ
ＩＤ及びＡＴ疾病は、両方とも、小さいほうのサブユニットの遺伝子コードでの
変異に由来する。これらの遺伝子変異は、ＤＮＡプロテインキナーゼ活性を阻害
する阻害剤と同様、ＤＮＡプロテインキナーゼが行う機能を分析するために使用
されている。

【００６５】Ｂ．ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤上述のように、本発明の特定の観点によると、本発明は、一つ以上のＤＮＡプロ
テインキナーゼの活性を妨害する化合物に関し、ＤＮＡプロテインキナーゼの活性部位又は複数の部位を直接不活化するか、ＤＮＡプロテインキナーゼがＤＮＡ及び／又はＤＮＡプロテインキナーゼがリン酸化する基質（類）への結合を直接
妨害するか、ＤＮＡプロテインキナーゼの、ＤＮＡ及び／又は基質及び基質（類
）への結合を競合させるか、又は、ＤＮＡプロテインキナーゼのサブユニットの
アセンブリを妨害するかによる。

【００６６】本発明の実施に使用することのできるＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤の例は
、ラパマイシン、ピロリン酸、ウォルトマニン、６−ジメチルアミノプリン、ＯＫ− １０３５、スタウロスポリン、及び一本鎖ＤＮＡを含む。これらの阻害剤は、当技術分野に周知の適する賦形剤と組み合わせる場合、経口、注射、及び局所を含む、
種々の形で被験者に投与することができる。投与濃度は、特定の被験者、阻害剤、及び遺伝子毒性エージェントにより、及び、治療処置の標準的な医療の実施にしたがって投与される。

【００６７】特に、阻害剤の投与濃度は、患者により受け入れられ、そして一つ以上の遺伝子
毒性エージェントに反応するサイトカインの発現を減少するのに充分なＤＮＡプ
ロテインキナーゼ活性を減少させることのできるように選択される。サイトカイ
ンの発現レベルは、当技術分野に周知の技術を使用して測定することができる。したがって、適する阻害剤の用量レベル及び投与法は、用量／計画の変化による
遺伝子毒性エージェントに反応するサイトカイン発現をモニタリングすることに
よって選択され得る。例えば、一つ以上のＤＮＡプロテインキナーゼを受容した被験者をＵＶ暴露した後ＴＮＦαのレベルをモニターすることができる。遺伝子
毒性エージェントへの暴露によるＴＮＦαのような一次のサイトカインの増加に
つれ、二次のサイトカインは、例えば、インターフェロンγのレベルが下落し、そしてＩＣＡＭ−１のレベルが下落し、そしてＵＶのような遺伝子毒性エージェントに反応して上昇する、というより複雑な動態を有し得る。このような二次サイトカインを、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤の用量／及び計画を決定するために使用すると、これらのより複雑な動態は、例えば、遺伝子毒性エージェント暴露後の予測値でのインターフェロンγ活性のレベルを維持する阻害剤のレベル
を選択するのに、考慮する必要がある。

【００６８】本発明の特に好ましい態様では、阻害剤投与のレベル／計画は、ＤＮＡ−キナーゼ活性をアッセイすることにより、例えば、ＤＮＡプロテインキナーゼ活性を、
本明細書に記載するアッセイを使用してアッセイすることにより、選択する。こ
れらの態様にしたがうと、一つ以上のＤＮＡプロテインキナーゼの活性の実質的
な減少（例えば、１０％、好ましくは５０％の減少）を生じる阻害剤投与のレベル／計画を選択する。例えば、ＦＲＡＰ活性のレベルは、モニターすることができ
、そして、一つ以上の遺伝子毒性エージェントへの暴露時のサイトカインの放出を減少するために、選択することができる。再度、ＵＶの暴露は、遺伝子毒性エー
ジェントであり得、ＴＮＦα放出を最小限にするようにＦＲＡＰのレベルを選択する。

【００６９】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤は、連続的に、又は、好ましくは、遺伝子毒性エージェント（複数）への患者の暴露と組み合わせて投与することができる。最
も好ましくは、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤は、遺伝子毒性エージェント（類
）への暴露前、例えば、暴露３０分前に投与され、投与は、暴露の間、及び、暴露後
２４時間のような暴露後の期間も続ける。暴露の前、間、及び後より短い投与も、本発明の実施に使用することができるが、あまり好ましくない。

【００７０】Ｃ．ラパマイシンＤＮＡプロテインキナーゼ活性の特に重要な阻害剤は、ラパマイシンである。Ｅ．Ｂｒｏｗｎ、Ｐ．Ｂｅａｌ、Ｃ．Ｋｅｉｔｈ、Ｊ．Ｃｈｅｎ、Ｔ．Ｓｈｉｎ
、及びＳ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、“Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐ７０Ｓ６ｋｉ
ｎａｓｅｂｙｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＦＲＡＰｉｎｖ
ｉｖｏ”、Ｎａｔｕｒｅ、２７７巻、４４１頁乃至４４６頁、１９９５年に記載されているように、この阻害剤は、特異的にＦＲＡＰの大小のサブユニットのアセ
ンブリを阻害する。これらの著者は、ラパマイシンに耐性を獲得している変異ＦＲＡＰ類を同定しており、薬物特異性を例示している。

【００７１】Ｍ．Ｗｙｍａｎｎ、Ｇ．Ｂｕｌｇａｒｅｌｌｉ−Ｌｅｖａ、Ｍ．Ｚｖｅｌｅｂ
ｉｌ、Ｌ．Ｐｉｒｏｌａ、Ｂ．Ｖａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋ、Ｍ．Ｗａｔｅｒ
ｆｉｅｌｄ、及びＧ．Ｐａｎａｙｏｔｏｕ、“Ｗｏｒｔｍａｎｉｎｎｉｎａｃ
ｔｉｖａｔｅｓｐｈｏｓｐｈｏｉｎｉｓｉｔｉｄｅ３−ｋｉｎａｓｅｂｙ
ｃｏｖａｌｅｎｔｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｙｓ−８０２、ａ
ｒｅｓｉｄｕｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｔｒ
ａｎｓｆｅｒｒｅａｃｔｉｏｎ”、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１６巻、１７２２頁乃至１７３３頁、１９９６年に記
載されているように、ラパマイシンに対し、他の重要なＤＮＡプロテインキナー
ゼ活性の阻害剤であるウォルトマニンは、リン酸化に含まれる重要なアミノ酸を
変更することによりＦＲＡＰを阻害する。

【００７２】Ｍ．ＳｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎａｎｄＴ．Ｓｔｒｏｍ、“Ｉｍｍｕｎｏｒ
ｅｇｕｌａｔｏｒｙｄｒｕｇｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃｂａｓｉｓｆ
ｏｒｕｓｅｉｎｏｒｇａｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”、ＰｅｄｉａｔｒｉｃＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、１１巻、６５１頁乃至６５７頁、１９９
７年に記載されているように、ラパマイシンは、例えば、Ｔ細胞などの、従来の
免疫細胞の増殖を阻害するために、移植及び臓器移植の間の免疫系を抑制するた
めに今日臨床上使用される。これは、遺伝子毒性エージェントへの短期間の暴露
と組み合わせては使用されず、むしろ、移植を維持するために長期間使用される
。重要なことは、ラパマイシンを投与されている患者を含む、免疫抑制療法を受
けている患者は、通常、数年に渡って行うことができ、長期の免疫抑制療法の間
、太陽光線などの遺伝子毒性エージェントを避けるように明らかに指示される。
Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ、Ｃ．Ｐｒｏｂｙ及びＩ．Ｌｅｉｇｈ、“Ｓｋｉｎｃａｎｃ
ｅｒｉｎｒｅｎａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔｐａｔｉｅｎｔｓ”、ＣａｎｃｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ、４５巻、２２０頁乃至２２４頁、１９９３年を参照
のこと。

【００７３】最近では、ラパマイシンは、臨床試験の最後の工程にあり、アメリカン・ホー
ム・プロダクツ（ＡｍｅｒｉｃａｎＨｏｍｅＰｒｏｄｕｃｔｓ）の部門であ
るワイス・エアスト・ラボラトリー（Ｗｙｅｔｈ−ＡｙｅｒｓｔＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）から、ラパミュン（Ｒａｐａｍｕｎｅ、商標）として市販されて
いる。これは、移植を受けた患者の治療において、単独で又は低用量のシクロス
ポリンＡと組み合わせて使用される。

