CN1260482A - 在杀真菌剂筛选中孢子附着测定的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种方法,根据测定真菌孢子对基质抑制萌发－伴生附着能力来筛选具有杀真菌毒性的化合物。该方法用于发现抑制真菌孢子萌发的化合物。

Description

在杀真菌剂筛选中孢子附着测定的应用
真菌是植物和人类许多重要疾病的病原体，也引起材料如木材、油漆和塑料的生物性腐蚀。需要不断发现新的比已存在的产品更有效的抗真菌化合物，以及具有对环境更有利和在毒性方面更有利的性质。
为了增加成功发现具有有利性质的新抗菌化合物的机率，需要筛选大量尽可能有效的化合物。经常地，可利用的供试化合物数量少，迫使使用一些“离体”筛选形式，即在微量滴定板或其他小容器中评价杀真菌毒性，而不是在植物上测定每一种化合物控制真菌病害的能力。
许多不同的技术可用于“离体”测定杀真菌毒性。常用的方法包括测定供试化合物在接种了真菌的琼脂板上产生的生长抑制圈，测定在补加有供试化合物的营养培养基上的真菌菌落的直径，在含有补加了供试化合物的营养培养基的微量滴定板或其他容器上用肉眼或分光光度计评价菌丝体的生长。
萌发试验即评价化合物抑制孢子萌发能力的试验，也已经广泛地用于体外测定杀真菌毒性。这种方法的优越之处是对于许多真菌而言孢子萌发非常快速地发生，允许杀真菌毒性的效果在几个小时之内测定，而不象其他经典方法得需一天或多天。更大的优越性是对于不可能在实验室培养基上培养的“专性”真菌病原菌如锈菌和白粉病菌可以进行孢子萌发测定。像这样的专性病原菌的孢子可从感染的植物上采集，在离体的适当条件下诱导萌发{例如参见，M.A.de Waard，Meded.Fac.Landbouwwetensch.36，113-119(1971)，和J.Gorska-Poczopko，Bulletin de l’Academie Polonaise des Sciences，20，681-684(1972)}。萌发试验对于评价抗真菌化合物的作用机制也非常有用。对于许多化合物，孢子萌发是在真菌生长中对抑制最敏感的阶段，而其他具杀真菌毒性的化合物可能对萌发显示出很少或无抑制，但对随后的菌丝体生长存在极强的抑制。因此，萌发测定与其他测定杀真菌毒性的方法，如测定菌丝体生长的抑制或控制植物、动物或材料上的真菌菌落的方法，可为洞察化合物的杀真菌毒性机制提供有价值的信息。
孢子萌发试验的主要缺点是为评价萌发，需要显微镜检查孢子，这是一种单调乏味的和强体力劳动的工序，该工序本身导致不能筛选大量的化合物。本发明通过排除对孢子的显微观察的需要而克服了这个困难。
本发明的基础是发现了：
1、正在萌发的真菌孢子对基质的牢固附着(萌发-伴生附着)是真菌的一般特性，这可以区别于在其他发育阶段的真菌附着。
2、萌发-伴生附着可以被抗真菌化合物抑制。
3、抑制萌发-伴生附着的能力与抑制孢子萌发的能力具有良好的相关性，因此，是一种有用的抑制萌发能力的测定指标，该能力可用于杀真菌剂的筛选。
因此，萌发-伴生的孢子附着的测定可以替代基于抑制萌发能力的化合物筛选时的显微镜检查。
真菌在不同发育阶段与叶子和其他基质附着的能力在许多文件中有说明。据报道，发生附着的发育阶段包括孢子、已萌发的孢子、附着孢和菌丝体阶段{E.B.G.Jones，Mycological Research，98，961-981(1994)}。在一些情况下，附着被认为是一种被动的过程，而在其他情况下，附着涉及粘性物质的活跃分泌{Braun，E.J.和Howard，R.J.，Protoplasma，181，202-212(1994)}。已有人报道，在萌发之前真菌孢子对表面的附着发生在各种真菌中，如灰葡萄孢菌{R.P.Doss等，《应用与环境微生物学》[Applied and Environmental Microbiology]，59，1786-1791(1993)}、Magnaporthe grisea{Hamer，J.E.