CN1263869C

CN1263869C - 病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法

Info

Publication number: CN1263869C
Application number: CNB031114520A
Authority: CN
Inventors: 赵雨杰; 何群; 侯伟健; 张玉魁; 王绍成; 潘忠诚; 王天骄; 马佳明; 马汝海
Original assignee: Individual
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2003-04-14
Filing date: 2003-04-14
Publication date: 2006-07-12
Anticipated expiration: 2023-04-14
Also published as: CN1515689A

Abstract

本发明涉及医学体外诊断技术，具体地讲是一种基因芯片——病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法。它是在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定有甲、乙、丙、丁、戊、庚、TTV七种类型的肝炎病毒型及亚型的特异性探针，同时另设有质控探针和多个乙型肝炎耐药分析探针。利用相应探针与经扩增并加入荧光标记的肝炎病毒DNA或cDNA杂交，经扫描仪扫描芯片，并对杂交信号进行分析，获得有关信息。这种芯片能同时检测七种病毒性肝炎，并分析其亚型及耐药特性，具有诊断快速准确、特异性高、信息量大的特点，对临床诊断和流行病学筛查都有很大帮助。

Description

病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法

一、技术领域：本发明涉及医学体外诊断技术，具体的讲是一种基因芯片——病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法。

二、背景技术：病毒性肝炎是一种发病率极高、对人类健康危害极大的传染性疾病，目前发现的就有甲、乙、丙、丁、戊、庚、TTV七种类型，以及由这些病毒感染引起的肝硬化、肝癌等。我国是肝炎的高发区，全国仅乙型肝炎病毒感染者达1.3亿以上，每年的发病率在6000万人次。有资料表明，乙型肝炎特定基因变异与病毒耐药有很大相关性。因此，对病毒性肝炎快速、有效的诊断是预防和治疗肝炎的必要条件。

目前在临床上已开展的实验室诊断方法主要有三大类，即组织培养法、免疫学方法(酶联免疫吸附ELISA和放射免疫法RIA)以及基因诊断技术(斑点杂交和聚合酶链反应PCR)。这些方法对病毒性肝炎的诊断起到了非常积极的作用，但存在不足之处：(1)组织培养法对实验室条件要求高，周期长，而且只能区分病毒的种；(2)ELISA和RIA检验往往只能间接推测病毒在体内的感染状况，不能直接判断病毒是否存在以及存在数量；(3)PCR和斑点杂交虽可直接检测病毒基因组本身，甚至可以用来分析基因型和变异株，但由于对仪器、试剂及场地等要求条件较高，以及方法学上尚有欠妥之处，难以标准化导致符合率差等原因而被国家暂时取消，并且从目前已获得的结果看，各实验室之间利用基因诊断技术检测肝炎病毒的结果很难取得一致，也缺乏统一的标准；(4)而且，所有这些方法都有一大缺陷，就是效率低。一次只能检测一种病原体或某种病原体的一项指标。而现实的情况是，多种肝炎病毒可同时存在并感染人体。为此，急需发展一种标准化的程序和方法，并能够一次性地诊断出所感染的微生物的种类，以利于正确、快速地采取治疗措施。

三、发明内容：

1、发明目的：本发明提供一种病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片及其制备工艺和使用方法，其目的在于解决病毒性肝炎的检测对实验室条件、仪器、试剂要求高、检测效率低、诊断不准确等方面存在的问题。

2、技术方案：本发明是通过以下技术方案来加以实现的：

一种病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片，其特征在于：该芯片为玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，依次分别固定有甲、乙、丙、丁、戊、庚、TTV七种类型的病毒型肝炎及其常见亚型的探针；在该芯片的微阵列中，设有质控探针和多个乙肝耐药分析探针；探针的大小为15-20个碱基，设计75个探针，所设计的探针序列见下文；

