CN1289254A - 使用抗生素和毒素结合寡糖组分治疗细菌性痢疾的化合物和方法 - Google Patents

使用抗生素和毒素结合寡糖组分治疗细菌性痢疾的化合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及致病性大肠杆菌感染所致腹泻和相关病症的治疗。更具体而言,本发明得益于意想不到的发现:在施用抗生素时,施用结合和除去致病性大肠杆菌所产生的志贺样毒素(SLT)的组分,提供改善的治疗。提供了既包括抗生素也包括毒素结合组分的新的组合物和在施用抗生素时,同时施用毒素结合组分的治疗方法。这些组合物和方法杀死产生病症的肠大肠杆菌生物体并中和由该生物体产生的和/或由被杀死的该生物体释放的SLT。由此,这些组合物和方法能够较传统治疗更好地减轻感染症状并抑制感染进展成溶血尿毒症综合症(HUS)。

Description

使用抗生素和毒素结合寡糖组分 治疗细菌性痢疾的化合物和方法
相关申请的相互参考
本申请要求申请号为60/075643的美国申请的优先权，其公开的全部内容在此引入作为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及致病性大肠杆菌感染所致腹泻和相关病症的治疗。更具体而言，本发明得益于一个意想不到的发现：即在施用抗生素时，施用一种能结合和除去致病性大肠杆菌产生的志贺样毒素的组分，可以提供改善的治疗效果。提供了含有抗生素和毒素结合组分的新的组合物，和在施用抗生素的同时施用毒素结合组分的治疗方法。这些组合物和方法杀死产生病症的肠道大肠杆菌生物体，并且中和生物体产生的和/或生物体被杀死时释放的SLT。由此，这些组合物和方法较传统治疗能够更好地减轻感染症状和抑制感染进展成溶血性尿毒症综合征(HUS)。
参考文献
在本申请中，在引证下列参考文献时，在相关部分用[]中的数字表示。
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上述出版物、专利和专利申请在此将其全部引入参考，引入的程度就象每一个出版物、专利和专利申请的内容专门地和独立地包括在本文中那样。
现有技术
已经发现，致病性大肠杆菌菌株引起的腹泻与多种肠毒素的产生有关。一些致病性大肠杆菌产生与志贺样毒素密切相关的肠毒素，而志贺样毒素与志贺氏菌属引起痢疾有关。第一个被分离的志贺样毒素(SLT)家族的成员是非洲绿猴(Vero)细胞的细胞毒，最初称作vero细胞毒素。由于通过相关基因序列分析证实其结构类似于志贺样毒素，因此，目前该毒素更多地被称作志贺样毒素Ⅰ(SLTⅠ)[5,6,7]。
SLT家族的其它成员也已陆续地被分离，可以通过血清学分辨，或根据基因序列或宿主特异性进行分辨[37-43]。根据毒素是由哪种大肠杆菌菌株和哪种感染宿主分离出来的，对各种类型的SLTⅡ进行了描述并赋予了不同命名。这样，已经命名的不同变体有SLTⅡ；vtx2ha；SLTⅡvh；vtx2hb；SLTⅡc；SLTⅡvp等等。
所有这些SLT，均是由酶(A)亚单位和复(B)亚单位组成的多亚基蛋白质。B低聚体是毒素结合部分，使得毒素结合到宿主细胞受体上。SLTⅠ、SLTⅡ和SLTⅡvh的B亚单位识别在非-还原末端含有最小二糖亚单位αGal(1-4)βGal的宿主细胞globoseries糖脂受体；已经证实，SLTⅡvp与含有这些亚单位的受体结合，但不必要在非-还原末端[2,44-51]。A亚单位具有使哺乳动物细胞28S核糖体RNA脱嘌呤的酶活性(N-糖苷酶)。此酶活性使得毒素-感染的细胞丧失进行蛋白合成的能力。
在肾脏和肠系膜血管上发现的SLT作用位点是内皮细胞，SLT可以引起导致肾衰和出现血红蛋白尿的损害。SLT是溶血尿毒症综合征的病原剂。出血性肠炎(血性腹泻)的发病机理也可能部分与SLT有关。溶血尿毒症综合征(HUS)是儿童急性肾衰的主导原因，在大肠杆菌O157:H7和产生其它vero细胞毒素/志贺样毒素的大肠杆菌(VTEC)感染后5-10天，大约7-10％的儿童受到侵害。
近来对致病性大肠杆菌的注意力，集中在大肠杆菌污染一定肉类和随后使食入这些肉类的人感染之间的已知关系上。对于汉堡肉而言，该问题特别严重，发现食入夹生的肉是感染的致病因素。该问题被通过SLT表达使致病性大肠杆菌感染快速进展成HUS的事实而复杂化，提示这样一种假设：最初占据消化道，通过向感染个体的血流中跨膜释放SLT毒素，随后是内皮损伤和接下来的肾损害。
