CN1257986C - 检测遗传性乳光牙本质的突变基因dspp的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测遗传性乳光牙本质的突变基因dspp的方法。本发明将遗传性乳光牙本质的突变位点定位于dspp的第三个外显子处并提供了该方法在遗传性乳光牙本质疾病的检测与治疗中的应用，为进一步研究牙齿的矿化过程以及遗传性乳光牙本质的致病机理以及用于患者的临床诊断或产前诊断奠定了基础。本申请还提供了一种试剂盒以及试剂盒在遗传性乳光牙本质的检测与治疗方法中的应用。

Description

检测遗传性乳光牙本质的突变基因dspp的方法

发明领域

本发明涉及一种检测遗传性乳光牙本质的突变基因dspp的方法，该方法可为直接测序法或限制性内切酶法或寡核苷酸探针杂交法。更具体地说，本发明是一种将遗传性乳光牙本质的突变位点定位于dspp的第三个外显子处的方法。另外，本申请还涉及了依据本发明的方法制备而成的试剂盒以及试剂盒在遗传性乳光牙本质的检测与治疗方法中的应用。

背景技术

遗传性乳光牙本质是一种常染色体显性遗传病，发病率为1/8000，1973年Shields将其归为II型牙本质生长不全(Dentinogenesis Imperfect Type II)。患者的乳牙和恒牙均受到影响，受累的牙齿呈灰蓝色或深棕色且伴有乳白色光泽。在X光片下，可以看到牙冠呈球形，牙根变小，髓室和根管变窄或完全闭锁。牙釉质的形成尽管不受遗传性乳光牙本质的直接影响，但是由于牙本质和牙釉质的接触面从贝壳状变平，使牙釉质很容易从牙本质上脱落，使本来就发育不良的牙本质过快磨损，牙齿显著变短，严重者可磨低至牙槽突。由于过度磨损，年龄较大的病人可出现牙槽骨的增生和牙龈的增厚、纤维性变。结果，遗传性乳光牙本质患者不得不接受广泛的牙齿护理和昂贵的治疗。

遗传性乳光牙本质的致病基因已被定位在4q21上的2MB的范围内，在此范围内已发现4个基因与组织的矿化过程有关。它们分别是分泌型焦磷酸蛋白(secreted phosphoprotein 1，SSP1)，牙本质基质蛋白1(dentin matrixprotein 1，DMP1)，牙本质唾液酸焦磷酸蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)和骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，IBSP)。最近dspp的基因组顺序被测定完成(AF163151)。dspp编码DSP和DPP 2个蛋白质，其中DPP高度磷酸化，被认为可调节羟基磷灰石晶体的形状和大小，在羟基磷灰石晶体的成核过程中起着重要的作用。

尽管dspp的基因组被测定完成，但是本领域却没有人利用直接测序法、限制性内切酶法或寡核苷酸探针杂交法将遗传性乳光牙本质的突变位点定位于dspp的具体外显子处；发明人选取4q21附近的8个短串联重复序列标记(STRP)，进行连锁分析，把本发明所用遗传性乳光牙本质家系的致病基因定位在染色体4q。通过对dspp基因前4个外显子及其旁侧的基因组序列的测定，发现了1个无义突变，且突变造成了翻译的提前终止。因为限制性内切酶RsaI具有识别突变与正常的DNA序列的特点，所以上述突变可通过RsaI酶切来检测。通过对无义突变位点的检测，从而为进一步研究牙齿的矿化过程以及遗传性乳光牙本质的致病机理以及用于患者的临床诊断或产前诊断奠定了基础。另外，发明人依据本发明的方法制备成一种可准确快速诊断遗传性乳光牙本质疾病的试剂盒。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种检测遗传性乳光牙本质的突变基因dspp的方法。