等，《科学》[Science]，239，288-290(1988)}、菜豆刺盘孢菌{Young，D.H.和Kauss，H.，《应用与环境微生物学》47，616-619(1984)}，以及乔生刺盘孢菌{Mercure，E.W.等，《生理与分子植物病理学》[Physiological and Molecular PlantPathology]，46，121-135(1995)}。据报道，在萌发期间或萌发后很短时间在真菌中也发生孢子附着，所述真菌例如有：灰葡萄孢菌{R.P.Doss等，《应用与环境微生物学》61，260-265(1995)}、高粱柄锈菌{Chaubal，R.等，《加拿大植物杂志》[Canadian Journal of Botany]，69，2044-2054(1991)}、以及菜豆单孢锈菌{L.Epstein等，《生理与分子植物病理学》30，373-388(1987)}。由于据报道对各种真菌而言，在萌发之前和之后都发生附着，附着可作为抑制萌发的杀真菌剂筛选方法的基础令人惊奇。
Inoue等{《农药科学》[Pesticide Science]，19，145-152(1987)}报道，氯苯噻酮和三环唑抑制稻梨孢菌附着孢对大麦叶片的附着。然而，在比有助于渗透的萌发以后的阶段，附着孢被某些真菌形成特殊结构。因此，氯苯噻酮和三环唑通过抑制真菌的黑化起作用，这两种杀真菌剂对真菌的生长或萌发几乎不产生什么效果，应用本发明的方法不可能检测到这种效果。Vuddhakel等{Journal of AntimicrobialChemistry，21，755-763(1988)}报道，白色假丝酵母菌(该菌为人类病原真菌)的酵母形态，对涤纶织物纤维的附着被各种抗真菌药抑制。这个报告与本发明无关，因为白色假丝酵母菌的酵母形态通过芽生机制生长，而不是如本发明方法中提到的真菌是通过芽管发育的。值得注意的是，吡咯抗菌剂和阿莫罗芬被发现能抑制假丝酵母菌的附着，然而已知这些化合物作为麦角甾醇生物合成抑制剂，对真菌孢子的萌发很少有影响，但却对随后的菌丝体生长有影响作用。
本发明提出一种测定潜在的杀真菌化合物的抗真菌活性的方法，所述化合物防止真菌产生能萌发的孢子或分生孢子，该方法包括以下步骤：
(i)将含在水中或含水营养培养基中的真菌孢子悬浮液施加在一种含有潜在的杀真菌化合物(处理)或不含有潜在的杀真菌化合物(对照)的基质表面上，
(ii)在适合孢子萌发的一定温度下培养足够长的时间以使萌发发生，
(iii)除去未结合的孢子，
(iv)测定与含有或不含有潜在的杀菌化合物的基质表面结合的孢子数或真菌材料的数量，
(v)确定上述潜在的杀真菌剂对真菌的毒性效果，通过将处理样品与对照比较，用与表面结合的孢子或真菌材料的数量的减少来表示所述的毒性效果。
在另一实施方案中，本发明提供一种测定潜在的杀真菌化合物的抗真菌活性的方法，所述化合物防止真菌产生能萌发的孢子或分生孢子，该方法包括以下步骤
(i)将含在水中或含水营养培养基中的真菌孢子悬浮液施加在一种含有潜在的杀真菌化合物(处理)或不含有潜在的杀真菌化合物(对照)的基质表面上，
(ii)在适合孢子萌发的一定温度下培养足够长的时间以使萌发发生，
(iii)通过测定处理与对照样品中未与基质表面结合的孢子数或真菌材料的数量，并将该数量从孢子总数或真菌材料总量中减去，来确定与含有或不含有潜在的杀菌化合物的基质表面结合的孢子数或真菌数量，
(iv)确定上述潜在的杀真菌剂对真菌的毒性效果，通过将处理样品与对照比较，用与表面结合的孢子或真菌材料的数量的减少来表示所述的毒性效果。
与基质结合的孢子或真菌材料的数量可以通过适当的技术来确定。根据在未结合的孢子群落中的孢子数或真菌材料的数量的测定，相似的技术可以被用于评价附着。可以用于计数结合或未结合的孢子或真菌材料的技术实例包括，但不必限于：