由于因素复杂，现有技术已经建议，在治疗肠出血性大肠杆菌感染中反对使用抗生素[8]，尽管最近的出版物提出早期施用抗生素可以降低vero细胞毒素的水平[55]。在治疗这种病症中，抗生素至少部分被禁忌，因为由被抗生素杀死的生物体释放出来的毒素进入肠道，加重毒素所致的腹泻和其它病症。一些研究提示，抗生素治疗在大肠杆菌O157:H7的最小抑菌浓度(MIC)或低于最小抑菌浓度时，事实上，可能诱导生物体产生vero细胞毒素[62]。如果确实如此，则会增加发展成HUS的可能并进一步与使用抗生素治疗感染相抵触。抗运动性药物的使用也显示为实得其反[9]。
一个报道的治疗感染的方法是，让感染患者口服可药用的含有αGal(1-4)βGal亚单位的惰性亲和支持体[10]。支持体进入患者肠道，其αGal(1-4)βGal亚单位与志贺样毒素结合。随后，结合在该固体支持体上的毒素作为粪便的一部分由机体排出。该方法是首先报道的为了将毒素由机体排除，反过来，抑制了与毒素蓄积有关的病症表现的方法之一。也已经证明，通过时间临界施用包含含有αGal(1-4)βGal亚单位(其亚单位可以与SLT结合)的可药用惰性亲和支持体的药物组合物，使得由肠出血性大肠杆菌感染引起的临床HUS的发病率下降。特别是，业已发现，在出现感染3天之内施用该药物组合物，则由肠出血性大肠杆菌感染引起的临床HUS的发病率下降[54,55]。虽然这些报道的方法取得了显著的进步，但在治疗肠出血性大肠杆菌感染治疗中需要更显著的进步，以降低HUS的发生和与之相关的高死亡率。尤其是，需要既能杀死肠出血性大肠杆菌生物体又能中和及排除SLT的化合物和方法。优选的化合物将是非侵害性给药，如以适宜药物制剂口服给药。
发明概述
本发明涉及这样一个令人惊奇的和意想不到的发现：在给致病性大肠杆菌感染者或易感者施用抗生素的同时施用结合SLT的组分，可以有利地治疗肠出血性大肠杆菌感染。特别是，提供包含含有可以结合SLT的寡糖的可药用惰性亲和支持体的毒素结合组分。尤为有用的是含有αGal(1-4)βGal亚单位的寡糖。优选是用含有抗生素和含有结合SLT的寡糖的药用惰性亲和支持体的药物组合物实现这种同时给药的。
一方面，本发明提供了预防或缓解患有或易患有肠出血性大肠杆菌介导的一种或多种疾病的患者的疾病的方法，包括对患者同时给药有效量的共价结合于可药用惰性支持体的至少一个SLT结合寡糖序列(寡糖-支持体)，所述寡糖序列结合SLT以及所述结合到寡糖-支持体上的SLT能从胃肠道排除。实施方案中，抗生素是头孢克肟、四环素、环丙氟哌酸、复方磺胺甲基异噁唑、丝裂霉素-C、磷霉素或卡那霉素；寡糖包括αGal(1-4)βGal亚单位，特别是其中寡糖选自αGal(1-4)βGal、αGal(1-4)βGal(1-4)βGlcNAc和αGal(1-4)βGal(1-4)βGlc；和使用非-肽基接头将寡糖与支持体结合是非常有用的。在一优选的实施方案中，将含有抗生素和SLT结合寡糖-支持体的单个药物组合物给药。在另一优选的实施方案中，在显示感染的约3天内给药。
另一方面，本发明提供用于治疗或预防与肠出血性大肠杆菌有关的病症的药物组合物，包括至少一种抗所述肠出血性大肠杆菌有效的抗生素和至少一种共价结合于可药用惰性支持体的寡糖序列(寡糖-支持体)以及一种可药用载体，其中所述寡糖序列与SLT结合，其中与所述寡糖-支持体结合的SLT能够从胃肠道排除。实施方案中，所述抗生素是头孢克肟、四环素、环丙氟哌酸、复方磺胺甲基异噁唑、丝裂霉素-C、磷霉素或卡那霉素；寡糖包括αGal(1-4)βGal亚单位，特别是其中寡糖选自αGal(1-4)βGal、αGal(1-4)βGal(1-4)βGlcNAc和αGal(1-4)βGal(1-4)βGlc；和使用非-肽基接头将寡糖与支持体结合是非常有用的。在一优选的实施方案中，在出现感染约3天之内给药。
再一方面，本发明提供预防或减轻患者或易感者的由肠出血性大肠杆菌介导的一种或多种病症的方法，包括首先向患者施用有效量的至少一种共价结合于可药用惰性支持体的SLT结合寡糖序列(寡糖-支持体)，其中所述寡糖序列结合SLT，接着向患者同时施用有效量的至少一种抗生素和有效量的至少一种共价结合于可药用惰性支持体的SLT结合寡糖序列(寡糖-支持体)，其中所述寡糖序列结合SLT，其中每次给药后，与所述寡糖-支持体结合的SLT能够从胃肠道排除。实施方案中，所述抗生素是头孢克肟、四环素、环丙氟哌酸、复方磺胺甲基异噁唑、丝裂霉素-C、磷霉素或卡那霉素；寡糖包括αGal(1-4)βGal亚单位，特别是其中寡糖选自αGal(1-4)βGal、αGal(1-4)βGal(1-4)βGlcNAc和αGal(1-4)βGal(1-4)βGlc；和使用非-肽基接头使寡糖与支持体结合是非常有用的。在一优选的实施方案中，在最初单独施用毒素结合组分之后，施用含有抗生素和SLT结合寡糖-支持体的单个药物组合物。在另一优选的实施方案中，在出现感染约3天之内给药。
