CN1286263A - 新的人Rab基因及其编码的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的人Rab蛋白(RABPA)、编码这种多肽的多核苷酸以及通过重组技术产生多肽的方法。本发明也公开了将该多肽用于AIDS和其它获得性和遗传性免疫缺陷病、退行性神经性疾病、病毒性感染等疾病的方法。本发明还公开了这种多肽的拮抗剂及其在治疗和预防上的用途。此外,本发明还公开了鉴别Rabpa核酸序列和检测RABPA多肽的方法。

Description

新的人Rab基因及其编码的多肽

本发明涉及新鉴别的多核苷酸、由此多核苷酸编码的多肽以及这些多核苷酸和多肽的用途和制备。更具体地说，本发明涉及一种新的人Rab蛋白(命名为RABPA)及其编码基因Rabpa。本发明还涉及促进和抑制此多肽作用的方法。

细胞内有两种GTP结合蛋白在信号传导中起极其重要的功能，其一是位于细胞膜下的异源三聚体形式的G蛋白，另一种是小分子量单体形式的GTP结合蛋白。这种GTP结合蛋白构成一个超级家族，也称ras超级家族。它包括Ras、Rho、Alf、Sarl、Ran和Rab等家族，其中Ras家族帮助把细胞外信号从细胞表面受体传到细胞核，它通过MAP(促分裂原激活蛋白)激酶级联放大来调节基因表达，Ras家族成员的突变使细胞增殖信号一直放大不能衰减从而导致癌变；Rho家族主要调节肌动蛋白细胞骨架的再组织；Ran调节细胞核内外的运输；Rab、AlF、Sar1等家族调节细胞器之间膜泡的运输，其中Arf和Sar1起作用是在供体细胞器膜泡的形成阶段，而Rab则调节膜泡的运输的正确锚定。(Yan Feng et al．The Journal ofcell biology，vol 131，1995．)(Suzanne R Pfeffer，Curr opin cell biol 1994，6：522-526.)(Peter novick and Patrick Brennward，cell vol 75，597-601，nov 9 1993.)

真核细胞一般被细胞内膜分隔成许多大大小小的不同的区室，各区室之间存在着物质和信息的交流。区室间的物质交流的主要载体是膜泡，由于区室是多种多样的，所以膜泡运输也必须是高度选择的，以保证物质从何处来运到何处去这一特异性。Rab蛋白-一种小分子GTP结合蛋白，据认为是用来确保膜泡载体运输的特异性的。真核细胞内有多种Rab蛋白，不同的Rab本身也定位于细胞内不同的膜区室—每种Rab蛋白都结合到与内吞、外排及细胞内运输过程相关的细胞器膜上，一般每种细胞器在其膜的胞质面上至少锚定有一种Rab蛋白(Philippe chavier，Lettles to nature，Vol 353，24 oct．1991：769-773.)(Peter novickand Patrick Brennward，Cell，vol 75，597-601，1993.11.9)(Suzanne R Pfeffer，Curropin cell biol 1994，6：522-526.)。

Rab蛋白一般具有以下的结构特征：(1)Rab相当保守，在酵母、果蝇、植物和哺乳类中都发现有Rab基因，而且相当保守(Mustafa Benli，et al.TheEMBO Journal Vol 15 No 23 pp 6460-6475，1996)。(2)分子量大小在20-27KD之间，所以Rab基因的CDS的长度一般不超过700个核苷酸(John Armstrong et al.Journal of Cell Science 109：1265-1274(1996).)(Gregory Jedd，et al.The Journal ofcell biology，Vol 137，No3 May 5 1997 563-580)。(3)具有四个分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的保守的GTP／GDP结合区域，这也是ras超家族的特点。(4)Ⅰ、Ⅱ之间还有保守的效应子(GAP)结合区域(Janouei-Lerssey Ⅰ“two-hybrid system screen withthe small GTP-binding protein Rab6：Identification of a novel mouse GDPdissociation inhibitor isoform and two other potential partners of Rab6.)。(5)C末端为高变区域，但尾部都有CC、CXC或CXXX基序，该基序为GGTase(异戊二烯基转移酶)作用位点-GGTase，把十五碳法尼基或二十碳牻牛儿牻牛儿基转移至末端Cys残基上，Rab合成后首先由GGTase进行异戊二烯化修饰，修饰后利用高度变化的C末端插入细胞器的膜上。已证明：Rab的高度变化的C末端决定了Rab蛋白成员在各个不同的细胞器膜上的位置，原因是其C末端可以互补地结合到在各细胞器膜上特异性分布的鸟苷释放因子(GDF)上。如果Rab的C末端被去除，则其膜结合特异性消失，各种Rab功能是可以互换(Philippe chavier，Lettlesto nature，Vol 353，24 oct.1991：769-773.)。(6)Rab基因的表达大部分没有组织将异性，但也有不少基因经Northern分析表明只表达于脑、表皮和肝脏等组织。如Rab17主要表达于表皮细胞中，S10(也是Rab成员)只表达于淋巴细胞系，Rab3a主要表达于神经细胞，Rab3d只表达于脂肪细胞中。现今在脑组织发现的Rab特别多(John Armstrong et al.Journal of Cell Science 109：1265-1274(1996).)(MustafaBenli，et al.The EMBO Journal Vol 15 No 23 pp 6460-6475，1996)(GregoryJedd，，et al.The Journal of cell biology，Vol 137，No.3 May 5 1997 563-580)(Janouei-Lerssey I“two-hybrid system screen with the small GTP-bindingprotein Rab6：Identification of a novel mouse GDP dissociation inhibitor isoform andtwo other potential partners of Rab6.)。