a)通过视觉检查或借助于成像分析设备的显微镜分析，
b)细胞计数设备的使用，如Coulter Counter，
c)基于本身固有颜色的、发荧光的或发冷光的细胞组分，用分光光度计、荧光测定仪或光检测设备计数孢子，
d)在附着之前或者之后对孢子细胞组分染色，并针对具体的染色选用适当的分光光度计、荧光测定仪或光检测设备来定量附着，
e)化学分析，和
f)在附着之前或者之后利用放射活性材料标记孢子细胞组分，并通过测定掺入的放射活性来测定孢子的附着。
应当可以理解，在附着测定中为了便于发现附着的孢子，可对真菌本身进行处理。例如，真菌通常可以被遗传修饰成能表达一个易于发现的标志如绿色荧光蛋白质、颜料或荧光染料。
在孢子附着测定中，可以使用的基质实例包括(但不必限于)，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯(Permanox)、聚甲基丙烯酸甲酯(Plexiglas)和玻璃。测定可以采用一种能让有机体在其上繁殖的天然或合成的基质，如植物或动物细胞和组织、皮革、木材、纺织品、金属或塑料。
本发明的方法可以用于筛选对子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲的抗真菌活性，这几类真菌产生具有萌发能力的孢子或分生孢子。其实例包括(但不必限于)：葡萄孢菌、Magnaporthe spp.、刺盘孢菌、曲霉菌、柄锈菌、单孢锈菌、白粉菌、镰孢菌、链格孢菌、青霉菌、长蠕孢菌、黑星菌、尾孢菌、壳针孢菌、球腔菌、钩丝壳霉菌、柄球菌、链核盘菌、单丝壳菌、核腔菌、假尾孢菌、嘴孢菌、核盘菌、茎点霉菌。
下面的实施例是为实践本发明而提供的进一步的指导。实施例1  灰葡萄孢菌的孢子附着和萌发之间的时间相关性
灰葡萄孢菌于室温在荧光灯照射下，生长在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上，每14天继代培养。为制备孢子悬浮液，将20ml无菌水milliQTM加入培养盘中(10-14天龄)，表面用无菌环轻轻刮擦。液体通过玻璃棉过滤，以除去菌丝体碎片，然后将孢子浓度调节到需要的浓度。
测定在聚甲基戊烯孔状载片(双孔载片Lab-Tek Permanox，NuncInc.)上进行。孔状载片孔或者容纳了5μl二甲基亚砜(DMSO)(对照)或者容纳了溶于DMSO中的供试化合物，接着加入500μl Sabouraud葡萄糖液体培养基(SDB，从Difco实验室取得)。然后加入浓度为200000孢子/ml的孢子水悬浮液(500μl)，轻轻地混合，再将小瓶或载片在25℃下温育所需的一定的时间。为评价孢子附着，未附着孢子的数量测定通过将液体转移到计数小瓶中，马上加入1ml IsotonII计数液体到孔中，轻轻地摇动冲洗孔状载片孔一次，然后把冲洗液体也倒入计数小瓶中。将计数液体(14ml)加入小瓶中，用Coulter Counter(Coulter科学仪器公司)细胞计数仪对孢子计数。附着孢子的数量通过从孢子的总数中减去未附着孢子的数量来计算，以百分率表示(附着％)。为评价萌发，在孔状载片中的总孢子群落用5％戊二醛固定，即通过加入0.077ml70％戊二醛到孔状载片孔中。为了证明芽管长出，萌发孢子数量用显微镜最少检查100个孢子来确定。萌发孢子的数量以总数的百分率表示(萌发％)。下表的数据显示出孢子对载片的附着是时间依赖性的，并该附着与孢子萌发的时间-过程密切地平行。
    时间(小时)     附着％     萌发％
    0123468     014.130.478.691.093.896.5     05.327.083.289.395.898.8
实施例2.杀真菌剂对灰葡萄孢菌孢子萌发-伴生的附着的影响