本发明制备工艺按如下步骤进行：

(1)、病毒性肝炎特异性探针和引物；

从数据库中获得可靠的病毒基因序列以及耐药特征序列，根据所述的探针序列设计探针；

从数据库中获得可靠的病毒基因序列以及耐药特征序列，用引物

5′-GTTGCTGTACAAAACCT，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`反转录扩增甲型肝炎病毒670-890cDNA序列，选择5`-caaatgctatgttgtccactgagtc，5`-caaatgccatgttgtccactg甲型肝炎病毒cDNA序列为寡核苷酸探针，对待测血样的预处理过程中，检测所有的甲型肝炎病毒；用引物5`-GTGCCATTTGTTCAGTG，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`扩增乙型肝炎病毒的部分S基因686-991片断，利用33个寡核苷酸探针鉴别乙肝病毒acute、chronic、adr、adyw、carcinoma、negtive、anti-drug、adw2、adw、wild、ayw基因亚型。采用巢式PCR对丙型肝炎病毒的反转录产物进行扩增，用两对引物5`-GGCGACACTCCACCATAGATC、TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`，5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG、AACACCATGACGGACTATCCCA-5`扩增丙型肝炎病毒33-290序列片断；用寡核苷酸探针5`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC、5`-TGGATCAACCCGCTCAATG鉴别丙型病毒肝炎病毒特征序列；用引物5`-CCTTCAGCGAACAGAG、TGAATAGCAGGGGTGT-5`反转录扩增丁型肝炎病毒321-502cDNA序列片断，用十个寡核苷酸探针鉴别丁肝病毒Acute、Quebec、Venezuela、Italy、C.A.P、African、Smalian、TW2476基因亚型；用引物5`-CGGTCAGCCGTCTG、CGAACCGCACTGGT-5`反转录扩增戊型肝炎病毒的cDNA5212-5415基因片断，选取四个寡核苷酸探针鉴别戊肝Chinese、JRA1、Indian基因亚型；用引物5`-TGGTAGGTCGTAAATCC、ACTGTTCCTGGTCACC-5`反转录扩增庚型肝炎病毒cDNA 136-401基因片断，选取五条寡核苷酸探针鉴别Iowan、China、HGVCN、USA、PNF2161庚肝病毒的基因亚型；筛选引物5`-CTGCAATCCATGTATGAT、ACCATGTCTCCTTGTCATAT-5`反转录扩增TTV病毒cDNA1393-1697序列片断，用寡核苷酸探针5`-AGCAACAACATGGGCATCATAC、5`-AGCAACAACATGGGGATCATAC识别TTV病毒基因序列。

(2)、合成探针；

(3)、制备芯片；

用去离子水将合成的探针溶解，得到浓度为200mmol/l的溶液，在玻璃基片上进行点样；点好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时；以探针缓冲液及蒸馏水冲洗玻片，吹干；以封闭液封闭玻片，之后洗涤3次，吹干备用。

对待测血样的预处理过程中，PCR扩增引物序列见下文；

在合成探针的步骤中，探针5’端加氨基修饰。

点样中点的大小为50-100微米。

探针缓冲液为1xSSC，0.1％SDS；封闭液为1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。

对上述检测芯片的使用方法按如下步骤进行：

(1).处理样品；

取准备好的病人脑脊液少量，分别提取DNA，备用；如需长时间放置，在-20℃下冻存；

(2).PCR扩增

在反应管中加入扩增反应混合物-Taq酶，相应的处理好的样品和引物，足量的dNTP以及荧光素Cy3标记的dUTP；扩增条件如下：

94℃ 5min

94℃ 30sec

56℃ 30sec

72℃ 1min

72℃ 5min

以上步骤为30～35个循环；

(3).杂交；

PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR产物的比例为1∶1，洗涤3次；

(4).检测；

用扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果；

(5).数据分析

将芯片分析结果输出。

3、优点及效果；

基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一，它是物理学、化学、微电子学、精密机械与生命科学交叉综合的高科技。基因芯片集成的不是电子元器件，采用在位组合化学、微电子芯片光刻技术，或者利用其它方法将大量特定序列的DNA探针有序地固定在基片上，在与待测样品DNA作用后，即可检测到大量的生命信息，包括基因识别、基因突变和基因表达等。利用基因芯片可以快速、高效地获取或处理大量的生命信息，它对生命科学研究、医学诊断、新药筛选和司法鉴定等具有革命性的推动作用。

本发明提供了一种病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片。将已经合成的特异性探针以矩阵的形式固定于基片表面，通过芯片与待测样本DNA杂交，即可获取大量与肝炎病毒相关的生物学信息。利用这种芯片，通过一次操作就可以同时完成七种肝炎病毒型及其亚型的检测，并对常用药物进行耐药特性分析。该基因芯片具有诊断准确、特异性高、信息量大的特点。如果将此芯片成功应用于临床，必将带来极大的经济效益和社会效益。