优选实施方案描述
如上所述，本发明涉及在施用有效对抗肠出血性大肠杆菌的抗生素时，同时共同施用结合SLT的SLT结合寡糖-支持体组合物。共同给药产生更为有效的预防HUS和其它与致病性大肠杆菌感染有关的病症的治疗方案。有毒素-结合组合物的存在，抗生素杀死微生物时释放的毒素被中和并从机体中排除。因此，这些方法较传统治疗能够更好地减轻感染的症状和抑制感染进展成溶血尿毒症综合征(HUS)。A．定义
本文使用的术语的含义如下：
术语“生物相容性”，指与动物或人组织或体液没有化学作用。生物相容性物质是非-敏化的。
术语“相容性接头臂”，指起到将寡糖结构与生物相容性支持体隔开的部分，呈双官能的，其中一个官能团能够与支持体的交互的官能团共价结合，另一个官能团能够与寡糖结构的交互官能团结合。本发明相容性接头臂优选是非-肽基接头臂。这就是说，接头臂不使用肽基去将寡糖结构连接到支持体上。该寡糖可通过8-甲氧基羰基辛基连接或通过另一适当的非-肽基连接，如式-NH-(CH2)m-NHC(O)NH-的脲样连接臂来连接，其中m是由约2到约10的整数。
“溶血尿毒症综合征”或“HUS”在如果有肾损伤和溶血或血小板减少时，认为存在。肾损伤需要血清肌酸酐浓度升高(小于5岁时，＞50μmol/L，或者5-6岁时，＞60μmol/L)，或者在疾病急性期记录的肌酸酐值差异大于50％，或者在尿液显微镜下检查时每一高倍视野中至少有10个红细胞。如果血红蛋白浓度≤105g/L，或者如果血涂片中有红细胞碎片，或者如果在血红蛋白降至≤105g/L之前曾输入过红细胞，则判定为存在溶血。血小板减少定义为血小板浓度小于150×109/L。
术语“寡糖”，指含1～约20糖单元的糖。糖衍生物也可被用作包括在术语寡糖中的糖部分[58-60]。
术语“器官牵连”，指临床上定义的由SLT介导的器官牵连，与疾病的自然进程有关。肠道以外的器官包括，以例举方式表示有，肾脏、心脏、中枢神经系统(“CNS”)的各部分(即，脑、脊髓等)、肝脏等等。常规的血液化学检测可以估测肝脏、心脏和肾脏牵连，而包括痴呆、惊厥、定向力障碍等在内的临床症状用于测定CNS受牵连情况。
术语“志贺样毒素”或“SLT”或“vero细胞毒素”，指本领域技术人员通常知晓的肠出血性大肠杆菌产生的一组毒素，与志贺氏菌产生的那些志贺样毒素类似。这些毒素包括酶活性A亚单位和多亚基受体结合B亚单位。SLT包括SLTⅠ和被本领域技术人员称作SLTⅡ的各组毒素。SLT与寡糖-支持体组分的快速紧密结合，可以通过本领域已知的试验如vero细胞毒性中和试验来证明。
术语“支持体(support)”，指结合寡糖序列的惰性物质，通常通过相容的连接臂结合。当用于体内时，支持体是生物相容性的。
术语“SYNSORB”，指共价键合在CHROMOSORB PTM(Manyille Corp.Denver.Colorado)上的合成的8-甲氧基羰基辛基寡糖结构[11]，CHROMOSORB PTM是衍生的硅粒(silica particle)。共价结合于生物相容性支持体如CHROMOSORB PTM的合成寡糖序列(SYNSORB)可用于结合SLT毒素或vero细胞毒素。这些组分在防止HUS和有关病症方面非常有用。这些组分中，特别优选SYNSORB，这是因为它无毒且耐机械和化学降解。业已发现，SYNSORBs通过大鼠胃肠道而不受到影响。口服给药后，可以被快速、彻底清除(72小时清除99％)。此外，SYNSORB上寡糖部分的高密度特别适于结合vero细胞毒素。
为了应用的目的，所有糖参考使用传统三字母命名法。除非另有声明，除岩藻糖是L-构型外，假定所有糖是D-构型。另外，所有糖是吡喃糖形式。
为了应用的目的，鉴定了存在有与SLT介导的大肠杆菌感染有关的至少一种病症后，即认为出现感染。这些病症包括例如，患者患有腹泻和下述一种症状：腹痛性痉挛、粪便带血、直肠脱垂、患者粪便中检测到产生vero细胞毒素的大肠杆菌；可疑的食入食物中检测到产生vero细胞毒素的大肠杆菌；或者与已知患有SLT介导的感染的个体有过密切接触。优选地，出现感染表现为血性腹泻。在一尤其优选的实施方案中，对受SLT介导的大肠杆菌感染折磨的个体的最初临床鉴定是通过粪便的诊断评估进行确诊的。一种检测SLT介导的大肠杆菌感染的市售的诊断工具由Merdian Diagnostic.Inc.Cincinnati.Ohio.USA45244以Premier EHEC的名字出售。B．合成