评价各种杀真菌剂抑制萌发-伴生孢子对聚苯乙烯计数小瓶、聚甲基戊烯(Permanox)孔状载片和96孔平底聚苯乙烯微量滴定板附着的抑制能力，以及对孢子萌发和菌丝体生长的影响(见下表)。同实施例1一样在孔状载片上的附着测定和萌发测定均在25℃下培养5小时。在计数小瓶中的附着测定在20ml容量的聚苯乙烯计数小瓶(VWRcat.no.14310-640)中进行。计数小瓶容纳了5μlDMSO(对照)或者溶于DMSO中的供试化合物，接着加入500μl SDB。然后加入浓度为200000孢子/ml的孢子水悬浮液(500μl)，轻轻地混合，将小瓶或载片在25℃下温育5.5小时。为了确定未结合孢子的数量，将15ml计数液体加入小瓶中，盖上瓶盖，轻轻地上下颠倒5次，然后用Coulter Counter细胞计数仪计数。
为了在微量滴定板中进行附着测定，供试化合物的储液以DMSO制备，然后用SDB稀释，如此之后使DMSO浓度在稀释后≤2％。这些供试化合物溶液的两倍系列稀释液在96孔平底微量滴定板上中用SDB(100μl)制备。孢子悬浮液(浓度2×105孢子/ml，共100μl)被加入到孔中，将滴定板在25℃下培养5.5小时。为了除去尽可能多的液体，通过倒转和轻拍微量滴定板将含有未结合孢子的培养基除去。附着孢子的计数通过用磺若丹明B{(Skehan等，Journal of the National CancerInstitute，82，1107-1112(1990)}染色来测定它们的细胞蛋白质含量，在564nm下测定吸光率。附着抑制通过含有杀真菌剂孔中的吸光率值与无杀真菌剂的对照孔中的吸光率值比较确定。EC50值从剂量反应曲线求得。
菌丝体生长抑制在有毒的琼脂中测定评价。每一个供试杀真菌剂的4倍系列稀释液以DMSO制备，并将每一稀释液125μl加入25ml熔化的麦芽提取物琼脂(每升含20g麦芽提取物，20g葡萄糖，1g蛋白胨和20g琼脂)中。将含有供试化合物的培养基立刻倒入9cm直径的皮氏培养皿中。每一种处理使用两个重复培养皿。每一皿用在PDA上培养的灰葡萄孢菌的生长边缘采集的直径7mm的活塞接种。菌落直径在黑暗中25℃下连续生长3天后测量。EC50值从剂量反应曲线求得。
结果在下面表中给出。每一种供试化合物在3种附着测定中的EC50值是相似的。孢子附着对所有抑制萌发的化合物(萌发抑制剂，GI)在低浓度(＜2ppm)下敏感。相反地，在低浓度下不抑制萌发的化合物(萌发后起作用的化合物，AG)，由于菌丝体生长比萌发更敏感地受到它们的抑制，在孢子附着测定中它们具有很少的活性或无活性。附着抑制EC50同萌发抑制EC50大体上类似。
  化合物 *分类     孢子附着的抑制(EC50，ppm)   萌发抑制EC50(ppm)   菌丝体生长抑制EC50(ppm)
  计数小瓶   微量滴定板 孔状载片
醚菌酯嘧菌酯百菌清灭菌丹福美双氟啶胺拌种咯乙烯菌核利多菌灵嘧霉胺   GIGIGIGIGIGIGIGIAGAG     0.0140.190.0930.211.040.0410.0960.56＞25＞25   0.0110.190.100.331.860.0510.0900.62＞10＞10   0.0350.280.0890.221 870.0711.89＞5.0＞25＞25     0.0200.320.0670.15＜0.6250.028＜0.0312＜0.5＞258.6     0.283.050.355.500.780.0330.00150.110.0450.48
*GI＝萌发抑制剂，AG＝萌发后起作用的化合物实施例3.醚菌酯对灰葡萄孢菌孢子在Plexiglas 载片上萌发-伴生附着 的影响
