CN1260395A - 与抗癌基因编码产物pRB相作用的人类基因pRb－BP131 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb－BP131,它的cDNA由1384个核苷酸组成,编码序列编码187个氨基酸组成的蛋白质。它在人体的正常组织中广泛表达。pRb－BP131基因定位在第15号染色体q21.2－21.3区段。

Description

与抗癌基因编码产物pRB相作用的人类基因pRb-BP131

本发明涉及与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP131及它在人体各组织中的表达和在染色体上的定位，以探索肿瘤诊断和治疗的新途径。

Rb基因是人类报道最早的肿瘤抑制基因，其正常的编码蛋白不仅是一种重要的细胞增殖抑制因子，还广泛参与了细胞分化、细胞凋亡、抑制肿瘤形成等多种复杂的生理过程(Mulligan，G.，TIG，1998，14：223-229；Knudsen，E.S.et al.，Genes & Dev.，1998，12：2278-2292；Luo，R.X.，etal.，Cell，1998，92：463-473；Macleod，K.，Curr.Opin.Genet.Dev.，1999，9(1)：31-39)其核心环节就是DNA与蛋白质，蛋白质与蛋白质相互作用，Rb发生作用主要是通过影响转录来实现的，它通过与多种转录因子的相互作用对转录发生正调控或负调控。

正常的Rb具有抑癌功能，但Rb基因的一些缺失或突变所造成的突变体由于丧失了对细胞增殖、分化等的正常控制而导致细胞癌变。常见的由于Rb突变所导致的肿瘤有视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、前列腺癌和膀胱癌(Paggi，M.G.，et al.，J.Cell Biochem.，1996，62：418-430)。此外，Rb还是一些小的DNA肿瘤病毒的病毒抗原(如腺病毒的E1A蛋白、SV40的大T抗原)的早期作用因子。因此，Rb与各蛋白质因子之间的相互作用显得尤为重要，已成为人们注意的焦点。过去几年来，人们已经克隆了许多编码产物能够与pRB相作用的基因(Weinberg，R.A.，Science，1991，254：1138-1146；Cavanaugh，A.H.，et al.，Nature，1995，374：177-180；Wang，C.Y.，et al.，Science，1993，260：1330-1335；Dunaief，J.L.，et al.，Cell，1994，79：119-130；Woitach，J.T.，et al.，Nat.Genet.，1998，19(4)：371-374；Simons，A.，et al.，Oncogene，1997，14(2)：145-155)，一方面研究这些因子的结构特征，寻找它们与pRB的作用规律，另一方面致力于研究它们的功能。这两方面的研究为阐明pRB参与细胞各项生理过程的调控机制奠定了基础。同时研究Rb与其他蛋白质因子的相互作用，有助于探讨肿瘤的发病机制，为肿瘤的诊断和治疗提供新的设想和方案。

酵母双杂交系统是近年来发展起来的一种在体内研究蛋白质之间相互作用的体系(Chien，C.T，et al.Proc.Acad.SCi.USA，1991，88：9578-9582)该系统的原理是基于酵母中的一种转录因子GAL4功能的重建。GAL4分子含有两个相对独立的功能域：DNA结合区和转录激活区。把欲验证存在相互作用的两个蛋白质(X和Y)的基因分别与GAL4的DNA结合区和转录激活区融合，再将这两个融合表达载体转入特殊的酵母细胞中，此酵母菌的染色体上，已整合了可被GAL4的DNA结合区所识别并结合的位点及下游报告基因(HIS 3或Lac Z)，如果两个蛋白质之间发生相互作用，报告基因就能表达。蛋白质Y也可是一个基因文库，这样就可以从中筛选与蛋白质X相互作用的新蛋白质基因。

为此，本发明的目的是提供一种能与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP131全长cDNA序列，并表明它在16种正常人组织中表达水平及在染色体上的定位，在肿瘤的诊断和治疗上具有潜在的应用意义。