四、具体实施方式：本发明实施的具体步骤是：

1.设计病毒特异性探针和引物

从NCBI等数据库获得可靠的病毒基因序列以及耐药特征序列等，利用生物信息学生物软件设计引物和特异性的探针。

用生物信息学相关软件严格筛选探针序列。为了准确诊断甲型肝炎，用引物5`-GTTGCTGTACAAAACCT，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`反转录扩增甲型肝炎病毒670-890cDNA序列，选择5`-caaatgctatgttgtccactgagtc，5`-caaatgccatgttgtccactg甲型肝炎病毒cDNA序列最为寡核苷酸探针，检测所有的甲型肝炎病毒。用引物5`-GTGCCATTTGTTCAGTG，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`扩增乙型肝炎病毒的部分S基因686-991片断，利用33个寡核苷酸探针鉴别乙肝病毒acute、chronic、adr、adyw、carcinoma、negtive、anti-drug、adw2、adw、wild、ayw基因亚型。为了提高丙型病毒性肝炎的检测灵敏度，采用巢式PCR对丙型肝炎病毒的反转录产物进行扩增，用两对引物5`-GGCGACACTCCACCATAGATC、TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`，5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG、AACACCATGACGGACTATCCCA-5`扩增丙型肝炎病毒33-290序列片断。用寡核苷酸探针5`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC、5`-TGGATCAACCCGCTCAATG鉴别丙型病毒肝炎病毒特征序列。用引物5`-CCTTCAGCGAACAGAG、TGAATAGCAGGGGTGT-5`反转录扩增丁型肝炎病毒321-502cDNA序列片断，用十个寡核苷酸探针鉴别丁肝病毒Acute、Quebec、Venezuela、Italy、C.A.P、African、Smalian、TW2476基因亚型。用引物5`-CGGTCAGCCGTCTG、CGAACCGCACTGGT-5`反转录扩增戊型肝炎病毒的cDNA 5212-5415基因片断，选取四个寡核苷酸探针鉴别戊肝Chinese、JRA1、Indian基因亚型。用引物5`-TGGTAGGTCGTAAATCC、ACTGTTCCTGGTCACC-5`反转录扩增庚型肝炎病毒cDNA136-401基因片断，选取五条寡核苷酸探针鉴别Iowan、China、HGVCN、USA、PNF2161庚肝病毒的基因亚型。筛选引物5`-CTGCAATCCATGTATGAT、ACCATGTCTCCTTGTCATAT-5`反转录扩增TTV病毒cDNA1393-1697序列片断，用寡核苷酸探针5`-AGCAACAACATGGGCATCATAC、5`-AGCAACAACATGGGGATCATAC识别TTV病毒基因序列。

2.合成探针

由上海生物工程有限公司合成。探针5’端加氨基修饰。

3.制备基片

根据需要设定点样程序，矩阵分布根据探针杂交动力学要求及点样方便与否安排。用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l。使用CEL公司生产的玻璃基片，用BioRobotics公司的点样仪按预先设定好的程序进行点样。按照不同要求从几十点到上千点，点的大小为50-100微米左右，点间距依点的数量而定。点好的芯片于37℃下水化12小时，然后在80℃下烘干2小时。以探针缓冲液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸馏水冲洗玻片，吹干。以封闭液(1％BSA，PH＝70.01mol/l PB)封闭玻片，之后洗涤3次。吹干备用。

上述病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片的应用方法包括以下步骤：

1.处理样品

取待检血样100℃水浴10分钟，骤然冷却至0℃，13000G离心5分钟，取上清备用。如需长时间放置，在-20℃下冻存。

2.PCR或RT-PCR扩增

在反应管中加入扩增反应混合物，相应的Taq酶(乙型肝炎病毒)和/或反转录酶，处理好的样品和引物，足量的dNTP以及荧光素(Cy3)标记的dUTP。扩增条件如下：

(反转录条件42℃30min)

94℃ 5min

94℃ 30sec

56℃ 40sec

72℃ 1min

72℃ 5min

以上步骤为30个循环；

3.杂交

PCR产物与芯片上的探针在50℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR产物的比例为1∶1。洗涤3次。

