CZ20001704A3 - Způsob prevence nebo zlepšení stavů zapříčiněných enterohemorhagickou E. coli a farmaceutický prostředek pro prevenci a léčbu těchto stavů - Google Patents

Abstract

Řešení se zabývá léčbou průjmových onemocnění a asociovaných stavů způsobených infekcí patogenní E. coli. Předmětem řešení jsou nové Jéěebné prostředky, obsahující jak antibiotikum, tak i toxin vážící složku, a dále způsoby léčby využívající simultánního podání toxin vážící složky kdykoliv je pacientu podáno antibiotikum. Zmíněné prostředky zabíjí střevní bakterie E. coli, které zapříčiňují uvedené stavy a neutralizují SLT produkované těmito organizmy a/nebo uvolněné z těchto organizmů, pokud jsou usmrceny. Dále zlepšují symptomy infekce a inhibují rozvinutí zmíněné infekce v hemolytický uremický syndrom (HUS).

Description

Navrhovaný vynález se zabývá léčbou průjmových onemocnění a asociovaných stavů způsobených infekcí patogenní E. coli. Konkrétně se vynález zabývá zcela neočekávaným zjištěním, že podáním sloučeniny, která váže a odstraňuje SLT toxiny („shiga like toxins“ tj. toxiny podobné toxinům produkovaným bakteriemi rodu Shigella, pozn. překladatele) produkované patogenními E. coli, spolu s antibiotiky lze dosáhnout značného zlepšení léčby. Předmětem navrhovaného vynálezu jsou tedy nové léčebné prostředky, obsahující jak antibiotikum, tak i toxin vážící složku, a dále způsoby léčby využívající simultánního podání toxin vážící složky kdykoliv je pacientu podáno antibiotikum. Zmíněné prostředky a způsoby léčby zabíjí střevní bakterie E. coli, které zapříčiňují zmíněné stavy a neutralizují SLT produkované těmito organizmy a/nebo uvolněné z těchto organizmů pokud jsou usmrceny. Zmíněné prostředky a způsoby léčby jsou tedy mnohem lépe schopny zlepšovat symptomy infekce a inhibovat rozvinutí zmíněné infekce v hemolytický uremický syndrom (HUS) než běžná léčba.

Dosavadní stav techniky

Bylo zjištěno, že úplavice způsobená patogenními kmeny E. coli je spojena s produkcí celé řady enterotoxinů. Některé patogenní E. coli produkují enterotoxiny, které jsou blízce příbuzné shiga toxinu, asociovanému s úplavicí zapříčiněnou bakteriemi rodu Shigella. Prvním člen rodiny SLT, který byl izolován, byla látka, cytotoxická pro buňky kočkodana zeleného Cercopithecus aethiops sareus (Věro), původně nazvaná verotoxin. Vzhledem k tomu, že byla sekvenováním odpovídajících genů potvrzena podobnost zmíněného toxinu s shiga toxinem, je tento toxin nyní spíše nazýván toxin podobný shiga toxinu I (zkráceně SLTI z anglického shiga-like toxin I) [5,6,7],

Následně byli izolovány další toxiny patřící do SLT rodiny, které mohou být rozlišeny sérologicky, na základě genové sekvence nebo na základě své • ·

hostitelské specifity [37-43]. Byly popsány nejrůznější typy SLTII, kterým byla přiřčena nejrůznější jména v závislosti na kmeni E. coli, ze kterého byly izolovány a v závislosti na hostitelském organizmu. Tyto varianty byly nazvány například SLTII; vtx2ha; SLTIIvh; vtx2hb; SLTIIc; SLTIIvp a tak dále.

Všechny SLT jsou multimerní proteiny tvořené enzymatickou podjednotkou (A) a několika (B) podjednotkami. Oligomer B podjednotek je vazebnou částí toxinu, která je zodpovědná za vazbu na receptory hostitelských buněk. B podjednotky SLTI, SLTII a SLTIIvh rozpoznávají na povrchu hostitelských buněk receptory pro globulární glykolipidy, obsahující alespoň jednu disacharidovou podjednotku aGal(l-4)3Gal na neredukujícím konci. Bylo zjištěno, že také SLTIIvp váže receptory obsahující zmíněnou podjednotku, ale nikoliv nezbytně na neredukujícím konci [2, 44-51], Podjednotka A má enzymatickou aktivitu (Nglykosidáza), která odstraňuje puriny z 28S ribozomální RNA u savčích buněk. Tato enzymatická aktivita blokuje schopnost toxinem infikovaných buněk provádět proteosyntézu.

Místem zásahu SLT jsou endoteliální buňky ledvin a cévní systém mezenteria, kde může SLT způsobovat poškození, jehož výsledkem je selhání ledvin a hemoglobin v moči. SLT je příčinným agens hemolytického uremického syndromu. SLT může být také částečně zahrnut v patogenezi hemorhagického zánětu tlustého střeva (krvácivý průjem). Hemolytický uremický syndrom (HUS) je hlavní příčinou akutního selhání ledvin u dětí a vyskytuje se přibližně u 7 až 10 % dětí v období 5 až 10 dnů po infekci E. coli O157;H7 a dalšími E. coli produkujícími verotoxin nebo SLT (VTEC).

V poslední době se pozornost, zaměřená na patogenní E. coli, soustřeďuje na známou korelaci mezi kontaminací určitých typů masa E. coli a infekcí vyvolanou u člověka následkem požití tohoto masa. Tento problém je zvláště palčivý u masa používaného při výrobě hamburgerů, kde bylo zjištěno že požití tohoto nedostatečně tepelně zpracovaného masa je příčinným agens infekce. Tento problém je komplikován rychlým rozvojem infekce patogenních E. coli v HUS způsobeným expresí SLT, což odpovídá předpokladu, že v první fázi je bakteriemi kolonizován intestinální trakt a následně dochází k poškození endotelu a průniku SLT toxinu transmembránovým přenosem z ledvin do krevního řečiště infikovaného jedince.

Dalším komplikujícím faktorem bylo rozhodnutí odborníků nepoužívat při léčení enterohemorhgické infekce E. coli antibiotika [8], přestože podle posledních publikací vede včasné podání antibiotik ke snížení hladiny verotoxinu [55]. Přinejmenším zčásti byla antibiotika kontraindikována pro léčbu takových • · • · · · • · • · · · · onemocnění z toho důvodu, že uvolňování toxinů do střeva z organismů zabitých antibiotiky zhoršuje průjmy a další stavy způsobené toxiny. Některé studie předpokládají, že léčba antibiotiky v minimální inhibiční koncentraci (MIC) stanovené pro E. coli O157:H7 nebo v koncentraci ještě nižší, ve skutečnosti produkci verotoxinů studovanými organizmy indukují [62], Je-li tomu tak, pravděpodobně by taková léčba zvýšila pravděpodobnost vzniku HUS a dále by zhoršovala možnost léčit takové infekce antibiotiky. Také použití léčiv snižujících pohyblivost se zdá být kontraproduktivní [9].

Jedním z publikovaných způsobů léčby takových infekcí je orální podání farmaceuticky přijatelného inertního afinitního nosiče obsahujícího aGal-(l4)3Gal podjednotku infikovanému pacientu [10]. Tento inertní nosič projde do střevního traktu pacienta, kde podjednotka aGal-(l-4)PGal váže SLT. Následně je toxin, vázaný k tomuto pevnému nosiči, eliminován z organizmu jako součást stolice. Tato procedura je jednou z prvních, pokud ne vůbec jedinou, metodou odstranění takových toxinů z těla, která zároveň inhibuje projevy stavů, asociovaných s akumulací zmíněných toxinů. Dále bylo prokázáno, že klinické projevy HUS způsobeného enterohemorhagickou infekcí E. coli lze redukovat podáním farmaceutického prostředku s obsahem farmaceuticky přijatelného inertního afinitního nosiče obsahujícího aGal-(l-4)PGal podjednotku, která váže SLT. Načasování podání zmíněného farmaceutického prostředku je pro úspěšnou léčbu kritické. Konkrétně bylo zjištěno, že klinické projevy HUS způsobeného enterohemorhagickou infekcí E. coli lze redukovat podáním zmíněného farmaceutického prostředku během prvních 3 dnů od propuknutí infekce [54,55], Aniž bychom podceňovali nepochybné výhody zmíněných publikovaných způsobů léčení, je zřejmé, že jsou žádoucí další zlepšení v léčbě enterohemorhagických infekcí E. coli, vedoucí ke snížení výskytu projevů HUS a zároveň ke snížení vysoké úmrtnosti, spojené právě s tímto syndromem. Konkrétně jsou žádoucí látky a způsoby léčení, schopné jak zabíjet enterohemorhagické E. coli, tak i neutralizovat SLT toxiny. Vhodná sloučenina by měla být podávána neinvazivním způsobem, například perorálně, ve formě vhodného farmaceutického přípravku.