本发明是一种与抗癌基因编码产物pRB相作用的人类新基因pRb-BP131，它是根据上述情况，利用pRB融合GAL4的DNA结合区，作为蛋白质X，以人胎脑cDNA文库融合GAL4的转录激活区为蛋白质Y，筛选到了一个人类新基因pRb-BP131。测定了其全序列，并进行了染色体定位和在16种正常人组织中的Northern杂交分析，为研究pRB的作用原理开辟了新的途径。

本发明以pRB为靶分子，利用酵母双向杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选到多个阳性克隆，测定各阳性克隆的cDNA序列，得到一个长度为596bp的cDNA序列(序列表SEQ ID NO：1)，经基因数据库检索未发现同源序列，该cDNA序列编码187个氨基酸的肽段(序列表SEQ ID NO：3)。Northern杂交的结果表明，该基因全长mRNA约为1.4kb。在进一步的双向杂交筛选中又得到一个长约1.2kb的克隆，测定其核苷酸序列后，确定它们可以共同拼接成pRb-BP131基因的全长cDNA(图1)，全长为1384bp(序列表SEQ ID NO：2)。其中5’非翻译区为62bp，编码区为564bp，编码187个氨基酸组成的蛋白质(序列表SEQ ID NO：3)，3’非翻译区为758bp。

该基因的编码产物C端区(178-182位氨基酸)存在一个RB结合蛋白所特有的LxCxE结合模体(motif)。经数据库检索，未显示它与任何蛋白编码基因之间有较高的同源性，该基因为“孤儿”基因，同家族的其他基因尚未见有报道。

进行16种正常人组织mRNA的Northern杂交分析，结果表明该基因在各种组织中广泛表达(图2)。其中在心脏、脑、胰脏和睾丸组织中表达量较高，在胎盘中表达量次之，在胸腺、肝脏、肾脏、脾脏、骨胳肌、卵巢、小肠、结肠、前列腺、和外周血白细胞中有一定表达，在肺中只有微量的表达。

本发明还利用辐射杂交细胞系法(Radiation hybrid，简称RH)进行了pRb-BP131基因的染色体定位分析。在pRb-BP131基因3’非编码区合成一对引物(序列表SEQ ID NO：5)，对RH Mapping Kit中的83个辐射杂交细胞株的模板进行PCR反应，实验结果在计算机中进行连锁和统计分析，将该基因定位于第15号染色体的q21.2-21.3区段。

本发明的优点与功能：

1、提供一种全新的pRb-BP131基因的cDNA序列，它的编码产物能与抗癌基因的产物pRB相作用，在肿瘤的诊断和治疗上具有潜在的应用意义。

2、pRb-BP131在16种正常人组织中广泛表达，显示该基因在细胞内具有重要功能作用，可作为诊断指标。

3、本发明已将pRb-BP131基因定位在15号染色体的q21.2-21.3区段，宜进行染色体上基因的连锁分析，应用于疾病的诊断。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