4.检测

用Genomic Solutions公司的扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果。

5.数据分析

Genomic Solutions公司的扫描仪的配套分析软件检芯片结果输出。

以下结合具体的实施例对发明的技术方案作进一步的说明：

实施例1：

设计肝炎病毒引物及特异性探针75个。探针的大小为15-20个碱基。由上海生物工程有限公司合成。探针5’端加氨基修饰。

制备基因芯片：

用CEL公司生产的玻璃基片，使用BioRobotics公司的点样仪按预先设定好的程序进行点样。用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l。点好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时。以探针缓冲液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸馏水冲洗玻片，吹干。以封闭液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封闭玻片，之后洗涤3次。吹干备用。

处理血样：取临床检验结果为乙肝患者(S抗原阳性、e抗原阳性、c抗原阳性)静脉血3-5毫升，100℃水浴10分钟，骤然冷却至0℃，13000G离心5分钟，取上清备用。

PCR扩增：采用的引物序列是：5`-GTGCCATTTGTTCAGTG、GGATAACTAACCTTTCACA-5`

反应总体积为20μl，在反应管中加入10X buffer 2μl，Taq酶0.2μl，处理好的样品0.8μl和上下游引物各2μl，dNTP0.8μl以及Cy3标记的dUTP1.2μl，其余的用H₂O。扩增条件如下；

94℃ 5min

94℃ 30sec

56℃ 40sec

72℃ 1min

72℃ 5min

以上步骤为30个循环；

杂交：PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR产物的比例为1∶1。洗涤3次。

检测：用Genomic Solutions公司的扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果。

数据分析：Genomic Solutions公司的扫描仪的配套分析软件将芯片结果输出。与临床检验结果比较，符合率100％。

实施例2：

探针引物设计以及芯片制作同实施例1。

处理血样：取临床检验结果为丙肝患者(丙肝抗原阳性)静脉血3-5毫升，用华美公司丙肝检测试剂盒抽提丙肝病毒RNA，备用。

RT-PCR扩增：采用的引物序列是：5`-GGCGACACTCCACCATAGATC、TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`

反应总体积为20μl，在反应管中加入10X buffer 2μl，MgCl₂4μl，反转录酶0.75μl，处理好的样品0.8μl和引物2.5μl，dNTP2.0μl，其余的用H₂O。

42℃下反应45min，然后95℃下10min灭活反转录酶。

PCR扩增：采用的引物序列是：5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG、AACACCATGACGGACTATCCCA-5`

反应总体积为20μl，在反应管中加入10X buffer 2μl，Taq酶0.5μl，上一步反应产物8.0μl和上下游引物各2.5μl，dNTP0.4μl以及Cy3标记的dUTP1.2μl，其余的用H₂O。扩增条件如下：

94℃ 5min

94℃ 30sec

56℃ 30sec

72℃ 30sec

72℃ 5min

以上步骤为35个循环；

病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片引物及探针序列表

病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片引物序列表

甲肝引物primer1.1primer1.2乙肝引物primer2.3primer2.4丙肝引物outer Primer3.3outer Primer3.4iner primer3.5iner primer3.6丁肝引物primer4.1primer4.2戊肝引物primer5.1primer5.2庚肝引物Primer6.1Primer6.2TTV引物Premer7.1Premer7.2

Sequnce5`-TCCACATTTGGATTGGGATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`Sequnce5`-GTGCCATTTGTTCAGTGGGATAACTAACCTTTCACA-5`Sequnce5`-GGCGACACTCCACCATAGATCTCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGAACACCATGACGGACTATCCCA-5`Sequnce5`-CCTTCAGCGAACAGAGTGAATAGCAGGGGTGT-5`Sequnce5`-CGGTCAGCCGTCTGCGAACCGCACTGGT-5`Sequnce5`-TGGTAGGTCGTAAATCCACTGTTCCTGGTCACC-5`Sequnce5`-CTGCAATCCATGTATGATACCATGTCTCCTTGTCATAT-5`

Seq No.670890Seq No.686991Seq No.632933290Seq No.321502Seq No.52125415Seq No.136401Seq No.13931697