Rab蛋白会定位于在细胞一定区室。Rab与内吞、外排及细胞内运输的膜泡转运的选择性锚定和融合有关，不同的Rab自身也特异性地锚定于不同的膜系统中。例如，YPTl(即酵母的Rabl)定位于高尔基复合体(Golgi complex)；Rab3a定位于分泌泡膜上；Rab4定位于早期内吞体；Rab7定位于晚期内吞体；Rab9定位于“高尔基体外侧网络”(Trans Golgi Network，TGN)；Rab5定位于细胞质膜。一种确定Rab蛋白在各膜的位置的方法是免疫荧光显微镜检技术。其原理是Rab只利用C末端锚定在膜上而它的N-末端仍然露在细胞质中，所以构建Rab基因的真核细胞表达载体时可以在Rab基因的N未端附加一个c-myc的抗原表位基因，当载体转染cos细胞后外源基因表达则形成c-myc-Rab融合蛋白，而后用带有荧光素标记的抗c-myc抗体处理COS细胞，显微镜检时，有萤光的位置便是Rab锚定的位置。由此可检测出Rab在各种膜的位置(Marino Zerial et al.methods inenzymology.vol 219：398-407.)。

在膜泡运输过程中，Rab蛋白通过与许多蛋白因子相互作用而实现其功能，这些蛋白因子包括：(1)异戊二烯基转移酶GGTase。当Rab合成后，GGTase将十五碳或二十碳的异戊二烯基转至Rab末尾的CC或CXC基序的半胱氨酸残基上。(2)REP(Rab Escort Protein-Rab的分子伴娘)，将未修饰或未完全修饰的Rab送至GGTase的催化区域使Rab完成修饰。(3)GTP酶激活蛋白-GAP(GTPaseactivating protein)，当膜泡与目标膜融合后激活Rab的GTPase活性，使Rab催化的GTP水解成GDP。(4)鸟苷解离抑制因子-GDI(Guanine-nucletide disassoiationinhibitor)，将结合GDP形式的Rab从目标膜解离下，并与Rab共溶于细胞质中。(5)鸟苷释放因子-GDF(GDI displacement Factor)，促使Rab从GDI上解脱出而与自身结合，并使Rab特异性的锚定在供体膜上。(6)鸟苷交换因子-GEF(guanine-nucleotide exchange factor)，催化GTP将锚定于供体膜的Rab结合的GDP替换下。结合GTP形式的Rab蛋白才具有活性。(7)V-Snare。该因子位于供体膜上，受Rab的催化，在形成膜泡后移至目标膜，可与目标膜上的T-Snare相互结合；当T-Snare与V-Snare结合后，膜泡与目标膜发生融合，完成物质运输。(8)Rab亲和蛋白(Rabphlin)。Rab亲和蛋白可以阻碍Rab的功能发挥(Peter novick and PatrickBrennward，cell vol 75，597-601，nov 9 1993.)(Armand Tavitian，methods inenzymology.vol 219：387-397)(Suzanne R Pfeffer，Curr opin cell biol 1994，6：522-526.)。

