CN1281960C - 一种测定鲎试剂灵敏度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细菌内毒素的检测，具体地说是一种测定鲎试剂的灵敏度的方法，1)采用同一个浓度的标准内毒素，在内毒素测定仪上，分别对不同灵敏度的标准鲎试剂进行重复试验，得到相应的特征反应时间的均值和标准差；2)待测灵敏度的鲎试剂，与同一个浓度的标准内毒素反应并得到相应的特征反应时间，将该反应时间与不同灵敏度的标准鲎试剂的反应时间的均值和标准差进行比较，判断并得到待测鲎试剂的灵敏度。本发明的优点是快速、准确、应用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及细菌内毒素的检测，具体地说是一种测定鲎试剂灵敏度的方法。
背景技术
细菌内毒素(Bacterial Endotoxin)是革兰氏阴性细菌所产生的具有各种生物活性的大分子物质，其主要化学成分为脂多糖(LPS)；内毒素是注射剂药品(原料等)中的主要污染物质。
细菌内毒素的检测方法有家兔试验法、鲎试验法。鲎试验法(LimulusAmebocyte Lysate，LAL，或Tachypleus Amebocyte Lysate，TAL)是利用鲎试剂与内毒素发生凝集反应的机理，以定性或定量检测药品或机体血液中的感染细菌内毒素的一种体外检测方法。采用产色或产萤光的肽型化合物，用于分析内毒素，化合物结构R1-A1-A2-A3-A4-B-R2，R2代表产色或产萤光基团；内毒素激活LAL的酶，酶水解肽型化合物生成颜色[文献1.美国专利：名称为Peptide-type substrates useful in the quantitative determination ofendotoxin.专利号为：US4510241]；利用内毒素的脂多糖与多粘菌素或八肽或类似的环肽的相互作用来测定内毒素，环肽或脂多糖上标记酶以供进一步检测[文献2.欧洲专利：名称为Endotoxin assay.专利号为EP0265127]；用于鲎试剂测定用的肽型化合物，结构X-A1-A2-A3-B-R，A1-A2-A3是氨基酸，B是酰胺混合物，R与鲎试剂反应释放后产生氨基，进一步形成可见颜色[文献3.欧洲专利：名称为Peptide substrates and method for thequantitative assay of endotoxin.专利号为EP0228666]；一种用鲎血液变形细胞溶解物的试剂，及其测定含丝氨酸蛋白酶样品中内毒素的方法[文献4.中国专利：名称为用于内毒素测定的试剂以及使用该试剂进行测定的方法，专利号为ZL94103286.8]；用于内毒素特异性鉴别的含有鲎变形细胞溶解物试剂和烷基葡糖苷的试剂，及使用该试剂特异性鉴别样品中内毒素的方法[文献5.中国专利：名称为用于内毒素特异性鉴别的试剂，专利号为ZL94117898.6]；一种鲎试剂细菌内毒素快检盒及使用方法，是按细菌内毒素检查法所需的鲎试剂、内毒素、溶解液、移液滴管等有关用具经特殊处理后，分套包装成试剂盒，简化实验操作[文献6.中国专利：名称为鲎试剂细菌内毒素快检盒及使用方法，专利号为ZL95115774.4]；一种鲎试剂的活性定向生产工艺，制得鲎试剂不易受污染，灵敏度高，自身空白阴性观察时间长，产品稳定性高[文献7.中国专利：专利号为ZL95105652.2]；一种通过鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应实现对水中细菌毒素含量进行限量测定的仪器[文献8.中国专利：名称为一种细菌内毒素测定仪，专利号为ZL95216488.4]，它具有结构简单、成本低廉、操作方便、检测判定结果可靠以及符合药典规定等诸多优点。