按照本领域已知的方法完成抗生素的合成。适用于本发明的抗生素包括适用于治疗肠出血性大肠杆菌感染的那些抗生素，也就是说，细菌生物体对抗生素敏感，即无耐药性。优选的是杀菌性抗生素，而不是抑菌性抗生素。应当使用与联合给药的寡糖-支持体组分不起反应的那些抗生素。这样的抗生素为本领域技术人员所知或者可以由本领域技术人员选出。(参见例如，Goodman和Gilman，治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第7版，其公开在此引入参考。)特别优选的抗生素包括头孢克肟、环丙氟哌酸、复方磺胺甲基异噁唑、丝裂霉素-C、磷霉素、卡那霉素、阿齐红霉素、四环素、米诺环素、cefditoren/头孢特仑新戊酯、诺氟沙星、氯霉素、链霉素、氨苄西林、磺胺甲噁唑-甲氧苄啶和萘啶酸[56,57]。
寡糖结构的化学合成可以使用本领域已知的方法完成。通常，用适宜地保护的独立的单糖来装配这些寡糖。
对于每个要合成的单个结构而言，所用的特异方法通常是合适的和最优化的。总的来说，寡糖糖苷的全部或部分的化学合成，首先涉及在还原糖或单糖的异头碳原子上形成配糖键。特别是，自然存在或化学修饰的糖结构(葡基供体)的适宜保护形式是在还原单元的异头中心进行选择性修饰，以便引入离去基团，所述离去基团包括卤素、三氯乙酰亚胺酸、乙基、硫代糖苷等。然后，供体在本领域众所周知的催化条件下与糖苷配基或合适型的碳水化合物受体进行反应，所述受体在要建立糖苷键的位置具有一个自由羟基。
本领域技术人员知晓的大量糖苷配基部分，其可以按照适合的构型结合于还原单元的异头中心上。在合成碳水化合物领域中熟知的相容性保护基团的适宜应用，使得合成的结构得以选择性修饰或者其它糖单元或糖模块进一步结合于受体结构。
糖苷键形成后，糖苷可用于偶合其它糖单元或在选择位置进行化学修饰，或者在常规脱保护之后用于酶合成。总之，自然发生或化学修饰的糖单元与糖苷的化学键合，是通过使用文献中已经很好地建立的化学过程来完成的[12-28]。
结合或固定本发明寡糖结构的支持体，包括本领域已知的各种生物相容性物质。特别优选水溶性生物相容性聚合物，如水凝胶、羧甲基纤维素、合成的聚合物等等。尤其是，这些支持体对于释放(特别是延时释放)到肠道特别有用。有用的支持体是非吸收的，也就是说，它们是可溶的或不溶性的，只要它们不被机体吸收。
固体支持体特别适用于某些应用。本发明寡糖结构要结合的这些固体支持体可以是薄片或颗粒形式。大量各种生物相容性固体支持体物质为本领域所已知。其实例有二氧化硅、合成的硅酸盐如多孔玻璃、生物产生的硅酸盐如硅藻土、含硅酸盐的矿物质如高岭石和合成聚合物如聚苯乙烯、聚丙烯和多糖。优选地，体内用的固体支持体的颗粒大小为约10～500微米。特别是，以100～200微米的颗粒为优选。
寡糖结构共价键合或非共价(被动)吸附到支持体上，以便被固定而形成寡糖-支持体结构。共价键合可以通过支持体上的官能团与寡糖结构的相容性连接臂之间的反应来实现。意想不到的发现是，寡糖结构通过相容性连接臂结合到生物相容性支持体上，提供了一种虽然是支持体但能够有效地清除毒素的产物。直接键合所用的连接部分，优选是适宜长度(至少1个碳原子)的有机双官能分子，其仅仅起到隔开支持体表面和寡糖结构的作用。
本发明寡糖-支持体组分优选由下式表示：(寡糖-Y-R)n-支持体其中寡糖代表至少1个糖单元的寡糖基，该糖基结合SLT。Y是氧、硫或氮。R是至少1个碳原子的糖苷配基。支持体的定义同上，n是大于或等于1的整数。优选使用含有约2～10糖单元的寡糖序列。优选有2-6个糖单元和/或含αGal(1-4)βGal单元的序列。有时，可以有1个以上的SLT结合寡糖基连接到支持体上。优选地，n是使得每克组分含有约0.25～2.50微摩尔寡糖的数。
大量的糖苷配基连接臂为本领域所已知。例如，含有对-硝基苯基(即，-OC6H4pNO2)的连接臂已被公开[29]。在合成过程中的适当时间，硝基还原成可以以N-三氟乙酰氨基形式保护起来的氨基。在与支持体偶合之前，三氟乙酰氨基被去除从而使得氨基暴露。