测定在定做的以Plexiglas制造的孔状载片上进行。孔状载片孔中容纳了5μl DMSO(对照)或者溶于DMSO中的醚菌酯(杀真菌剂)，接着加入500μl SDB。然后加入浓度为200000孢子/ml的孢子水悬浮液(500μl)，轻轻地混合，将小瓶或载片在25℃下培养所需的一定时间。未附着孢子的数量测定通过将液体转移到计数小瓶中，马上加入1ml计数液体到孔中轻轻地摇动，冲洗孔状载片一次，然后把冲洗液体倒入计数小瓶中。再将计数液体(14ml)加入小瓶中，用Coulter Counter细胞计数仪计数孢子。附着孢子的数量通过从总孢子数减去未附着孢子的数量来计算，以百分率表示(附着％)。结果(见下表)显示了正在萌发的灰葡萄孢菌孢子对Plexiglas载片的附着和醚菌酯抑制附着的能力。
  时间(小时)   对照附着％   附着％，在10ppm醚菌酯存在下
    012345678     02.08.414.425.849.164.383.689.6 17.426.2
实施例4.醚菌酯对灰葡萄孢菌孢子在玻璃小瓶中萌发-伴生附着的影 响
测定在27×55mm硼硅酸盐玻璃小瓶中进行，所述小瓶从Kimble玻璃股份有限公司取得。小瓶容纳了5μl DMSO(对照)或者溶于DMSO中的醚菌酯，接着加入500μl SDB。然后加入浓度为200000孢子/ml的孢子水悬浮液(500μl)，轻轻地混合，将小瓶在25℃下温育所需的一定时间。为了确定未附着孢子的数量，将15ml计数液体加入小瓶中，盖上盖子，轻轻地上下颠倒5次，用Coulter Counter细胞计数仪计数孢子。附着孢子的数量通过从总孢子数减去未附着孢子的数量来计算，以百分率表示(附着％)。结果(见下表)显示了正在萌发的灰葡萄孢菌孢子对玻璃的附着和醚菌酯抑制附着的能力。
    时间(小时)   对照附着％ 附着％，在10ppm醚菌酯存在下
    0234567     02.74.626.358.872.683.4 23.429.6
实施例5.醚菌酯对灰葡萄孢菌孢子在聚乙烯小瓶上萌发-伴生附着的 影响
测定在26.9×59.5mm聚乙烯小瓶(PolyQ小瓶，从Beckman仪器股份有限公司取得)中进行。小瓶容纳了5μl DMSO(对照)或者溶于DMSO中的醚菌酯，接着加入500μl SDB。然后加入浓度为200000孢子/ml的孢子水悬浮液(500μl)，轻轻地混合，将小瓶在25℃下温育所需的一定时间。为了确定未附着孢子的数量，将15ml计数液体加入小瓶中，盖上盖子，轻轻地上下颠倒5次，然后用Coulter Counter细胞计数仪计数孢子。附着孢子的数量通过从总孢子数减去未附着孢子的数量来计算，以百分率表示(附着％)。结果(见下表)显示了正在萌发的灰葡萄孢菌孢子对聚乙烯的附着和醚菌酯抑制附着的能力。
    时间(小时)     对照附着％   附着％，在10ppm醚菌酯存在下
    0234567     09.820.436.860.974.989.0 12.715.1
实施例6.醚菌酯对灰葡萄孢菌孢子在聚丙烯小瓶上萌发-伴生附着的 影响
测定在25×56mm RediPaKStarline聚丙烯小瓶中进行，所用小瓶从Wheaton科学产品公司取得。小瓶容纳了5μl DMSO(对照)或者溶于DMSO中的醚菌酯，接着加入500μl SDB。然后加入浓度为200000孢子/ml的孢子水悬浮液(500μl)，轻轻地混合，将小瓶在25℃下温育所需的一定时间。为了确定未附着孢子的数量，将15ml计数液体加入小瓶中，盖上盖子，轻轻地上下颠倒5次，用Coulter Counter细胞计数仪计数孢子。附着孢子的数量通过从总孢子数减去未附着孢子的数量来计算，以百分率表示(附着％)。结果(见下表)显示了正在萌发的灰葡萄孢菌孢子对聚丙烯的附着和醚菌酯抑制附着的能力。
    时间(小时)     对照附着％ 附着％，在10ppm醚菌酯存在下
    0234567     07.025.025.959.359.563.2 18.9
实施例7.菜豆毛盘孢菌孢子在附着和萌发之间的时间相关性