Podstata vynálezu

Vynález se zabývá překvapivým a neočekávaným objevem, prokazujícím že enterohemorhagická E. coli infekce může být s výhodou léčena současným podáním sloučeniny vážící SLT a antibiotika pacientu, který trpí infekcí • · 4 · · · patogenním kmenem E. coli, nebo který je k takové infekci vnímavý. Konkrétně jsou předmětem vynálezu toxin vážící sloučeniny obsahující farmaceuticky přijatelný inertní afinitní nosič obsahující oligosacharid, který váže SLT. Zvláště vhodné jsou oligosacharidy obsahující aGal-(l-4)3Gal podjednotku. Zmíněného současného podání může být s výhodou dosaženo použitím farmaceutického prostředku obsahujícího jak antibiotikum, tak i farmaceuticky přijatelný inertní afinitní nosič obsahující oligosacharid vážící SLT. Vynález se zabývá prostředky a způsoby prevence a léčby infekcí patogenními a především hemorhagickými kmeny E. coli.

Jedním z aspektů navrhovaného vynálezu je způsob prevence nebo léčebná metoda vedoucí ke zlepšení jednoho nebo více stavů způsobených enterohemorhagickou E. coli u pacientů trpících zmíněnými stavy, nebo ke zmíněným stavům citlivých, zahrnující současné podání účinného množství nejméně jednoho antibiotika a účinného množství nejméně jedné SLT vážící oligosacharidové sekvence kovalentně vázané k farmaceuticky přijatelnému inertnímu nosiči (vázaný oligosacharid) pacientu, kde zmíněná oligosacharidová sekvence váže SLT a kde je SLT vázaný ke zmíněnému vázanému oligosacharidů schopen vyloučení z gastrointestinálního traktu. Zvláště vhodnými provedeními navrhovaného vynálezu jsou případy, kdy zmíněným antibiotikem je cefixim, tetracyklin, ciprofloxacin, co-trimoxazol, mitomycin-C, fosfomycin nebo kanamycin; kdy oligosacharid obsahuje podjednotku aGal(l-4)PGal, zvláště případy kdy je oligosacharid vybrán ze skupiny zahrnující aGal(l-4)PGal, aGal(l-4)PGal(l-4)PGlcNAc a aGal(l4)3Gal(l-4)pGlc; a kdy je oligosacharid vázán k nosiči s použitím nepeptidylového mezerníku. Je s výhodou, pokud je pacientu podán jediný přípravek obsahující antibiotikum i SLT vážící vázaný oligosacharid. V dalším z výhodných provedení vynálezu je přípravek podán v rozpětí tří dnů od propuknutí infekce.

V dalším z provedení navrhovaného vynálezu je předmětem vynálezu farmaceutický prostředek vhodný pro prevenci nebo léčbu stavů asociovaných s infekcí enterohemorhagickou E. coli, obsahující nejméně jedno antibiotikum účinné proti zmíněné enterohemorhagické E. coli nejméně jednu oligosacharidovou sekvenci kovalentně vázanou k farmaceuticky přijatelnému inertnímu nosiči (vázaný oligosacharid), kde zmíněná oligosacharidová sekvence váže SLT, a farmaceuticky přijatelný nosič; kde je SLT navázaný ke zmíněnému vázanému oligosacharidů schopen být eliminován z gastrointestinálního traktu. Zvláště vhodnými provedeními navrhovaného vynálezu jsou případy, kdy

zmíněným antibiotikem je cefixim, tetracyklin, ciprofloxacin, co-trimoxazol, mitomycin-C, fosfomycin nebo kanamycin; kdy oligosacharid obsahuje podjednotku aGal(l-4)PGal, zvláště případy kdy je oligosacharid vybrán ze skupiny zahrnující aGal(l-4)PGal, aGal(l-4)pGal(l-4)3GlcNAc a aGal(l4)PGal(l-4)PGlc; a kdy je oligosacharid vázán k nosiči s použitím nepeptidylového mezerníku. Je s výhodou, pokud je přípravek podán v rozpětí tří dnů od propuknutí infekce.

Dalším z aspektů navrhovaného vynálezu je způsob prevence nebo léčebná metoda vedoucí ke zlepšení jednoho nebo více stavů způsobených enterohemorhagickou E. coli u pacientů trpících zmíněnými stavy, nebo ke zmíněným stavům citlivých, zahrnující nejprve podání nejméně jedné SLT vážící oligosacharidové sekvence, kovalentně vázané k farmaceuticky přijatelnému inertnímu nosiči (vázaný oligosacharid), kde zmíněná oligosacharidová sekvence váže SLT, a následně současné podání účinného množství nejméně jednoho antibiotika a účinného množství nejméně jedné SLT vážící oligosacharidové sekvence, kovalentně vázané k farmaceuticky přijatelnému inertnímu nosiči (vázaný oligosacharid), kde zmíněná oligosacharidová sekvence váže SLT a kde je následně po každém podání SLT navázaný k vázanému oligosacharidu schopen být eliminován z gastrointestinálního traktu. Zvláště vhodnými provedeními navrhovaného vynálezu jsou případy, kdy zmíněným antibiotikem je cefixim, tetracyklin, ciprofloxacin, co-trimoxazol, mitomycin-C, fosfomycin nebo kanamycin; kdy oligosacharid obsahuje podjednotku aGal(l-4)PGal, zvláště případy kdy je oligosacharid vybrán ze skupiny zahrnující aGal(l-4)pGal, aGaI(l-4)PGal(l-4)3GlcNAc a aGal(l4)PGal(l-4)3Glc; a kdy je oligosacharid vázán k nosiči s použitím nepeptidylového mezerníku. Je s výhodou, pokud je pacientu nejprve podán pouze prostředek vážící toxin, a následně jediný farmaceutický prostředek, obsahující antibiotikum i SLT vážící vázaný oligosacharid. V dalším z výhodných provedení navrhovaného vynálezu je podání zmíněných prostředků uskutečněno během 3 dnů od propuknutí infekce.

POPIS ZVLÁŠTĚ VHODNÝCH PROVEDENÍ NAVRHOVANÉHO VYNÁLEZU.

Jak bylo zmíněno výše, vynález se zabývá současným podáním SLT vážícího vázaného oligosacharidu, který váže SLT pokaždé, když je podáno antibiotikum účinné proti enterohemorhagické E. coli. Výsledkem simultánního podání obou léčiv je účinnější prevence HUS i dalších stavů spojených s infekcí patogenní E. coli. Je-li přítomna toxin vážící látka, jsou toxiny, uvolněné z mikroorganizmů • · · φ φφφ φφφ φφ · zabitých antibiotikem, neutralizovány a vyloučeny z těla ven. Proto jsou navrhované postupy daleko účinnější pro zlepšení symptomů infekce a pro inhibici progrese infekce v hemolytický uremický syndrom HUS, než konvenční léčba.

Φ φφ φφ φ φ φ · φ φ φ φ φφφ φφφφ

A. DEFINICE

Uvedené termíny, použité v tomto textu, mají následující významy:

Termín „biokompatibilní“ označuje chemickou látku, která je s ohledem na živočišné či lidské tkáně a tělesné tekutiny chemicky inertní. Biokompatibilní materiály jsou nealergizující.

Termínem „kompatibilní spojovací rameno“ je označována jednotka, která slouží jako mezerník oddělující oligosacharidovou strukturu od biokompatibilního nosiče a která má dvojí funkci. Jedna funkční skupina spojovacího ramene váže příslušnou funkční skupinu inertního nosiče a druhá funkční skupina váže příslušnou funkční skupinu oligosacharidové struktury. Kompatibilní spojovací rameno, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu, není peptidylové, Je nutné zmínit, že spojovací rameno nevyužívá pro spojení oligosacharidové struktury s nosičem peptidové skupiny. Oligosacharid může být připojen prostřednictvím 8-methoxykarbonyloktyl spojovníku, nebo prostřednictvím jiného vhodného spojovníku nepeptidylové povahy, jako je například spojovací rameno odvozené od močoviny, mající vzorec -NH-(CH2)_m-NHC(O)NH-, kde m je celé číslo od 2 do asi 10.