利用动态比浊法和动态比色法原理，可以采用仪器来定量测定内毒素的浓度C，即在鲎试剂反应过程中，观察其浊度变化曲线或产色物质的颜色变化曲线，预设一个吸光度OD值如OD0.02或拐点，以反应曲线从开始上升到该预设值时经历的时间作为反应时间(T(OD0.02)或T50，秒)，该反应时间的对数与内毒素浓度的对数呈线性关系，即标准曲线为LogT(OD0.02)＝a+b LogC或者Log T50＝a+b LogC，通过与标准曲线的比较来计算样品中的内毒素浓度。国内外常用的相应的检测仪器有美国LAL-5000型、日本和光Toxinometer ET-201系列、国内金山川EDS-98，MB-80系列检测系统及天大BET-32系列检测系统。
采用鲎试验法，不管是定性还是定量测定内毒素的含量，鲎试剂灵敏度的准确性是至关重要的；常规的鲎试剂灵敏度的测定方法是限量法：分别进行预测定和正式测定，需要将细菌内毒素工作标准品等比稀释为至少4个浓度，每个浓度做4个管，所用标准品多，试验准备耗时长；反应保温时间为60±2分钟，反应时间长；观察结果用目测法，容易出现人为误差；内毒素的回收率在50-200％之间，范围宽。
发明内容
本发明的目的是，提供一种测定鲎试剂灵敏度的方法，以准确、快速地测定鲎试剂的灵敏度，解决了测定鲎试剂灵敏度的方法稳定性问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
1)采用同一个浓度的标准内毒素，在内毒素测定仪上，分别对不同灵敏度的标准鲎试剂进行重复试验，得到相应的特征反应时间的均值和标准差；
2)待测灵敏度的鲎试剂，与同一个浓度的标准内毒素反应并得到相应的特征反应时间，将该反应时间与不同灵敏度的标准鲎试剂的反应时间的均值和标准差进行比较，判断并得到待测鲎试剂的灵敏度。
内毒素测定仪是采用动态比浊法或动态比色法定量测定内毒素，得到相应的不同灵敏度鲎试剂的相应的反应时间的均值和标准差；所述动态比浊法为OD限值法、透光率限值法或T50归一化法；标准鲎试剂灵敏度范围最好为0.01～0.5EU/ml；未知鲎试剂的灵敏度范围最好在0.01～0.5EU/ml；待测灵敏度的鲎试剂，与一个或多个浓度的标准内毒素反应，得到相应的反应时间，该反应时间为200～8000秒；最好为470～3600秒。
本发明具有如下优点：
1.快速。本发明采用定量法来测定鲎试剂的灵敏度，由于利用其定量测定的原理，采用同一个浓度的标准内毒素，在内毒素测定仪上，分别对不同灵敏度的标准鲎试剂进行重复试验，得到相应的反应时间的均值和标准差，然后采用同一浓度的内毒素标准即可完成鲎试剂灵敏度的测定，试验准备耗时短。另外，在内毒素测定仪器上，采用鲎试剂直接测定内毒素，最少试验10分钟即可得到相应的数据，用于鲎试剂灵敏度的计算，反应时间短。
2.准确。本发明可以利用已有的内毒素测定仪器，实现鲎试剂灵敏度的准确、定量化测定，计算的鲎试剂的灵敏度精确。观察结果用仪器测定吸光度法，结果客观、准确。
3.应用范围广。本发明可应用于动态比浊法和动态比色法，可望应用于科研、药品生产检验、鲎试剂的生产过程监控和质量控制等，为药品中内毒素的测定提供更科学、客观的方法。
附图说明
图1为采用7.3EU/ml的内毒素标准品，分别与不同灵敏度的鲎试剂反应特征反应时间结果示意图。
图2为采用不同的内毒素标准品，分别与0.06EU/ml灵敏度的鲎试剂反应特征反应时间结果示意图。
具体实施方式
实施例1.