在本发明一个方面，通过连锁分析把本发明中所使用家系的致病基因定位在染色体4q。然后测定侯选基因dspp前4个外显子在患者中的基因组序列，并于正常对照做比较，发现在dspp的第三个外显子中有一个无义突变，从而本发明找到了遗传性乳光牙本质的致病基因为dspp。由于该突变导致了限制性内切酶RsaI识别位点的改变，所以该方法为检测遗传性乳光牙本质病提供了方便。并且本发明为进一步研究牙齿的矿化过程以及遗传性乳光牙本质的致病机理及治疗奠定了基础。另外，本发明发现dspp基因是遗传性乳光牙本质的致病基因，这是进一步在更多的遗传性乳光牙本质家系中寻找dspp基因的其它致病突变的前提，也为下述的诊断试剂盒的更加完善奠定了基础。

本发明的另一个目的是提供一种dspp突变基因在遗传性乳光牙本质治疗中的应用。

本发明的再一个目的是依据上述方法提供一种含外侧forward primer、外侧reverse primer、内侧forward primer、内侧reverse primer、10倍PCR反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶、MgCl₂、限制性内切酶RsaI、限制性内切酶10倍反应缓冲液、BSA的试剂盒。通过使用该试剂盒在本发明发现的无义突变附近设计PCR引物，进行PCR反应，再用限制性内切酶RsaI酶切PCR产物，即可简便快速的诊断此病。该诊断试剂盒不但可使遗传性乳光牙本质的临床诊断更加准确，而且还可用于产前诊断。

本发明还提供上述试剂盒在遗传性乳光牙本质的检测与治疗方法中的应用。

另一方面，本发明把dspp基因和遗传性乳光牙本质联系起来，为此病的治疗提供了新的思路。在进一步了解突变的dspp基因致病的基础上，合成可调节牙齿矿化过程的相关药物进行治疗。

附图简述

图1.遗传性乳光牙本质家系图。图中的先证者用左上尖头表示，黑色图标代表受累个体。

图2.遗传性乳光牙本质患者dspp基因与正常对照的部分测序图谱。左边图谱为正常个体的dspp的部分图谱，右边为患者的突变dspp基因的部分测序图谱。

图3.PCR产物经RsaI酶切的酶切图谱。左边第一个+/+为对照(Cont.)的酶切图谱；+/-为受累个体的酶切图谱；其余+/+为正常个体的的酶切图谱，因其dspp的无义突变破坏了RsaI的识别位点，导致在琼脂糖电泳后出现一条较大条带。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不是用于来限制本发明。

实施例

实施例1

1.遗传性乳光牙本质致病基因的定位：

1.1对象    所分析的遗传性乳光牙本质家系是在天津医科大学口腔医院临床工作中发现的(图1)。此家系现存活36人，15人受累。先证者V2，男，5岁，乳牙还未全部脱落，但髓腔根管已有闭锁趋势，以前牙为明显。乳牙过度磨损，但未见根尖周阴影，恒牙胚发育也未见异常。患者临床表现符合遗传性乳光牙本质的主要特征。家系中的其他患者也具有该病的主要特征。致病基因传递规律符合常染色体显性遗传特征。我们对其中13名家庭成员(其中患者10名)的DNA进行了分析。

1.2连锁分析

1.2.1外周血细胞DNA的提取在征得受试者的同意后，从13个家庭成员中分别静脉采血5ml，加抗凝剂，立即混匀。4℃，3000rpm离心15分钟，用吸管吸弃上层血浆。在剩余溶液中加入5至10倍的双蒸水，室温静置10分钟。4℃，3500rpm离心15分钟。用真空泵吸弃上清，加15mmol/LTES(15mmol/L Tris-HCl pH8.0，15mmol/L EDTA pH8.0，15mmol/L NaCl 4ml)，重悬沉淀。加入270μl 10％的SDS混匀，再加入40μl的蛋白酶K(10mg/ml)，混匀。50℃2小时后，37℃过夜。冰浴冷却至0℃，加1倍体积的酚，混匀，4℃，3500rpm离心15分钟。取上清，用酚再抽提一次。取上清，加1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，室温5分钟，4℃，3500rpm离心5分钟，取上清。用氯仿∶异戊醇(24∶1再抽提一次)再抽提一次。取上清，加入2.5倍冰预冷95％乙醇，轻摇直到DNA析出、成团。用70％乙醇洗涤1次。最后把DNA吸入1.5ml的离心管中，干燥，回溶于1.0ml TE中。待溶解后，用紫外分光光度计定量。