Termínem „hemolytický uremický syndrom“ neboli „HUS“ je označován stav, kdy se u pacienta projevuje poškození ledvin a buď hemolýza, nebo trombocytopenie. Poškození ledvin se projevuje zvýšením koncentrace sérového kreatininu (>50 pmol/L u pacientů mladších 5 let, nebo >60 pmol/L u pacientů mezi 5 a 6 lety), nebo změnou v zaznamenané hladině kreatininu během akutní fáze onemocnění o více než 50 %, nebo více než 10 červenými krvinkami/HPF (tj. 10 červených krvinek v zorném poli při standardním mikroskopickém vyšetření moči, pozn. překladatele) při mikroskopickém vyšetření moči. Hemolýza je považována za prokázanou v případě kdy je koncentrace hemoglobinu větší nebo rovna 105 g/L, nebo pokud jsou v krevním roztěru patrné fragmenty červených krvinek, nebo pokud byla provedena transfúze červených krvinek ještě než hladina hemoglobinu poklesla na hodnotu menší nebo rovnou 105 g/L. Trombocytopenie je definována jako snížená koncentrace krevních destiček a to na hladinu nižší než 150 x 10⁹/L. Termínem „oligosacharid“ je označován sacharid skládající se z 1 až 20 sacharidových jednotek. Tímto termínem jsou označovány i sacharidy, kde sacharidové jednotky zahrnují i různé cukerné deriváty [58-60], • ft ftft • · · « • ♦ · ft «· Α··« ft* ftft ftft • · · • · · · ••••ft ftft ft • · · ft ftft ·♦

Termínem „postižení orgánu“ je označováno klinicky definované postižení orgánu zapříčiněné SLT, které koreluje s přirozeným postupem onemocnění. Kromě střeva patří mezi postižené orgány například ledviny, srdce, některé součásti centrálního nervového systému („CNS“), (například mozek, mícha ...) a podobně. Běžné krevní biochemické testy mohou odhalit zasažení jater, srdce nebo ledvin, zatímco klinické symptomy včetně demence, záchvatů, ztráty orientace a podobně jsou projevy zasažení centrálního nervového systému.

Termíny „shiga-like toxin“ nebo „SLT“ nebo „verotoxin“ označují skupinu toxinů, které jsou produkovány enterohemorhagickou E. coli a které se podobají v oboru běžně známým shiga toxinům produkovaným bakteriemi rodu Shigella. Tyto toxiny se skládají z enzymaticky aktivní podjednotky A a multimerní receptor vazebné podjednotky B. Mezi SLT patří SLTI a dále skupina rozličných toxinů souborně nazývaná SLTII. Rychlá a pevná vazba SLT k vázanému oligosacharidu může být prokázána v oboru běžně známými testy, jako je například verocytotoxický neutralizační test.

Termínem „nosič“ je označován inertní materiál, ke kterému je vázána oligosacharidová sekvence, nejčastěji prostřednictvím kompatibilního spojovacího ramene. Pro použití in vivo musí být nosič biokompatibilní.

Termínem „SYNSORB“ jsou označovány syntetické 8-methoxykarbonyloktyl oligosacharidové struktury, kovalentně vázané na CHROMOSORB P^tm (Manville Corp. Denver, Colorado) [11], což jsou derivatizované křemičité částice. Syntetické oligosacharidové sekvence, kovalentně vázané k biokompatibilnímu nosiči, například CHROMOSORB P^tm (SYNSORB) mohou být použity pro vazbu SLT toxinů nebo verotoxinů. Tyto sloučeniny jsou vhodné pro prevenci HUS a asociovaných stavů. SYNSORB je pro tyto prostředky zvláště vhodný, neboť je netoxický a rezistentní k mechanické i chemické degradaci. Bylo prokázáno, že SYNSORB prochází gastrointestinálním traktem krysy beze změny. Dále bylo zjištěno, že je SYNSORB po orálním podání vyloučen z těla rychle a úplně (99 % je vyloučeno během 72 hodin). Pro vazbu verotoxinů je zvláště vhodná vysoká hustota oligosacharidových jednotek, navázaných na SYNSORB.

Pro účely této patentové přihlášky jsou všechny sacharidy označovány konvenčními třípísmennými názvy. Všechny sacharidy jsou považovány za Dkonformaci, pokud není výslovně uvedeno jinak, s výjimkou fukózy, která je v konformaci L. Dále jsou všechny použité sacharidy pyranózy.

Pro účely této patentové přihlášky je okamžik projevu infekce určen jako okamžik kdy lze identifikovat alespoň jeden stav způsobený SLT, které se objevují následkem infekce E. coli. Mezi takové stavy patří například u pacientů s «- φ * 9 * * e

• · • · φφφ φφφφ φ * φ φ φφ « průjmovým onemocněním jeden z následujících projevů: abdominální křeče, krev ve stolici, výhřez konečníku, stanovení verotoxin produkujících E. coli v pacientově stolici, požití potravin, u kterých se předpokládá kontaminace verotoxin produkujících E. coli, nebo přímý kontakt s jedince u kterého byla prokázána SLT zprostředkovaná infekce. Nejraději je přítomnost infekce manifestována krvavými průjmy. Zvláště vhodný je stav, kdy jsou prvotní klinické příznaky, naznačující že byl jedinec postižen infekcí E. coli produkující SLT, potvrzeny diagnostickým vyšetřením stolice. Jedna z komerčně dostupných diagnostických souprav pro detekci infekce SLT produkující E. coli je prodávána firmou Meridian Diagnostic, lne. Cincinnati, Ohio, USA 45244 pod komerčním názvem Premier EHEC.

B. SYNTÉZA

Antibiotikum může být syntetizováno v oboru běžně známými metodami. Mezi antibiotika vhodná pro použití podle navrhovaného vynálezu patří antibiotika vhodná pro léčbu infekcí enterohemorhagickými kmeny E. coli, tj. antibiotika, ke kterým jsou zmíněné organizmy citlivé, nikoliv rezistentní. Vhodnější jsou antibiotika baktericidní, méně vhodná antibiotika bakteriostatická. Vhodná pro použití jsou antibiotika, která nereagují se současně podávaným vázaným oligosacharidem. Taková antibiotika jsou známá nebo mohou být odborníky snadno vybrána (viz. například Goodman and Gilman, The pharmacological Basis of Therapeutics, 7^th Ed., která je zde zahrnuta odkazem). Zvláště vhodnými antibiotiky jsou cefixim, ciprofloxacim, co-trimoxazol, mitomycin-C, fosfomycin, kanamycin, azitromycin, tetracyklin, minocykíin, cefditoren/cefteram, norfloxacin, chloramfenikol, streptomycin, ampicilin, sulfamethoxazoltrimethoprim a kyselina nalidixová [56, 57],

Chemické metody syntézy oligosacharidových struktur mohou být odvozeny od v oboru běžně známých metod chemické syntézy. Zmíněné oligosacharidové struktury jsou obvykle syntetizovány s použitím vhodně chráněných monosacharidových jednotek.

Pro každou jednotlivou syntetizovanou strukturu musí být specifické metody obvykle přizpůsobeny a optimalizovány. Obecně zahrnuje chemická syntéza oligosacharidových glykosidů nebo jejich částí nejprve tvorbu glykosidické vazby na anomerním atomu uhlíku redukujícího cukru nebo monosacharidu. Konkrétně je odpovídajícím způsobem chráněná forma přirozeně se vyskytující nebo chemicky modifikované sacharidové struktury (donor glykosylu) selektivně modifikovaná v anomerním centru redukující části molekuly, čímž je do molekuly vnesena výchozí • · skupina obsahující halogenidy, trichloroacetimidát, acetyl, thioglykosid atd.

Donor poté reaguje za katalytických podmínek, které jsou v oboru dobře známé, s aglykonem nebo s odpovídající formou uhlovodíkového akceptoru, který má jednu volnou hydroxylovou skupinu v pozici, kde může být vytvořena glykosidická vazba.