菜豆毛盘孢菌在黑暗中25℃下用马铃薯葡萄糖琼脂培养，每7-14天继代培养。为了制备悬浮液，将15ml无菌水加入培养盘中(7-10天时间)，并将培养盘在旋转摇动器上轻轻地摇动10分钟，以便释放孢子。制得的孢子悬浮液通过玻璃棉过滤，并调节到需要的浓度。孢子附着测定和萌发测定同实施例1针对葡萄孢菌所描述的那样进行，除了SDB培养基含吐温20(40ppm)以及制备的孢子接种体浓度为5×105孢子/ml以外。下表的数据显示出孢子对载片附着的时间依赖性，并该附着同孢子萌发的时间过程具有密切的平行性。
    时间(小时)     附着％     萌发％
    02468     017.132.885.896.4     0011.850.597.7
实施例8.杀真菌剂对葫芦科刺盘孢菌孢子附着的影响
评价各种杀真菌剂抑制孢子附着能力的试验在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中和Permanox孔状载片上进行，并测定这些杀真菌剂对孢子萌发和菌丝体生长的影响。测定同实施例2针对葡萄孢菌所描述的那样进行，除了SDB培养基含吐温20(40ppm)、制备的孢子接种体浓度为5×105孢子/ml，以及附着和萌发测定采用8小时的温育以外。结果显示于下表。对微量滴定板和孔状载片的附着抑制，每一种供试化合物的EC50值是相似的。孢子附着对所有在低浓度(＜2ppm)下抑制萌发的化合物敏感。相反，不抑制萌发的多菌灵，由于菌丝体生长比萌发更敏感地受到它的抑制，它在孢子附着测定中具有很少的活性或无活性。附着抑制EC50同萌发抑制EC50大体上类似。
化合物 *分类   附着抑制(EC50，ppm)   萌发抑制EC50(ppm) 菌丝体生长抑制EC50(ppm)
微量滴定板   孔状载片
  醚菌酯嘧菌酯百菌清氟啶胺多菌灵   GIGIGIGIAG     0.0260.0270.068＜0.0191.96     0.0540.0140.1040.007＞10     0.0150.0100.0050.004＞10     ＞10＞107.100.0170.060
*GI＝萌发抑制剂，AG＝萌发后起作用的化合物实施例9.杀真菌剂对构巢曲霉菌孢子附着的影响
评价各种杀真菌剂抑制孢子附着能力的试验在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中进行。附着测定同实施例2针对葡萄孢菌所描述的那样进行，除了所制备的孢子接种体浓度为2×106孢子/ml以及滴定板在37℃下温育8小时以外。如下表所示，萌发抑制剂(醚菌酯、氟啶胺和百菌清)是高度有效的孢子附着抑制剂，而苯菌灵却不是，它在萌发后发挥作用，是高度有效的菌丝体生长抑制剂。
    化合物     *分类 孢子附着测定EC50
    醚菌酯百菌清氟啶胺苯菌灵     GIGIGIAG     ＜0.0390.0780.097＞20
*GI＝萌发抑制剂，AG＝萌发后起作用的化合物实施例10.Magnaporthe grise孢子附着和萌发之间的时间相关性
孢子从在皮氏培养皿中生长在马铃薯葡萄糖琼脂上Magnaporthegrisea培养物上采集，为了取出孢子，向培养皿中加入水，轻轻地刮擦表面。制得的悬浮液通过玻璃棉过滤，除去菌丝体碎片，将浓度调节到2×105孢子/ml。孢子悬浮液(100μl)加入96孔平底聚苯乙烯微量滴定板的孔中，滴定板的各孔中含100μl酵母提取物葡萄糖培养基(YEG，每升水含30g葡萄糖和4g酵母提取物)，以及在黑暗中25℃下培养。在选定的时间，采用5％戊二醛固定孢子来评价孢子萌发，通过显微镜检查测定已萌发孢子的数量，计算出占总数的百分率。另一滴定板用于测定孢子附着：为了尽可能除去更多的液体，通过倒转和轻拍微量滴定板除去未结合的孢子。附着孢子的计数通过用磺若丹明B染色测定它们的细胞蛋白质含量来实现，也可以通过在染色过程结束时计数每一孔限定面积中孢子的数量。下表的数据显示出孢子对微量滴定板附着的时间依赖性，该附着同孢子萌发的时间-过程具有密切的平行性。