病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片探针序列表

甲肝探针Probe1.1Probe1.2乙肝探针ProbeProbe 2.1

Sequnce5`-caaatgctatgttgtccactgagtc5`-caaatgccatgttgtccactgSequnce5`-ATCCCATCATCCTGGGCTTT

Seq No.Gene type797HAV797HAVSeq No.611 Gene type611 acute，adr，adyw，carcin

Probe2.2Probe2.3Probe2.4Probe2.5Probe2.6Probe2.7Probe2.8Probe2.9Probe2.10Probe2.11Probe2.12Probe2.13Probe2.14Probe2.15Probe2.16Probe2.17Probe2.18Probe2.19Probe2.20Probe2.21Probe2.22Probe2.23Probe2.24Probe2.25Probe2.26Probe2.27Probe2.28Probe2.29Probe2.30Probe2.31Probe2.31Probe2.32Probe2.33丙肝探针Probe3.1

5`-CCCATCATCTTTGGCTTTCG5`-ATCCCATCGTCCTGGGCT5`-ATCCCATCATCTTGGGCTTTC5`-ATCCCATCATCTTGGGGTTTC5`-TGGGCTTTCGGAAAATTCC5`-TGGGCTTTCGCAAGATTCC5`-TTGGCTTTCGCAAGATTCCT5`-TGGGCTTTCGCAAAATACCT5`-TGGGCTTTCGCAAAATTC5`-TCAGCCCGTTTCTCTTGGC5`-CAGCCCGTTTCTCCTGGC5`-GGCCTCGGTCCGTTTCTC5`-TGGTTCGTAGGGCTTTCCC5`-AGTGGT TCGCAGGGCTTTC5`-GCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGT5`-CTTTCAGTTATATGGATGATCTGGTATT5`-CTTTCAGCTATATGGATGATGTGGT5`-CTTTCAGTTATANGGATGACGTGG5`-GCTTTCAGCTATATAGATGATGTGGTA5`-TCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTT5`-TCTGTACAACATCT TGAGTCCCTTT5`-TCTGTGCAACATCTTGAGTCCC5`-TCTGTACAGCATCGTGAGTCCC5`-TCTGTACAACATCTTGAATCCCTTT5`-CACAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAA5`-TTAAAACTCAAACAATGTTTTCGGA5`-CTAAAACTCAAGCAATGTTTTCGAA5`-CTCAAAATTAAGCAATGTTTTCGAA5`-CAAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAA5`-CACAAACTCAAACACTGTTTTAGAAAA5`-AGAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAAA5`-AGAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGA5`-CAAAAGATCAAACACTGTTTTAGAAAASequnce5`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC

oma，negtive，611anti-drug611anti-drug，adw2611chronic，adw，wild623ayw623adywacute，adr，carcinoma，n623egtive，623anti-druganti-drug，adw，adw2，w623ild656chronic，adw，wild656adyw652carcinomanegtiveadr，carcinoma，adyw，chroni701c，adw，adw2，wild，anti-drug730acute，ayw，negtiveacute，negtive，carcinoma，adyw，chronic，adw，730wild730ayw730adw2730anti-drug769anti-drug769adywacute，carcinoma，negti769ve，ayw，adw，wild769chronic769adw2931adr931adyw931acute，negtive931adr931carcinoma931chronic931ayw931adw931wildadw2SeqNo.Gene type272HCV

Probe3.2丁肝探针Probe4.1Probe4.2Probe4.3Probe4.4probe4.5Probe4.6Probe4.7Probe4.8Probe4.9Probe4.10戊肝探针Probe5.1Probe5.2Probe5.3Probe5.4庚肝探针Probe6.1Probe6.2Probe6.3Probe6.4Probe6.5TTV探针Probe7.1Probe7.2

5`-TGGATCAACCCGCTCAATGSequnce5`-GAGCGCATCGCAGAGGG5`-GAGCGCATCGCGAGAGG5`-GGGGCGCATCGCGA5`-GAGCGCTCGGGTGGTAGG5`-AGCTCTGACGCGCGAGG5`-GACCCTGGTACCGGGGG5`-AGGCGCTTCGAGCGGTA5`-AGACTCTCTTCCCGGTGGGA5`-GGCTCTCTCACGCGGTAGG5`-GAGCTCCCTCCTCCTCCTTCSequnce5`-GGACCTCGTGTTCGCCAAC5`-GCCCTCGGCAGCCAAT5`-CCTCGACAGCCGCCCC5`-GACCTCGCGTTCGCCAASequnce5`-AGCCCGTCACCCACCTG5`-GCCCGTAACCCGCCTG5`-GCCCATTACCCACCTGGG5`-AGCCCGTTACCCACCTGG5`-TACGGTCCACGTCGCCCSequnce51-AGCAACAACATGGGCATCATAC5`-AGCAACAACATGGGGATCATAC