含有硫的连接臂已被公开[30]。特别是，已经证实，与硫代亲核试剂发生取代反应衍生自2-溴乙基的连接臂，使得连接臂具有不同的末端官能团如-OCH2CH2SCH2CO2CH3和-OCH2CH2SC6H4-pNH2。这些末端官能团允许与支持体上的互补官能团发生反应，从而与支持体形成共价连接。这些反应也为本领域所熟知。
已经公开了6-三氟乙酰氨基-己基连接臂(-O-(CH2)6-NHCOCF3)[31]，其中三氟乙酰氨基保护基团已被去掉，暴露用于结合的伯氨基。
已知连接臂的其它例子包括7-甲氧基羰基-3,6二氧庚基连接臂[32](-OCH2-CH2)2OCH2CO2CH3)；2-(4-甲氧基羰基-丁烷甲酰氨基)乙基[33](-OCH2CH2NHC(O)(CH2)4CO2CH3)；烯丙基连接臂[34](-OCH2CH=CH2)，通过基团与适宜单体共聚生成共聚物；已知的其它烯丙基连接臂[35](-O(CH2CH2O)2CH2CH=CH2)。另外，在2-氨基乙硫醇存在时[36]，烯丙基连接臂可衍生为连接臂-OCH2CH2CH2SCH2CH2NH2。其它适宜的连接臂也已被公开[12-14,16,17]。使寡糖基共价结合于支持体的具体连接并不是重要的。
优选地，糖苷配基连接臂是疏水基团，最优选糖苷配基连接臂是选自下列基团的疏水基团：-(CH2)5OCH2CH2CH2-,-(CH2)8CH2O-和-NH-(CH2)m-NHC(O)NH-，其中m是约2到约10的整数。
使用大鼠(临床前研究普遍接受的模型，因为它们可以预示在人体的反应)的研究中，已经发现SYNSORB通过大鼠胃肠道而不受到影响。口服给药后，它们被快速、彻底地清除掉(72小时清除99％)。此外，SYNSORBs上寡糖部分的高密度特别适宜与具有碳水化合物结合亲和力的毒素进行结合。
非-肽基连接臂优选用作本发明的相容性连接臂。不期望使用糖肽，因为糖肽含有数个常常不同的连接在同一蛋白质上的寡糖。大量得到糖肽也有困难，并且需要昂贵和费时的纯化。同样，不期望使用BSA或HSA缀合物，这是由于口服给药时其在胃肠道中可疑的稳定性。
含有SLT结合单元的寡糖基通过非-肽基间臂共价结合于惰性支持体上，使得肠出血性大肠杆菌感染有关病症的患者或易感者肠道中的病毒被有效地结合和排除。当合成结合着相容性接头臂的寡糖时(以非-衍生形式)，则得到可与各种支持体偶合的高纯度的组分。
寡糖偶合到支持体上或优选通过诸如Lemieux等[11]描述的连接臂直接偶合。二糖和三糖单元也直接偶合在可药用支持体上或者构成偶合到此支持体上的寡糖的一部分。
优选在本发明中使用的、含有通过非-肽基连接臂连接到所述支持体的αGal(1-4)βGal亚单位的惰性亲和性支持体，可以使用下列本领域已知的方法而制得[11,12,61]。每种情况下，各个半抗原的8-甲氧基羰基辛基糖苷被活化并被连接到甲硅烷氨化的固体支持体上，其中基质由SiO2组成，接下来是固体支持体上保留的氨基的乙酰化。这些配方是：
P1-二，含有至少0.25μmol/g的αGal(1-4)βGal二糖；
P1-三，含有至少0.25μmol/g的αGal(1-4)βGal(1-4)βGlcNAc三糖；和
Pk-三，含有至少0.25μmol/g的αGal(1-4)βGal(1-4)βGlc三糖。C．药物组合物
本发明方法通过每逢向致病性大肠杆菌感染患者或易感者施用抗生素时，同时施用结合SLT的组分来实现。使用本领域技术人员已知的任何适宜剂型和任何适宜的给药途径来配制抗生素并进行给药。优选地，使用含有一定量的、治疗大肠杆菌有效的、至少一种抗生素和一定量的、有效地结合患者肠道中SLT和/或vero细胞毒素的、结合于支持体上的、一种或多种结合SLT和/或vero细胞毒素的寡糖结构的药物组合物。
当使用口服给药时(优选口服给药)，可以以各种方式配制组合物。优选呈流体或半固体形式。含有流体药物惰性支持体如水的组合物可以考虑口服给药。也可使用其它药物相容性的流体或半固体。这些流体或半固体的使用为本领域技术人员所熟知(参见例如，Remington’sPharm.Sci.18版，1990)。
也优选与流体或半固体食物如肠营养制剂、苹果沙司、冰激淋或布丁混合的组合物。优选没有令人不快的味道或回味的制剂，如SYNORB。也可使用一个鼻胃管将组合物直接释放到胃中。
也可使用固体药物组合物，也可任选地和方便地以含有药学惰性载体的制剂使用，所述惰性载体包括惯常的固体载体如乳糖、淀粉、糊精或硬脂酸镁，这些组合物通常呈片剂或胶囊形式。也可使用(寡糖-Y-R)n-支持体组分本身，而不另外添加惰性药学载体，特别是以胶囊形式使用时。当使用的载体是药学惰性载体时，所用载体的量通常为基于组合物总重量的约1～约99重量％，更优选约75～95重量％。
