CN102759513A

CN102759513A - 一种快速检测灰霉病菌对杀菌剂敏感性的方法

Info

Publication number: CN102759513A
Application number: CN2012102597338A
Authority: CN
Inventors: 刘峰; 幕卫; 杨晓楠
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2012-07-25
Publication date: 2012-10-31

Abstract

一种快速检测灰霉病菌对杀菌剂敏感性的方法，具体是基于微孔板法对杀菌剂对灰霉病菌的抑制效果进行测定的方法。在测定杀菌剂对灰霉孢子萌发的抑制率时，其步骤为：1）设置不同药剂浓度处理组及对照组。2）测定其OD值，培养24h后再测定OD值，根据其OD变化值计算药剂对分生孢子萌发的抑制率。在测定杀菌剂对灰霉菌丝生长抑制率时，其步骤为：1）将微孔板中灰霉孢子悬浮液培养12h，再设置不同药剂浓度处理组及对照组。2）测定OD值，培养12-24h后再测定OD值，根据其OD变化值计算药剂对灰霉菌丝生长的抑制率。该方法综合了孢子萌发法和菌丝生长速率法的优势，测试速度快、结果准确、重现性好，具有良好的实用性。

Description

一种快速检测灰霉病菌对杀菌剂敏感性的方法

（一）技术领域

本发明涉及杀菌剂室内毒力测定技术，具体是基于微孔板法对杀菌剂对灰霉病菌的抑制效果进行快速、准确测定的方法。

（二）技术背景

灰霉病Botrytis cinerea是寄主范围很广的世界性病害，在番茄、黄瓜等设施蔬菜上危害尤为严重，生产上灰霉病主要以化学防治为主。但番茄灰霉病菌是一种较易产生抗药性的高风险真菌，其对不同杀菌剂的抗性发展在国内外已经被频繁报道，及时进行快速高效的敏感性检测是灰霉病菌抗药性治理的必要程序。另外，由于新杀菌剂开发成功机率的降低以及合成能力迅速提高，利用室内生测方法对新化合物的抑菌效果进行高通量筛选已成为新农药创制过程中的必经环节。传统的杀菌剂室内生测方法为孢子萌发法和菌丝生长速率法，前者计数困难，后者测试时间较长（72h）、工作量大，两者很难作为快速进行敏感性检测和高通量筛选杀菌剂的方法。寻找快速、准确和易于操作的生测方法成为国内外病菌敏感性检测和杀菌剂高通量筛选的目标。

微孔板法（Microtiter method）是利用酶标仪的比色功能快速检测微孔板（96孔板）中悬浮液的OD值，以OD增加值作为评价指标，用空白对照组与药剂处理组OD增加值的差值来计算药剂抑制率的方法。该方法在杀细菌剂筛选中应用较多，但在杀真菌剂中报道较少。G.Stammler（2006）曾用YBA培养液制得2×10⁴个/ml的孢子悬浮液，利用微孔板法测定了啶酰菌胺对灰霉病菌孢子萌发及菌丝生长的综合抑制效果，由于孔中悬浮液OD值增加缓慢，测试时间长达5d；张晓等（2010）建立了番茄早疫病菌Alternaria solania的高通量定量筛选方法，并对常用杀菌剂的抑菌效果进行了评价，但是该方法只能检测药剂对番茄早疫病菌孢子萌发及菌丝生长的综合抑制效果，在只检测孢子萌发抑制率时则OD增加值过小，由于酶标仪本身有一定的测量误差，OD增加值过小容易导致测试结果的重复性差。

（三）发明内容

本发明以番茄灰霉病菌B.cinerea为对象，以已有研究方法为基础，通过对试验条件进行优化尽量增加了孔中悬浮液OD增加值，并通过与传统生测方法的比较确定了合适的测量时间，目的在于确定一种快速、准确的杀菌剂室内生测方法，使其能够用于分别测定杀菌剂对灰霉病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制效果。

1）测定杀菌剂对灰霉病菌孢子萌发抑制率以及对孢子萌发和菌丝生长综合抑制率的方法步骤为：

将用PDE培养基洗脱、过滤获得的孢子悬浮液加入到96孔板中，再加入经稀释过的待测药剂，获得相应的药剂质量浓度，并设置空白对照组。用封口膜将96孔板密封严实，于酶标仪上测定OD值(对照0h吸光度值为OD₀，各处理0h吸光度值为OD₁)。于21℃黑暗条件下振荡（150r/min）培养，分别于24h、36h时再测定OD值，按照公式(1)计算药剂对分生孢子萌发的抑制率（24h时）及对孢子萌发和菌丝生长的综合抑制率（36h时）。

2）测定杀菌剂对灰霉病菌菌丝生长抑制率的方法步骤为：

将用PDE培养基洗脱、过滤获得的孢子悬浮液加入到96孔板中，将其于21℃黑暗条件下振荡（150r/min）培养12h后，再加入经稀释过的药剂，获得相应的待测药剂质量浓度，设置空白对照组。用封口膜将96孔板密封严实，于酶标仪上测定OD值(对照0h吸光度值为OD₂，各处理0h吸光度值为OD₃)。于21℃黑暗条件下振荡（150r/min）再培养，于12-24h后再测定OD值。按照公式（2）计算药剂对菌丝生长的抑制率。

所述的PDE培养基，其配置方法为：马铃薯200g，沸水煮30分钟后过滤得到滤液，向滤液中加入葡萄糖20g，加去离子水至1L，经灭菌后每升加入激动素0.01g，赤霉素0.05g，维生素B2 0.15g，FeCl₃ 0.15g，CaCl₂ 0.2g，链霉素（50μg/mL）且用1mol/L NaOH调节至pH值4.5。