Odborníkům je známa celá řada aglykonových struktur, které mohou být navázány v odpovídající konfiguraci k anomernímu centru redukující části molekuly. Odpovídající využití kompatibilních blokujících skupin, dobře známých odborníkům zabývajícím se syntézou uhlovodíků, umožňuje selektivní modifikaci syntetizovaných struktur nebo další navázání dalších sacharidových jednotek nebo sacharidových bloků k akceptorovým strukturám.

Po vytvoření glykosidické vazby mohou být na glykosidový sacharid navázány další sacharidové jednotky, nebo může být na vybraných atomech nebo skupinách chemicky modifikován, nebo může být po konvenčním odstranění chránících skupin použit pro enzymatické syntézy. Obecně je chemická vazba přirozeně se vyskytujících nebo chemicky modifikovaných sacharidových jednotek, kterou vznikají cukerné glykosidy, prováděna pomocí chemických metod, které jsou v odborné literatuře podrobně rozpracovány [12-28],

Mezi nosiče, ke kterým jsou oligosacharidové struktury podle navrhovaného vynálezu navázány, nebo na kterých jsou imobilizovány, patří celá řada v oboru známých biokompatibilních materiálů. Zvláště vhodné jsou ve vodě rozpustné biokompatibilní polymery jako jsou hydrogely, karboxymethylcelulózy, syntetické polymery a podobně. Tyto nosiče jsou vhodné především pro dopravení navázané látky do střeva, zejména v případech, kdy je žádoucí prodloužené uvolňování. Vhodné nosiče nejsou v těle adsorbovány, tj. mohou být rozpustné i nerozpustné, ale nesmějí být v těle pacienta adsorbovány.

Pro některé aplikace jsou zvláště vhodné pevné nosiče. Pevné nosiče, ke kterým jsou navázány oligosacharidové struktury podle vynálezu, mohou být ve formě listů nebo částic. Odborníkům je známa celá řada biokompatibilních pevných nosičů. Příkladem mohou být oxid křemičitý, syntetické křemičitany jako například slinuté sklo, biogenní křemičitany jako například rozsivková zemina (křemelina), minerály s obsahem křemičitanú jako například kaolinit a syntetické polymery jako například polystyren a polypropylén a polysacharidy. Pevné nosiče mají s výhodou velikost částic pro použití in vivo v rozmezí od asi 10 do asi 500 mikronů. Zvláště vhodná je velikost částic 100 až 200 mikronů.

Oligosacharidové struktury jsou imobilizovány kovalentní, nebo nekovalentní (pasivní) vazbou k nosiči, čímž vzniká struktura, která je pro potřeby

navrhovaného vynálezu nazývána vázaný oligosacharid. Kovalentní vazba může vzniknout reakcí funkčních skupin nosiče a kompatibilního spojovacího ramene oligosacharidové struktury. Překvapivě bylo zjištěno, že vazbou oligosacharidové struktury k biokompatibilnímu nosiči prostřednictvím kompatibilního spojovacího ramene dává vzniknout produktu, který, nehledě na nosič, efektivně odstraňuje toxin. Vazebnými látkami, které jsou používány pro nepřímou vazbu nosiče a oligosacharidové struktury, jsou s výhodou bifunkční molekuly odpovídající délky (nejméně jeden uhlíkový atom), které zjednodušeně slouží pro udržení určité vzdálenosti mezi oligosacharidovou strukturou a nosičem.

Vázaný oligosacharid podle navrhovaného vynálezu má nejraději obecný vzorec:

(OLIGOSACHARID-Y-R)_n-NOSIČ kde OLIGOSACHARID představuje oligosacharidovou skupinu obsahující nejméně jednu sacharidovou jednotku vážící SLT, Y je kyslík, síra nebo dusík, R je aglykonové spojovací rameno obsahující nejméně jeden uhlíkový atom, NOSIČ je definován výše a n je celé číslo větší nebo rovné jedné. Oligosacharid obsahuje s výhodou sekvenci 2 až 10 sacharidových jednotek. Zvláště vhodné jsou sekvence 2 až 6 sacharidových jednotek a/nebo sekvence obsahující podjednotku aGal(l4)PGal. V některých případech může být k nosiči navázáno více SLT vazebných oligosacharidových jednotek. Číslo n je s výhodou takové, aby sloučenina obsahovala 0,25 až 2,50 mikromolů oligosacharidu na gram celkové hmotnosti. Odborníkům je známa celá řada aglykonových spojovacích ramen. Spojovací rameno s obsahem para-nitrofenylové skupiny (tj. -OC6H₄pNO₂) bylo popsáno například v [29], V určitém čase v průběhu syntézy je nitroskupina redukována na aminoskupinu, která může být chráněna jako N-trifluoroacetamido skupina. Před vazbou k nosiči je trifluoroacetamido skupina odstraněna, čímž je aminoskupina odmaskována.

Také vazebné rameno s obsahem síry již bylo v odborné literatuře popsáno [30]. Konkrétně je toto vazebné rameno odvozeno od 2-bromoethyl skupiny, která substituční reakcí s thionukleofily dává vzniknout spojovacím ramenům nesoucím celou řadu různých terminálních funkčních skupin jako jsou například

-OCH₂CH₂SCH₂CO₂CH3 a -OCH₂CH₂SC₆H₄-pNH₂.

Tyto terminální funkční skupiny umožňují reakci s komplementární funkční skupinou nosiče, čímž vzniká kovalentní vazba mezi spojovacím ramenem a nosičem. Takové reakce jsou odborníkům dobře známé.

• · • · · · • · • ·

V článku [31] bylo popsáno 6-trifluoroacetamido-hexyl spojovací rameno (-O(CH₂)6-NHCOCF₃), u kterého může být odstraněna trifluoroacetamido chránící skupina, čímž je odmaskována primární aminoskupina, použitá pro další párování. Příklady dalších známých spojovacích ramen mohou být 7-methoxykarbonyl-3,6dioxaheptyl spojovací rameno [32] (-OCH₂-CH2)2OCH2CO₂CH₃), 2-(4methoxykarbonylbutankarboxyamidojethyl [33] (-OCH₂CH₂NHC(O)(CH2)4CO2 CH₃), alylové spojovací rameno [34] (-OCH₂CH=CH₂), které kopolymerací radikálu s odpovídajícím monomerem dává vzniknout kopolymerům a další alylová spojovací ramena popsaná v [35] [-O(CH2CH₂O)2CH2CH=CH2]. Dále mohou být alylová spojovací ramena derivatizována v přítomnosti 2-aminoethanthiolu [36] za vzniku spojovacího ramene -OCH2CH2CH2SCH2CH2NH2. Další vhodná spojovací ramena byla popsána v [12-14, 16 a 17], Konkrétní způsob, jakým je oligosacharidová skupina navázána k nosiči, není kritický.

S výhodou je aglykonovým spojovacím ramenem hydrofobní skupina a vůbec nejraději je aglykonovým spojovacím ramenem hydrofobní skupina vybraná ze skupiny obsahující

O /nu X_JL_ (CH₂)5OCH₂CH₂CH2-, -(CH₂)₈CH₂O- a -NH-(CH₂)_m(Gn2)g G

NHC(O)NHkde m je celé číslo od 2 do 10.

Studie na krysím modelu (obecně uznávaný model pro preklinické studie, neboť z výsledků studie na krysách lze předpovědět reakce lidského pacienta) prokázaly, že materiály SYNSORB prochází gastrointestinálním traktem krysy nezměněny. Bylo zjištěno, že jsou tyto materiály po orálním podání z těla vyloučeny rychle a úplně (99 % bylo vyloučeno během 72 hodin). Dále vysoká hustota navázaných oligosacharidových skupin je zvláště vhodná pro vazbu toxinů vykazujících vazebnou afinitu k uhlovodíkům.

Pro použití ve funkci kompatibilního spojovacího ramene podle vynálezu jsou vhodná nepeptidylová spojovací ramena. Použití glykopeptidů není žádoucí, neboť glykopeptidy obsahují několik často odlišných oligosacharidů, navázaných na jediné molekule proteinu. Dále je často obtížné získat glykopeptidy ve velkém množství a je nezbytná nákladná a zdlouhavá purifikace. Podobně není žádoucí použití BSA nebo HSA konjugátů, neboť stabilita těchto konjugátů v gastrointestinálním traktu po orálním podání je sporná.