1.2.2STRPs荧光标记PCR及PCR产物分析扫描

(1)STRPs引物的选择

选取4q21上的8个标记做连锁分析。八个STRPs标记分别为：D4S2915，D4S2932，GATA62A11，D4S2409，DSP STRP，SPP1，D4S1563，D4S1544。八个STRPs引物序列见表1。以上述8对引物，在Perkin Elmer 9600型热循环仪上进行PCR，反应体系为12.5μl(10×PCR缓冲液1.25μl，2mmol/L dNTPs 0.5μldNTP(Sigma公司产品)，1％FdNTP 0.5μl，2U/μlTaq聚合酶(购自原平皓生物技术有限公司)0.25μl，5pmol/μl primer 0.25μl，40ng/μl Genomic DNA 1.0μl)。PCR反应条件为94℃变性50s，退火1min(退火温度见表1)，72℃延伸50s，35个循环，最后72℃延伸5min。

(2)STRPs等位片段分析

在PCR产物能被把聚丙烯酰胺凝胶分开的情况下，把同一个体的不同位点的PCR产物混合，取2μl PCR反应的混合产物与0.4μl ABI ROX-400分子量标准、2.1μl甲酰胺和0.4μl染料混合，95℃变性2min，冰浴迅速冷却，在Perkin Elmer公司ABI 377测序仪上，4％聚丙烯酰胺和36％尿素中电泳2h，用GENESCAN2.1软件进行数据收集，泳道线校正，内在分子量标准校正和迁移片段大小测量。

          表1.8个STRPs标记的引物序列及PCR反应的退火温度

位点	引物序列	退火温度
			D4S2915D4S2932GATA62A11D4S2409DSP STRPSPP1D4S1563D4S1544	5′引物    TTTTAGAAATAGTTGTCAACCTTCC3′引物    TATAAGACCTTTACACTGATAACCA5′引物    GAGCAAAACTCTGTCTCAAAAATAA3′引物    GGCTTACTTGGAAAGGTCTCTT5′引物    AACTTCACCATAGTGCCAGC3′引物    GACAAAATCCCTCTGTGCAT5′引物    ACTTTACCCCACAAGCATTG3′引物    CCATCCACCCTCAATACTTG5′引物    TCTGATTAGATCATACTTTGGC3′引物    ATACTGGCTATTGAAAAGGTTC5′引物    TCAGGTGATGCTTCTGCCTC3′引物    TGAGCCCAGGAGTTTAAGGC5′引物    GCTGCCTGACACACTGG3′引物    ACTATTGCTGTTGCTGACCC5′引物    CCATATAACACAATGGATATAGC3′引物    CAGAAACTCCAGCAGAGACT	50℃55℃62℃50℃58℃63℃56℃55℃

1.2.3连锁分析用LINKAGE软件包的MLINK连锁分析软件，在常染色体显性遗传两等位基因系统的模式下，设定在杂合子中致病基因频率和外显率分别为0.00001和0.99，设定等位片段具有相同的频率，分别在重组率为0，0.01，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4时计算Lod值，结果见表2。以Lod值＞1判断，遗传性乳光牙本质的致病基因定位在染色体4q。

表2.8个STRPs与遗传性乳光牙本质的2点Lod值连锁分析结果

Locus	Lod Score at a Recombination fraction of：							Zmax	θ
										0.00	0.01	0.05	0.10	0.20	0.30	0.40
	D4S2915D4S2932GATA62A11D4S2409DSP STRPSPP1D4S1563D4S1544	1.431.691.631.361.680.81-4.47-5.42	1.401.661.601.321.630.790.00-0.92	1.281.531.451.161.460.730.54-0.29	1.131.351.270.971.280.650.65-0.08	0.820.990.900.640.800.490.540.05	0.500.610.510.350.380.330.320.08										0.210.230.160.110.080.170.120.06	1.431.691.631.361.680.810.650.08	0.000.000.000.000.000.000.120.31

