CN1250781A - 哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法,在抽提液中分别加入了抑肽酶和苯甲基磺酰氟(PMSF),并采用连续肝素亲和层析技术,采用聚乙二醛低温高渗浓缩提取物,简化了提取工艺。从哺乳动物心肌中提取的aFGF样的物质,具有得率高、生物活性好的特点。以从牛心肌中提取aFGF样的物质为例,经检测:由120～136个氨基酸组成,分子量为13KDa以上,得率为每公斤400～600ug,ED50值为38～100ng。解决了aFGF来源困难的问题,可作为治疗多种疾病的药物的原材料。
Description
本发明涉及一种从哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法。
成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor)(以下简称FGF)，是一组首先从牛脑垂体中发现的、在动物机体内分布十分广泛的、且具有多种生物学功能的多肽生长因子。到目前为止，已经发现的FGF样物质共有9种，其中最主要的、研究最多的是酸性成纤维细胞生长因子(acidicfibroblastgrowthfactor)(以下简称aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor)(以下简称bFGF)，它们对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有广泛的促增殖作用，可直接参与创伤愈合和血管新生、神经生长及胚胎发育等重要过程。
aFGF是由140个氨基酸组成，基因定位在第4对染色体上，等电点为5.6，其氨基酸序列与bFGF有55％同源性。aFGF主要分布在动物的脑、心脏和视网膜，在这三个部位的含量约为bFGF的100倍以上。aFGF的获得主要是通过生化提取的方法。近年来，随着分子生物学技术的发展，通过基因工程的方法可以得到大量的高纯度的重组的酸性成纤维细胞生长因子，但由于细菌和酵母合成的酸性成纤维细胞生长因子与真核细胞内所表达的酸性成纤维细胞生长因子在折叠方式上的差异，使得重组的酸性成纤维细胞生长因子完全没有生物活性。因此，在基因工程技术尚未完美和普及的今天，采用生物化学的方法从组织中分离纯化出具有较高生物活性的酸性成纤维细胞生长因子，对研究该蛋白质的生物学特性、生理作用及临床上用于创伤愈合、组织修复和再生、促进血管生长和神经营养等治疗具有重要意义。
以往主要从牛脑中提取酸性成纤维细胞生长因子，但牛脑体积小、每只牛脑的重量约300克，约含酸性成纤维细胞生长因子200微克，故来源十分有限。而且以往分离纯化酸性成纤维细胞生长因子的方法主要是通过硫酸铵盐盐析、阳离子交换层析和高压液相层析技术。但该方法工艺复杂，所获得的酸性成纤维细胞生长因子的纯度和得率很低，活性丢失也较严重，难以获得大量的高纯度和高生物活性的酸性成纤维细胞生长因子。1986年人们发现肿瘤抽提物中具有酸性成纤维细胞牛长因子生物活性的物质，能与肝素结合并进一步将固相肝素亲和层析法用于纯化酸性成纤维细胞生长因子，但仍然没有解决在纯化过程中酸性成纤维细胞生长因子生物活性丢失和得率低的问题。
哺乳动物心脏中的FGF样物质有两种，即aFGF和bFGF。纯化FGF有两个关键环节：a、防止蛋白水解酶对FGF分子的降解；b、防止FGF生物活性的丢失。日本学者HajimeSasaki等采用氯仿抽提和heparin-Sepharose亲和层析技术从心肌组织中纯化到较高含量的aFGF样物质。Hajime采用的氯仿抽提法虽然能有效的阻止蛋白水解酶对FGF的降解过程，获得较均一的酸性成纤维细胞生长因子aFGF，但该法易使碱性蛋白质变性失活。
本发明的目的是选择从哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子，扩大酸性成纤维细胞生长因子的来源，并通过改进酸性成纤维细胞生长因子的提取技术，获得大量的高纯度和高生物活性的酸性成纤维细胞生长因子。采用本发明的方法还可在哺乳动物心肌中同时提取碱性成纤维细胞生长因子。
本发明是通过以下的技术方案实现的：一种从哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，包括如下步骤：(1)在哺乳动物心脏组织块中加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的酸性抽提液后将哺乳动物心脏进行匀浆化；(2)对抽提后得到的上清液至少进行一次酸沉淀；(3)将沉淀后得到的粗提物用截留值为8000～12000分子量的透析袋进行透析；(4)对透析得到的上清液进行柱层析和柱亲和层析分离；所述的酸性抽提液为0.15mol/l硫酸铵溶液，其中含0.5～1.0mmol/l的苯甲基磺酰氟(PMSF)；对抽提后得到的上清液用固体硫酸铵进行两次盐析沉淀；步骤(1)是在PH值3.5～4.5的酸度中进行；步骤(2)是在PH值5.5～6.5的酸度中进行；各步骤是在0～6℃的温度中进行；步骤(4)是采用羧甲基纤维素葡聚糖阳离子交换柱层析和柱亲和层析法从透析后的上清液中分离纯化酸性成纤维细胞生长因子样物质。
由于本发明采用了以上的方法，成功地阻断了酸性成纤维细胞生长因子在纯化过程中的生物降解和活性丢失的问题；简化了工艺流程，提高了酸性成纤维细胞生长因子的得率，从而从哺乳动物心肌中例如牛心、猪心、羊心等动物的心肌中获得大量的高生物活性和高纯度的酸性成纤维细胞生长因子。其技术指标以从牛心肌中提取aFGF样的物质为例：分子量13KDa或以上；纯度80％以上；活性在38～100ng/ml；得率为400～600ug/Kg；氨基酸组成为120～136个氨基酸以上。