【００７４】経口投与により運搬される場合、ラパマイシンの量の典型的な範囲は、２乃至
５ｍｇ／日である。局所経路により運搬される場合、典型的な濃度は、０．２重
量／体積％の範囲である。静脈内投与により運搬される場合、最大許容量は、２
５ｍｇ／ｋｇ体重である。臨床的には、免疫抑制の目的のための用量は、０．５
乃至２５ｍｇ／ｍ^２皮膚表面積／日の範囲である。

【００７５】Ｃ．Ｇ．Ｇｒｏｔｈ、Ｃ．Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ、及びＬ．Ｂａｃｋｍａｎ、
“Ｎｅｗｔｒａｉｌｓｉｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｈｏｗｔ
ｏｅｘｐｌｏｉｔｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｓｉｒｏｌｉｍｕｓ
ｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”、ＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、３０巻、４０６４頁及び４０６
５頁、及び、Ｂ．Ｋａｈａｎ、“Ｒａｐａｍｙｃｉｎ：ｐｅｒｓｏｎａｌａｌ
ｇｏｒｉｔｈｍｓｆｏｒｕｓｅｂａｓｅｄｏｎ２５０ｔｒｅａｔｅ
ｄｒｅｎａｌａｌｌｏｇｒａｆｔｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ”、ＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、３０巻、２１８５頁乃至２１８
８頁、１９８８年に記載されているように、特に、約２１乃至２４ｍｇ／ｍ^２体
表面積のラパマイシンの負荷量は、初期に静脈内で運搬される。これは、約１乃
至７ｍｇ／ｍ^２の用量の後、２乃至３ヶ月間全血中１５乃至３０ｎｇ／ｍｌの最
低濃度（ｔｒｏｕｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を生じるように調整し、
次にさらに、全血中約１０乃至１５ｎｇ／ｍｌの最低濃度を達成するように減少
される。しかし、Ｄ．Ｔｒｅｐａｎｉｅｒ、Ｈ．Ｇａｌｌａｎｔ、Ｄ．Ｌｅｇａ
ｔｔ及びＲ．Ｙａｔｓｃｏｆｆ、“Ｒａｐａｍｙｃｉｎ：ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉ
ｏｎ，ｐｈａｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｒ
ａｎｇｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ：ａｎｕｐｄａｔｅ”、ＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻、３４５頁乃至３５１頁、１９９８
年に記載されているように、ラパマイシンのほとんどは、赤血球において解離す
るので、ラパマイシン及びその代謝物の血漿及び組織濃度は、２ｎｇ／ｍｌ未満
である。

【００７６】重要なことに、このような組織濃度は、遺伝子毒性エージェントへの暴露の後
のＤＮＡプロテインキナーゼ活性を調節するのには不十分であり、したがって、
このような暴露に反応してサイトカイン放出を調節する。これは、２μｇ／ｍｌ
（又は約２ｎＭ）より高い濃度は、ＤＮＡプロテインキナーゼ、特に、ＦＲＡＰ
キナーゼの実質的な不活性化を達成するのに必要であるためである。後述の実施
例５に示すように、ＵＶによるＴＮＦαの誘導は、２μｇ／ｍｌ未満の用量では
ラパマイシンに感受性を有さない。したがって、１０乃至３０μｇ／ｍｌの全血
濃度を達成するための、ラパマイシン投与の最近の実施は、本発明のＦＲＡＰを
不活性化するのに十分である血漿又は組織でのラパマイシン濃度を達成しない。

【００７７】今日まで、ラパマイシンの推薦される濃度は、移植された器官の拒否を防ぐ能
力により決定されており、遺伝子毒性エージェントに暴露された非免疫細胞での
ＦＲＡＰ活性を阻害するのに要求される濃度ではない。加えて、用量は、延長さ
れた、長期使用のために定められており、遺伝子毒性エージェントへの暴露のた
めに調節されていない。

【００７８】これらの以前のラパマイシンの使用に対し、本発明に従うと、ラパマイシンは
、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＣＡＭ−１、及びＴＮＦαのような、免
疫抑制サイトカインの放出を減少するために使用され、ＵＶのような遺伝子毒性
エージェントへの照射の直前及び直後に投与する。さらに、ラパマイシンは、サ
イトカインの放出の減少を達成するのに十分高い濃度、すなわち、免疫拒否を防
ぐために使用されるよりも高い濃度で使用される。したがって、本発明に従うと
、ラパマイシンは、免疫系の抑制の代わりに、特に、遺伝子毒性エージェントへ
の暴露後の免疫系を保護するために使用される。

【００７９】免疫系を保護するために免疫抑制剤を使用するという考えは、直観に反し、そ
して、既存の当技術分野の理解と実施に逆らうものである。

【００８０】Ｄ．ＤＮＡプロテインキナーゼエンハンサー本発明の最も一般的な使用は、サイトカインの放出を減少することを含むこと
であるにもかかわらず、この放出を増加させることが望ましい場合もある。特に
、抗原特異性免疫反応を廃止するために、遺伝子毒性エージェントでの処理を使
用することを含む特定の治療が存在する（以下参照）。

【００８１】ＤＮＡプロテインキナーゼ活性のエンハンサーは、（１）二本鎖ＤＮＡの短い
セグメント（例えば、約２５，０００塩基対未満の長さを有するセグメント）、
すなわち、ＤＮＡプロテインキナーゼが結合することのできる末端を有するＤＮ
Ａセグメント、（２）短い又は長いストランドであり得る、損傷二本鎖ＤＮＡ、
（３）サブユニットが枯渇状態であるＤＮＡプロテインキナーゼサブユニット、
（４）ＤＮＡプロテインキナーゼがリン酸化する一つ又は複数の基質、及び（５
）ＡＴＰを含む。

【００８２】ＤＮＡプロテインキナーゼエンハンサーは、上記のようにＤＮＡプロテインキ
ナーゼ阻害剤とともに同様に投与することができるが、エンハンサーは生物であ
るので、エンハンサーの生物学的活性を保存し、標的組織までの運搬を促進する
賦形剤／担体を使用しなければならないことを除く。例えば、ＤＮＡの場合、カ
チオン性脂質は、ＤＮＡを細胞に運搬するのに使用され得、そして、タンパク質
の場合、リポソーム運搬系を使用して局所投与を行うことができる。Ｙａｒｏｃ
ｈ、米国特許第５，１９０，７６２号公報を参照のこと。

【００８３】エンハンサーの量／計画は、阻害剤について上記に記載した方法を使用して同
様に決定することができる。したがって、通常、エンハンサーは、遺伝子毒性エ
ージェントへの暴露の前に投与され、そして、暴露の間及びその後の期間も投与
が続けられる。再度、サイトカイン及び／又はＤＮＡプロテインキナーゼの濃度
のモニタリングは、特定の被検者、エンハンサー、及び遺伝子毒性エージェント
のための適する用量及び方法を決定するために使用される。

【００８４】Ｅ．サイトカイン放出の調節上記のように、本発明によると、遺伝子毒性エージェントへの暴露に続くサイ
トカインの放出は、ＤＮＡプロテインキナーゼ活性の阻害又は促進により減少又
は増加することができる。大抵の場合、サイトカイン放出の減少が望ましく、最
も一般的な例は、ＵＶ暴露の結果としてのサイトカイン放出を減少することであ
る。

【００８５】減少が望ましいもう一つの例は、ガンの化学療法及び放射線療法と組み合わせ
ることである。カルムスチン及びマイトマイシンＣのような多くの化学療法剤、
及び、Ｘ線での治療のような多くの放射線療法は、遺伝子毒性である。本発明に
よると、治療の副作用を減少するために、治療を行っている患者に一つ以上のＤ
ＮＡプロテインキナーゼ阻害剤を投与する。

【００８６】本発明の他の適用について、一つ以上の阻害剤が、治療期間に先立って投与さ
れることが好ましく、治療は、例えば、一日など、治療期間の後の期間に継続さ
れる。好ましくは、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤又は阻害剤類は、治療によ
り望ましくない遺伝子毒性の損傷に見舞われている組織に、それらが到達するよ
うな方法で運搬される。化学療法の場合、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤及び
阻害剤類は、典型的には、化学療法剤と同様の方法で投与されるが、化学療法の
副作用が最も一般的にあらわれる、例えば、消化管経路（経口投与）、頭皮（局
所投与）、及び／又は化学療法剤の注射部位（局所又は皮下）に特異的に投与す
る。同一の種類の特定の投与は、放射線療法の場合に使用することができる。