Kovalentní navázání oligosacharidové skupiny nesoucí SLT vazebné jednotky prostřednictvím nepeptidylového spojovacího ramene k inertnímu nosiči umožňuje účinné vyvázání a následné odstranění toxinu ze střeva pacienta trpícího nebo citlivého ke stavům asociovaným s infekcí enterohemorhagickou E. coli. Je-li oligosacharid syntetizován již s navázaným kompatibilním spojovacím ramenem (v nederivatizované formě), může být výsledná sloučenina získána ve vysoce čisté formě a může být použita pro vazbu na nejrůznější nosiče.

Oligosacharid je vázán k nosiči přímo, nejraději prostřednictvím spojovacího ramene, tak jak to popsal například Lemieux a kol. [11]. Di- a trisacharidové jednotky mohou být k farmaceuticky přijatelnému nosiči také vázány přímo, nebo mohou tvořit část oligosacharidu, který je k takovému nosiči navázán.

Inertní afinitní nosiče, obsahující aGal(l-4)PGal podjednotky, které jsou ke zmíněnému nosiči vázány prostřednictvím nepeptidylového spojovacího ramene a které jsou s výhodou používány v metodách podle navrhovaného vynálezu, jsou připravovány známými způsoby popsanými v [11, 12, 61] a v následujícím textu. V každém případě je 8-methoxykarbonyloktyl glykosid odpovídajícího haptenu aktivován a ligován k silylaminovanému pevnému nosiči, kde je základní hmota tvořena SiO₂. Následuje acetylace zbývajících aminových skupin pevného nosiče. Tyto přípravky jsou:

Pi-di, který obsahuje nejméně 0,25 pmol/g aGal(l-4)PGal disacharidu;

Pi-tri, který obsahuje nejméně 0,25 gmol/g aGal(l-4)pGal(l-4)pGlcNAc trisacharidu a

Pk-tri, který obsahuje nejméně 0,25 gmol/g aGal(l-4)3Gal(l-4)PGlc trisacharidu.

C. FARMACEUTICKÉ PROSTŘEDKY

Způsoby léčby podle vynálezu zahrnují simultánní podání prostředků které váží SLT vždy spolu s antibiotikem. Prostředky jsou podávány pacientům trpícím nebo citlivým k infekci patogenní E. coli. Antibiotikum může být připraveno a podáno v jakékoliv vhodné formě a jakýmkoliv vhodným, v oboru známým, způsobem. S výhodou jsou použity farmaceutické prostředky obsahující určité množství nejméně jednoho antibiotika, účinného proti infekci E. coli, a určité množství jedné nebo více oligosacharidových struktur, které váží SLT a/nebo verotoxin a které jsou navázány k nosiči a jako celek účinně váží SLT a/nebo verotoxin, přítomný ve střevě pacienta.

Pro orální způsob podání, který je považován za nejvhodnější, mohou být tyto prostředky upraveny různými způsoby. Nejraději jsou připraveny v kapalné nebo polotuhé formě. Prostředky obsahující kapalný farmaceuticky inertní nosič, jakým je například voda, mohou být pro orální způsob podání použity. Také další farmaceuticky kompatibilní kapaliny nebo polotuhé látky mohou být použity.

• · φ · * · • ·

Φ · φ · φφφφ ·· *

Použití takových kapalin nebo polotuhých látek je odborníkům dobře známé (viz. například Remington ’s Pharm. Sci. 18^th Ed., 1990).

Prostředky, které mohou být smíšeny s tekutými nebo polotuhými potravinami jako jsou střevní výživa, jablečná kaše, zmrzlina nebo puding jsou také vhodné. Prostředky jako SYNSORB, které nemají nepříjemnou chuť nebo nezanechávají nepříjemnou pachuť v ústech jsou zvláště vhodné. Pro dopravení prostředku přímo do žaludku může být použita také nasogastrická sonda.

Také pevné prostředky mohou být použity a to konvenčním způsobem v prostředcích s obsahem farmaceuticky inertních nosičů včetně běžných pevných nosičů jako jsou laktóza, škrob, dextrin nebo stearát hořečnatý. Tyto pevné prostředky mohou být připraveny ve formě tablet nebo kapslí. Prostředek (OLIGOSACHARID-Y-R)_n-NOSIČ může být použit i sám o sobě bez přídavku inertního farmaceutického nosiče, nejraději ve formě kapslí. Pokud je použit farmaceuticky inertní nosič, je typicky použit v množství od 1 do 99 % celkové hmotnosti prostředku, nejraději pak tvoří 75 až 95 % celkové hmotnosti prostředku.

Použitá dávka antibiotika je závislá na mnoha faktorech jako jsou konkrétní typ použitého antibiotika, stav pacienta a způsob podání. Dávka je zvolena tak aby účinně zabíjela patogenní E. coli v organismu infikovaného jedince. Výběr vhodné dávky antibiotika je věcí zkušených odborníků.

Dávka vázaného oligosacharidu je zvolena tak aby zajistila neutralizaci a eliminaci SLT ze střeva léčeného pacienta. Vhodné dávky se pohybují v rozmezí od 0,25 do 1,25 pmol oligosacharidu na kilogram tělesné hmotnosti a den. Při použití prostředků s obsahem SYNSORB je vhodná dávka asi 0,5 až 1 gram SYNSORB na kg tělesné hmotnosti a den, což odpovídá koncentraci SYNSORB ve střevě asi 20 mg/ml. Předpokládaná perioda podávání je 2 až 4 x denně po dobu 1 týdne nebo dokud neustoupí klinické symptomy. Velikost dávky a časový rozvrh podávání prostředku se může lišit v závislosti na konkrétním typu antibiotika a/nebo oligosacharidové struktury a na takových faktorech jako jsou věk a stav pacienta a rozsah onemocnění. Velikost dávky v závislosti na všech zmíněných faktorech určuje odborník.

Jak již bylo zmíněno výše, nejvhodnějším způsobem podání je orální způsob, ale prostředky mohou být upraveny i pro podávání jiným způsobem, například per rectum. Vhodnost takových prostředků závisí na konkrétním typu použitého prostředku a stavu konkrétního pacienta. Tyto prostředky mohou podle zamýšleného způsobu podání obsahovat kapalný nosič, kterým může být olej, vodný roztok, emulze, nebo může obsahovat některá vhodná rozpouštědla.

Prostředky mohou být připraveny ve formě jednotlivých dávek, nebo ve formě vícečetných dávek. V případě předem stanovených a připravených dávek obsahují kapalné prostředky pro orální podávání účinné množství antibiotika, tj. množství antibiotika účinné pro léčbu infekce E. coli a asi 1 pmol oligosacharidu/ml.

D. METODOLOGIE

SLT toxin může být neutralizován pomocí oligosacharidových sekvencí obsahujících podjednotky aGal(l-4)PGal, které zmíněný toxin váží. Konkrétně bylo zjištěno, že takové oligosacharidové sekvence kovalentně vázané k nosiči účinně neutralizují SLT toxin. Příkladem takových prostředků mohou být některé materiály typu SYNSORB, které váží SLT toxin a neutralizují jeho aktivitu. Antibiotika vhodná pro použití podle navrhovaného vynálezu jsou taková, která po podání infikovanému pacientu účinně léčí infekci E. coli. S výhodou jsou používána baktericidní antibiotika. Antibiotika mohou být podávána orálně, parenterálně (například intravenózně, intramuskulárně, subkutánně atd.) a dalšími cestami. Z účelem počáteční SLT detoxikace pacienta může být SLT vážící vázaný oligosacharid podán samostatně ještě před podáním antibiotika. Pokud je použito antibiotikum, které vyžaduje rozdílný časový rozvrh dávkování než SLT vážící vázaný oligosacharid, tj. pokud je například antibiotikum podáváno jen jedenkrát denně, může být SLT vážící vázaný oligosacharid doplňkově podán samostatně, čímž je zajištěno kontinuální očišťování organismu od SLT. Klíčovou myšlenkou navrhovaného vynálezu je podání SLT vážícího vázaného oligosacharidu vždy když je pacientu podáno antibiotikum. S výhodou je antibiotikum podáváno ve farmaceuticky přijatelné směsi spolu s vázaným oligosacharidem, který váže SLT. Oligosacharidové sekvence navázané k nosiči, vhodné pro použití podle navrhovaného vynálezu, zahrnují takové sekvence, které váží SLT toxin. Vazebná afinita oligosacharidu k SLT toxinu je snadno stanovena jednoduchými in vitro testy. Pro účely navrhovaného vynálezu jsou oligosacharidovými sekvencemi vážícími SLT toxin, které jsou navázané k nosiči, takové sloučeniny, které redukují konečné titry cytotoxické aktivity při testech na buňkách kočkodana zeleného nejméně o 50 %, nejraději pak nejméně o 95 %. Pro stanovení cytotoxické aktivity jsou používány v oboru běžně známé testy.

