CN1265706A - 用于制备氨苄青霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制备氨苄青霉素的方法,其中用苯基甘氨酸衍生物使6－氨基青霉烷酸(6－APA)进行酶酰化反应,反应混合物中所含6－APA与氨苄青霉素的总浓度大于250mM,溶液中6－APA的浓度被保持在低于300mM的水平且所用酰化剂与6－APA的摩尔比小于2.5。

Description

用于制备氨苄青霉素的方法
本发明涉及一种用于制备氨苄青霉素的方法，其中用苯基甘氨酸衍生物使6-氨基青霉烷酸(6-APA)进行酶酰化反应，反应混合物中所含6-APA与氨苄青霉素的总浓度大于250mM，溶液中6-APA的浓度被保持在低于300mM的水平且所用酰化剂与6-APA的摩尔比小于2.5。
WO-A-92/01061中描述了以高浓度的酰化剂与b-内酰胺衍生物通过b-内酰胺环、例如6-APA的酶酰化作用来制备b-内酰胺衍生物、包括氨苄青霉素的方法。将b-内酰胺环的浓度保持在相对较低的水平。从这些实例中可以推断以高摩尔比的酰化剂与b-内酰胺环可以实现高转化率，而以低摩尔比的酰化剂与b-内酰胺环则可以达到显著低的转化率。使用高摩尔比的酰化剂与b-内酰胺环的缺陷在于由于酰化剂的水解作用而导致的大量酰化剂的缺失。此外，已经发现在酶酰化反应后获得的反应混合物中含有的相当大量的D-苯基甘氨酸(相对于氨苄青霉素来说)会妨碍氨苄青霉素的改良，结果是可以分离较小量的氨苄青霉素。
已经发现：为在本方法中实现高转化率，非常重要的是能够在高浓度下、且由此在高浓度的b-内酰胺环条件下进行反应。
WO-A-96/02663中描述了一种方法，其中b-内酰胺环的酶酰化反应在恒定浓度的反应剂下进行。在本文所述的连续方法中，目的是达到最高可接受水平的两种反应剂浓度。
然而，已经发现：与在制备其它b-内酰胺衍生物、诸如头孢氨苄中可以实现的转化率相比，当在高浓度的6-APA下进行氨苄青霉素的制备时，仅能实现相对低的转化率。
目前申请人意外地发现：通过确保将反应混合物中含有的可溶形式的6-APA的浓度保持相对较低，所实现的转化率可以比选择尽可能高的溶解的6-APA的浓度时的转化率要高。此外，发现当将溶解的6-APA的浓度保持较低时反应混合物的可搅拌性相对更好。
在本发明的上下文中，“转化率”指的是所形成的氨苄青霉素与所用的6-APA的量的摩尔比。将溶解的6-APA的浓度表示为用摩尔表示的6-APA的量/kg反应混合物；将6-APA与氨苄青霉素的总浓度(溶解的和未溶解的)表示为用摩尔表示的6-APA与氨苄青霉素的量/kg的总反应混合物；除溶液外，总反应混合物可以含有许多固体物质，例如6-APA、氨苄青霉素、苯基甘氨酸和固定化酶。
酰化剂与6-APA的摩尔比、即所添加的苯基甘氨酸衍生物的总量除以所添加的6-APA的总量(均用摩尔表示)小于2.5。优选所述的摩尔比在1.0-2.0之间。特别是在1.2-1.8之间。
优选酶酰化反应以分批工艺进行。如果需要，也能够在顺序控制溶解的6-APA的浓度的条件下使反应连续进行。
在本发明的方法中，使得反应混合物中6-APA与氨苄青霉素(溶解的和未溶解的形式)的总浓度高于250mM，优选高于300mM，1，且特别是高于350mM。
在制备氨苄青霉素的过程中，基本上将溶解的6-APA的浓度保持在低于300mM的水平。在高浓度酰化剂下，如果必要，可以将溶解的6-APA的浓度选择为高于低浓度酰化剂下选择的溶解的6-APA的浓度。这是因为在高浓度酰化剂下的反应速率较高，即高浓度溶解形式的6-APA仅能存在相对较短的时间。
可以以不同方式将反应混合物中所含溶解形式的6-APA的浓度保持在较低的水平。保持溶解的6-APA的浓度较低的一种可能性是仅在开始阶段加入6-APA总量的一部分并在反应过程中添加其余的部分。然而，这种方法的缺陷在于必须将6-APA作为固体添加-这产生实际的难题。结果是优选在反应的开始时最初以分批法加入6-APA的总量，此后，在酶酰化反应过程中，反应混合物中6-APA的浓度会降低且氨苄青霉素的浓度会提高。不过，实现较低浓度溶解的6-APA的合适方法是、例如与反应剂达到最高溶解度时的pH相比将pH保持在较低值。将溶解形式的6-APA浓度保持较低的一种特别合适的方法是、例如确保将苯基甘氨酸衍生物的浓度保持在较低的水平，该方法例如通过在反应过程中部分量入(metering in)苯基甘氨酸衍生物来实现。
实际上，已经发现当将苯基甘氨酸衍生物的浓度保持较低时，几乎没有6-APA进入溶液，使得通过量入苯基甘氨酸衍生物可以控制溶液中6-APA的浓度。