抗生素的剂量取决于这样一些因素：特定的抗生素、患者的体质、给药途径。选用的剂量是有效杀死感染患者体内的致病性大肠杆菌。适宜剂量的选择，对于本领域技术人员来说是众所周知的。
选用的寡糖-支持体剂量是能够中和和排除感染患者肠道中发现的SLT的量。优选的有用剂量范围是约0.25～1.25微摩尔寡糖/公斤体重/天，最优选约0.5～1.0微摩尔寡糖/公斤体重/天。使用SYNSORB组合物，这意味着约0.5～1克SYNSORB/公斤体重/天，其使SYNSORB在肠道的浓度达约20mg/ml。预期给药为每日2-4次，给药1周或者直至临床症状消除。剂量水平和给药方案取决于特定抗生素和/或使用的寡糖结构以及诸如年龄、患者体质和疾病的严重程度等因素，所有这些因素均为本领域技术人员所熟知。
如前面所讨论过的，优选口服给药，但制剂也可以考虑通过其它方式给药，如通过直肠。这些制剂的有效性取决于所用的特定组合物和接受治疗的特定患者。这些制剂可以含有可为油性、含水的、乳化的流体支持体，或者含有适宜于给药方式的特定溶剂。
组合物可以制成单位剂量剂型或者多剂量或亚单位剂量剂型。对于前面所述的期望剂量，口服给药的流体组合物应当优选含有有效量的抗生素，即治疗大肠杆菌感染有效量的抗生素和大约1微摩尔寡糖/ml。D．方法学
SLT毒素可以被含有αGal(1-4)βGal亚单位的寡糖序列中和，其中的序列与毒素结合。特别是，已经发现该共价结合于支持体上的寡糖序列有效地中和SLT毒素。该组分的实例是特定SYNSORB，后者结合并中和SLT毒素活性。
适用于本发明的抗生素，是那些施用于感染患者后能有效治疗大肠杆菌的抗生素。优选杀菌性抗生素。抗生素可以通过口服、非肠道(如，静脉内、肌内、皮下等)或其它途径给药。在抗生素给药之前，可以单独施用SLT结合寡糖-支持体组分以便对患者体内的SLT进行最初清除。使用抗生素时，相对于SLT结合寡糖-支持体组分，需要不同的剂量方案，例如，当抗生素每日仅仅给药1次，则另外单独施用SLT结合寡糖-支持体组分以提供全天持续排除SLT的效果。请求保护的发明的关键是，每次施用抗生素时，也将SLT结合寡糖-支持体组分施用于患者。优选地，抗生素以与结合SLT的寡糖-支持体的药物混合物形式给药。
适用于本发明的结合于支持体的寡糖序列包括那些结合SLT毒素的序列。寡糖对SLT毒素的结合亲和力可以通过简单的体外实验很方便地测得。为了本发明目的，结合SLT的结合于支持体上的寡糖序列，意味着使用本领域已知的实验分析，使Vero细胞检测中细胞毒活性的终点效价降低至少50％，优选至少95％的那些组分。
适用于本发明的结合于支持体的其它寡糖序列是那些较不含有任何结合的寡糖序列的对照支持体(例如，CHROMOSORB P)能够显著好地(P≤0.05，使用适当的标准统计方法，如Wilcoxon或学生T-检验)结合SLT毒素的寡糖序列。
通过比较使用组合物治疗和不使用组合物治疗时SLT的活性，可以测得本发明组合物中和SLT的作用。利用这些化合物对Vero细胞的毒性，可以分析SLT的活性。Vero细胞(ATCC CCL81)得自美国标准培养保藏中心，Rockyille,MD。
在本发明方法中，当出现感染3天内并且除肠道外的其它器官受牵连之前施用上述药物组合物，由肠出血性大肠杆菌引起的HUS的临床发病率下降。相反，在这个时间框架之后，除了肠道受到感染外其它器官也受到感染时再施用药物组合物，基本上降低组合物降低HUS发病率的能力。
优选地，被大肠杆菌感染介导的SLT所折磨的个体的最初临床评价，是通过粪便诊断性评价而确认的。检测大肠杆菌感染介导的SLT的一种市售诊断工具由Meridian Diagnostic.Inc.Cincinnati.Ohio.USA45244以Premier EHEC名字出售。
由上述公开可以理解，本发明具有广泛的应用。相应地，下列实施例以例证的方式而不是以限定的方式给出。
实施例1SYNSORB-Pk中和暴露于抗生素中的大肠杆菌O157:H7表达的Vero细胞毒素活性的评价A．测定大肠杆菌O157:H7的MIC’s
根据抗微生物敏感性实验手册(Antimicrobial SusceptibilityTesting Manual)第三版(NCCLS Document M7-A2，第10卷第8期)中描述的方法，测定各种抗生素对大肠杆菌O157:H7(EEU 396，既产生VT 1又产生VT 2)的最小抑菌浓度(MIC’s)，使用大肠杆菌美国标准培养保藏(ATCC)株15922验证该方法。