【００８７】移植拒否療法を受けている患者は、免疫機構が抑制されているため、特に、遺
伝子毒性エージェントからの保護を必要とする。上記のように、これらの患者は
、通常、太陽に曝された皮膚の皮膚ガンに見舞われ、このようなガンの始まりは
、治療の始めから数年内に進行することがしばしばである。ＤＮＡプロテインキ
ナーゼ阻害剤、特に、ラパマイシンは、このような移植拒否療法に使用するが、
これらの使用は、遺伝子毒性エージェントへの暴露からの保護を達成しない。本
発明は、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤は、移植分野で使用される場合と異な
る形及び経路で運搬されるべきであることを教示している。

【００８８】特に、ラパマイシンのような、これらの阻害剤は、遺伝子毒性エージェントへ
の暴露の直前及び直後に投与すべきである。免疫抑制剤の系統的な使用が毒性に
より制限される場合、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤の付加的な局所的な使用
は、遺伝子毒性エージェントへの暴露の影響を緩和するのに使用されるべきであ
る。特に、太陽への暴露の場合、一つ以上の阻害剤を、太陽光線に曝された皮膚
の場所へ局所的に使用すべきである。用量は、ＤＮＡ損傷の結果としてのサイト
カイン放出の阻害を達成するように調整すべきである。これは、遺伝子毒性エー
ジェントへの暴露に見舞われたのが短時間である場合、ラパマイシンのような一
つ以上のＤＮＡプロテインキナーゼの用量は、移植拒否治療の間の他のときより
も高いことを意味する。

【００８９】本発明によると、これらの場合、ラパマイシン及びその同種物（ＳＤＺＲＡＤ
など）のような、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤である一つ以上の移植拒否薬
物は、シクロスポリンＡ又はアスコマイシンのような移植拒否阻害剤でない一つ
以上の移植拒否薬物と組み合わせて使用する。これらの二つの種類の薬物は、一般に、毒性が重複しないので、これらの組み合わせは、免疫抑制という目的を達成するのにより優れた柔軟性をもたらすのと同時に、一つ以上の遺伝子毒性エー
ジェントへの暴露の結果としてのサイトカイン生成から患者を保護する。

【００９０】本発明によると、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤である移植拒否薬物又は薬物類は、少なくともいくつかの免疫抑制に貢献する濃度で使用されるが、しかし、より重要なことに、遺伝子毒性エージェントへの反応によるサイトカイン放出
を阻害する濃度及び／又は様式で使用される。二種の免疫抑制剤の相対量は、患者の薬物への感受性及びサイトカイン放出からの保護の望ましいレベルを達成す
るのに必要とされるＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤（類）の量に基づいて各患
者で決定される。

【００９１】本発明の最も一般的な使用は、サイトカイン生成の減少と組み合わせられるが、本発明は、遺伝子毒性エージェントへの反応によるサイトカイン生成を促進するのに使用される場合もある。特に、本発明は、自己免疫疾患を含む、免疫抑制
遺伝子毒性エージェントに対する種々の疾病の治療に使用することができる。

【００９２】例えば、促進されたサイトカイン生成は、角化細胞の過剰増殖及び皮膚へのＴ
細胞の侵入により特徴付けられる皮膚病である乾癬の治療に使用される。この疾
病の治療に使用される二つの通常の遺伝子毒性エージェントは、コールタール及
びソラレン＋光線である。この場合、遺伝子毒性エージェント療法は、サイトカ
インを放出させ、Ｔ細胞活性を抑制し、そして病気の兆候を緩和する。本発明に
よると、ＤＮＡプロテインキナーゼエンハンサーは、遺伝子毒性剤に反応しての
サイトカイン放出のレベルを増大するのに使用される。

【００９３】特に、免疫抑制遺伝子毒性エージェントの投与の直前、又は、好ましくは、投
与時に、一つ以上のＤＮＡプロテインキナーゼ促進剤を患者に投与する。これら
のエンハンサーの使用は、投与が必要な遺伝子毒性エージェントの量を減少する
ことができ、エンハンサーのみ又は少量のみの遺伝子毒性エージェントとで免疫
抑制サイトカインの望ましい放出を達成することができる場合もある。

【００９４】この方法で説明することのできる他の疾病は、アトピー性皮膚炎、紅斑性狼瘡
、関節炎、及びポルフィリン症を含む。これらの疾病は、各々、Ｔ細胞活性化を
経て炎症を生じる。このＴ細胞の活性化は、適する免疫抑制活性化剤により抑制
することができ、そして、本発明のＤＮＡプロテインキナーゼエンハンサーは、
遺伝子毒性エージェントへの暴露時に免疫抑制サイトカインの形成の増加に役立
つ。

【００９５】Ｆ．ＤＮＡプロテインキナーゼ活性のレベルのアッセイＤＮＡプロテインキナーゼが遺伝子毒性エージェントとサイトカインの放出の
間の中心的な生物学的関連であるという発見は、（１）遺伝子毒性エージェント
に対する個体の感受性、及び（２）サイトカイン放出の効果的な調節のための測
定点（生物学的終点）としてこれらのキナーゼを役立たせる。

【００９６】従って、個体のＤＮＡプロテインキナーゼ活性のレベルを測定することにより
、ＤＮＡプロテインキナーゼに反応する種類のＤＮＡ損傷を生じる遺伝子毒性エ
ージェント（類）に対する個体の感受性のレベルを決定することができる。例え
ば、ＵＶに対する感受性を測定するためには、ＦＲＡＰ活性のレベルを測定し、
電離照射（Ｘ線）に対する感受性を測定するためには、ＡＴＭ活性のレベルを測
定する。高い測定レベルのＤＮＡプロテインキナーゼ活性は、高レベルのサイト
カイン放出を伴う遺伝子毒性エージェントに反応する個体であることを示し、低
い測定レベルは、低いレベルのサイトカイン放出を伴う薬剤への反応をする個体
であることを示す。

【００９７】いずれの場合も、望ましくなく、そしてその同定は、行うべき適切な診断及び
／又は治療方法をもたらす。特に、特定のＤＮＡプロテインキナーゼ活性が高レ
ベルの個体に、キナーゼに関する個々のサイトカイン放出を調節するために、上
記のようにこのようなＤＮＡプロテインキナーゼの阻害剤又は阻害剤類を使用す
ることができる。低レベルのＤＮＡプロテインキナーゼ活性の個体には、さらに
、低いレベルの活性の原因を決定するための診断法を行うことができ、例えば、
遺伝子スクリーニングを行うことができる。このようなＤＮＡプロテインキナー
ゼアッセイは、他には導かれることのない、スクリーニングを行うための基礎を
もたらす。

【００９８】ＤＮＡプロテインキナーゼ活性のためのアッセイを行うことによる、サイトカ
イン放出の調節の効果に関し、十分な量のＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤又は
エンハンサーを患者に投与するかとうかを決定し、用量、運搬様式、又は運搬計
画においての調節を適切にすることができる。

【００９９】ラパマイシンのようなＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤である、免疫抑制剤を
使用する免疫抑制療法を受けている患者の場合、ＤＮＡプロテインキナーゼ活性
のためのアッセイは、免疫抑制剤の望ましいレベルを得るために使用することが
できる。特に、ラパマイシンのような免疫抑制薬の複雑な代謝及び生物学的分布
のために、親化合物の血中濃度は、親化合物及びその代謝物の生物学的効果を示
すものでない。ＤＮＡプロテインキナーゼ活性のためのアッセイは、化合物及び
その代謝物の生物学的効果をより直接モニターする。

【０１００】本発明の実施に使用することのできるＤＮＡプロテインキナーゼ活性のレベル
のためのアッセイは、放射線標識されたＡＴＰ基質、例えば、^３２Ｐ−ＡＴＰ、
ペプチド基質、ゲル電気泳動、及び、オートラジオグラフィー読み取りを使用す
るものを含む。例えば、Ｄ．Ｐｒｉｃｅ、Ｊ．Ｇｒｏｖｅ、Ｖ．Ｃａｌｖｏ、Ｊ
．Ａｖｒｕｃｈ、及びＢ．Ｂｉｅｒｅｒ、“Ｒａｐａｍｙｃｉｎ−Ｉｎｄｕｃｅ
ｄＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅ７０−ＫｉｌｏｄａｌｔｏｎＳ６ＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻、９７３頁乃至
９７７頁、１９９２年を参照のこと。

