CN1256952A - 治疗肝癌的基因药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗肝癌的基因药物及其制备方法。它是在已知的目的基因上通过多聚左旋赖氨酸(PL)与肝细胞导向分子ASOR连接。由于ASOR对肝细胞中乳糖蛋白分子存在特异性,实现靶向转染和靶向表达。为制备上述药物,首先将ASOR与PL在EDC、pH7.2条件下反应,制成ASOR－PL复合物,然后再与目标基因充分混合,利用两者之间的静电引力结合在一起。本发明提供的基因药物对肝细胞具有特异性。
Description
本发明涉及治疗肝癌的药物，特别是基因药物，以及该药物的制备方法。
目前，在基因治疗中，首先必须解决组织特异性治疗问题，即靶向转染和靶向表达。靶向转染是利用特异性载体将目的基因特异性地带到靶细胞。现有的方法有脂体包埋，局部导入，病毒衣壳蛋白的包装，利用受体分子制备的配体。这些方法中，首推制备配体分子，因为该靶向载体符合临床治疗模式。
本发明的目的是提供具有特异性靶向载体的治疗肝癌的基因药物，同时提供该药物的制备方法。
该基因药物是由去唾液酸类粘蛋白(ASOR)与多聚左旋赖氨酸(PL)的复合物和治疗基因以4-6∶1(重量)组成，其中的治疗基因是白介素2cDNA为0.91kb，γ-干扰素cDNA为1.1kb，将两者亚克隆于真核细胞表达载体PCDNA3.1(+)的质粒中。
上述基因药物的制备方法是：
(1)将ASOR，PL和EDC混合溶解后，在PH7.4-7.2，37℃下搅拌反应，然后透析除盐，并分离出ASOR-PL复合物；
(2)将上述得到的ASOR-PL复合物与治疗基因按4-6∶1(重量)充分混合后，过滤除菌。
ASOR作为配体分子对肝细胞中的乳糖蛋白分子存在特异性。该去唾液酸类粘蛋白可由类粘蛋白OR，经酸解法脱去唾液酸后制成。
本申请人还确定了ASOR-PL与DNA的配比关系为4-6∶1。当靶向载体过剩时，可竞争性地抑制目的基因进入肝脏；另一方面，当DNA过剩时，剩余的DNA失去靶向作用。将ASOR-PL和目的DNA分别接0∶1，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10∶1(重量)11个不同的组合制备药物。然后在0.8％琼脂糖凝胶中进行阻滞电泳，电泳的条件为：电压80V，时间1小时。电泳后在溴乙锭溶液中染色30分钟，紫外透射仪检测结果。结果如下：
比例小于4∶1的能检测出未阻滞的目的DNA；比例为4∶1的仅有痕量的未阻滞目的DNA，比例为5∶1时，全部目的DNA被阻滞。由此说明ASOR-PL与目的DNA的最佳比例为5∶1。
实验表明，本发明提供的基因药物能使治疗基因定向富集在肝细胞上。
实施例
1.ASOR-PL复合物的制备：
首先将OR用酸解法制备ASOR，然后将ASOR，PL和EDC按1.0∶0.22∶0.45重量比混合溶解后，用NaOH调PH为7.2，在37℃下搅拌反应3小时后，在蒸馏水中透析48小时除盐，再用G50层析柱，在PH7.2-4的缓冲液，10mmolPBS进行层析分离，收集第1峰物质，进行超滤浓缩即得到ASOR-PL复合物。用Bradford法测定溶液中ASOR-PL含量。
2.治疗基因的重组：
将含有IFN-r的PHIIF-SV-gamma和含有IL-2的PcDHT-5质粒转入JM-199大肠杆菌中扩增，回抽提质粒，用BamHI酶切上述质粒和真核细胞表达的载体质粒PcDNA3.1(+)，低溶点胶分离所切片段，以T4DNAligase在胶中连接后，转入感受态JM-199菌中，经用BamHI酶切筛出阳性克隆扩增，纯化阳性质粒，经用DNA序列分析，选出确为含有目的基因序列，并且插入方向正确的克隆再扩增回收质粒。目的基因片段IL-2CDNA为0.94kb，IFN-rcDNA为1.1kb。
3.ASOSR-PL复合物与治疗基因的连接：
将ASOR-PL，DNA按5∶1(重量)混合，在37℃下维持1小时，经0.22μm滤膜过滤去菌即可。
药代动力学研究：
(1)以该比例制备的药物经静脉注入SD大鼠体内后，用同位素P32-dATP标记质粒DNA片段，用Southern印迹的方法，发现其它组织中不存在靶向药物，说明该药物的靶向性好。
(2)经尾静脉注入SD大鼠体内10-30分钟时为血药高峰期，1小时后在血中几乎测不到。10分钟后开始在肝脏出现，45分钟时出现高峰，并持续6小时在高峰水平；24，48，72小时均可检测到较高浓度的基因载体在肝细胞内，8天后仅有微量，10天后测不到载体质粒DNA。
其它组织，除肾脏在30，45，60分钟可检测到载体质粒DNA外，其它组织均在注药1小时后未能测出载体质粒。
Claims (2)
1.治疗肝癌的基因药物，由去唾液酸类粘蛋白(ASOR)与多聚左旋赖氨酸(PL)的复合物和治疗基因以4-6∶1(重量)组成，其中的治疗基因是白介素2cDNA为0.91kb，γ-干扰素cDNA为1.1kb，将两者亚克隆于真核细胞表达载体PCDNA3.1(+)的质粒中。
2.权利要求1所述的治疗肝癌基因药物的制备方法：
(1)将ASOR，PL和EDC混合溶解后，在PH7.4-7.2，37℃下搅拌反应，然后透析除盐，并分离出ASOR-PL复合物；
(2)将上述得到的ASOR-PL复合物与治疗基因按4-6∶1(重量)充分混合后，过滤除菌。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 98112778 CN1256952A (zh) | 1998-12-11 | 1998-12-11 | 治疗肝癌的基因药物及其制备方法 |
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| CN 98112778 CN1256952A (zh) | 1998-12-11 | 1998-12-11 | 治疗肝癌的基因药物及其制备方法 |
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| CN1256952A true CN1256952A (zh) | 2000-06-21 |
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ID=5222582
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|---|---|
| CN (1) | CN1256952A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1328377C (zh) * | 2003-04-21 | 2007-07-25 | 北京大学 | 人肝癌相关基因laptm4b的一个等位基因及其编码产物与应用 |
-
1998
- 1998-12-11 CN CN 98112778 patent/CN1256952A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN1328377C (zh) * | 2003-04-21 | 2007-07-25 | 北京大学 | 人肝癌相关基因laptm4b的一个等位基因及其编码产物与应用 |
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