Rab基因在以下方面有很大的利用价值，(1)研究与Rab基因相关的遗传性疾病。Chediak-Higashi综合症是一种的常染色体隐性遗传病，其病症是细胞内有巨大的来源于分泌路径的细胞器膜。该病病因可能为Rab基因突变的纯合体导致细胞的分泌蛋白分选发生缺陷。这提示Rab基因可应用于疾病的诊断和治疗。(Tatjana Stanrovic，Genomics 40，267-276(1997).)(2)Rab在基因工程中的应用价值。既然Rab对于真核细胞细胞器间的蛋白转运和膜泡运输的正确定位和融合至关重要，因此已有学者尝试着发挥Rab的作用进行基因工程生产或利用Rab调节细胞内蛋白的转运。例如，Chishi A．等人报道，Rab3D的超表达加强转基因小鼠腺泡受控淀粉酶的分泌。(3)Rab蛋白也与神经元的发育有关，阻断rab基因在幼体神经元内的表达会使树突和轴突的生长受到抑制。(Lukas A et a1.methods inenzymology.vol 257：302-312)(4)应用同源克隆法寻找新的Rab家族成员基因。由于一些相关Rab基因的基序都已弄清楚，各种组织的cDNA文库都已构建完成，这也方便了在cDNA文库中寻找新基因。同时也可在不同的物种，如小鼠，果蝇及植物中搜寻新的Rab基因，并在该物种中探寻基因的功能和应用价值(FANGLAI，et al.Genomics 22，610-616(1994).)。(5)利用酵母双杂交系统寻找与Rab相互作用的蛋白因子的基因，并努力验证其功能。GGTase、REP、GAP、GDF、GDI、GEF等许多因子对于Rab功能发挥起着重要作用，尤其是GGTase-异戊二烯转移酶，催化将异戊二烯基转移至ras蛋白和Rab蛋白的半胱氨酸残基上，修饰后的Rab、ras蛋白才具有正常的功能，所以Galb M.H.称GGTase的抑制物将是极具潜在价值的抗癌药物。最近又发现一种新的作用因子叫Rab亲和蛋白(MonicaArribas，et al.European Journal of cell biology 74，209-216 1997..)，该蛋白可以与Rab蛋白结合，抑制Rab蛋白的GTP水解酶活性从而完全阻断Rab的功能(WilliamH.Brondyk，methods in enzymology.vol 257：200-208)。因此，为治疗目的研究和开发人RAB多肽及其激动剂／抑制剂有重要意义。

本发明的目的是提供一种新的人Rab多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颍的分离出的RABPA多肽，该多肽是人源的，它包含：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80％相同性：(a)编码上述人RABPA多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID No.1中200-838位的序列；和(b)具有SEQ ID No.1中1-920位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述的多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者上述的多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人RABPA活性的多肽的制备方法，该方法包含：(a)在适合表达人RABPA的条件下，培养上述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人RABPA活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人RABPA多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-700个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人RABPA多肽活性的化合物，以及抑制人RABPA多肽的表达的化合物。还提供了筛选和／或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人RABPA多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了上述化合物来调节人RABPA蛋白在体内、体外活性的方法。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人RABPA多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人RABPA多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人RABPA多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人RABPA的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人RABPA多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗AIDS和其它的获得性和遗传性的免疫缺陷病等病症。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了本发明RABPA蛋白的氨基酸序列。采用标准的氨基酸单字母缩写。全长蛋白是213个氨基酸，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为保守的GTP／GDP结合区域。

图2是本发明RABPA蛋白和已知的Rab2蛋白(Q14964)的同源性比较图。上方序列是RABPA蛋白，下方序列是Rab2蛋白(Q14964)。相同氨基酸用“丨”表示，相似氨基酸用“：”或“.”表示。

图3是显示RABPA表达产物的电泳图。图中，从左到右是第一、二泳道分别是空质粒(即含没装基因的PBV220表达载体)的菌体42℃诱导和30℃未诱导蛋白电泳图；第三泳道为标准低分子量蛋白标记物(从上到下分子量分别为97KD、66KD、43KD、31KD、20KD和14KD)；第四、五泳道分别为基因诱导和未诱导电泳图，箭头所指为表达的人RABPA蛋白。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链的，且如果是单链，单链可以是编码链和非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与SEQID NO：1中所示的编码序列相同，也可以是不同的编码序列，但该不同的编码序列(由于基因密码的重复或简并的结果)编码的多肽与SEQID NO：2的相同。编码SEQID NO：2多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和附加编码序列(如前导序列或分泌序列或前蛋白序列)；成熟蛋白的编码序列(和可有可无的附加编码序列)和非编码序列(如成熟多肽的5′和／或3′编码序列的内含子或非编码序列)。