Další vázané oligosacharidové sekvence, vhodné pro použití podle vynálezu jsou takové sekvence, které váží SLT toxin významně lépe (p<0,05 s použitím standardních statistických metod jako jsou Wilcoxonův nebo Studentův T-test) než kontrolní nosič, který neobsahuje žádné vázané oligosacharidové sekvence (například CHROMOSORB P).

·· ♦···

Účinnost prostředků podle vynálezu na neutralizaci SLT může být stanoven porovnáním aktivity SLT s a bez léčby zmíněnými prostředky. Aktivita SLT může být testována s využitím toxicity zmíněných látek k buňkám kočkodana zeleného.

Tyto buňky (Věro cells ATCC CCL81) lze získat z American Type Culture

Collection, Rockville, MD.

Při použití metod podle vynálezu jsou klinické projevy HUS, který je důsledkem infekce enterohemorhagickou E. coli, redukovány, pokud jsou farmaceutické prostředky popsané výše podány během 3 dnů od počátečních projevů infekce a to dříve než jsou zasaženy kromě střeva ještě další orgány. Naopak podání zmíněných farmaceutických prostředků po této lhůtě, kdy jsou infekcí zasaženy kromě střeva i další orgány, podstatně redukuje schopnost zmíněných prostředků redukovat následky HUS.

S výhodou jsou první klinické příznaky postižení SLT následkem infekce E. coli potvrzeny diagnostickým vyšetřením stolice. Jedna z komerčně dostupných diagnostických souprav pro detekci infekce E. coli a SLT je prodávána firmou Meridian Diagnostic, lne., Cincinnati, Ohio, USA 45244 pod názvem Premier EHEC.

Z výše uvedených závěrů je zřejmé, že navrhovaný vynález nalezne široké uplatnění. V souladu s tím jsou pro ilustraci uvedeny následující příklady, které však v žádném případě rozsah vynálezu nelimitují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Vyhodnocení neutralizační aktivity SYNSORB-Pt vzhledem k verotoxinu exprimovanému kmenem E. coli O157:H7, vystavenému působení antibiotik.

A. Stanovení MIC pro E. coli O157:H7.

Minimální inhibiční koncentrace (MIC) různých antibiotik pro kmen E. coli O157;H7 (EEU 396, který produkuje VT1 i VT2) byly stanoveny metodou popsanou v Antimicrobial Susceptibility Testing Manual, 3^rd Ed. (NCCLS Document M7-A2, Vol. 10, No. 8). Pro ověření metody byl použit kmen E. coli ATCC 25922 (American Type Culture Collection).

Minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro nejrůznější testovaná antibiotika jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1: Minimální inhibiční koncentrace antibiotik pro E. coli O157:H7 a referenční kmen ATCC 25922.

kmen E. coli	Antibiotikum	(pg/ml)
Cefixim	Tetracyklin	Ciprofloxacin	Co-trimoxazol (trimethoprim/sul famethoxazol)	Mitomycin-C
O157:H7 (EEU396)	4,8	1,92	0,192	0,96/4,8	9,6
ATCC #25922	0,96	1,92	0,0384	0,96/4,8	9,6

B. Růst E. coli O157:H7 a působení antibiotik a SYNSORB-P_k.

Bakterie E. coli O157:H7 byly kultivovány přes noc v 200 ml Mueller-Hinton (MH) média v 1L erlenmeyerově baňce. Kultivace probíhala při teplotě 37 °C na New Brunswick Gyrotory třepačce model č. G10 při 120 rpm. Tato kultura byla poté zředěna na OD 0,6 při vlnové délce 625 nm a 50 ml alikvoty byly rozděleny do 125 ml erlenmeyerových baněk.

Antibiotika byla přidávána v koncentracích odvozených od MIC stanovených výše, tak je to doporučeno v Walterspiel et al., (Infection, 1992, 20: 25-9) [62] a kultura byla inkubována na třepačce po dobu dalších 24 hodin při teplotě 37 °C. Pro dosažení maximální produkce verotoxinů kmenem E. coli O157:H7 byla použita finální koncentrace každého z antibiotik ve 24 hodinové kultuře 1/2 MIC. Pro každé testované antibiotikum byly připraveny vždy dvě baňky. Spolu s antibiotikem byl vždy do jedné z páru baněk přidán SYNSORB-P_k v koncentraci 10 mg/ml.

Množství verotoxinů v každé z 24 hodinových kultur bylo poté stanoveno pomocí verocytotoxického testu tak jak ho popsal Armstrong, G.D. et al., (J. Infect. Dis. 1991, 164: 1160-67) [53], Výsledky byly vyneseny do grafů, ze kterých byly extrapolovány hodnoty CD₅₀ pro kultury s antibiotiky s přídavkem SYNSORB-P_k nebo bez. Procento neutralizace verotoxinové aktivity u kultur s antibiotikem ošetřených SYNSORB-p_k vzhledem k neošetřeným kulturám s antibiotikem bylo vypočteno podle vzorce uvedeného v Armstrong et al., 1991 [53],

Procenta neutralizace verotoxinové aktivity v kulturách E. coli O157:H7 ošetřených různými antibiotiky a SYNSORB-P_k jsou uvedena v tabulce 2.

4444 • 4 4 4 4 • 44 4444 44 4

Tabulka 2

Neutralizace verotoxinové aktivity pomocí SYNSORB-Pk v přítomnosti antibiotika.

Antibiotikum (pg/ml)	SYNSORB-Pk (10 mg/ml)	CD50 b)	procento neutralizace
Tetracyklin	+	0,0	100
(0,96)	-	15,8
Ciprofloxacin	+	5,0	90
(2,4)	-	50,1
Co-trimoxaxol	+	0,0	100
(0,48)	-	63,1
Cefixim	+	0,0	100
(2,4)	-	316,2
Mitomycin-C	+	0,0	100
(0,96)	-	158,4

^b) Počet ředění nutných pro dosažení CD₅₀.

Uvedená data ukazují, že ošetření antibiotiky v kombinaci se SYNSORB-Pk může být účinným způsobem redukce vážných komplikací jako je například HUS u pacientů postižených infekcí E. coli O157:H7. Jak vyplývá z uvedených údajů, SYNSORB-Pk váže verotoxin, exprimovaný E. coli O157:H7 v přítomnosti antibiotik. Podobně bude SYNSORB-Pk vázat i verotoxiny, uvolněné buňkami bakterií uhynulými následkem antibiotické léčby, a tak bude preventivně působit proti jejich uvolňování do oběhového systému. Tím je umožněna antibiotická léčba, která zbaví organismus patogenních E. coli, aniž by se zvyšovalo nebezpečí vzniku HUS u postižených pacientů.

Příklad 2: Léčba infekce E. coli.

Během 3 dnů od prvních projevů infekce enterohemorhagickou E. coli, jako je například kmen O157:H7, je pacientům podáván dvakrát denně prostředek obsahující účinné množství vhodného antibiotika, jakým je například kanamycin, a 250 mg/kg SYNSORB-Pk, zamíchaný v dětské výživě. Měřením SLT ve střevním obsahu lze prokázat snížení hladiny SLT. U ošetřených pacientů dále nedochází ve srovnání s neošetřenými pacienty, pacienty ošetřenými pouze antibiotiky, pacienty » · · · • »··· · i · i , „ · .»··· ·»♦·.

·· ..*· β φ · Φ ft ft ft ftft ft ftft ftft ošetřenými pouze SYNSORB-P_k a pacienty ošetřenými antibiotiky i SYNSORB-P_k, ovšem každým prostředkem nezávisle, tj. nikoliv simultánně, k rozvoji HUS.

Vzhledem k tomu, že byl vynález popsán s odkazy na nejvhodnější příklady provedení, je nutné uvést, že vynález není těmito příklady nikterak limitován. Právě naopak, předmětem vynálezu jsou nejrůznější modifikace a ekvivalentní uspořádání, jejichž rozsah a povahu určují následující patentové nároky.