【０１０１】放射線標識された反応体の使用を避け、同時にＰｒｉｃｅらの方法よりも多く
のサンプルを処理することのできる好ましいアッセイは、後述の実施例４に示さ
れている。被験者のＤＮＡプロテインキナーゼ活性を決定するために使用される
場合、アッセイは、（１）細胞サンプルを被験者から得、（２）ＤＮＡプロテイ
ンキナーゼ（類）を含む調製物を、抗ＤＮＡプロテインキナーゼ抗体を使用して
サンプルから得、（３）調整物を、キナーゼ（類）に対する適切な基質（類）と
ともに、キナーゼ（類）に感受性のある一種又は複数の種類のＤＮＡ損傷に曝し
、そして、（４）基質（類）のリン酸化のレベルを、キナーゼ（類）のレベル／
活性の測定として使用する工程を含む。基質のリン酸化のレベルは、ＤＮＡプロ
テインキナーゼによりアッセイ下でリン酸化される場合、基質に特異的な抗体と
共に標準的なＥＬＩＳＡ法を使用して定量する。

【０１０２】アッセイの特異性及び感度は、アッセイを行うときに使用される抗ＤＮＡプロ
テインキナーゼ抗体及び／又は基質の種類及び／又は濃度を変化又は組み合わせ
ることにより改良され得る。特に、複数のキナーゼのためのＤＮＡプロテインキ
ナーゼ活性のレベルは、工程（２）及び（３）において、それぞれ、抗ＤＮＡプ
ロテインキナーゼ抗体及び基質の混合物を形成することにより同時に決定するこ
とができる。アッセイの感度は、抗体及び／又は基質濃度及び／又は反応時間を
増加することにより改良することができる。

【０１０３】Ｇ．処理化合物本発明のＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤は、単独で適する賦形剤とともに処
方されるか、又は、お互いに組み合わされるか、及び／又は、例えば、ＤＮＡプ
ロテインキナーゼ阻害剤ではない、遺伝子保護剤のような、他の薬剤成分と組み
合わせることができる。このような例の一つは、局所的な配合において、ラパマ
イシンと、例えば、二酸化チタンのような、一つ以上のサンスクリーン、及び／
又は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶのような一つ以上のＤＮＡ修復酵素（類）との
組み合わせを、太陽ＵＶのような、一つ以上の遺伝子毒性エージェントへの照射
の前、間、又は後に使用する。ＤＮＡ修復酵素の場合、リポソームにＤＮＡ修復
酵素を被胞することは、好ましい投与方法である。Ｙａｒｏｓｈ、米国特許第５
，０７７，２１１号公報、５，２９６，２３１号公報、及び５，２７２，０７９
号公報を参照のこと。

【０１０４】このような配合中のＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤のレベルは、例えば、Ｄ
ＮＡプロテインキナーゼ活性アッセイを使用して、上記のように選択することが
できる。配合中の他の活性成分のレベルは、一般に、単独で使用する場合の成分
の濃度に相当する。

【０１０５】化学療法を受けている患者の場合、同時に投与するために、例えば、ウォルト
マニンのような本発明のＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤を、例えば、マイトマ
イシンＣのような遺伝子毒性エージェント化学療法と組み合わせることができる
。

【０１０６】本発明のＤＮＡプロテインキナーゼエンハンサーは、適切な賦形剤と組み合わ
せて単独で配合されるか、又は、それらがお互いに、及び／又は、ＤＮＡプロテ
インキナーゼエンハンサーでない薬剤、例えば、遺伝子毒性エージェントと組み
あわせることができる。このような例の一つは、損傷を受けたＤＮＡ、ソラレン
、及び乾癬患者の皮膚に適用することのできる適切な賦形剤を組み合わせる。

【０１０７】

【実施例】

いずれかの方法に制限することを意図せずに、本発明は以下の実施例により十
分に説明される。実施例に共通する物質及び方法は以下のとおりである。

【０１０８】物質及び方法細胞培養物不死化されたヒトＨａＣａｔ細胞ラインを、ニューヨーク州立大学（ストニー
・ブルック）のＪｏｎａｔｈａｎＧａｒｌｉｃｋ博士から得た。Ｊ．Ｋｉｂｉ
ｔｅｌ、Ｖ．Ｈｅｊｍａｄｉ、Ｌ．Ａｌａｓ、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｂ．Ｓｕｔｈ
ｅｒｌａｎｄ、及びＤ．Ｙａｒｏｓｈ、“ＵＶ−ＤＮＡＤａｍａｇｅｉｎ
ｍｏｕｓｅａｎｄｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｓｔｈｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α”
、ＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、６７巻
、５４１頁乃至５４６頁、１９９８年に記載されているように、ＸＰＴＮＦ２細
胞ラインは、ＸＰ群ＡＳＶ−４０形質転換繊維芽細胞ラインＸＰ１２ＢＥを、
ｐＣＡＴ_ＴＮＦでトランスフェクションすることにより調製した。この細胞ライ
ンは、マウスＴＮＦαプロモーターからのクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子を発現する。これらの形質転換された細胞ラインを、１０％
のウシ新生児血清及び抗生物質を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改良されたイーグル培
地で、３７℃において、加湿された５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて生長さ
せた。形質転換していないヒト角化細胞を、サンディエゴ（カリフォルニア州）
のクローンティクス・コーポレーション（ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ）より購入し、３７℃において、加湿された５％ＣＯ_２インキュベータ
ーにおいて、タンパク質を含まない角化細胞生長培地に細胞を供給し生長させた
。

【０１０９】薬物及び遺伝子毒性処理ラパマイシン、ウォルトマニン、スタウロスポリン及びリポポリサッカリド（
ＬＰＳ）は、シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ）から得た。薬物を、１，０００倍の濃度で調製し、使用する直
前に培地へ希釈した。ラパマイシン、ウォルトマニン、又はスタウロスポリンで
処理された細胞を、ＵＶ照射前３０分間及び照射後１８時間処理した。ＬＰＳ処
理については、ＬＰＳを３７℃で１時間細胞に加え、次に、細胞を１８時間新鮮
な培地に再度培養した。

【０１１０】ＵＶは、ウエスティンハウスＦＳ−４０非フィルター太陽灯（Ｗｅｓｔｉｎｇ
ｈｏｕｓｅＦＳ−４０ｕｎｆｉｌｔｅｒｅｄｓｕｎｌａｍｐ）から、３．
２Ｊ／ｍ^２／秒で得た。ＵＶ照射に関しては、培地を除去し、そして細胞を照射
し、次に、同一の培地で１８時間再度培養した。

【０１１１】細胞抽出物及びウエスタンブロット正常ヒト表皮角化細胞を、１０ｃｍプレートに９０％のコンフルエンスで生長
させ、次に、薬物および遺伝子毒性エージェントで処理した。インキュベーショ
ンの後、細胞をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む標準的なランニング（
ｒｕｎｎｉｎｇ）緩衝液で回収し、２秒間ヒート・システム・ウルトラソニック
・ソニケーター（ＨｅａｔＳｙｓｔｅｍＵｌｔｒａｓｏｎｉｃＳｏｎｉｃ
ａｔｏｒ）を７０％の力でソニケートし、５分間水中で沸騰させ、−７０℃で貯
蔵した。

【０１１２】ウエスタンブロットについて、１０μｇの細胞抽出物を、ランニング染色物を
含む５μｌのサンプル緩衝液と混合し、混合物を２分間沸騰させ、スタッキング
緩衝液を含む標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（バイオラド・ミニ・プロテーンII
装置（ＢｉｏｒａｄｍｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ II ａｐｐａｒａｔｕｓ））
へ負荷した。ｐ７０^Ｓ６Ｋウエスタンでは、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用し
、ＴＮＦαＷｅｓｔｅｒｎでは、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した。ゲルを、
ランニング染色がゲルの底に到達するまで、ゲル当たり２５ｍＡｍｐｓで操作し
た。タンパク質を、セミ−ファー（Ｓｅｍｉ−ｐｈｏｒ）装置（サンフランシス
コ（カリフォルニア州）のへファー・サイエンティフィック・インストルメント
（ＨｏｅｆｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））において
、０．８３ｍＡｍｐｓ／ｃｍ^２で４５分間電気泳動トランスブロットすることに
より、イモビリオンＰ（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ）膜へ移した。ブロットを５％
の脂肪を含まない乾燥乳でブロックし、４℃で一晩一次抗体をプローブした。ｐ
７０^Ｓ６Ｋブロットについては、抗体は、リン酸化された形のトレオニン−４２
１及びセリン−４２４に特異的であった（ニュー・イングランド・バイオラボス
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ））。次にブロットを洗浄し、そし
て、ホースラディッシュペルオキシダーゼを架橋された抗ウサギ抗体とインキュ
ベートした。ブロットを、暴露のために、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌ
ｍ）ＥＣＬを使用して、ＥＣＬキット（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で展
開した。ＴＮＦαブロットのために、抗ヒトＴＮＦα抗体をベーリンガー・マン
ハイム・バイオケミカルズ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から得た。次に、ブロットを洗浄し、そして、ビオチンに
結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、及び次にアビジン−ホースラディッシュペル
オキシダーゼとインキュベートし、そして次に上記のＥＣＬキットで展開した。