1)单一浓度标准内毒素对不同鲎试剂的试验
采用标准内毒素浓度30EU/ml，分别对灵敏度为0.01EU/ml的标准鲎试剂进行三次重复试验，得到相应的反应时间T(OD0.02)的均值及其标准差(1)350±80(秒)；
采用标准内毒素浓度4.4EU/ml，分别对灵敏度为0.06EU/ml的标准鲎试剂进行五次重复试验，得到相应的反应时间T(OD0.02)的均值及其标准差(2)775±50(秒)；
采用标准内毒素浓度2.2EU/ml，分别对灵敏度为0.125EU/ml的标准鲎试剂进行三次重复试验，得到相应的反应时间T(OD0.02)的均值及其标准差(3)1035±120(秒)；
采用标准内毒素浓度4.4EU/ml，分别对灵敏度为0.25EU/ml的标准鲎试剂进行二次重复试验，得到相应的反应时间T(OD0.02)的均值及其标准差(4)1100±71(秒)；
采用标准内毒素浓度2.2EU/ml，分别对灵敏度为0.5EU/ml的标准鲎试剂进行七次重复试验，得到相应的反应时间T(OD0.02)的均值及其标准差(5)1450±180(秒)；
采用7.3EU/ml的内毒素标准品，分别与0.01、0.06、0.125、0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂反应，重复三次，得到特征反应时间，其平均值和标准差(秒)分别为：480±14；590±20；637±12；937±21；(见图1所示)
采用22、7.3、3.7、1.8EU/ml EU/ml的内毒素标准品，分别与0.06EU/ml灵敏度的鲎试剂反应，重复三次，得到特征反应时间，其平均值和标准差(秒)分别为：450±20；590±20；877±15；1193±51；(见图2所示)
2)鲎试剂的灵敏度测定
采用标准内毒素浓度4.4EU/ml，对待测鲎试剂1进行试验，得到反应时间T(OD0.02)值为820秒，在(2)的反应时间范围内，所以鲎试剂1的灵敏度是0.06EU/ml。
比较例1.
常规的鲎试剂灵敏度的测定方法是限量法，需要进行预测定和正式测定，需要将细菌内毒素工作标准品以2倍等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个边界稀释液，每一稀释液作4个管，且其最高浓度的4个管应均为阳性、最低浓度的4个管应均为阴性，轻轻振动上述试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃水浴中，保温60±2分钟观察结果并按要求计算本批鲎试剂灵敏度(λ)，内毒素的回收率在50～200％之间；即将不同浓度的标准内毒素与鲎试剂在37℃保温反应1小时，根据目测是否出现凝胶来判断、计算鲎试剂灵敏度。
Claims (6)
1.一种测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于：
1)采用同一个浓度的标准内毒素，在内毒素测定仪上，分别对不同灵敏度的标准鲎试剂进行重复试验，得到相应的特征反应时间的均值和标准差，标准鲎试剂灵敏度范围为0.01～0.5EU/ml；
2)待测灵敏度的鲎试剂，与同一个浓度的标准内毒素反应并得到相应的特征反应时间，将该反应时间与不同灵敏度的标准鲎试剂的反应时间的均值和标准差进行比较，判断并得到待测鲎试剂的灵敏度。
2.按照权利要求1所述的一种测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于：内毒素测定仪是采用动态比浊法或动态比色法定量测定内毒素，得到相应的不同灵敏度鲎试剂的相应的反应时间的均值和标准差。
3.按照权利要求2所述的一种测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于：所述动态比浊法为OD限值法、透光率限值法或T50归一化法。
4.按照权利要求1所述的一种测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于：未知鲎试剂的灵敏度范围在0.01～0.5EU/ml。
5.按照权利要求1所述的一种测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于：待测灵敏度的鲎试剂，与一个或多个浓度的标准内毒素反应，得到相应的反应时间，该反应时间为200～8000秒。
6.按照权利要求5所述的一种测定鲎试剂的灵敏度的方法，其特征在于：所述反应时间为470～3600秒。
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