所述孢子悬浮液孢子浓度为8×10⁵～1.6×10⁶个/mL，96孔板中每孔加入的孢子悬浮液和药剂的量分别为180μL和20μL。

所述酶标仪测定波长为630nm。

本发明的有益效果是：

1）本发明通过对试验条件的优化，提高了孢子悬浮液OD值增加速度，基本满足了快速测定的要求。

2）本发明通过改变加入药剂的时机，以及将测试结果与传统方法进行比对来确定合适的测量时间，达到了利用同一装置分别测定药剂对病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制效果的目的。

（四）具体实施方式

下面对本研究的具体实施方式进一步详细说明。

实施例1：利用本方法测定啶酰菌胺对采自山东省泰安市、寿光市和聊城市番茄日光温室病果上的57株灰霉菌株孢子萌发及菌丝生长的抑制效果。

将灰霉菌株用PDE洗脱、过滤获得的8×10⁵个/mL孢子悬浮液，加入到96孔板中的48个孔中（横排×竖排为8×6），每孔180μL，然后分别进行如下操作：

1）每孔加入经稀释过的啶酰菌胺药液20μL，使每横排啶酰菌胺的最终浓度为：0,0.03,0.1,0.3,1,3,10和30μg/mL，以等体积加入20μL无菌水为对照。每个药剂浓度重复6次，试验重复进行两次。用封口膜将96孔板密封严实，于酶标仪上测定OD₆₃₀值(对照0h吸光度值为OD₀，各处理0h吸光度值为OD₁)。于21℃黑暗条件下振荡（150r/min）培养，于24h时再测定OD₆₃₀值，按照公式(1)计算药剂对分生孢子萌发的抑制率，进一步计算抑制中浓度(EC₅₀)值。

2）将孢子悬浮液置于21℃黑暗条件下振荡（150r/min）培养12h后，再加入经稀释过的啶酰菌胺20μL，使啶酰菌胺最终浓度为：0,0.03,0.1,0.3,1,3,10和30μg/mL，以等体积加入20μL无菌水的孢子悬浮液为对照。每处理重复6次，试验重复两次。用封口膜将96孔板密封严实，于酶标仪上测定OD₆₃₀值(对照0h吸光度值为OD₂，各处理0h吸光度值为OD₃)。于21℃黑暗条件下振荡（150r/min）再培养，于18h后再测定OD₆₃₀值。按照公式（2）计算药剂对菌丝生长的抑制计算率。进一步计算抑制中浓度(EC₅₀)值。实验结果见表1。

表1灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性频率分布

结果表明，啶酰菌胺抑制灰霉病菌分生孢子萌发的EC₅₀值在不同菌株间存在较大差异，最低为0.1476μg/mL，最高为6.9198μg/mL，相差46.87倍，其EC₅₀均值为1.9311μg/mL。啶酰菌胺抑制菌丝生长的EC₅₀值为0.8520-18.0211μg/mL，均值为5.6488μg/mL。就EC₅₀均值看来，啶酰菌胺对灰霉分生孢子萌发的抑制作用强于对菌丝生长的抑制作用。

Claims

1.一种快速测定杀菌剂对灰霉病菌孢子萌发抑制率以及对孢子萌发和菌丝生长综合抑制率的方法，其特征是，步骤如下：

1）将用PDE洗脱、过滤获得的孢子悬浮液加入到96孔板中，再加入经稀释过的药剂，获得相应的药剂质量浓度，并设置空白对照组；

2）用封口膜将96孔板密封严实，于酶标仪上测定OD值(对照0h吸光度值为OD₀，各处理0h吸光度值为OD₁)，于21℃黑暗条件下振荡（150r/min）培养，分别于24h、36h时再测定OD值，按照公式(1)计算药剂对分生孢子萌发的抑制率（24h时）及对孢子萌发和菌丝生长的综合抑制率（36h时），

2.一种快速测定杀菌剂对灰霉病菌菌丝生长抑制率的方法，其特征是，步骤如下：

1）将用PDE洗脱、过滤获得的孢子悬浮液加入到96孔板中，将其于21℃黑暗条件下振荡（150r/min）培养12h后，再加入经稀释过的药剂，获得相应的药剂质量浓度，设置空白对照组；

2）用封口膜将96孔板密封严实，于酶标仪上测定OD值(对照0h吸光度值为OD₂，各处理0h吸光度值为OD₃)，于21℃黑暗条件下振荡（150r/min）再培养，于12-24h后再测定OD值。按照公式（2）计算药剂对菌丝生长的抑制率，

3.根据权利要求1、2所述的快速测定方法，其特征是，步骤1）所述的PDE培养基，其配置方法为：马铃薯200g，煮好过滤后加入葡萄糖20g，加去离子水至1L，经灭菌后每升加入激动素0.01g，赤霉素0.05g，维生素B2 0.15g，FeCl₃ 0.15g，CaCl₂ 0.2g，链霉素（50μg/mL）且用1mol/L NaOH调节至pH值4.5。

4.根据权利要求1、2所述的快速测定方法，其特征是，步骤1）所述的所述孢子悬浮液孢子浓度为8×10⁵～1.6×10⁶个/mL，每孔加入的孢子悬浮液和药剂的量分别为180μL和20μL。

5.根据权利要求1、2所述的快速测定方法，其特征是，步骤2）所述酶标仪测定波长为630nm。

6.根据权利要求1所述的快速测定方法，其特征是，步骤2）所述测定时间分别为24h和36h。

7.根据权利要求2所述的快速测定方法，其特征是，步骤2）所述测定时间为12-24h。