【０１１３】ＴＮＦ_ｃａｔアッセイＫｉｂｉｔｅｌら、１９９８年に記載されたように、ＣＡＴアッセイを行った
。簡潔にいうと、ＸＰＴＮＦ２細胞を、薬物及び遺伝子毒性エージェントで処理
し、そして１８乃至２４時間インキュベートした。抽出物を、冷凍及び解凍、及
び遠心分離を３回ずつ行って調製し、各抽出物５０μｇを５ｎｍｏｌｅのＢＯＤ
ＩＰＹ−クロラムフェニコール（ユージン（オレゴン州）のモレキュラー・プロ
ーブス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ））及び０．５ｍＭアセチルＣｏＡ
（シグマ・ケミカル・カンパニー）と混合した。３７℃で３０分間インキュベー
ションした後、反応生成物を冷酢酸エチルで抽出し、薄層クロマトグラフィーに
より分析した。蛍光基質とアセチル化生成物を、ＵＶ−Ａにより視覚化し、そし
て、デジタル化した画像を、コンピューター画像分析により分析し、アセチル化
されたクロラムフェニコールの画分、そして、ＣＡＴ活性を算出した。

【０１１４】免疫沈降及びＤＮＡプロテインキナーゼ活性アッセイＨａＣａｔ細胞は、１０ｃｍの皿で、コンフルエンスに近くなるまで生長させ
た。次に、これらを、ＴＧＮ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、５０ｍＭグ
リセロリン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トゥイーン（
Ｔｗｅｅｎ）２０、１ｍＭＤＴＴ、０．５μｌ／ｍｌシグマＰ８３４０プロテ
アーゼ阻害剤カクテル、２ｎＭミクロクリスチンＬＲ）中で、ヒート・システム
・ウルトラソニケーター・マイクロチップの７０％の力で１０秒ソニケートした
。遠心分離の後、抽出物を、同一の緩衝液で１ｍｇ／ｍｌタンパク質に調製し、
−７０℃で貯蔵した。ＤＮＡプロテインキナーゼ活性をアッセイするために、１
ｍｇのＨａＣａｔ抽出物を４℃で２時間２μｇのヤギ抗ＦＲＡＰ又は抗ＡＴＭ抗
体（サンタ・クルズ・バイオテクノロジー（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ））とともにインキュベートし、次に４０μｌのＰｒｏｔｅｉ
ｎＧＰＬＵＳ−アガロース（サンタ・クルズ・バイオテクノロジー）と混合
し、４℃で一晩回転した。

【０１１５】アガロースビーズを遠心分離により回収し、ＴＧＮ緩衝液、次に高濃度塩緩衝
液（１００ｍＭトリス、ｐＨ７．４、５００ｍＭＬｉＣｌ）、次にＰＫ緩衝液
（２５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．９、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、１ｍＭＤＴＴ、０．５μｌ／ｍｇシグマＰ８３４０プロテアーゼ
阻害剤カクテル、２ｎＭミクロクリスチンＬＲ、２００μＭＡＴＰ）で洗浄し
、５０μｌＰＫ緩衝液に再懸濁した。反応改良剤は、０．５μｇλＤＮＡ又は
２５０Ｊ／ｍ^２のＧ１５Ｔ殺菌性ランプでＵＶ−Ｃで照射されたλＤＮＡ、及び
４０ｎｇ／ｍｌのラパマイシンを含んだ。反応を開始するために、２．６μｇの
ＦＫＢＰ（シグマ・ケミカル・カンパニー）をＦＲＡＰ反応に加え、次に５０μ
ｇのｐ５３ペプチド（アミノ酸１乃至３９３、サンタ・クルズ・バイオテクノロ
ジー）及び１ｎｍｏｌＡＴＰをすべてＤＮＡプロテインキナーゼ反応に添加した
。３０℃での２時間のインキュベーションの後、反応生成物を遠心分離によりア
ガロースから分離した。

【０１１６】反応生成物を、標準ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（１．５９ｇ／ＬＮａ_２ＣＯ_３、２．９３ｇ／ＬＮａＨＣＯ_３、０．１ｇ／Ｌチメリゾール）で８倍
に希釈し、２００μｌをイムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）２ＨＢ９６ウェルＥＬ
ＩＳＡプレート（シャンティリー（バージニア州）のダイネックス・テクノロジ
ース・インク（ＤｙｎｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．））に入れ、
４度で一晩インキュベートした。このウェルを洗浄し、室温で６０分間５％ウシ
胎児血清アルブミンでブロックした。次に、ウェルを、ビオチンに結合した抗ホ
スホセリンＢＳＡ抗体２．５μｌと、ビオチンに結合した抗ホスホトレオニンＢ
ＳＡ抗体２．５μｌの、ＴＢＳ／ＮｏｎＩ（２５ｍｌ／Ｌ２ＭＴｒｉｓｐ
Ｈ８、３０ｍｌ／Ｌ５ＭＮａＣｌ、０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０）混
合物（シグマ・ケミカル・カンパニー）で、６０分間室温でインキュベートした
。ウェルを洗浄し、１０ｍｌＴＢＳ／ＮｏｎＩ中の１０μｌのアバジン−アルカ
リリン酸の混合物１００μｌとともに、６０分間室温でインキュベートした。プ
レートを洗浄し、０．１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ１０）中のホスホニトロフ
ェニルホスフェートで展開し、そして微量滴定プレート・リーダーにより４０５
ｎｍで読み取った。

【０１１７】実施例１この実施例は、ＴＮＦαが、ＵＶ暴露後の正常なヒト角化細胞により発現され
ること、及び、この発現は、ラパマイシンにより阻害されることを示す。

【０１１８】ＨａＣａｔ細胞ライン由来のヒト角化細胞を、ＦＳ４０太陽灯で２００Ｊ／ｍ ^２ＵＶ−Ｂで照射した。並行培養体（ｐａｒａｌｌｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）を
、２ｎｇ／ｍｌのラパマイシンで照射３０分間前及び次に照射６０分後に処理し
た。３７℃で２４時間インキュベートした後、これらの細胞を、リン酸−生食緩
衝液へ掻き取ることにより、抽出物を調製し、これらをウルトラソニケーターの
マイクロチップ（ヒート・システム・ウルトラソニケータ−）の最大の７０％の
エネルギーに２秒間曝した。

【０１１９】タンパク質１０μｇを次に１５％ポリアクリルアミドゲルの各ウェルに負荷し
、電気泳動した。分離したタンパク質を、半乾燥トランスブロッティングにより
ニトロセルロースフィルターペーパー上に溶出し、抗ヒトＴＮＦα抗体でプロー
ブした。ヒトＴＮＦαのサンプルを標準として使用した。

【０１２０】図４に示すように、レーン１に見受けられるように、ＵＶはＴＮＦαを誘導す
る。レーン２のこのバンドで非常に減少していることから分かるように、２ｎｇ
／ｍｌのラパマイシンは、ＴＮＦαの発現を阻害した。これに対し、リポポリサ
ッカリド（ＬＰＳ）は、細胞表面膜受容体ＣＤ１４へ結合することにより、ＤＮ
Ａ損傷なしにＴＮＦαを誘導する。１μｇ／ｍｌＬＰＳで処理された細胞は、Ｔ
ＮＦαを誘導し（レーン３参照）、そして、ラパマイシンは、ＴＮＦαのこのＬ
ＰＳ誘導に影響しない（レーン３をレーン４と比較）。

【０１２１】実施例２この実施例は、ＵＶによるＴＮＦαのｍＲＮＡ発現の誘導が、ラパマイシンに
より阻害されることを示す。

【０１２２】この原理を説明するため、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の制御下で、クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）からなる導入遺伝子を有す
るヒト細胞を使用した。この系は、ＴＮＦα遺伝子の転写を行うこれらの刺激を
観察するために使用した。ＣＡＴ遺伝子の転写は、薄層クロマトグラフィーによ
る、アセチル化された形のクロラムフェニコールの形成を測定する簡潔な酵素ア
ッセイにより容易に測定される。これらのアッセイの例は、図５に示されている
。