实施例2

侯选基因的突变筛查

选取dspp作为侯选基因进行突变筛查。用软件Primer 3针对前4个外显子设计PCR引物以进行巢式PCR反应，共8对引物(表2)。E1out、E2out、E34fout和E34lout为第一轮PCR反应的引物，E1in、E2in、E34fin和E34lin为第二轮PCR反应的引物。第一轮PCR反应的前3对引物的反应体系为50μl：

10×PCR缓冲液           5μl

2mmol/L dNTPs           5μl

5pmol/μl primer        5μl

2U/μl Taq聚合酶        1μl

50ng/μl Genomic DNA    1μl

加水至50μl。反应条件为94℃30秒，退火30秒，72℃延伸(退火温度及延伸时间见表3)，30个循环。最后72℃延伸5min。

                 表3  引物序列及PCR反应的退火和延伸温度

引物名称	引物序列	退火温度	延伸时间
				E1outE2outE34foutE34loutE1inE2inE34finE34lin	5′引物    ATTGTCATGCAAAAGTCCAG3′引物    CAATAAAAATGGCCCAGGTG5′引物    TGTTTTCCTTCATTGGCACA3′引物    AAACATGATGGCTGGCTAGT5′引物    GGGCTGATCTAACACGTCCA3′引物    CCTCGTTTCTACAGGAATTCTCA5′引物    GCATCCAGGGACAAGTAAGC3′引物    TGTAATTGAAAGCATCCTGGTG5′引物    ATTGTCATGCAAAAGTCCAG3′引物    CTTGTTTGAAAGCCCAAGGT5′引物    GATGTCCCCATAACCACACC3′引物    TCCAAATTTTCCACAGTGAGC5′引物    CAAGCCCTGTAAGAAGCCACT3′引物    TGCTTCCAGCTACTTGAGGTC5′引物    AGCCACAAACAGAAGCAACA3′引物    TCATCCACATTCCTACCCAGT	59℃55℃55℃见正文61℃63℃63℃见正文	60秒100秒100秒见正文60秒100秒100秒见正文

E34lout的反应体系为50μl：

其中Mix1  2mmol/L dNTPs                8.75μl

          5pmol/μl primer             2.4μl

          50ng/μl Genomic DNA         1μl

加水至25μl。

Mix2  10×PCR缓冲液                    5μl

      Expand Long Template(Roche产品)  0.75μl

加水至25μl。

再把Mix1和Mix2混合。反应条件为：

94℃10秒，55℃30秒，68℃2分钟，10个循环，

94℃10秒，63℃30秒，68℃2分钟+20秒/每个循环，20个循环，

最后接68℃7分钟。取5μl PCR产物进行电泳分离，电压90V，电泳时间15分钟，电泳完、拍照存档。取第一轮PCR产物稀释250-1250倍，进行第二轮PCR反应。反应条件为：94℃10秒，退火30秒，72℃延伸，25个循环，(退火温度及延伸时间见表2)。取PCR产物电泳、拍照存档。取第二轮PCR产物，以PCR引物为测序引物直接测序。将所得到的序列图谱进行分析，凡有杂和双峰处，说明该位点为杂和状态，需进一步分析。对包含杂和状态位点的序列与Genebank的序列进行比较并按正常读码框架进行翻译。发现患者dspp核苷酸序列的第3658位由C突变为T，该突变位于dspp基因的第三个外显子处。该突变导致dspp编码的氨基酸序列的第45位由正常的谷氨酰胺的密码子CAG突变为终止密码子TAG，结果使dspp翻译提前终止，dspp基因的表达产物之一DPP便不能产生(图2)。

实施例3    酶切鉴定：

3.1PCR反应    用E34fout引物先做第一轮PCR反应，反应完毕后，电泳、拍照存档。然后取第一轮PCR产物稀释250倍，用E34lout进行第二轮PCR反应，反应体系100μl，反应条件同突变筛查部分。取第二轮PCR产物电泳、拍照存档。

3.2PCR反应回收(PCR回收试剂盒为Life Technologies的ConcertPapid PCR Purfication System)