术语“编码多肽的多核苷酸”是指仅为多肽的编码序列的多核苷酸，也指包括附加编码序列和／或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，该变异体编码具有本发明RABPA相同的氨基酸序列的多肽片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是此多核苷酸天然存在的等效变异体或此多核苷酸的非天然存在的变异体。因此，本发明包括编码与RABPA同样的成熟多肽的多核苷酸，还包括这些多核苷酸的变异体，而这些变异体编码本发明所述的多肽的片段、衍生物或类似物。这些核苷酸变异体包括缺失变异体、取代变异体和添加或插入变异体。如上述所示，此多核苷酸可以是SEQID NO：1所示编码序列的天然存在的等位变异体的编码序列。正如本领域所公知的，等位变异体是多核苷酸的替换形式，它可以是一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还包括这样的多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以按相同的阅读框架而融合于某个协助多肽在宿主细胞中表达和分泌的多核苷酸序列(比如，作为分泌序列控制多肽从细胞中运输出来的前导序列)。有前导序列的多肽是一个蛋白原，宿主细胞可以切掉其前导序列，从而形成此多肽的成熟形式。多核苷酸还可以编码一个由成熟蛋白和附加的3′氨基酸残基组成的蛋白原。有序列原的成熟蛋白是蛋白原，是此蛋白的非活性形式。一旦序列原被切除就形成了一个有活性的成熟蛋白。因此，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白，或有序列原的蛋白，或同时具有序列原和前序列(前导序列)的蛋白。

本发明还涉及这样的多核苷酸，即当与上述的序列有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同时可与之杂交的多核苷酸。特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用，“严格条件”这个术语是指只有当序列之间有至少95％和最好至少97％相同时才能杂交。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，与SEQ ID NO：1中200-838位的DNA编码的多肽在生物功能和活性方面实质上相同。

本发明还涉及具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽和这种多肽的片段、类似物和衍生物。

本发明中的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生，根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

当指本发明的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”指保留与此多肽相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括切除蛋白原部分后能被激活以产生活性成熟多肽的蛋白原。本发明的多肽片断、衍生物或类似物可以是(ⅰ)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ⅱ)在一个或多个氨基酸残基中包括一个取代基团的多肽，或(ⅲ)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片断、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

术语“分离的”是指材料从其原始环境分离出来，例如，位于动物体内的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，而从天然系统中的一部分或所有共存材料中分离出来的同样的多核苷酸或多肽就是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，这样的多核苷酸或多肽也可以是组合物的一部分，只要这些载体或组合物不是其天然环境的一部分，则其仍是分离的。

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体制造的遗传工程宿主细胞和用重组技术生产的本发明的多肽的产品。本发明的多核苷酸序列可以包含在用于表达多肽的众多表达载体中的任一种中。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，比如SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、质粒和噬菌体DNA组合衍生而来的载体、病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒。总之，只要能在宿主体内复制存活，任何质粒和载体都可以用。

表达载体最好含有提供筛选转化的宿主细胞的表型性状的基因，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

表达载体中的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子)连接在一起以指导mRNA合成。这类启动子的一些有代表性的例子有：LTR或SV40启动子，E.coli.1ac或trp启动子，噬菌体λPL启动子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中的表达启动子。表达载体还包括有翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。含有上述适当DNA序列和适当启动子或调控序列的载体可以用来转化适当宿主细胞以使宿主表达此蛋白。

宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或是低等真核细胞，如酵母细胞，或是原核细胞，如细菌细胞。适当宿主的一些有代表性的例子有：如大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌；诸如酵母之类的真菌细胞；昆虫细胞，例如果蝇细胞和sf9细胞；动物细胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤细胞；植物细胞等。通过本文的讲授，适当宿主细胞的选择是本领域熟练技术人员所公知的。

适当的DNA序列可以通过各种不同方法插入载体。一般来说，DNA序列通过本领域公知的程序被插入合适的限制性内切酶位点。这些和其他步骤对本领域技术人员是公知的。当合适的宿主被转化并生长到适当的细胞密度后，选用的启动子即可用适当的方法(如温度转换或化学诱导)诱导，细胞再培养一段时间。细胞经离心后收获，用物理或化学的方法破碎细胞，得到的粗提物留作进一步纯化用。破碎包括冻融法、超声波法、机械破碎法、或使用细胞裂解试剂。用硫酸胺或乙醇沉淀，酸抽提，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维层析，疏水相互作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析或植物凝激素层析等方法，可将蛋白从重组细胞培养物中回收并纯化出来。如果需要，可以使用蛋白质再折叠步骤以形成成熟蛋白的构象。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)来完成最后的纯化步骤。