【０１２３】基質のみは、レーン１に示されており、未処理細胞抽出物によるアセチル化の
背景レベルは、レーン２、６、及び９に示されている。ＴＮＦαプロモーターか
らのＣＡＴ発現は、蛍光クロラムフェニコール基質のアセチル化が増大すること
により反映され、薄層クロマトグラフィーアッセイにおいてより早い移動種（底
から頂上まで）である。

【０１２４】ＴＮＦαは、ＵＶのような遺伝子毒性エージェントにより誘導され（レーン３
、７、及び１０）、そして、ＬＰＳでの処理のような、非遺伝子毒性エージェン
トでの処理により誘導される（レーン１２）。ＴＮＦαのＵＶでの誘導は、ラパ
マイシンにより阻害され（レーン５）、ＤＮＡプロテインキナーゼＦＲＡＰが、
ＤＮＡ損傷の信号をサイトカインＴＮＦα遺伝子の発現へ変換することが必要で
あることを示す。

【０１２５】ラパマイシンのみでは、非処理細胞に比べて効果を有さない（レーン４をレー
ン２と比較）。ＴＮＦα誘導は、ＤＮＡプロテインキナーゼを阻害する用量であ
る、５００ｎＭのウォルトマニンにより阻害され（レーン８）、そして、ＤＮＡ
プロテインキナーゼによる特徴的な種類のリン酸化である、セリンリン酸化を特
異的に阻害する用量である、２００ｎＭのスタウロスポリンによっても阻害され
る（レーン１１）。これらの結果は、ＴＮＦαプロモーターによるＵＶ発現誘導
は、一般に、ＤＮＡプロテインキナーゼを、そして特異的にはＦＲＡＰキナーゼ
を必要とし、セリン残基でのリン酸化を含むことを示す。

【０１２６】これに対し、非遺伝子毒性エージェントであるＬＰＳによるＴＮＦαの誘導は
、レーン１２及び１３、及び図６に示されるように、ラパマイシンにより阻害さ
れなかった。

【０１２７】まとめると、この実施例は、ＵＶ−ＤＮＡ損傷により導かれるＴＮＦα転写経
路は、ラパマイシンに感受性のあるＤＮＡプロテインキナーゼを必要とし、そし
て、細胞膜又は他の場所での非ＤＮＡ損傷は、このようなキナーゼを含まないこ
とを示す。

【０１２８】実施例３当技術分野に周知のように、ＦＲＡＰキナーゼ活性化に続く経路の下流は、ｐ
７０^Ｓ６Ｋキナーゼのリン酸化であり、リポソームタンパク質をリン酸化し、そ
して、遺伝子転写の翻訳を変更する。したがって、ＦＲＡＰキナーゼのＵＶ特異
性活性化の測定の一つは、ｐ７０^Ｓ６Ｋのリン酸化である。この実施例は、この
ような活性化を示すために、この方法を使用する。

【０１２９】ヒト角化細胞を、２ｎｇ／ｍｌのラパマイシンで予め処理し、次に、ＵＶ照射
又はＬＰＳで処理し、そして、上記のように抽出した（実施例１及び物質及び方
法を参照のこと）。抽出物を１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、次
に、ｐ７０^Ｓ６Ｋのセリン／トレオニンがリン酸化された形に特異的な抗体でウ
エスタンブロットにおいてプローブした。負荷制御として、ポリアクリルアミド
ゲルをクマシーブルーで染色し、各レーンに負荷された総タンパク質を同定した
。

【０１３０】図７に示すように、ＵＶ照射は、ｐ７０^Ｓ６Ｋのリン酸化を増加し（レーン１
をレーン２と比較）、そして、このリン酸化は、ラパマイシンでの予処理により
阻害された（レーン３）。これに対し、ＬＰＳで誘導されたｐ７０^Ｓ６Ｋのリン
酸化（レーン４）は、ラパマイシンに比較的感受性がなかった（レーン４をレー
ン５と比較）。この図の底部に示される負荷対照バンドは、ゲル中のタンパク質
の負荷当量を示す。

【０１３１】実施例４この実施例は、損傷又は破壊されたＤＮＡによるＤＮＡプロテインキナーゼ活
性の直接の活性化を示す。

【０１３２】ヒト角化細胞ラインＨａＣａｔ抽出物中のＡＴＭ又はＦＲＡＰを、（１）ＡＴ
Ｍ又はＦＲＡＰのいずれかに対する抗体、及び（２）アガロースビースに結合し
た抗−抗体の免疫沈降とともに、インキュベーションすることにより免疫沈降さ
せた。

【０１３３】結合したＡＴＭ又はＦＲＡＰを、遠心分離により回収し、次に、ｐ５３タンパ
ク質に由来するリン酸化基質ペプチドと、そしてＦＲＡＰの場合は、その小さい
サブユニットタンパク質であるＦＫＢＰと混合した。バクテリオファージλＤＮ
Ａの場合、ＵＶ照射されたＤＮＡ、又はラパマイシンを反応に加えた。次にアデ
ノシン三リン酸を添加し、反応体を３０℃で２時間インキュベートした。次に、
反応生成物を、ＥＬＩＳＡプレートに結合させ、ホスホセリン及びホスホトレオ
ニンに特異的な抗体でプローブした。これらの抗体の結合は、（１）アルカリリ
ン酸に結合した二次抗体、及び（２）ニトロフェニルリン酸基質により検出され
た。得られた黄色の物質をマルチウェルプレートリーダーを使用して４０５ｎｍ
で最適の濃度で測定した。

【０１３４】結果を図８に示す。図に示すように、ＦＲＡＰのｐ５３ペプチドのリン酸化は
、λＤＮＡの添加により刺激され、λＤＮＡの短いサイズは、多くの破壊された
末端を有する哺乳類ＤＮＡに類似していた（＋ＤＮＡバーとＦＲＡＰ／ＦＫＢＰ
／ｐ５３バーを比較）。しかし、ＦＲＡＰ活性は、添加されたＤＮＡが初めにＵ
Ｖで照射され、フォトプロダクツを誘導する場合、より大きかった（＋ＵＶ−Ｄ
ＮＡバーと、＋ＤＮＡバーを比較）。このＵＶ−ＤＮＡで高められたリン酸化は
、２ｎｇ／ｍｌラパマイシン（＋ラパマイシンバー）とのコインキュベーション
により完全に停止した。同様に、ＡＴＭリン酸化されたｐ５３ペプチド（ＡＴＭ
／ｐ５３バー）及びそのリン酸化は、λＤＮＡの添加（＋ＤＮＡバー）により刺
激され、その短いサイズは、破壊されたＤＮＡに類似していた。

【０１３５】実施例５この実施例は、ＵＶによるＴＮＦαの誘導を減少するラパマイシンの能力が、
用量依存性であることを示す。

【０１３６】１００Ｊ／ｍ^２ＵＶ−Ｂで照射され、ＴＮＦαプロモーターからのＣＡＴ遺伝
子の発現を誘導するＸＰＴＮＦ２細胞を、ラパマイシン濃度を増加しながらイン
キュベートした。プロモーターからの発現阻害のレベルを図９に示す。

【０１３７】図から明らかなように、２ｎｇ／ｍｌ未満のレベルのラパマイシンでは、この
ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害の阻害作用は、検出されなかった。効果は、２ｎ
ｇ／ｍｌで検出可能になり、そして、用量が高くなるにつれ、阻害も増加した。

【０１３８】本発明の特定の態様を記載し、そして例示したが、本発明の精神及び範囲を離
れることなく、改良することができる。

【０１３９】上記に参照した多くの引用した文献の内容を、本明細書に援用する。

【図面の簡潔な説明】

【図１】図１は、従来技術における遺伝子毒性エージェントに対する細胞の反応に含ま
れる経路の理解を示すフローチャートである。図１に示すように、遺伝子毒性エ
ージェントにより損傷を受けたＤＮＡは、ＤＮＡプロテインキナーゼを活性化し
、次に、リン酸化された基質を生成し、これが、細胞周期の停止及び細胞死の細
胞外事象を引き起こすと考えられていた。