各种抗生素的MIC’s检测结果列于表1。表1：抗生素对大肠杆菌O157:H7和参照株ATCC25922的最小抑菌浓度
大肠杆菌株 抗生素(μg/ml)
头孢克肟 四环素 环丙氟哌酸 复方磺胺甲基异噁唑(甲氧苄啶/磺胺甲异噁唑) 丝裂霉素-C
 O157:H7(EEU 396) 4.8 1.92 0.192 0.96/4.8 9.6
ATCC#25922 0.96 1.92 0.0384 0.96/4.8 9.6
B．使用抗生素和SYNSORB-Pk的大肠杆菌O157:H7的生长和处理
大肠杆菌O157:H7在型号G10转速为120rpm的New BrunswickGyrotory摇床工作台上的、1L Erlenmeyer烧瓶中的200mLMueller-Hinton(MH)肉汤中37℃过夜生长。然后，将过夜培养物稀释，使625λ时的光密度(O.D.)为0.6，并将50mL等份按比例配制到125mLErlenmeyer烧瓶中。
根据上面测定的MIC’s，基本上按照Walterspiel.J.N.等(感染(Infection),1992,20:25-9[62])推荐的浓度加入抗生素，在摇床上于37℃将培养物再孵育24小时。24小时培养物中每一个抗生素的终浓度，为对大肠杆菌O157:H7产生的最大vero细胞毒素的MIC’s的一半。每一种测试抗生素均配备了平行烧瓶。SYNSORB-Pk，以10mg/mL的浓度按照与加入抗生素同样的时间加入到每一对烧瓶的每一个烧瓶中。
使用Armstrong.G.D.等(J.Infect.Dis.1991,164:1160-7)[53]描述的vero细胞毒性试验方法，测定每一个24小时培养物中vero细胞毒素的量。将结果绘图并从图中推断出SYNSORB-Pk-处理和未处理的抗生素培养物的CD50值。使用Armstrong.G.D.等1991年[53]描述的公式，计算SYNSORB-Pk-处理的抗生素培养物相对于未处理的抗生素培养物的vero细胞毒素活性的中和百分比。
表2显示暴露于各种抗生素中的大肠杆菌O157:H7培养物的vero细胞毒素活性被SYNSORB-Pk中和的百分比。表2：存在抗生素时SYNSORB-Pk中和Vero细胞毒素活性
抗生素(μg/ml) SYNSORB-Pk(10mg/ml) CD50b 中和百分比
四环素(0.96) + 0.0 100
- 15.8
环丙氟哌酸(2.4) + 5.0 90
- 50.1
复方磺胺甲基异噁唑(0.48) + 0.0 100
- 63.1
头孢克肟(2.4) + 0.0 100
- 316.2
丝裂霉素(0.96) + 0.0 100
- 158.4
b是达到CD50所需的稀释倍数
数据表明，使用抗生素和SYNSORB-Pk联合治疗方案，可以有效降低大肠杆菌O157:H7感染患者的严重并发症如HUS的发生。这些中和数据证实，存在抗生素时SYNSORB-Pk结合由大肠杆菌O157:H7表达的vero细胞毒素。
类似地，其将结合垂死的抗生素处理的细菌释放的vero细胞毒素并防止毒素吸收进入循环系统。这使得抗生素能够消灭微生物而并不增加患者发展成HUS的机会。
实施例2治疗大肠杆菌感染
出现肠出血性大肠杆菌如O157:H7感染3天内，使用混合在婴儿食品中的含有有效量适宜抗生素(如卡那霉素)和250mg/kg SYNSORB-Pk的组合物，对患者进行每日2次治疗。与未接受治疗的患者、仅接受抗生素治疗的患者、仅接受SYNSORB-Pk治疗的患者或不同时间而不是同时接受抗生素和SYNSORB-Pk治疗的患者相比，测得的肠道中SLT的量下降，而且接受治疗的患者将不会发展成HUS。
尽管结合最佳实施例已经对本发明进行了描述，但是应当懂得，发明不受所公开的实施例的限制。相反，本发明旨在覆盖不背离所附权利要求实质和范围的各种更改和相当的变化。
本说明书中提到的每一出版物、专利和专利申请在此将其全部引入作为参考，引入的程度就象每一个出版物、专利和专利申请的内容专门地和独立地被指明引入作为参考一样。

Claims (34)

1．预防或减轻患者或易感者中肠出血性大肠杆菌介导的一种或多种病症的方法，包括同时向患者施用有效量的至少一种抗生素和有效量的共价结合于可药用惰性支持体的至少一种SLT结合寡糖序列(寡糖-支持体)，其中所述寡糖序列结合SLT，和其中结合到寡糖-支持体上的SLT能够从胃肠道排除。