因为Rab基因表达的下降会导致致命的细胞程序性死亡(美国专利5892012)。因此，作为一种新的RAB蛋白，本发明的RABPA多肽或其片段或其衍生物可以用来治疗与细胞程序性死亡相关的疾病，其中包括但不限于：AIDS和其它的获得性和遗传性的免疫缺损病；退行性神经性疾病如老年性痴呆，帕金森病，半侧硬化肌萎缩，色素性视网膜炎，小脑退化，脊髓发育不良综合症如再生障碍性贫血，局部贫血伤害如心肌梗塞、中风和再灌流受伤，毒素引发的疾病如酒精性肝中毒、肝硬变，病毒性感染如丙肝，乙肝和骨硬化病。

RABPA多肽或其片段或其衍生物加到细胞系中可以刺激细胞增殖，还可以借助脂质体、电穿孔等手段直接引入到活体细胞内。

本发明的多肽可以与合适的药用载体组合使用。这种组合物包含治疗有效量的多肽，和药学上可接受的载体或赋型剂。这样的载体包括但不限于：盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘醇、乙醇及其混合物。这些制剂应适合于给药方式。

本发明还提供含有一个或多个容器的药盒或试剂盒，在这些容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的途径给药。RABPA宜以有效地治疗和／或预防具体的适应症的量来给药。给药于患者的RABPA的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、欲治疗者的身体条件和诊断医生的判断。

本发明的多肽、其片段或其衍生物、或其类似物、或表达它们的细胞，可以用作免疫原，用来生产其抗体，用于诊断或用作拮抗剂。这些抗体可以是例如多克隆杭体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合链抗体、单链抗体，和人源化抗体，以及Fab片段，或Fab表达库的产物，可以用本领域各种已知的方法来生产这些抗体和片段。

针对相应于本发明序列的多肽产生的抗体，可以通过直接将多肽注射入动物(优选非人动物)来获得。这样获得的抗体然后会与其多肽结合。在这种方式中，甚至编码多肽片段的序列也可以用来产生结合整个天然多肽的抗体。然后，这些抗体可以用来将多肽从表达此多肽的组织中分离出来。

为制备单克隆杭体，可以使用任何通过连续细胞系培养物而生产抗体的技术，这些技术的例子包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，Nature，256：495-497)，trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，Immuolgy Today 4：72)，和生产人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies andCancer Terapy，Alan R.Liss，Inc.，pp77-96)。

可以对生产单链抗体的技术(USP4，946，778)加以改进，用来生产本发明的免疫多肽产物的单链抗体。

本发明还涉及定量和定位检测RABPA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中检测的RABPA水平可以用作解释RABPA在各种疾病中的重要性和用于诊断与RABPA相关的疾病。

本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)RABPA的药剂的方法。激动剂提高RABPA的生物功能(例如刺激细胞增殖等)，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达RABPA的膜与标记的RABPA一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。

激动剂/抑制剂也可以用在(例如上面所述的)含有药学上可接受载体的组合物中。

本发明的多肽也可以通过在活体表达这些多肽来使用，这通常称作“基因治疗”。例如，患者的细胞可以在体外用编码RABPA多肽的多核苷酸(DNA或RNA)进行基因工程操作，然后将工程化的细胞提供给欲用此多肽治疗的患者。这些方法是本领域熟知的。例如，细胞可以通过使用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒，用本领域已知的基因工程方法操作。

同样，细胞可以在体外经基因工程技术处理，在体内通过例如本领域已知的方法表达RABPA多肽。正如本领域所知的，生产含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞，可以被施用于患者体内，在体内产生工程细胞，并且在体内表达多肽。施用本发明多肽的这些和其它的方法，在本发明的教导基础上，对本领域的技术人员来说是显而易见的。例如，工程细胞的表达载体除了逆转录病毒之外，可以是在与合适的运送载体组合后用来在体内产生工程细胞的腺病毒。

本发明的多核苷酸可用来设计反义DNA或RNA，作为抑制剂治疗和预防与细胞增殖有关的各种紊乱(如肿瘤等)及治疗和预防各种炎症。通过三螺旋体形成或反义DNA或RNA(两方法均是以多核苷酸与DNA或RNA结合为基础)，反义技术可以用来控制基因表达。例如，编码本发明成熟多肽的多核苷酸序列的5′编码部分，可以用来设计约10-40个碱基对长度的反义RNA寡核苷酸。设计DNA寡核苷酸，互补于涉及转录的基因区域(三螺旋体一一参见Lee等，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooney等，Science，241：456(1988)；和Dervan等，Science，251：1360(1991))，由此防止转录和RABPA的产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交，并且阻遏mRNA分子翻译成RABPA。反义RNA和DNA可以转运到细胞，在体内抑制RABPA的产生。另外，反义RNA和DNA可以含磷酸硫脂键或肽脂键以延长其在体内的半衰期。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。