【図２】図２は、本発明による遺伝子毒性エージェントに対する細胞の反応に含まれる
経路を示すフローチャートである。図２に示すように、遺伝子毒性エージェント
により損傷を受けたＤＮＡは、ＤＮＡプロテインキナーゼを活性化し、次に、基
質をリン酸化し、これはサイトカインの細胞外への放出の引き金となる。

【図３】図３は、ＤＮＡプロテインキナーゼの系統図である。既知の脂質及びＤＮＡプ
ロテインキナーゼの関係を、アミノ酸配列相同性に基づき示す。タンパク質は、
脂質キナーゼ活性を有するものと、プロテインキナーゼ活性を有するものに分割
されている。各タンパク質について、タンパク質の名前と機構を示す。細いバー
は、非相同性部分を示し、太いバーは、Ｋｕ又はＦＫＢＰタンパク質のような、
小さいサブユニットが結合する領域を示す。色をつけていない太いバーは、キナ
ーゼ活性化部位の領域を表し、そして、垂直に縞状の領域は、ＤＮＡプロテイン
キナーゼの間の相同性を示すカルボキシ末端である。各タンパク質について、ア
ミノ酸の数（既知）及びＡＴＭタンパク質のキナーゼ領域のアミノ酸配列との相
同性の％（同一又は保存されたアミノ酸置換）を示す。この図は、Ｖ．Ｚａｋｉ
ａｎ、“ＡＴＭ−ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ：ｗｈａｔｄｏｔｈｅｙｔ
ｅｌｌｕｓａｂｏｕｔｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｈｕｍａｎ
ｇｅｎｅｓ？”、Ｃｅｌｌ、８２巻、６８５頁乃至６８７頁、１９９５年、及び
Ｓ．Ｊｉｎ、Ｓ．Ｉｎｏｕｅ及びＤ．Ｗｅａｖｅｒ、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆ
ｔｈｅＤＮＡＤｅｐｅｎｄｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅｓ”、ＣａｎｃｅｒＳｕｒｖｅｙｓ、２９巻、２２１頁乃至２６１頁に記載されてい
る。

【図４】図４は、ヒト角化細胞でのＴＮＦαタンパク質発現のウエスタンブロットであ
る。ヒト系ＨａＣａｔに由来する細胞は、２００Ｊ／ｍ^２のＵＶ−Ｂで照射され
るか、又は、１μｇ／ｍｌのＬＰＳで処理され、３７℃で２４時間インキュベー
トされた。抽出物を調製し、１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニト
ロセルロースに移し、そして、抗ヒトＴＮＦα抗体でブロットし、続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼを二次抗体に結合し、そして、ＥＣＬ化学発光
系を使用して暴露した。レーンは、（１）照射された、（２）照射されそして照
射の前３０分間、２ｎｇ／ｍｌラパマイシンで処理された、（３）ＬＰＳで処理
された、（４）ＬＰＳ及びラパマイシンで処理された、（５）本物のＴＮＦα標
準である。

【図５】図５は、種々のＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤の存在下及び非存在下でのＵ
Ｖ暴露に続くＴＮＦαプロモーターからのクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェレース（ＣＡＴ）の誘導を示す。ヌクレオチド除去修復の欠乏している、
ＸＰ１２ＢＥ細胞、ＴＮＦｃａｔトランスジーンで形質転換し、ＴＮＦαプロモ
ーター由来のＣＡＴを発現するＸＰＴＮＦ２細胞系を形成した。細胞をＤＮＡプ
ロテインキナーゼ阻害剤で照射の前３０分間処理し、次に１００Ｊ／ｍ^２ＵＶ−
Ｂに曝した。１８時間後、抽出物を調製し、蛍光クロラムフェニコール基質を使
用してＣＡＴ活性をアッセイした。反応生成物を、薄層クロマトグラフィーで分
離し、そして、ＵＶ−Ａ光線で蛍光を視覚化した。サンプルは、（１）基質のみ
、（２）非処理細胞、（３）ＵＶ照射された細胞、（４）ＵＶ照射され且つラパ
マイシンで処理された細胞、（５）ラパマイシンのみで処理された細胞、（６）
非処理細胞、（７）ＵＶ照射された細胞、（８）ＵＶ照射され且つウォルトマニ
ンで処理された細胞、（９）非処理細胞、（１０）ＵＶ照射された細胞、（１１
）ＵＶ処理され且つスタウロスポリンで処理された細胞、（１２）ＬＰＳ処理さ
れた細胞、及び（１３）ＬＰＳ及びラパマイシンで処理された細胞である。

【図６】図６は、ＬＰＳ処理後のＴＮＦαプロモーターに由来するクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェレース（ＣＡＴ）の誘導を示す。ＸＰＴＮＦ２細胞は、
ＵＶの代わりに１μｇ／ｍｌのＬＰＳに曝す以外は、図５のように処理された。
ＣＡＴ活性は、タンパク質抽出物の量及び３０分間に形成された生成物の量から
計算し、蛍光薄層クロマトグラフィープレートのコンピューター画像分析により
定量化された。

【図７】図７は、ヒト角化細胞のｐ７０^Ｓ６Ｋリン酸化のウエスタンブロットである。
ヒト系ＨａＣａｔ由来の細胞を２００Ｊ／ｍ^２ＵＶ−Ｂで照射するか又は１μｇ
／ｍｌのＬＰＳで処理し、２４時間３７℃でインキュベートした。抽出物を調製
し、１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移し、ヒ
トｐ７０^Ｓ６Ｋのリン酸化された形のセリン及びトレオニンに対する抗体でブロ
ットし、次に、二次抗体でホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させ、Ｅ
ＣＬ化学発光系を使用して暴露した。レーンは、（１）非照射、（２）照射、（
３）照射且つ照射前３０分間２ｎｇ／ｍｌラパマイシンでの処理、（４）ＬＰＳ
での処理、及び（５）ＬＰＳ及びラパマイシンでの処理である。

【図８】図８は、ｐ５３ペプチド上でのＦＲＡＰ及びＡＴＭキナーゼ活性を示す。抽出
物は、ヒト角化細胞系ＨａＣａｔから調製した。抽出物を、ＦＲＡＰ（黒いバー
）又はＡＴＭ（灰色のバー）に対する抗体とインキュベートし、そして、抗体−
キナーゼの結合生成物を遠心分離によりプロテインＧビーズで沈降した。ビーズ
に結合したＦＲＡＰキナーゼをＦＫＢＰタンパク質と混合し、ＦＲＡＰ及びＡＴ
Ｍをｐ５３タンパク質のペプチドの部分とともにインキュベートした。この混合
物に、表示のように、種々のＤＮＡ類及び阻害剤を添加した。３０℃で２時間後
、反応生成物を８倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加し、ホスホセリン修飾
されたタンパク質及びホスホトレオニン修飾されたタンパク質に対する抗体、及
びニトロフェニルリン酸化基質に対するアルカリフォスファターゼ二次抗体を展
開させた。対照は、ホスホセリン及びホスホトレオニン胎児ウシ血清アルブミン
を含んだ。リン酸化されたタンパク質は、４０５ｎｍにおいて光学濃度で測定し
た。

【図９】図９は、異なる濃度のラパマイシンに対するＴＮＦ_ｃａｔ発現の阻害のレベル
を示す、用量依存性曲線である。ＣＡＴ活性は、図５に示すようにアセチル化さ
れたクロラムフェニコールの画分から算出し、そして、ラパマイシン非存在下で
の活性と比較した。明細書に組み込まれ、そして明細書の一部を構成する以下の図は、本発明の種
々の態様を説明と共に示し、本発明の原理を説明するためのものである。もちろ
ん、図及び説明は、説明のためのものであって、本発明をこれに限定するもので
はない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4C084 AA17 NA06 NA14 ZA072 ZA082 ZA712 ZA892 ZA922 ZB112 ZB262 ZB332 ZC202 ZC372 4C086 CB22 MA01 MA04 NA06 NA14 ZA07 ZA08 ZA71 ZA89 ZA92 ZB11 ZB26 ZB33 ZC20 ZC37