附图说明：

图1.pRb-BP131 cDNA片段的克隆

图中53-647为双向杂交筛出的131号克隆的核苷酸序列，即SEQ ID

NO：1中的序列

图中217-1384为双向杂交筛出的41号克隆的核苷酸序列

图2.以pRb-BP131为探针，人不同组织mRNA的Northern杂交

图中：1.心脏   2.脑      3.胎盘     4.肺脏

      5.肝脏   6.骨胳肌  7.肾脏     8.胰脏

      9.脾脏   10.胸腺   11.前列腺  12.睾丸

     13.卵巢   14.小肠   15.结肠    16.外周血白细胞

实施例1利用酵母双向杂交系统筛选pRb-BP131 cDNA片段

将pRB与GAL4 DNA结合结构域融合的表达质粒和人胎脑cDNA文库与GAL4转录激活结构域融合的表达质粒(均购自CLontech公司)共转化于酵母HF7c中。靶蛋白质粒的营养筛选标记为TRP1基因，文库质粒的营养筛选标记为LEU2因，如果靶蛋白与被检测蛋白之间有相互结合，就激活HF7c中报告基因HIS3的表达，因此细胞就能在缺少Leu、Trp和His的基本培养基上生长。在1.5×10⁶个转化子(在L^-和W^-平板上)中获得295个能在SD(W^-L^-H^-)平板上生长的双转化子。为了排除假阳性克隆，测定这些克隆的半乳糖苷酶活力，发现有57个克隆在X-gal平板上显蓝色。将阳性转化子接种于缺少Leu的培养液中培养，抽取质粒DNA，转化大肠杆菌，再制备质粒DNA。将该质粒与靶蛋白质粒转化到另一酵母菌株SFY526中，在X-gal平板上均显蓝色，表明有半乳糖苷酶活力，证明确为阳性克隆。对57个阳性克隆中的cDNA文库质粒分别进行限制性内切酶图谱分析和部分DNA序列测定，57个阳性克隆仅代表6个独立的基因，得到一个cDNA片段长度为596bp(序列表SEQ IDNO：1)，在基因文库中未查询到同源序列，它代表一个新的人类基因，并命名为pRb-BP131。

实施例2.pRb-BP131全长cDNA的克隆和测序

在后续的双杂交阳性克隆的测序过程中又得到一个长度为1184bp的片段，和第一步得到的596bp的片段有约430bp的重叠。进行阅读框分析，发现它们能共同拼接成全长pRb-BP131 cDNA克隆(图1)。后在5’和3’分别合成引物(序列表SEQ ID NO：4)，以人胎脑cDNA文库为模板，确实能得到长约1.4kb的PCR扩增片段。pRb-BP131 cDNA全长1384bp，5’非翻译区为62bp，编码区为564bp，3’非翻译区为758bp(序列表SEQ ID NO：2和NO：3)。

实施例3 pRb-BP131在人正常组织中表达分析

将固定有人16种正常组织mRNA的尼龙膜(CLontech公司)，放入杂交管内，加入5ml 68℃预热的快速杂交液(CLontech公司)，68℃预杂交1小时，加入变性的同位素标记的pRb-BP131的0.6kb片段，68℃杂交2小时。取出杂交管洗膜，2×SSC，0.05％SDS中室温10分钟，0.1×SSC，0.1％SDS 50℃洗两次，共30分钟。将膜置于滤纸上晾干，压片，即得图2。

实施例4 pRb-BP131在染色体上的定位

在pRb-BP131 cDNA的3’非编码区合成一对引物(序列表SEQ IDNO：5)，对RH Mapping Kit(购自Stanford SHGC)中的83个辐射杂交细胞系的模板进行PCR反应：10μl体系，含25ng模板，1.5mM Mg²⁺，200μMdNTP，两种引物各8pM，1μl10×PCR Buffer，1U Taq酶，反应条件为95℃ 4分钟热启动后按94℃ 25秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒的顺序进行35个循环的反应，最后在72℃继续延伸7分钟。电泳分析PCR结果，其PCR产物为242bp，有相应扩增产物的记为1，无扩增产物的记为0，按顺序将结果排成串，送到SHGC网站中在计算机中进行连锁和统计分析，找出与之连锁的已经定位的标记基因，从而将该基因定位于第15号染色体的q21.2-21.3区段。