简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。

将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomes：aManual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。

本发明多肽和多核苷酸的其他用途，例如将本发明多肽用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人RABPA的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。根据本发明的教导，这些应用对于本领域技术人员而已是显而易见的。

在本发明的一个实例中，提供一种分离的核苷酸(多核苷酸)它编码具有SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的成熟多肽。本发明的多核苷酸是从18周人胎脑cDNA文库发现的。它含有编码大致213个氨基酸长度的蛋白的开放读框。它结构上与Rab基因(X99962)在核酸水平上73.2％相同；与Rab基因(X99962)编码的蛋白(Q14964)有75.6％相同性和82.6％相似性。本发明的RABPA多肽含有特征基序，参见图2，其中结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区是GTP/GDP结合区域，效应子结构域为GTPase激活蛋白结合区域，下划线为蛋白C端高变区域及CXC结构域。另外，经计算机分析RABPA蛋白的分子量为24566.89道尔顿，等电点为7.43。

此外，由于本发明的人RABPA具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和／或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：人Rabpa基因cDNA的克隆

用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quick mRNA IsolationKit(Qiegene)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBS-SK载体的多克隆位点上，转化DH5c细菌形成cDNA文库。共获得约2800个克隆。用双脱氧法测定所有克隆的5′和3′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个克隆067D10的DNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对067D10克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，067D10克隆所含的全长cDNA是一个新的DNA序列(如SEQ ID NO：1所示)，从第200bp至841bp有一个641bp的ORF，编码一个213个氨基酸的新的蛋白质(如SEQ ID NO：2所示)。我们将此基因命名为人Rabpa基因，所编码的蛋白命名为RABPA蛋白。

实施例2：用RT-PCR方法克隆人Rabpa基因

用胎脑细胞总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA。用Qiagen的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增：正向引物F15-GGAATTCATGGAGGCCAT CTGGCTGTAC-3(SEQ ID NO：3)；反向引物R1：5-GGAAGCTTCATGCCGTATGCAGCAGCCA-3(SEQ ID NO：4)。扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH8.5)，1.5mmol/LMgCl₂，200μmol/L dNTP，各25pmol引物，2.5U的Taq DNA聚合酶。在PE9600型DNA热循环仪上按下列条件反应25个周期：94℃30sec；55℃，30sec；72℃2min。在RT-PCR时同时设β-肌动蛋白为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物QIAGEN试剂盒纯化后，用TA克隆试剂盒连接到pBV220表达载体，并测定DNA序列。结果PCR产物的DNA序列与SEQID NO：1的200-841bp完全相同，并且在两端分别含有EcoRⅠ和HindlⅡ酶切位点。

实施例3 人Rabpa基因的重组表达：

把装有Rabpa基因的pBV220表达载体转入DH5α宿主菌中，通过在LB板上的生长能力识别转化体，筛选出氨苄青霉素抗性菌落。质粒DNA通过限制性分析分离和确定。将含有所需构建物的克隆在补充有Amp(100ug/ml)的LB介质中的液体培养基中生长过夜。用过夜培养物以1∶100-1∶250的比率来接种大量的培养物。将细胞生长到光学密度600(O.，D.60O)为0.4和0.6之间。42℃诱导表达3小时，12％SDS-PAGE胶鉴定表达产物。

因Rabpa基因表达的蛋白在42℃生长环境中不能稳定存在，因此本发明人尝试在表达载体的SD序列后且在新基因起始密码子ATG前插入51bp的人工合成的干扰素寡核苷酸片段(ATGtgctact gccaggaccc gtacgttaaa gaagctgaaa acctggaattc(SEQ ID NO：5)(在SEQ ID NO：5后面为包括ATG在内的920bp的RABPA编码序列))，使干扰素片段与Rabpa基因一起融合表达。实验证明：融合表达的蛋白能稳定存在于细菌体内。蛋白表达电泳图如图3所示。图中，从左到右是第一、二泳道分别是空质粒(即含没装基因的PBV220表达载体)的菌体42℃诱导和30℃未诱导蛋白电泳图；第三泳道为标准低分子量蛋白标记物(从上到下分子量分别为97KD、66KD、43KD、31KD、20KD和14KD)；第四、五泳道分别为基因诱导和未诱导电泳图，箭头所指的就是表达的人RABPA蛋白，分子量约25kDa。