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子毒性エージェントへの暴露によるサイトカインの放出
を阻害するためにヒトを処置する方法であって、前記方法が、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤を、遺伝子毒性エージェントに曝された細胞によるサイトカイン
放出を防ぐのに十分な量で、前記ヒトに投与することを含む、方法。
【請求項２】遺伝子毒性エージェントが、紫外線光線である、請求項１記
載の方法。
【請求項３】遺伝子毒性エージェントが、化学療法エージェント又は放射
線療法エージェントである、請求項１記載の方法。
【請求項４】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤が、ラパマイシンである、
請求項１記載の方法。
【請求項５】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤が、インターロイキン−１、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１０、及び細胞
内接着分子１からなる群から選択される少なくとも一つのサイトカインの放出を
阻害するのに十分な量で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項６】遺伝子毒性エージェントへの暴露によるサイトカインの放出
を阻害するためにヒトを処置する方法であって、前記方法が、ＤＮＡプロテイン
キナーゼの少なくとも一つの活性を減少するのに十分な量で、ＤＮＡプロテイン
キナーゼ阻害剤を前記ヒトに投与し、その結果、遺伝子毒性エージェントに曝さ
れた細胞によるサイトカイン放出を阻害することを含む、方法。
【請求項７】遺伝子毒性エージェントが、紫外線光線である、請求項６記
載の方法。
【請求項８】遺伝子毒性エージェントが、化学療法エージェント又は放射
線療法エージェントである、請求項６記載の方法。
【請求項９】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤が、ラパマイシンである、
請求項６記載の方法。
【請求項１０】ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、及びＦＲＡＰからなる群
から選択されるＤＮＡプロテインキナーゼの少なくとも一つの活性を減少させる
のに十分な量で、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤が投与される、請求項６記載
の方法。
【請求項１１】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤が、インターロイキン−
１、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１０、及び細
胞内接着分子１からなる群から選択される少なくとも一つのサイトカインの放出
を阻害する、請求項６記載の方法。
【請求項１２】ＤＮＡプロテインキナーゼ活性を調節することにより、遺
伝子毒性エージェントのＤＮＡ損傷作用によるサイトカインの放出を変更するこ
とを含む、遺伝子毒性エージェントの作用の変更方法。
【請求項１３】遺伝子毒性エージェントのＤＮＡ損傷作用を防き、ＤＮＡ
プロテインキナーゼ活性を調節することによりサイトカインの放出を減少するこ
とを含む、遺伝子毒性エージェントの副作用を処理する方法。
【請求項１４】副作用が、皮膚ガン、紅斑、ウイルスの活性化、炎症、熱
、吐き気、嘔吐、頭痛、悪寒、色素異常、脱毛、及びこれらの組み合わせからな
る群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】以下のような治療を行われている患者のための移植拒否治
療の少なくとも一つの副作用を減少させるための方法：（ａ）一回投与量で移植拒否を阻害する化合物の投与、及び、（ｂ）患者への遺伝子毒性エージェントの暴露と組み合わせて前記化合物の追加
量を投与し、前記化合物が、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤である、投与。
【請求項１６】化合物がラパマイシンである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】以下のような治療を行われている患者のための移植拒否治
療の少なくとも一つの副作用を減少させるための方法：（ａ）患者への移植拒否を阻害することのできる第一の化合物の投与、及び、（ｂ）患者への遺伝子毒性エージェントの暴露と組み合わせて患者への移植拒否
を阻害することのできる第二の化合物の投与であって、前記第二の化合物が、Ｄ
ＮＡプロテインキナーゼ阻害剤である、投与。
【請求項１８】前記第一の化合物が、シクロスポリンＡである、請求項１
７記載の方法。
【請求項１９】前記第二の化合物が、ラパマイシンである、請求項１７記
載の方法。
【請求項２０】遺伝子毒性エージェントへの暴露によるサイトカインの放
出を阻害するのに十分な量で、このような治療に必要な場合、患者に移植拒否を
阻害することの可能な化合物を投与することを含み、前記化合物が、ＤＮＡプロ
テインキナーゼ阻害剤である、移植拒否治療を行う方法。
【請求項２１】化合物がラパマイシンである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】移植拒否治療を行う方法であって、このような治療に必要
な患者に、移植拒否の制御及び遺伝子毒性エージェントへの暴露によるサイトカ
インの放出の阻害の両方に貢献するのに十分な量で、化合物を投与することを含
み、前記化合物が、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤である、方法。
【請求項２３】化合物がラパマイシンである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】移植拒否治療を行う方法であって、このような治療が必要
な患者に、移植拒否を制御するのに貢献するのに十分な量で、第一の化合物を投
与し、及び、移植拒否の制御及び遺伝子毒性エージェントへの暴露によるサイト
カインの放出の阻害の両方に貢献するのに十分な量で、第二の化合物を投与する
ことを含み、前記第二の化合物が、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤である、。
【請求項２５】前記第一の化合物が、シクロスポリンＡである、請求項２
４記載の方法。
【請求項２６】前記第二の化合物がラパマイシンである、請求項２４記載
の方法。
【請求項２７】サイトカイン放出を促進する方法であって、（ａ）少なくとも一つの遺伝子毒性エージェントをヒトの組織又は器官に投与し
、そして（ｂ）少なくとも一つのＤＮＡプロテインキナーゼ促進剤を、遺伝子毒性エージ
ェントに反応して組織又は器官からのサイトカインの放出を促進するのに十分な
量で、前記組織又は器官に投与する、ことを含む、方法。
【請求項２８】組織又は器官が炎症に見舞われている、請求項２７記載の
方法。
【請求項２９】組織又は器官が皮膚であり、炎症が乾癬であり、遺伝子毒
性エージェントが、コールタール及びソラレン＋光線からなる群から選択される
、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】免疫抑制剤の患者への投与を監視する方法であって、前記
免疫抑制剤が、少なくとも一つのＤＮＡプロテインキナーゼの阻害剤であって、
前記方法は、（ａ）患者から細胞のサンプルを採取し、そして、（ｂ）前記サンプルの少なくとも一つのＤＮＡプロテインキナーゼの活性レベル
を決定する、ことを含む、方法。
【請求項３１】工程（ｂ）の決定に基づいて、免疫抑制剤の量、計画、又
は投与経路の少なくとも一つを調整する工程をさらに含む、請求項３０記載の方
法。
【請求項３２】免疫抑制剤がラパマイシンである、請求項３０記載の方法
。
【請求項３３】一つ以上の遺伝子毒性エージェントに対する、個体の感受
性を決定する方法であって、（ａ）個体から細胞のサンプルを採取し、そして、（ｂ）前記サンプルの少なくとも一つのＤＮＡプロテインキナーゼの活性レベル
を決定する、ことを含む、方法。
【請求項３４】一つ以上の遺伝子毒性エージェントに対する、個体の感受
性を決定する方法であって、（ａ）個体から細胞のサンプルを採取し、そして、（ｂ）前記サンプルの、前記遺伝子毒性エージェントにより生じたＤＮＡ損傷の
種類に特異的なＤＮＡプロテインキナーゼの活性レベルを決定する、ことを含む、方法。
【請求項３５】生体サンプル中のＤＮＡプロテインキナーゼの活性を決定
する方法であって、（ａ）サンプルからＤＮＡプロテインキナーゼを単離し、（ｂ）単離したキナーゼを、キナーゼがリン酸化することのできる基質とともに
、キナーゼが感受性を有する種類のＤＮＡ損傷にさらし、そして、（ｃ）リン酸化された基質の濃度を決定し、前記濃度が、キナーゼの活性の指標
である、方法。
【請求項３６】基質のリン酸化のレベルが、リン酸化されたときに基質に
対して特異的な抗体を使用して決定される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤及び遺伝子毒性エージェ
ントを含む、組成物。
【請求項３８】遺伝子毒性エージェントが、化学療法エージェントである
、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】遺伝子毒性エージェントが、コールタールである、請求項
３７記載の方法。
【請求項４０】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤及びソラレンを含む、組
成物。
【請求項４１】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤、及びＤＮＡプロテイン
キナーゼ阻害剤ではない、免疫抑制剤を含む、組成物。
【請求項４２】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤がラパマイシンであり、
ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤でない免疫抑制剤がシクロスポリンＡである、
請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤及びＤＮＡプロテインキ
ナーゼ阻害剤でないゲノプロテクティブ（遺伝子保護）エージェントを含む、組
成物。
【請求項４４】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤でないゲノプロテクティ
ブエージェントが、日焼け止めである、請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤でないゲノプロクティブ
エージェントが、ＤＮＡ修復酵素である、請求項４３記載の組成物。
【請求項４６】ＤＮＡプロテインキナーゼがラパマイシンである、請求項
４３記載の組成物。
【請求項４７】患者への化学療法又は放射線療法の投与又は運搬の副作用
を減少する方法であって、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤を、患者の消化管、
頭皮、又は化学療法又は放射線療法が投与又は運搬される部位の少なくとも一つ
に投与することを含む、方法。