           Magnaporthe grisea在微量滴定板中
                孢子附着和萌发的时间过程
  时间(小时) 附着(A564，SRB染色) 附着(孢子/mm2)     萌发％
    2468     0.0140.0430.0830.118     46.8111.5100.6118.6     8.340.745.858.8
实施例11.各种杀真菌剂对Magnaporthe grisea孢子萌发-伴生附着的 影响
在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中进行评价各种杀真菌剂抑制孢子附着的能力。供试化合物的储液以DMSO制备，然后用YEG稀释，如此之后使DMSO浓度在稀释后≤2％。这些供试化合物溶液的两倍系列稀释液在96孔平底微量滴定板中用YEG(100μl)制备。将孢子悬浮液(浓度2×105孢子/ml，共100μl)加入到孔中，并将滴定板在黑暗中25℃下温育6小时。为了尽可能除去更多的液体，通过倒转和轻拍微量滴定板除去未结合的孢子。附着孢子的计数通过用磺若丹明B染色测定它们的细胞蛋白质含量。附着抑制通过含有杀真菌剂孔中的吸光率值与无杀真菌剂的对照孔中的吸光率值比较来确定。附着抑制EC50值从剂量反应曲线求得。如下表所示，已知的抑制孢子萌发的化合物，如孢子叶球素(strobilurin)类型的化合物醚菌酯和嘧菌酯，以及多作用点杀真菌剂(百菌清和代森锰锌)是强烈的萌发-伴生附着的抑制剂。咪酰胺，一种通过抑制麦角甾醇生物合成而起作用的杀真菌剂，以及破坏细胞微管的甲基硫菌灵，在孢子附着测定中具有很少或无活性。这与它们对萌发几乎无影响，而对菌丝体生长有很强的抑制的事实相一致。
    杀真菌剂     *分类 EC50(ppm)
    醚菌酯嘧菌酯百菌清代森锰锌时鲜胺甲基硫菌灵     GIGIGIGIAGAG     0.0670.0640.0380.115＞10.07.5
*GI＝萌发抑制剂，AG＝萌发后起作用的化合物实施例12.小麦隐匿柄锈菌孢子附着和萌发之间的时间相关性
小麦隐匿柄锈菌的孢子从重感染的小麦叶片上用0.05％吐温20的水溶液洗涤采得。制得的孢子悬浮液通过粗棉布过滤除去叶片污染材料，用0.05％吐温20稀释得到2×105孢子/ml的浓度。
孢子悬浮液(2×106孢子/ml，50μl)加入96孔平底聚苯乙烯微量滴定板的孔中，滴定板的各孔中含50μl 0.05％吐温20。将滴定板置于室温下10分钟，然后在黑暗中19℃下温育，用旋转摇动器在100rpm下连续摇动。在选定的时间，采用5％戊二醛固定孢子来评价孢子萌发，通过显微镜检查测定已萌发孢子的数量，并计算出占总孢子数的百分率。另一滴定板用于测定孢子附着：为了尽可能除去更多的液体，通过倒转和轻拍微量滴定板除去未结合孢子。附着孢子的计数通过用磺若丹明B染色测定它们的细胞蛋白质含量来实现，也可以通过在染色过程结束时计数每一孔限定面积中孢子的数量。下表的数据显示出，如同通过磺若丹明B染色测定或者通过计数附着孢子的数量所得出的结果，孢子以时间依赖的方式对载片附着，并且该附着同孢子萌发的时间-过程具有密切的平行性。
  时间(小时) 附着(SRB染色) 附着(孢子/mm2)   萌发％
    00.511.522.53456     0.0020.020.060.180.350.490.610.850.880.94     01.483.7311.4616.6726.2230.332.6446.7937.41     004.544.0351.0663.1978.6489.7376.7284.68
实施例13.各种杀真菌剂对小麦隐匿柄锈菌萌发-伴生附着的影响