取4ml洗涤缓冲液，加10ml 95％乙醇，混匀。

加400μl结合缓冲液到90μl PCR产物中，混匀。

把混合液加到柱(cartridge)中央，28℃，11,900g，离心1分钟，弃去流出的液体。

加700μl的洗涤缓冲液(含乙醇)，20℃，11,900g，离心1分钟，弃去流出的液体，20℃，11,900g，离心1分钟。

把柱子换到1.5ml的回收离心管中，加预热到65℃的50μl TE缓冲液(pH8.0，10mmol/L Tris.Cl，1mmol/L EDTA)，R.T.1分钟，11,900g，离心2分钟。取5μl回收产物琼脂糖(BIOWEST公司产品)电泳，拍照，存档。

3.3.RsaI酶切

酶切体系15μl：

BSA(10mg/ml)                     0.15μl

10倍缓冲液                       1.5μl

RsaI(Promega产品)(10U/μl)       1μl

PCR产物                          12.35μl

37℃，2小时。酶切反应完毕后，取15μl反应混合物琼脂糖电泳，照相。发现此家系的正常个体的PCR产物可被限制性内切酶RsaI完全酶解，而受累个体因为无义突变破坏了RsaI识别位点，导致在琼脂糖电泳后出现一条较大条带(图3)。51个无关正常个体PCR产物也可被RsaI完全酶解。

实施例4

遗传性乳光牙本质疾病诊断的试剂盒及应用

试剂盒含有：

外侧5′引物                (5pmol/μl)

外侧3′引物                (5pmol/μl)

内侧5′引物                (5pmol/μl)

内侧3′引物                (5pmol/μl)

所述引物用于以dspp基因为模板，扩增含3658位核苷酸的片段

10倍PCR反应缓冲液

dNTPs                          (2mmol/μl)

Taq DNA聚合酶                  (2U/μl)

MgCl₂

限制性内切酶RasI               (10/μl)

限制性内切酶10倍反应缓冲液

BSA                            (10mg/ml)

使用时用外侧5′引物和外侧3′引物先做第一轮PCR反应，反应完毕后，电泳、拍照存档。然后取第一轮PCR产物稀释250倍做模板，用内侧5′引物和内侧3′引物进行第二轮PCR反应，取第二轮PCR产物电泳、拍照存档。用MgCl₂调整PCR产物的离子强度，入限制性内切酶RsaI，37℃2h(BSA 10mg/ml 0.15μl，10倍缓冲液1.5μl，(RsaI 10U/μl)1μl，PCR产物12.35μl)。酶切反应完毕后，取15μl反应混合物琼脂糖电泳，照相。正常个体的PCR产物可被限制性内切酶RsaI完全酶解，而受累个体因为无义突变破坏了RsaI识别位点，导致在琼脂糖电泳后出现一条较大条带。这样通过待测个体的dspp基因的部分测序图谱就可其是否为遗传性乳光牙本质病患者。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。

Claims (5)

1.一种检测遗传性乳光牙本质的突变的dspp基因的方法，其特征在于所述突变位于dspp基因的3658位，该位置的核苷酸C突变为T，该突变序列的检测方法包括直接测序法、限制性内切酶法或寡核苷酸探针杂交法。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

A：选取dspp作为候选基因进行突变筛查，针对dspp基因的前4个外显子设计PCR引物，以进行PCR反应；

B：PCR反应产物经纯化后直接测序或克隆后测序，将所得到的序列与GeneBank中的序列比较并按正常读码框架进行翻译以确定dspp基因的突变位点。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

A：提取DNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR反应；

B：PCR反应产物经纯化，或用MgCl₂直接调节PCR反应产物的MgCl₂浓度后，用限制性内切酶RsaI酶切，酶切反应完毕后，取反应混合物琼脂糖电泳，照相，以确定突变基因。

4.一种用于诊断遗传性乳光牙本质疾病的试剂盒，其包括：引物，所述引物用于以dspp基因为模板，扩增含3658位核苷酸的片段；10倍PCR反应缓冲液；dNTP；Taq DNA聚合酶；MgCl₂；限制性内切酶RsaI；限制性内切酶10倍反应缓冲液；BSA。

5.如权利要求4所述试剂盒在遗传性乳光牙本质的突变基因的检测方法中的应用。

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