                        序列表(1)一般信息

(I)申请人：中国科学院上海生物化学研究所

(II)发明名称：与抗癌基因编码产物pRB相作用的人类基因pRb-BP131

(III)序列数：5(2)SEQ ID NO：1信息

(I)序列特性：

  (A)长度：596个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性

(II)分子类型：cDNA

(III)序列描述：SEQ ID NO：1：GGTTTGCACA  ATGTCGGAAA  TGGCTGAGTT  GTCCGAGCTG  TATGAAGAGA  GCAGTGACCT      60GCAGATGGAT  GTGATGCCTG  GCGAGGGTGA  CCTTCCGCAG  ATGGAGGTAG  GCAGCGGGAG     120CCGGGAGCTA  TCCCTGCGTC  CCTCCCGCAG  CGGGGCCCAA  CAGCTCGAGG  AGGAAGGCCC     180AATGGAGGAG  GAGGAGGCCC  AGCCAATGGC  GGCGCCAGAG  GGGAAACGGA  GCCTTGCTAA     240CGGGCCCAAC  GCTGGGGAGC  AGCCAGGCCA  GGTGGCGGGC  GCAGACTTCG  AGAGCGAGGA     300CGAGGGCGAG  GAATTTGATG  ACTGGGAGGA  CGACTACGAC  TATCCCGAAG  AGGAGCAGCT     360CAGTGGTGCC  GGCTACAGAG  TATCAGCCGC  TCTTGAAGAA  GCCGACAAGA  TGTTTCTGAG     420AACAAGAGAA  CCAGCCCTGG  ATGGCGGGTT  TCAGATGCAT  TATGAGAAGA  CCCCGTTTGA     480TCAGTTAGCT  TTTATCGAAG  AGCTTTTTTC  ACTGATGGTT  GTCAATCGTC  TGACCGAAGA     540ACTCGGCTGT  GATGAGATTA  TTGATAGAGA  GTAGTTAGAT  GCTGTTAAAA  GAGGAG         596(3)SEQ ID NO：2信息

(I)序列特性：

  (A)长度：1384个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性

(II)分子类型：cDNA

(III)序列描述：SEQ ID NO：2：CGCACGGCCG  CGCAGATCTG  TCTTGCTGGA  AGCTTTTTCC  TAGAGGTTGA  GCGGTTTGCA            -3CAATGTCGGA  AATGGCTGAG  TTGTCCGAGC  TGTATGAAGA  GAGCAGTGAC  CTGCAGATGG            58ATGTGATGCC  TGGCGAGGGT  GACCTTCCGC  AGATGGAGGT  AGGCAGCGGG  AGCCGGGAGC           118TATCCCTGCG  TCCCTCCCGC  AGCGGGGCCC  AACAGCTCGA  GGAGGAAGGC  CCAATGGAGG           178AGGAGGAGGC  CCAGCCAATG  GCGGCGCCAG  AGGGGAAACG  GAGCCTTGCT  AACGGGCCCA           238ACGCTGGGGA  GCAGCCAGGC  CAGGTGGCGG  GCGCAGACTT  CGAGAGCGAG  GACGAGGGCG           298AGGAATTTGA  TGACTGGGAG  GACGACTACG  ACTATCCCGA  AGAGGAGCAG  CTCAGTGGTG           358CCGGCTACAG  AGTATCAGCC  GCTCTTGAAG  AAGCCGACAA  GATGTTTCTG  AGAACAAGAG           418AACCAGCCCT  GGATGGCGGG  TTTCAGATGC  ATTATGAGAA  GACCCCGTTT  GATCAGTTAG           478CTTTTATCGA  AGAGCTTTTT  TCACTGATGG  TTGTCAATCG  TCTGACCGAA  GAACTCGGCT           538GTGATGAGAT  TATTGATAGA  GAGTAGTTAG  ATGCTGTTAA  AAGAGGAGGA  AACTACTTGA           598GGAGGGACCC  AACTTTCCGC  TATCTTTTGG  GTTCATTCCA  AATAGTTTTG  TGCCATTGAA           658AAACTTGACC  TTCAAAAAAA  TTTGTTTTTC  AGAATAGAAC  ACAATAGGAC  AGTGACTGCA           718CAGTTGTGAA  AAAGGAAGAG  AATCATTAAA  GAAAAAGAAA  AAAGATTTTA  AGACCGTTGA           778AATCAATTAT  CAAGAACGTC  CTAAAACACC  TATGGCTTTG  ACTTTGTTAT  TGATCCAGAT           838TATTTTCCTT  GCATTGGGGA  AAATATCTTT  CATATTTGTT  TGCTGTAAAG  ATGGTTTTGC           898AAGAATAAGT  CATGACCAAG  ACAAACTGCC  AATACAAAAG  CCCACTGATA  CTAATTATAT           958AATGAGAAAA  AAATGTATCC  AACTAGGACA  CATATCTTTT  GAGTTATTTG  GACTGAAAGC          1018TTAAGAAAAC  TTGGAAAATT  CTATTTTGTG  ATCTAGTCAA  GCCACAGTTA  TCAAAGGCTA          1078CATTTTCAGT  GTAAGATAAA  TGGATGAGTA  AACTCAAATA  TGTATCACGT  GTGCTTTGTA          1138TCTTAAGATG  TGTTTCCAAG  AGCATCTGAA  ATTTTGTTTG  TACATGTATC  TTGATCATTT          1198ATAAAGCCAC  TGTGATCTAT  AAATCAAGAA  AATCCATTGT  CATAACCATT  TTTAAAAGTC          1258AAAAATTAAG  ACATCCTTAA  TTAAAAAGTT  TCAAATCTAG  ACACTAAATG  TGTGTGAATG          1318TACA                                                                            1322(4)SEQ ID NO：3信息