实施例4

人细胞中RABPA的表达方式

进行Northern印迹分析，测定人细胞中RABPA的表达水平。用BNAzolTM B体系(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South Loop East，Houston，TX 77033)分离总细胞RNA样品。从各具体的人组织分离约10ug的总RNA，在1％琼脂糖凝胶上分离，并且印迹到尼龙滤器上(Sambrook，fritsch和Maniatis，Molecular Cloning，Cold SpringHarborPress，(1989)。用Stratagene Prime-It试剂盒，用50ngDNA片段做标记反应。标记的DNA用Select-G-50柱纯化(5 Prime-3 prime，Inc.5603 Arapahoe Road，Boulder，Co80303)。然后，滤器用放射标记的全长RABPA基因，在65℃下，以1，000，000cpm／ml在0.5M NaPO4、pH7.4和7％SDS中杂交过夜。用0.5×SSC、0.1％SDS在室温下冲洗两次和在60℃冲洗两次后，将滤器与强化荧光屏一起暴露在-70℃下。RABPA的信使RNA富含于活化和失活的T细胞、单核细胞和T细胞系中。

实施例4 cDNA克隆的同源检索

用本发明的Rabpa基因的序列及其编码的蛋白序列在Genbank，Swissport等数据库进行同源检索。用于检索的程序叫Blast(Basic local Alignment search tool)(1993 ProcNat Acad Sci 90：5873-5877)，Blast可以找出与Rabpa同源的许多基因，其中与本发明的Rabpa基因同源性最大的基因为一种已知的人RAB蛋白(Genbank准入号为X99962)，X99962编码的蛋白在Genbank的准人号为Q14964。这些检索到的基因或蛋白序列可以从Genbank数据库中调出。调出的序列可以用GCG软件包中的Pileup(多序列)和Gap(两序列)程序做连配比较。结果显示，X99962与067D10具有最高的同源性，在核苷酸水平上之间的相似性为73％。将两者编码的蛋白质进行比较(图2)，结果表明，两者高度同源，其相似性为826.％；相同性为75．5％。

用Pileup程序，将本发明的蛋白与Rab家族基因进行多序列同源比较。结果如图4所示。将本发明的Rabpa编码的蛋白用GCG软件包进行基序(motif)分析，结果表明Rabpa编码的蛋白属于Rab GTPase家族，具有GTPase共有的结构特征。Rabpa编码的蛋白的具体结果特征如图1所示。参见图1，图中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别为GTP/GDP结合区域，效应子结构域为GTPase激活蛋白即效应子结合区域，下划线为蛋白C端高变区域及CXC结构域。

另外经计算机分析，本发明的新的人Rabpa蛋白的分子量为24566.89道尔顿，等电点为7.43。

实施例5抗人RABPA抗体的产生

用多肽合成仪(PE-ABI)合成下述人RABPA特异性的多肽：NH₂-MetGluAlaIleTrpLeuTyrGlnPheArgLeuIleValIleGly-COOH。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白偶合形成复合物，方法参见：Avrameas.Immunochemistry，1969；6：43。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg／ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose 4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与人RABPA结合。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                           序列表