187HCVSeqNo.Gene type336Quebec hdv336Venezuela hdv336Acute hdv336Italy hdv336TW2667336Venzuela336C.A.P336African336Smalian336TW2476Seq No.Gene type5363HDV5369Chinese5372JRA15363IndianSeqNo.Gene type296Iowan，China296Serum296HGVCN296USA，PNF2161330HGVSeq No.Gene type1560TTV1560pTZVT416

Claims

1.一种病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片，其特征在于：该芯片为玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，依次分别固定有甲、乙、丙、丁、戊、庚、TTV七种类型的病毒型肝炎及其常见亚型的探针；在该芯片的微阵列中，设有质控探针和多个乙肝耐药分析探针；探针的大小为15-20个碱基，设计75个探针，所设计的探针序列如下：

甲肝探针 Sequnce Seq No.Gene type

Probe 1.1 5`-caaatgctatgttgtccactgagtc 797HAV

Probe 1.2 5`-caaatgccatgttgtccactg 797HAV

乙肝探针 SeqNo.

Probe Sequnce 611Gene type

acute，adr，adyw，carcin

Probe 2.1 5`-ATCCCATCATCCTGGGCTTT 611oma，negtive，

Probe 2.2 5`-CCCATCATCTTTGGCTTTCG 611anti-drug

Probe2.3 5`-ATCCCATCGTCCTGGGCT 611anti-drug，adw2

Probe 2.4 5`-ATCCCATCATCTTGGGCTTTC 611chronic，adw，wild

Probe 2.5 5`-ATCCCATCATCTTGGGGTTTC 623ayw

Probe2.6 5`-TGGGCTTTCGGAAAATTCC 623adyw

acute，adr，carcinoma，n

Probe2.7 5`-TGGGCTTTCGCAAGATTCC 623egtive，

Probe2.8 5`-TTGGCTTTCGCAAGATTCCT 623anti-drug

anti-drug，adw，adw2，w

Probe2.9 5`-TGGGCTTTCGCAAAATACCT 623ild

Probe2.10 5`-TGGGCTTTCGCAAAATTC 656chronic，adw，wild

Probe2.11 5`-TCAGCCCGTTTCTCTTGGC 656adyw

Probe2.12 5`-CAGCCCGTTTCTCCTGGC 652carcinoma

Probe2.13 5`-GGCCTCGGTCCGTTTCTC negtive

adr，carcinoma，adyw，chroni

Probe2.14 5`-TGGTTCGTAGGGCTTTCCC 701c，adw，adw2，wild，anti-drug

Probe2.15 5`-AGTGGTTCGCAGGGCTTTC 730acute，ayw，negtive

acute，negtive，carcino

ma，adyw，chronic，adw，

Probe2.16 5`-GCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGT 730wild

Probe2.17 5`-CTTTCAGTTATATGGATGATCTGGTATT 730ayw

Probe2.18 5`-CTTTCAGCTATATGGATGATGTGGT 730adw2

Probe2.19 5`-CTTTCAGTTATANGGATGACGTGG 730anti-drug

Probe2.20 5`-GCTTTCAGCTATATAGATGATGTGGTA 769anti-drug

Probe2.21 5`-TCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTT 769adyw

acute，carcmoma，negti

Probe2.22 5`-TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 769ve，ayw，adw，wild

Probe2.23 5`-TCTGTGCAACATCTTGAGTCCC 769chronic

Probe2.24 5`-TCTGTACAGCATCGTGAGTCCC 769adw2

Probe2.25 5`-TCTGTACAACATCTTGAATCCCTTT 931adr

Probe2.26 5`-CACAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAA 931adyw

Probe2.27 5`-TTAAAACTCAAACAATGTTTTCGGA 931acute，negtive

Probe2.28 5`-CTAAAACTCAAGCAATGTTTTCGAA 931adr

Probe2.29 5`-CTCAAAATTAAGCAATGTTTTCGAA 931carcinoma

Probe2.30 5`-CAAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAA 931chronic