(I)序列特性：

  (A)长度：187个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(II)分子类型：蛋白质

(III)序列特征：178～182位为pRB结合蛋白所特有的结合模体(图中下划线所示为该模体中保守的三个氨基酸L、C和E)

(IV)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Ser Glu Met Ala Glu Leu Ser Glu Leu Tyr Glu Glu Ser Ser    15Asp Leu Gln Met Asp Val Met Pro Gly Glu Gly Asp Leu Pro Gln    30Met Glu Val Gly Ser Gly Ser Arg Glu Leu Ser Leu Arg Pro Ser    45Arg Ser Gly Ala Gln Gln Leu Glu Glu Glu Gly Pro Met Glu Glu    60Glu Glu Ala Gln Pro Met Ala Ala Pro Glu Gly Lys Arg Ser Leu    75Ala Asn Gly Pro Asn Ala Gly Glu Gln Pro Gly Gln Val Ala Gly    90Ala Asp Phe Glu Ser Glu Asp Glu Gly Glu Glu Phe Asp Asp Trp   105Glu Asp Asp Tyr Asp Tyr Pro Glu Glu Glu Gln Leu Ser Gly Ala   120Gly Tyr Arg Val Ser Ala Ala Leu Glu Glu Ala Asp Lys Met Phe   135Leu Arg Thr Arg Glu Pro Ala Leu Asp Gly Gly Phe Gln Met His   150Tyr Glu Lys Thr Pro Phe Asp Gln Leu Ala Phe Ile Glu Glu Leu   165Phe Ser Leu Met Val Val Asn Arg Leu Thr Glu Glu Leu Gly Cys   180Asp Glu Ile Ile Asp Arg Glu                                   187(5)SEQ ID NO：4信息

(I)序列特性：

  (A)长度：28个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(II)分子类型：DNA(PCR引物)

(III)序列描述：SEQ ID NO：4：5’引物：TCTGTCTTGC  TGGAAGCTTT  TTCCTAGA    283’引物：TGTACATTCA  CACACATTTA  GTGTCTAG    28(6)SEQ ID NO：5信息

(I)序列特性：

  (A)长度：20个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(II)分子类型：DNA(PCR引物)

(III)序列描述：SEQ ID NO：5：

5’引物：CAGATGCTCT TGGAAACACA    20

3’引物：CTGCCAATAC AAAAGCCCAC    20

Claims (1)

1、一种与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP131，其特征在于它具有如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列和如序列表SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

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