可以将活化形式的苯基甘氨酸例如一种酰胺或一种酯、特别是一种甲酯用作(酶)酰化反应中的酰化剂。优选使用D-苯基甘氨酸酰胺(PGA)。
如果将PGA以一种其盐的形式、优选PGA与一种无机酸的盐、例如PGA.HCl、PGA.1/2H2SO4和PGA.HNO3来添加，那么会获得一种特别合适的实施方案。在这种方式中，实际上能够以一种简单的方式通过保持pH恒定来实现PGA的最佳添加量。优选使用PGA.1/2H2SO4，因为这种盐具有很高的溶解度。
酶酰化反应一般在低于40℃的温度下进行，优选-5℃-35℃。所述的酶酰化反应一般在5.5-8.0的pH下进行，优选6.0-6.8。
原则上可以将适合用作连接反应中的催化剂的任何酶用作这种酶。这类酶例如是公知为一般名称是青霉素酰胺酶或青霉素酰基转移酶的酶类。例如J.G.Shewale等在《生物化学方法》(ProcessBiochemistry)1989年8月，pp 146-154页和J.G.Shewale等在《国际生物化学方法》(Process Biochemistry International)1990年6月，pp.97-103中描述了这类酶。合适的酶的实例是来源于下列菌的酶类：醋杆菌属、特别是巴斯德氏醋杆菌；气单胞菌属；产碱杆菌属、特别是粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、Aphanocladium；芽孢杆菌属、特别是巨大芽孢杆菌；头孢属；埃希氏杆菌属、特别是大肠杆菌；黄杆菌属；镰孢属、特别是尖孢镰孢和茄病镰孢；克吕沃尔氏菌属；枝动菌属；鱼精蛋白杆菌属；变形菌属、特别是雷脱茄氏变形菌；假单胞菌属和黄单胞菌属、特别是柑桔黄单胞菌(Xanthomonas citrii)。
优选使用一种固定化酶，因为可以将这种酶简单地分离并再利用。合适的固定技术例如在EP-A-222462中所述。另一种合适的技术包括在一种载体上固定青霉素G酰基转移酶的步骤，其中所述的载体含有一种胶凝剂、例如明胶和一种带有游离氨基的聚合物、例如藻酸胺、脱乙酰壳多糖或聚乙烯亚胺(polyethylenimine)。此外，还可以使用结晶形式的酶(CLEC’sTM)。
在商购的固定化酶中，发现下列酶是特别合适的：例如来自Boehringer Mannheim GmbH的大肠杆菌酶，它商购的商品名为Enzygel；来自Recordati的固定化青霉素-G酰基转移酶和来自Pharma Biotechnology，Hannover的固定化青霉素-G酰基转移酶。
(酶)酰化反应和反应混合物的进一步改良实际上通常在水中进行。如果需要，反应混合物还可以含有一种有机溶剂或一种有机溶剂的混合物、优选小于30％(体积)。可以使用的有机溶剂的实例是：带有1-7个碳原子的醇类，例如一醇、特别是甲醇或乙醇；二醇、特别是乙二醇；或者三醇、特别是甘油。
当已经实现接近最高转化率时在大多数情况下优选终止反应。用于实现这一目的的合适的实施方案是降低pH，优选将pH降至4.0-6.3，特别是5.0-5.7。另一种合适的实施方案是一旦达到最高转化率就降低反应混合物的温度。也能够将两种实施方案合并使用。
在大多数情况下达到最高转化率时将反应终止后，反应混合物通常以一种悬浮液的形式存在，它含有几种固体物质，例如氨苄青霉素、D-苯基甘氨酸和固定化酶。就反应的经济性来说，优选回收所述的固定化酶。进行这一过程的合适方式是例如通过一种筛来过滤反应混合物，同时优选用定向旋转的搅拌器来进行搅拌，以便将所述的悬浮液向上压至搅拌器的中心部分。随后例如通过pH调节器可以回收有价值的成分，例如AMPI和PG。遗留的母液中仅含有少量的副产物，且如果需要可以随后将它们进行再循环。
在本发明的上下文中，各种成分可以以游离形式或作为盐存在于反应混合物中。所述的pH值通常指的是用在室温下校准的pH电极测定的pH值。
本发明通过实施例来进一步进行解释，然而，它们不用来限定本发明。
缩写：
AMPI.3H2O＝氨苄青霉素三水合物
6-APA     ＝6-氨基青霉烷酸
PGA       ＝D-苯基甘氨酸酰胺
PG        ＝D-苯基甘氨酸
AssemblaseTM是一种来源于如WO-A-97/04086中所述的大肠杆菌ATCC1105的固定化大肠杆菌青霉素酰基转移酶。固定方法如EP-A-222462中所述进行，将明胶和脱乙酰壳多糖用作胶凝剂并将戊二醛用作交联剂。用已添加到活化小颗粒中的酶的量来测定大肠杆菌青霉素酰基转移酶的总活性且等于3 ASU/g干重，将1 ASU(阿莫西林合成单位)定义为每小时由6-APA和D-p-羟苯基甘氨酸甲酯(HPGM)生成1g的阿莫西林。3H2O的酶的量(在20℃下，6.5％的6-APA和6.5％的HPGM)。