Probe2.31 5`-CACAAACTCAAACACTGTTTTAGAAAA 931ayw

Probe2.31 5`-AGAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAAA 931adw

Probe2.32 5`-AGAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGA 931wild

Probe2.33 5`-CAAAAGATCAAACACTGTTTTAGAAAA adw2

丙肝探针 Sequnce Seq No.Gene type

Probe3.1 5`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC 272HCV

Probe3.2 5`-TGGATCAACCCGCTCAATG 187HCV

丁肝探针 Sequnce Seq No.Gene type

Probe4.1 5`-GAGCGCATCGCAGAGGG 336Quebec hdv

Probe4.2 5`-GAGCGCATCGCGAGAGG 336Venezuela hdv

Probe4.3 5`-GGGGCGCATCGCGA 336Acute hdv

Probe4.4 5`-GAGCGCTCGGGTGGTAGG 336Italy hdv

probe4.5 5`-AGCTCTGACGCGCGAGG 336TW2667

Probe4.6 5`-GACCCTGGTACCGGGGG 336Venzuela

Probe4.7 5`-AGGCGCTTCGAGCGGTA 336C.A.P

Probe4.8 5`-AGACTCTCTTCCCGGTGGGA 336African

Probe4.9 5`-GGCTCTCTCACGCGGTAGG 336Smalian

Probe4.10 5`-GAGCTCCCTCCTCCTCCTTC 336TW2476

戊肝探针 Sequnce Seq No.Gene type

Probe5.1 5`-GGACCTCGTGTTCGCCAAC 5363HDV

Probe5.2 5`-GCCCTCGGCAGCCAAT 5369Chinese

Probe5.3 5`-CCTCGACAGCCGCCCC 5372JRA1

Probe5.4 5′-GACCTCGCGTTCGCCAA 5363Indian

庚肝探针 Sequnce Seq No.Gene type

Probe6.1 5`-AGCCCGTCACCCACCTG 296Iowan.China

Probe6.2 5`-GCCCGTAACCCGCCTG 296Serum

Probe6.3 5`-GCCCATTACCCACCTGGG 296HGVCN

Probe6.4 5`-AGCCCGTTACCCACCTGG 296USA，PNF2161

Probe6.5 5`-TACGGTCCACGTCGCCC 330HGV

TTV探针 Sequnce Seq No.Gene type

Probe7.1 5`-AGCAACAACATGGGCATCATAC 1560TTV

Probe7.2 5`-AGCAACAACATGGGGATCATAC 1560pTZVT416

2.一种制备权利要求1所述的病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片的制备工艺，其特征在于：所述的制备工艺按如下步骤进行：

(1)、设计病毒性肝炎特异性探针和引物；

从数据库中获得可靠的病毒基因序列以及耐药特征序列，根据所述的探针序列设计探针；从数据库中获得可靠的病毒基因序列以及耐药特征序列，用引物5`-GTTGCTGTACAAAACCT，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`反转录扩增甲型肝炎病毒670-890cDNA序列，选择5`-caaatgctatgttgtccactgagtc，5`-caaatgccatgttgtccactg甲型肝炎病毒cDNA序列为寡核苷酸探针，对待测血样进行预处理，即：检测所有的甲型肝炎病毒；用引物5`-GTGCCATTTGTTCAGTG，GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5`扩增乙型肝炎病毒的部分S基因686-991片断，利用33个寡核苷酸探针鉴别乙肝病毒acute、chronic、adr、adyw、carcinoma、negtive、anti-drug、adw2、adw、wild、ayw基因亚型；采用巢式PCR对丙型肝炎病毒的反转录产物进行扩增，用两对引物5`-GGCGACACTCCACCATAGATC、TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5`，5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG、AACACCATGACGGACTATCCCA-5`扩增丙型肝炎病毒33-290序列片断；用寡核苷酸探针5`-TGGTACTGCCTGATAGGGTGC、5`-TGGATCAACCCGCTCAATG鉴别丙型病毒肝炎病毒特征序列；用引物5`-CCTTCAGCGAACAGAG、TGAATAGCAGGGGTGT-5`反转录扩增丁型肝炎病毒321-502cDNA序列片断，用十个寡核苷酸探针鉴别丁肝病毒Acute、Quebec、Venezuela、Italy、C.A.P、African、Smalian、TW2476基因亚型；用引物5`-CGGTCAGCCGTCTG、CGAACCGCACTGGT-5`反转录扩增戊型肝炎病毒的cDNA 5212-5415基因片断，选取四个寡核苷酸探针鉴别戊肝Chinese、JRA1、Indian基因亚型；用引物5`-TGGTAGGTCGTAAATCC、ACTGTTCCTGGTCACC-5`反转录扩增庚型肝炎病毒cDNA136-401基因片断，选取五条寡核苷酸探针鉴别Iowan、China、HGVCN、USA、PNF2161庚肝病毒的基因亚型；筛选引物5`-CTGCAATCCATGTATGAT、ACCATGTCTCCTTGTCATAT-5`反转录扩增TTV病毒cDNA1393-1697序列片断，用寡核苷酸探针5`-AGCAACAACATGGGCATCAIAC、5`-AGCAACAACATGGGGATCATAC识别TTV病毒基因序列；扩增及扩增同时标注荧光素；