2．权利要求1所述方法，其中所述抗生素选自头孢克肟、四环素、环丙氟哌酸、复方磺胺甲基异噁唑、丝裂霉素-C、磷霉素和卡那霉素。
3．权利要求1所述方法，其中寡糖含有αGal(1-4)Gal亚单位。
4．权利要求3所述方法，其中寡糖选自αGal(1-4)βGal、αGal(1-4)βGal(1-4)βGlcNAc和αGAl(1-4)βGal(1-4)βGlc。
5．权利要求1所述方法，其中寡糖通过非-肽基接头结合到支持体上。
6．权利要求1所述方法，其中施用的是含有抗生素和SLT结合寡糖-支持体的单个药物组合物。
7．权利要求1所述方法，其中在出现感染约3天内实施给药。
8．权利要求1所述方法，其中所述寡糖序列具有2～10个糖单元。
9．权利要求5所述方法，其中所述接头臂选自-(CH2)8C(O)-和-NH-(CH2)m-NHC(O)NH-，其中m是约2～约10的整数。
10．可用于治疗或预防肠出血性大肠杆菌相关病症的药物组合物，包括：
a)有效量的至少一种抗生素；
b)共价结合于可药用惰性支持体的至少一种寡糖序列(寡糖-支持体)，其中所述寡糖序列结合SLT；和
c)可药用载体，其中结合到所述寡糖-支持体上的SLT能够从胃肠道排除。
11．权利要求10所述组合物，其中所述至少一种抗生素作为杀细菌剂对所述肠出血性大肠杆菌有效。
12．权利要求10所述组合物，其中所述抗生素是头孢克肟、四环素、环丙氟哌酸、复方磺胺甲基异噁唑、丝裂霉素-C、磷霉素和卡那霉素。
13．权利要求10所述组合物，其中寡糖含有αGal(1-4)Gal亚单位。
14．权利要求13所述组合物，其中寡糖选自αGal(1-4)βGal、αGal(1-4)βGal(1-4)βGlcNAc和αGal(1-4)βGal(1-4)βGlc。
15．权利要求10所述组合物，其中寡糖通过非-肽基接头结合到支持体上。
16．权利要求10所述组合物，其中的组合物在出现感染约3天内给药。
17．权利要求10所述组合物，其中组合物以口服给药。
18．权利要求10所述组合物，其中所述寡糖序列具有2～10个糖单元。
19．权利要求15所述组合物，其中所述接头臂选自-(CH2)8C(O)-和-NH-(CH2)m-NHC(O)NH-，其中m是约2～约10的整数。
20．预防或减轻患者或易感者的由肠出血性大肠杆菌介导的一种或多种病症的方法，包括步骤：
a)向患者施用有效量的至少一种共价结合于可药用惰性支持体的SLT结合寡糖序列(寡糖-支持体)，其中所述寡糖序列结合SLT；和在步骤a)之后
b)同时向患者施用有效量的至少一种抗生素和有效量的至少一种共价结合于可药用惰性支持体的SLT结合寡糖序列(寡糖-支持体)，其中所述寡糖序列结合SLT，和其中每次给药后，结合到所述寡糖-支持体上的SLT能够从胃肠道排除。
21．权利要求20所述方法，其中抗生素是头孢克肟、四环素、环丙氟哌酸、复方磺胺甲基异噁唑、丝裂霉素-C、磷霉素和卡那霉素。
22．权利要求20所述方法，其中寡糖含有αGal(1-4)Gal亚单位。
23．权利要求20所述方法，其中寡糖选自αGal(1-4)βGal、αGal(1-4)βGal(1-4)βGlcNAc和αGal(1-4)βGal(1-4)βGlc。
24．权利要求20所述方法，其中寡糖通过非-肽基接头结合到支持体上。
25．权利要求20所述方法，其中在最初单独施用毒素结合组分后施用含有抗生素和SLT结合寡糖-支持体的单个药物组合物。
26．权利要求20所述方法，其中在出现感染约3天内实施给药。
27．权利要求20所述方法，其中所述寡糖序列具有2～10个糖单元。
28．权利要求24所述方法，其中所述接头臂选自-(CH2)8C(O)-和-NH-(CH2)m-NHC(O)NH-，其中m是约2～约10的整数。
29．权利要求1所述方法，其中惰性支持体是二氧化硅。
30．权利要求10所述组合物，其中惰性支持体是二氧化硅。
31．权利要求20所述方法，其中惰性支持体是二氧化硅。
32．权利要求1所述方法，其中在除肠道受牵连外在其它器官受到牵连之前向患者实施给药。
33．权利要求10所述组合物，其中的组合物在除肠道受牵连外在其它器官受到牵连之前向患者给药。
34．权利要求20所述方法，其中在除肠道受牵连外在其它器官受到牵连之前向患者实施给药。
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