实施例I
PGA.1/2H2SO4溶液的制备。
在T＝5℃下将301.6g的PGA(2.00mol)悬浮于650g的水中。在1小时的期限内逐滴加入102.1g、96％H2SO4(1.00mol)，同时搅拌，通过冷却将温度保持在T＜25℃。
实施例II
氨苄青霉素的合成
将300g净重(net wet)的Assemblase填入一种安装了带有175μm筛目的筛底的酶反应器(1.5l，直径11cm)中。
向制备反应器(1.2l)中添加131.6g的6-APA(0.600mol)、30.2g的PGA(0.200mol)和400ml的水(T＝10℃)。在T＝10℃下将该混合物搅拌15分钟且然后将其在时间t＝0时转入装有100ml水(T＝10℃)的酶反应器中。
在t＝0时，启动所述酶反应器中的搅拌器。在283分钟的期限内以恒定的速度加入423.7g(0.800mol)的PGA.1/2H2SO4溶液，同时将温度保持在10℃。pH约为6.3。从t＝328分钟开始，通过用6N(含水)H2SO4滴定将pH保持在6.3。在t＝540分钟时氨苄青霉素的量为最大值且通过加入6N的H2SO4使pH降至5.6。
目前酶反应器中含有：
575mmol的AMPI(＝相当于所用6-APA量的96％)
15mmol的6-APA
50mmol的PGA
365mmol的PG
反应过程中的浓度如图1中所示。
比较实验A
氨苄青霉素的合成
将300g净重(net wet)的Assemblase填入一种安装了带有175μm筛目的筛底的酶反应器(1.5l，直径11cm)中。
在10℃下向制备反应器(1.2l)中添加溶于500ml水的143.2g(0.950mol)PGA。在10℃下15分钟的期限内以小量方式添加131.6g的6-APA(0.600mol)，同时冷却，而通过用6N(含水)H2SO4滴定将pH保持在7.0。总计需要54.5ml的6N H2SO4。在T＝10℃下将混合物搅拌15分钟且然后在时间t＝0时转入装有100ml水(T＝10℃)的酶反应器中。在t＝10时起动酶反应器中的搅拌器。通过用6N的H2SO4滴定将pH保持在7.0。使温度保持在10℃。在t＝160分钟时氨苄青霉素的量为最大值且通过加入6N的H2SO4使pH降至5.6。总计向所述的酶反应器中添加147.6ml的6N H2SO4。所述的混合物相对较粘而难以搅拌。
目前酶反应器中含有：
551mmol的AMPI(＝相当于所用6-APA量的92％)
24mmol的6-APA
50mmol的PGA
330mmol的PG
反应过程中的浓度如图2中所示。

Claims (10)

1.用于制备氨苄青霉素的方法，其中用苯基甘氨酸衍生物使6-氨基青霉烷酸(6-APA)进行酶酰化反应，反应混合物中所含6-APA与氨苄青霉素的总浓度大于250mM，溶液中6-APA的浓度被保持在低于300mM的水平且所用酰化剂与6-APA的摩尔比小于2.5。
2.根据权利要求1的方法，其中反应混合物中所含6-APA与氨苄青霉素之和的浓度大于300mM。
3.根据权利要求1或2的方法，其中溶液中6-PAP的浓度被保持在低于250mM的水平。
4.根据权利要求1-3中任意一项的方法，其中所用总酰化剂与6-APA的摩尔比小于2.0。
5.根据权利要求1-4中任意一项的方法，其特征在于在酶酰化反应过程中部分量入6-APA和/或苯基甘氨酸衍生物。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于将苯基甘氨酸衍生物作为D-苯基甘氨酸酰胺与一种酸的盐的形式量入。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于将苯基甘氨酸衍生物以D-苯基甘氨酸酰胺。1/2 H2SO4水溶液的形式量入。
8.根据权利要求5-7中任意一项的方法，其特征在于通过测定pH来控制苯基甘氨酸衍生物的添加量。
9.根据权利要求1-8中任意一项的方法，其特征在于一旦达到接近最高转化率就降低反应混合物的pH。
10.根据权利要求1-9中任意一项的方法，其特征在于一旦达到接近最高转化率就降低反应混合物的温度。
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