在微量滴定板中进行评价各种杀真菌剂抑制孢子附着的能力。供试化合物的储液以DMSO制备，然后用0.05％吐温20稀释，如此之后使DMSO浓度在稀释后≤2％。这些供试化合物溶液的两倍系列稀释液用0.05％吐温20(50μl)在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中制备。将孢子悬浮液(浓度2×105孢子/ml，50μl)加入到各孔中。将滴定板置于室温下10分钟，然后在黑暗中19℃下温育4小时，同时用旋转摇动器在100rpm下连续摇动。为了尽可能除去更多的液体，通过倒转和轻拍微量滴定板除去未结合的孢子。附着孢子的计数通过用磺若丹明B染色测定它们的细胞蛋白质质含量来实现。附着抑制通过含有杀真菌剂孔中的吸光率值与无杀真菌剂的对照孔中的吸光率值比较来确定。附着抑制EC50值从剂量反应曲线求得。如下表所示。已知的抑制孢子萌发的化合物，如甲酰苯胺类(噻呋酰胺和萎锈灵)、孢子叶球素类型的化合物醚菌酯和氟啶胺，以及多作用点杀真菌剂(百菌清和代森锰锌)均抑制萌发-伴生附着。通过抑制麦角甾醇生物合成而起作用的杀真菌剂(腈苯唑和腈菌唑)在孢子附着测定中具有很少或无活性。这与这些的化合物对孢子萌发不如对菌丝体生长敏感的事实相一致。
    杀真菌剂     *分类     EC50(ppm)
    噻呋酰胺萎锈灵醚菌酯氟啶胺百菌清代森锰锌腈苯唑腈菌唑     GIGIGIGIGIGIAGAG     0.0430.0810.0160.3650.4730.569.2＞10
*GI＝萌发抑制剂，AG＝萌发后起作用的化合物

Claims (7)

1.一种测定潜在的杀真菌化合物的抗真菌活性的方法，所述化合物防止真菌产生能萌发的孢子或分生孢子，该方法包括以下步骤：
(i)将含在水中或含水营养培养基中的真菌孢子悬浮液施加在一种含有或不含有潜在的杀真菌化合物的基质表面上，
(ii)在适合孢子萌发的一定温度下培养足够长的时间以使萌发发生，
(iii)除去未结合的孢子，
(iv)测定与含有或不含有潜在的杀菌化合物的基质表面结合的孢子数或真菌材料的数量，
(v)确定上述潜在的杀真菌剂对真菌的毒性效果，通过将处理样品与对照比较，用与基质表面结合的孢子或真菌材料的数量的减少来表示所述的毒性效果。
2.一种测定潜在的杀真菌化合物的抗真菌活性的方法，所述化合物防止真菌产生能萌发的孢子或分生孢子，该方法包括以下步骤
(i)将含在水中或含水营养培养基中的真菌孢子悬浮液施加在一种含有或不含有潜在的杀真菌化合物的基质表面上，
(ii)在适合孢子萌发的一定温度下培养足够长的时间以使萌发发生，
(iii)通过测定处理与对照样品中未与基质表面结合的孢子数或真菌材料的数量，并将该数量从孢子总数或真菌材料总量中减去，来确定与含有或不含有潜在的杀菌化合物的基质表面结合的孢子数或真菌数量，
(iv)确定上述潜在的杀真菌剂对真菌的毒性效果，通过将处理样品与对照比较，用与基质表面结合的孢子或真菌材料的数量的减少来表示所述的毒性效果。
3.权利要求1或2的方法，其中所述真菌选自子囊菌纲、半知菌纲和担子菌纲。
4.权利要求3的方法，其中所述真菌的种选自葡萄孢菌、Magnaporthe、毛盘孢菌、曲霉菌、柄锈菌、单孢锈菌、白粉菌、镰孢菌、链格孢菌、青霉菌、长蠕孢菌、黑星菌、尾孢菌、壳针孢菌、球腔菌、钩丝壳霉菌、柄球菌、链核盘菌、单丝壳菌、核腔菌、假尾孢菌、嘴孢菌、核盘菌和茎点霉菌。
5.权利要求1或2的方法，其中通常可对所述真菌进行遗传修饰，使之能表达易于检测的信号如绿色荧光蛋白质、颜料或荧光染料。
6.权利要求1或2的方法，其中所述基质是聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃，或一种能使真菌在其上长成菌落的天然或合成的基质。
7.权利要求6的方法，其中所述天然或合成的基质是植物或动物细胞或组织、皮革、木材、纺织品、金属或塑料。
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