Závěry každé publikace, patentu nebo patentové přihlášky, citované v tomto textu, jsou zde uvedeny výhradně formou odkazu a to ve stejném rozsahu, jako kdyby bylo u každé jednotlivé publikace, patentu nebo patentové přihlášky uvedeno, že je součástí navrhovaného vynálezu jen jako literární odkaz.

LITERÁRNÍ ODKAZY

Následující publikace jsou citovány v příslušné části textu ve formě odpovídajícího pořadového čísla v hranaté závorce ([ ]).

Karmali M. A. et al., J. Clin. Microb. 22: 614-619 (1985).

Head, S. et al., Infeci Immunol 58:1532-1537 (1990).

Samuel et al., Infect Immunol 58: 611-618 (1990).

Altman D. G. Practical Statistics for Med. Res. lst ed. New York Chapman and Halí 179 228 (1991).

Calderwood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 84: 4364-4368 (1987).

Jackson et al Microb. Pathog. 2: 147-153 (1987).

Strockbine et al., J. Bacteriol. 170: 1116-1122 (1988).

Robson et al., J. Pediatr 117: 675-676 (1990).

Cimolai et al., J. Pediatr 117: 676 (1990).

Armstrong et al., International Patent Application Publication No WO 93/08209 for DIAGNOSIS AND TREATMENT OF BACTERIAL DYSENTERY published 29 April 1993.

Lemieux R U. et al., “The Properties of a Synthetic Antigen Related to the Blood-Group Lewis A” J. Am. Chem. Soc. 97: 4076-83 (1975).

Lemieux. R U. et al., “Glycoside-Ether-Ester Compounds” U.S. Patent No. 4.137.401. issued January 30 1979.

Lemieux R U. et al., Artificial Oligosaccharide Antigenic Determinants U. S. Patent No. 4.238.473 issued December 9 1980.

·· ·«

·· ··** * · · • · ♦ · · • · ♦ · • · · · · • φ · · φφφ φφφφ ··

Lemieux R U. et al., Synthesis of 2-Amino-2-Deoxyglycoses and 2-Amino-2Deoxyglycosides from Glycals U.S. Patent No. 4.362.720 issued December 7. 1982.

Cox D. et al., “A New Synthesis of 4-O-a-D-Galactopyranosyl-D-GalactoPyranose” Carbohy. Res. 62: 245-252 (1978).

Dahmen. J. et al., Synthesis of Space Arm, Lipid, and Ethyl Glycosides of the Trisaccharide Portion [a-D-Gal-(l-4)-P-D-Gal(l-4)-3-D-Glc] of the Blood Group p Antigen Preparation of Neoglycoproteins Carbohy. Res. 127: 15-25 (1984).

Garegg. P. J. et al. A Synthesis of 8-Methoxycarbonyloct-l- yl-O-a-DGalactopyranosy 1-( 1-3)-0-β-D-Galactopy ráno syl-(l-4)-2-Acetamido-2-Deoxyβ-D-Glucopyranoside” Carbohy. Res. 136: 207-213 (1985).

Garegg P. J. et al., Synthesis of 6- and 6' -deoxy Derivatives of Methyl 4-0a-D-galactopyranosyl^-D-galactopyranoside for Studies of Inhibition of Pyelonephritogenic Fimbriated E. coli Adhesion to Urinary Epithelium-Cell Surfaces” Carbohy. Res. 137: 270-275 (1985).

Jacquinet J. C. et al. Synthesis of Blood-group Substances. Part 11. Synthesis of the Trisaccharide O-a-D-Galactopyranosyl-(l-3)-O^-D-galactopyranosyl-(l4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose. J.C.S. Perkin 7:326-330 (1981).

Koike K. et al., Total Synthesis of Globotriaosyl-E and Z-Ceramides and Isoglobotriaosyl-E-Ceramide. Carbohy. Res. 163: 189-208 (1987).

Schaubach R. et al, Tumor-Associated Antigen Synthesis: Synthesis of the Gal-a-(l-3)-Gal^-(l-4)-GlcNAc Epitope. A Specific Determinant for Metastatic Progression? Liebigs Ann. Chem. 607-614 (1991).

Ratcliffe R M. et al. “Sialic Acid Glycosides, Antigens, Immunoadsorbents and Methods for Their Preparation U. S. Patent No. 5.079.353 issued January 7 1992.

Okamoto K. et al. Glycosidation of Sialic Acid. Tetrahedron. 47: 5835-5857 (1990).

Abbas S. A. et al., “Tumor-Associated Oligosaccharides I Synthesis of SialylLewis Antigenic Determinant”. Sialic Acids Proč. Japan-German Symp Berlin 22-23 (1988).

Paulsen. Advances in Selective Chemical Syntheses of Complex Oligosaccharides Ange-w. Chem. Int. Ed. Eng. 21: 155-173 (1982).

• to ··* * • · to to

Schmidt. New Methods for the Synthesis of Glycosides and Oligosaccharides Are There Alternatives to the Koenigs-Knorr Method? Arisen Chem Int Ed Eng. 25: 212-235 (1986).

Fíigedi. P. et al “Thioglycosides as Glycosylating Agents in Oligosaccharide Synthesis”, Glycoconjugate J. 4: 97-108 (1987).

Kameyama. A. et al., “Total Synthesis of Sialyl Lewis X” Carbohy. Res. 209: cl-c4 (1991).

Ekborg G. et al., Synthesis of Three Disaccharides for the Preparation ot Immunogens bearing Immunodeterminants Known to Occur on Glycoproteins. Carbohy. Res. 110: 55-67 (1982).

Dahmén. J. et al., “2-Bromoethyl Glycosides: Applications in the Synthesis of Spacer-Arm Glycosides” Carbohy. Res. 118: 292-301 (1983).

Rana. S. S. et al., “Synthesis of Phenyl 2-Acetamido-2-Deoxy-3-O-a-LFucopyranosyl-P-D-Glucopyranoside and Related Compounds Carbohy. Res. 91: 149-157 (1981).

Amvam-Zollo P. et al., “Streptococcus pneumoniae Type XIV Polysaccharide Synthesis of a Repeating Branched Tetrasaccharide with Dioxa-Type SpacerArms”. Carbohy. Res. 150: 199-212 (1986).

Paulsen H., “Synthese von oligosaccharid determinanten mit amid-spacer vom typ des T-antigens” Carbohy. Res. 104: 159-219 (1982).

Chernyak A. Y. et al., “A New Type of Carbohydrate Containing Synthetic Antigen Synthesis of Carbohydrate-Containing Polyacrylamide Copolymers having the Specificity of 0:3 and 0:4 Factors of Salmonella” Carbohy. Res. 128: 269-282 (1984).

Fernandez-Santana V. et al., “Glycosides of Monoallyl Diethylene Glycol A New type of Spacer group for Synthetic Oligosaccharides J. Carbohy. Chem. 8(3): 531-537 (1989).

Lee R.T. et al., Synthesis of 3-(2-Aminoethylthio) Propyl Glycosides Carbohy. Res. 37: 193-201 (1974).

Cannon et al., J. Gen. Microb. 136: 1125-1135 (1990).

Wemsiem et al., J. Bactenol 170: 4223-4230 (1988).

Ito et al., Microb. Pathog. 8: 47-60 (1990).

Head et al., FEMS Microb. Lett. 51: 211-216 (1988).

Schmitt et al., Infect. Immun. 59: 1065-1073 (1991).

Scotland et al., Lancet ii: 885-886 (1991).

Oku et al., Microb. Pathog. 6: 113-122 (1989).

Boyd et al., Nephron 51: 207-210 (1989).

DeGrandis et al., J. Biol. Chem. 264: 12520-12525 (1989).

Waddell et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 152: 674-679 (1988).

Lingwood et al., J. Biol. Chem. 262: 8834-8839 (1987).

Waddell et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 87: 7898-7901 (1990).

Cohen et al., J. Biol. Chem. 262: 17088-17091 (1987).

Jacewicz et al., J. Exp. Med. 163: 1391-1404 (1986).

Lindberg. et al., J. Biol. Chem. 262: 1779-1785 (1987).

Armstrong. G. D. et al., Infect. Immunol. 55: 1294-1299 (1987).

Armstrong. G. D. et al., J. Infeci. Dis. 164: 1160-1167 (1991).

Rafter D. J. et al., WO 97/49431 (1997).

Matsuda E. et al., VTEC Abstracts page 108 (1997).