(1)一般信息：(ⅱ)发明名称：新的Rab基因及其编码的多肽(ⅲ)序列数目：5(2)SEQ ID NO：l的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：920bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：1 GCATTTCATC ACCTTTGCGA GCGCAGCATC CATCCCTCCG CTCTCCCGGC51 GCCTGGGCCT ACCCAGCTTC GGGCTCCCAG GCCAGCGATG CGCTCGCGGC101 TGAGCTAGAT CCTGCCGAGC CGCGCTCTCT GAGGCGTCGG CGGGGCGCCC151 CCTCCCGCCG TCCCCGGTCC GGGCCAAGGA GACCTGCAGA GCCGCGGCCA201 TGGAGGCCAT CTGGCTGTAC CAGTTCCGGC TCATTGTCAT CGGGGATTCC251 ACAGTGGGCA AGTCCTGCCT GATCCGCCGC TTCACCGAGG GTCGCTTTGC301 CCAGGTTTCT GACCCCACCG TGGGGGTGGA TTTTTTCTCC CGCTTGGTGG351 AGATCGAGCC AGGAAAAAGC ATCAAGCTCC AGATCTGGGA TACCGCGGGT401 CAAGAGAGGT TCAGATCCAT CACTCGCGCC TACTACAGGA ACTCAGTAGG451 TGGTCTTCTC TTATTTGACA TTACTAACCG CAGGTCCTTC CAGAATGTCC501 ATGAGTGGTT AGAAGAGACC AAAGTACACG TTCAGCCCTA CCAAATTGTA551 TTTGTTCTGG TGGGTCACAA GTGTGACCTG GATACACAGA GGCAAGTGAC601 TCGCCACGAG GCCGAGAAAC TGGCTGCTGC ATACGGCATG AAGTACATTG651 AAACGTCAGC CCGAGATGCC ATTAATGTGG AGAAAGCCTT CACAGACCTG701 ACAAGAGACA TATATGAGCT GGTTAAAAGG GGGGAGATTA CAATCCAGGA751 GGGCTGGGAA GGGGTGAAGA GTGGATTTGT ACCAAATGTG GTTCACTCTT801 CAGAAGAGGT TGTCAAATCA GAGAGGAGAT GTTTGTGCTA GTCAGTTCTT851 TTATTTCCAA AACATGCTCT CCTACTTGAA CTGAAAAGTA AGAGAAATAA901 ATAGAATCTT TGTGTAACTG(2)SEQ ID NO：2的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：213个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：多肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Glu Ala Ile Trp Leu Tyr Gln Phe Arg Leu Ile Val Ile Gly 15Asp Ser Thr Val Gly Lys Ser Cys Leu Ile Arg Arg Phe Thr Glu 30Gly Arg Phe Ala Gln Val Ser Asp Pro Tnr Val Gly Val Asp Phe 45Phe Ser Arg Leu Val Glu Ile Glu Pro Gly Lys Thr Ile Lys Leu 60Gln Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Ser Ile Thr 75Arg Ala Tyr Tyr Arg Ash Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Phe Asp 90Ile Thr Ash Arg Arg Ser Phe Gln Ash Val His Glu Trp Leu Glu 105Glu Thr Lys Val His Val Gln Pro Tyr Gln Ile Val Phe Val Leu 120Val Gly His Lys Cys Asp Leu Asp Thr Gln Arg Gln Val Thr Arg 135His Glu Ala Glu Lys Leu Ala Ala Ala Tyr Gly Met Lys Tyr Ile 150Glu Thr Ser Ala Arg Asp Ala Ile Ash Val Glu Lys Ala Phe Thr 165Asp Leu Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Leu Val Lys Arg G1y Glu Ile 180Thr Ile Gln Glu Gly Trp Glu Gly Val Lys Ser Gly Phe Val Pro 195Ash Val Val His Ser Ser Glu Glu Val Val Lys Ser Glu Arg Arg 210Cys Leu Cys                                                 213(2)SEQ ID NO：3的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：28碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3GGAATTCATG GAGGCCATCT GGCTGTAC                                       28(2)SEQ ID NO：4的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：28碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：4：GGAAGCTTCA TGCCGTATGC AGCAGCCA                                     28(2)SEQ ID NO：5的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：51碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：ATGTGCTACT GCCAGGACCC GTACGTTAAA GAAGCTGAAA ACCTGGAATT C           51

Claims (17)

1．一种分离的人RABPA多肽，它包含：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

2．如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。

3．一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80％相同性：

(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽。

5．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID No.1中200-838位的序列；

(b)具有SEQ ID No.1中1-920位的序列。

6．一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7．一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞：

(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

8．一种具有人RABPA活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达人RABPA的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有人RABPA活性的多肽。

9．一种能与权利要求1所述的人RABPA多肽特异性结合的抗体。

10．一种核酸分子，它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-700个核苷酸。

11．一种化合物，其特征在于，它选自下组：

(a)模拟权利要求1所述多肽的活性的化合物，

(b)促进权利要求1所述多肽的活性的化合物，

(c)拮抗权利要求1所述多肽的活性的化合物，

(d)抑制权利要求1所述多肽的表达的化合物。

12．如权利要求11所述的化合物，其特征在于，它是SEQID NO：1所示的多核苷酸序列或其片段的反义序列。

13．一种应用权利要求11所述化合物来调节人RABPA蛋白在体内、体外活性的方法。

14．一种检测与权利要求1所述的多肽异常表达相关的疾病或疾病的易感性的方法，其特征在于，包括检测编码所述多肽的核酸序列中的突变。

15．如权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于筛选促进人RABPA多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人RABPA多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。

16．如权利要求10所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

17．一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的人RABPA多肽以及药学上可接受的载体。

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