(2)、合成探针；

(3)、制备芯片；

3.根据权利要求2所述的病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片的制备工艺，其特征在于：对待测血样的预处理过程中，PCR扩增引物序列如下：

甲肝引物 Sequnce Seq No.

prime r1.1 5`-TCCACATTTGGATTGG 670

prime r1.2 GATCTAGTCTCCTCCTGTC-5` 890

乙肝引物 Sequnce Seq No.

prmer2.3 5`-GTGCCATTTGTTCAGTG 686

primer24 GGATAACTAACCTTTCACA-5` 991

丙肝引物 Sequnce Seq No.

outer Primer3.3 5`-GGCGACACTCCACCATAGATC 6

outer Primer3.4 TCCAGAGCATCTGGCACGTAG-5` 329

iner primer3.5 5`-CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACG 33

iner primer3.6 AACACCATGACGGACTATCCCA-5` 290

丁肝引物 Sequnce Seq No.

primer4.1 5`-CCTTCAGCGAACAGAG 321

primer4.2 TGAATAGCAGGGGTGT-5` 502

戊肝引物 Sequnce Seq No.

primer5.1 5`-CGGTCAGCCGTCTG 5212

primer5.2 CGAACCGCACTGGT-5` 5415

庚肝引物 Sequnce Seq No.

Primer6.1 5`-TGGTAGGTCGTAAATCC 136

Primer6.2 ACTGTTCCTGGTCACC-5` 401

TTV引物 Sequnce Seq No.

Premer7.1 5`-CTGCAATCCATGTATGAT 1393

Premer7.2 ACCATGTCTCCTTGTCATAT-5` 1697

4.根据权利要求2所述的病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片的制备工艺，其特征在于：在合成探针的步骤中，探针5’端加氨基修饰。

5.根据权利要求2所述的病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片的制备工艺，其特征在于：点样中点的大小为50-100微米。

6.根据权利要求2所述的病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片的制备工艺，其特征在于：探针缓冲液为1xSSC，0.1％SDS；封闭液为1％BSA，PH＝70.01mol/l PB。

7.一种权利要求1所述的病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片的使用方法，其特征在于：所述的使用方法按如下步骤进行：

(1).处理样品；

将病人脑脊液的样品，分别提取DNA，备用；如需长时间放置，在-20℃下冻存；

(2).PCR引物扩增

在反应管中加入扩增反应混合物——Taq酶，相应的处理好的样品和引物，足量的dNTP以及荧光素Cy3标记的dUTP；扩增条件如下：

94℃5min

94℃30sec

56℃30sec

72℃1min

72℃5min

以上步骤为30～35个循环；

(3).杂交；

PCR产物与权利要求1所述病毒性肝炎集成诊断及耐药分析芯片上的探针在60℃下杂交2小时，用10xSSC，0.1％SDS的杂交缓冲液与PCR产物的比例为1∶1，洗涤3次；

(4).检测；

用扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果；

(5).数据分析

将芯片分析结果输出。