Itoh T. et al., VTEC Abstracts page 19 (1997).

Yamamoto T. et. al., VTEC Abstracts page 115 (1997).

Hinsgaul O. et. al., PCT/CA97/00862 (1997).

Hinsgaul. O et. al., PCT/CA97/00863 (1997).

Hinsgaul O. et. al., PCT/CA97/00864 (1997).

Yeske et. al., PCT based on US 08/781 327 (1998).

Walterspiel J.N. et al., Infection 20: 25-29 (1992).

Závěry výše uvedenývh publikací, patentů a patentových přihlášek jsou zde citovány jako celek a ve stejném rozsahu jako kdyby zde byl individuálně zahrnut plný text každého článku, patentu či patentové přihlášky.

Claims (34)

1. Prostředek, který obsahuje antibiotikum a SLT vážící oligosacharidovou sekvenci kovalentně navázanou pro použití jako léčiva pro léčení nebo prevenci stavů zapříčiněných enterohemorhagickou E. coli vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jednu SLT vážící oligosacharidovou sekvencí, kovalentně navázanou k farmaceuticky přijatelnému inertnímu nosiči (tj. vázaného oligosacharidu), kde zmíněná oligosacharidová sekvence váze SLT a kde může být SLT navázaný k vázanému oligosacharidu vyloučen z gastrointestinálního traktu.

2. Prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněné antibiotikum je vybráno ze skupiny obsahující cefixim, tetracyklin, ciprofloxacin, co-trimoxazol, mitomycin-C, fosfomycin a kanamycin.

3. Prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněný oligosacharid obsahuje podjednotku aGal(l-4)PGal.

4. Prostředek podle nároku 3 vyznačující se tím, že zmíněný oligosacharid je vybrán ze skupiny obsahující aGal(l-4)PGal, aGal(l4)pGal(l-4)pGlcNAc a aGal(T-4)pGal(T-4)pGlc,

5. Prostředek podle nároku lvyznačující se tím, že zmíněný oligosacharid je vázán k nosiči s použitím nepeptidylového mezerníku.

6. Prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že je pacientu podán jediný farmaceutický prostředek obsahující antibiotikum i SLT vážící vázaný oligosacharid.

7. Prostředek podle nároku lvyznačující se tím, že je léčivo podáno během 3 dnů od prvních projevů infekce.

8. Prostředek podle nároku lvyznačující se tím, že zmíněná oligosacharidová sekvence obsahuje 2 až 10 oligosacharidových jednotek.

9. Prostředek podle nároku 5 v y z n a č u j í c í se tím, že zmíněné spojovací rameno je vybráno ze skupiny obsahující -(CH₂)₈C(O)- a -NH(CH₂)_m-NHC(O)NH-, kde m je celé číslo od 2 do 10.

10. Farmaceutický prostředek vhodný pro prevenci a léčbu stavů zapříčiněných enterohemorhagickou E. coli vyznačující se tím, že zahrnuje • · • · · · » · · 4

a) účinné množství nejméně jednoho antibiotika

b) nejméně jednu oligosacharidovou sekvencí kovalentně navázanou k farmaceuticky přijatelnému inertnímu nosiči (vázaný oligosacharid), kde zmíněná oligosacharidová sekvence váže SLT a

c) farmaceuticky přijatelný nosič, kde může být SLT navázaný ke zmíněnému vázanému oligosacharidu vyloučen z gastrointestinálního traktu.

11. Prostředek podle nároku 10 vy značující se tím, že zmíněné nejméně jedno antibiotikum je účinnou baktericidní látkou pro zmíněnou enterohemorhagickou E. coli.

12. Prostředek podle nároku 10 vy z n a č u j í c i se tím, že zmíněné antibiotikum je cefixim, tetracyklin, ciprofloxacin, co-trimoxazol, mitomycin-C, fosfomvcin nebo kanamycin.

13. Prostředek podle nároku 10 vyznačuj ící se tím, že zmíněný oligosacharid obsahuje podjednotku otGal(l-4)PGal.

14. Prostředek podle nároku 10 vyznačuj ící se tím, že zmíněný oligosacharid je vybrán ze skupiny obsahující ocGal(l-4)pGal, aGal(l4)pGal(l-4)pGlcNAc a aGal(l-4)pGal(l-4)PGlc.

15. Prostředek podle nároku 10 vy značující se tím, že zmíněný oligosacharid je vázán k nosiči s použitím nepeptidylového mezerníku.

16. Prostředek podle nároku 10 v y z n a č u j í c i se tím, ž e je tento prostředek podán pacientu během 3 dnů od prvních projevů infekce.

17. Prostředek podle nároku 10 vy z n a č u j í c í se tím, ž e je tento prostředek podán orálně.

18. Prostředek podle nároku 10 vy značující se tím, že zmíněná oligosacharidová sekvence obsahuje 2 až 10 oligosacharidových jednotek.

19. Prostředek podle nároku 15 vyznačuj ící se tím, že zmíněné spojovací rameno je vybráno ze skupiny obsahující -(CLDgCÍO)- a -NH(CH₂)_m-NHC(O)NH-, kde m je celé číslo od 2 do 10.

20. Prostředek který obsahuje antibiotikum a SLT vážící oligosacharidovou sekvenci kovalentně navázanou pro použití jako léčiva pro léčení nebo • · antibiotikum a oligosacharidové prevenci stavů zapříčiněných enterohemorhagickou E. coli vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jednu SLT vážící oligosacharidovou sekvenci, kovalentně vázanou k farmaceuticky přijatelnému inertnímu nosiči (tj. vázaného oligosacharidu), kde zmíněná oligosacharidová sekvence váže SLT, a součastné nejméně jedno účinné množství nejméně jedné SLT vážící sekvence, kovalentně vázané k farmaceuticky přijatelnému inertnímu nosiči (tj. vázaného oligosacharidu), kde zmíněná oligosacharidová sekvence váže SLT a kde může být následně po každém podání SLT navázaný k vázanému oligosacharidu vyloučen z gastrointestinálního traktu.

21. Prostředek podle nároku 20 v y z n a č u j i c i se tím, že zmíněné antibiotikum je eefixim, tetracyklin, ciprofloxacin, co-trimoxazol, mitomycin-C, fosfomycin nebo kanamycin

22. Prostředek podle nároku 20 vyznačuj ící se tím, že zmíněný oligosacharid obsahuje podjednotku aGal(l-4)PGal.

23. Prostředek podle nároku 20 v y z n a č u j i c i se tím, že zmíněný oligosacharid je vybrán ze skupiny obsahující aGal(l-4)pGal, aGal(l4)pGal(l-4)pGlcNAc a aGal(l-4)pGal(l-4)pGlc.

24. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že zmíněný oligosacharid je vázán k nosiči s použitím nepeptidylového mezerníku.

25. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že je podán jediný farmaceutický prostředek obsahující antibiotikum i SLT vážící vázaný oligosacharid následně po podání toxin vážícího prostředku samotného.

26. Prostředek podle nároku 20 v y z n a č u j i c i se tím, že je prostředek podán pacientu během 3 dnů od prvních projevů infekce.

27. Prostředek podle nároku 20 vyznačujíc i se tím, že zmíněná oligosacharidová sekvence obsahuje od 2 do 10 sacharidových jednotek.

28. Prostředek podle nároku 24 vyznačující se tím, že zmíněné spojovací rameno je vybráno ze skupiny obsahující -(CfL)₈C(O)- a -NH(CH₂)_m-NHC(O)NH-, kde m je celé číslo od 2 do 10.

• » • · · · · · ···· · · · · · ·

29. Prostředek podle nároku 1 vyznačující se zmíněným inertním nosičem je oxid křemičitý.

30. Prostředek podle nároku 10 vyznačující se zmíněným inertním nosičem je oxid křemičitý.

31. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se zmíněným inertním nosičem je oxid křemičitý.

32. Prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím • ♦ · · 4 · » • · · · • · · 4 • « · · tím, že tím, že tím, že ž e podání léčiva pacientu je uskutečněno dříve než dojde k zasažení jiných orgánů než střeva.

33. Prostředek podle nároku 10 vyznačující se tím, že je zmíněný prostředek podán pacientu dříve než dojde k zasažení jiných orgánů než střeva.

34. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že podání léčiva pacientu je uskutečněno dříve než dojde k zasažení jiných orgánů než střeva.