本发明可从牛心、猪心、羊心或其它动物的心脏中提取aFGF样的物质，从而扩大了酸性成纤维细胞生长因子的来源。本发明的具体方法可以通过以下的实施例来实现：
本实施例选择从牛心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，按每个牛心肌重2500克-3000克，约含酸性成纤维细胞生长因子1500-1800微克，较牛脑多7-10倍。具体方法是：
(一)aFGF的分离纯化
分离纯化流程：
将原料牛心肌切开后，用冰生理盐水冲洗净残血，然后剪除结缔组织和大血管，切成组织碎块，加入0.15M(NH4)2SO4(含抑肽酶、PMSF)溶液，在粉碎机中粉碎成匀浆，在4℃温度下离心(7500rpm/min，60min)后，去沉淀，取上清液，再分别进行二次硫酸铵盐沉淀，取第二次沉淀物(含FGF)进行透、浓缩，并经CM-Sephadex层析，获得含较纯FGF组分的蛋白质，收集0.6mol/LNaCL洗脱物，然后再在核酸蛋白检测仪监测下经二次Heparin-Sepharose亲和层析后分段收集1.0mol/L、2.0mol/LNaCL洗脱物，分别得到：酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
在上述流程中，为防止蛋白水解酶对FGF的降解，本发明在硫酸铵抽提液中加入了少量的PMSF，该物质有明显的抑制蛋白水解酶的作用，结果表明用含有PMSF的抽提液获得的aFGF和bFGF都是比较均一的，得率也较高。本发明还采用了改良的传统硫酸铵沉淀、采用羧甲基纤维素葡聚糖阳离子交换柱层析和heparin-Sepharose亲和层析法从牛心肌组织中分离纯化了两种FGF样物质，其中：aFGF分子量约为13KDa或以上，在亲和层析柱上采用1.0mol/lNaCl的缓冲剂洗脱得到；用该法可同时提取到bFGF，其分子量约为16KDa，可在亲和层析柱上采用2.0mol/lNaCl的缓冲剂洗脱得到。对3T3细胞的生物活性测定表明：aFGF的最大刺激剂量为160pg/ml，ED50值约为38～100ng/ml，得率为400～600ug/Kg；bFGF最大刺激剂量为50ng/ml，ED50值约为0.13ng/ml，得率为6～10ug/Kg。
下面结合一实例和附图，再进一步说明本发明的特征和优点。
图l是CM-Sephedex洗脱曲线；
图2是Heparin-Sepharose洗脱曲线。
FGF的分离纯化：
(1)抽提和盐析
将新鲜或冷冻的牛心剪除结缔组织和大血管，用生理盐水洗净残余的血块，用组织剪剪成碎块，称湿重，在4℃条件下，按每kg组织块加入含500单位/L抑肽酶0.15mol/L硫酸铵溶液1L，用DS-1型组织捣碎机反复捣碎3分钟，制成匀浆。再加入含1.0mmol/LPMSF的0.15mol/L硫酸铵溶液1L搅拌均匀后，用6mol/LHCL将匀浆液的PH调至4.5，冰浴中机械搅拌2小时，然后7500rpm/min离心60分钟，弃沉淀，上清液用1mol/LNaOH调节PH至6.0，该上清液在不断搅拌下缓慢加入固体(NH4)2SO4粉230g/L，盐析沉淀。次日7500rpm/min，离心60分钟，弃沉淀，所得上清液再加入固体硫酸铵粉300g/L，盐析沉淀，7500rpm/min，离心60分钟，弃上清液，所得到的沉淀即为含有aFGF和bFGF的粗提物。
(2)透析和浓缩
将粗提物用少量冷去离子水溶解后，置于截留值≤10000的透析袋内，在4℃下不断搅拌，对水彻底透析；收集透析液在低温下置于聚乙二醛中浓缩，计算总体积，测定蛋白质浓度。
(3)CM-SephedexC50柱层析
将FGF粗提物浓缩液20-40ml，对0.1mol/LPH6.0PBS透析，然后上样于预先用同样缓冲液平衡过的CM-SephedexC50(2.5×50cm)柱，在核酸蛋白检测仪和记录仪的监测下进行洗脱，流速为50ml/hr，可得到第一个蛋白峰(CMF1)，待蛋白峰下降至基线位置时，再递次用含0.15mol/LNaCL和0.6mol/LNaCL的上述磷酸盐缓冲液洗脱，分别可得到第二个蛋白峰(CMF2)和第三个蛋白峰(CMF3)。CM-Sephedex洗脱曲线由图1所示，请参阅。分别收集上述CMF1、CMF2和CMF3组份，待测其蛋白质浓度和生物活性。
(4)Heparin-SepharoseCL6B柱亲和层析
将含FGF的CMF3组份对0.6mol/LNaCL，10mmol/LPH7.0Tris-HCL缓冲液透析后泵上预先用同一缓冲液平衡过的二级Heparin-SepharoseCL6B柱(1.2×20cm)，再用同一缓冲液洗脱，流速为24ml/hr，洗去未结合的杂蛋白(H1)，再依次用含1.0mol/L和2.0mol/LNaCL，PH7.0的Tris-HCL缓冲液洗脱，(Heparin-Sepharose洗脱曲线由图2所示，请参阅)，分别收集具有生物活性的蛋白组份，然后对水彻底透析、浓缩和冷冻干燥后低温保存。
牛心源性FGF的生物学鉴定：
1.分子量测定：
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶电泳(SodiumDodeySulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS-PAGE)法测定分子量：将标准蛋白和待测蛋白样品加入等体积的样品缓冲液中(10％SDS-1％硫基乙醇-0.01mol/LPH7.8磷酸钠缓冲液)混匀后，在沸水中加热3分钟，然后按预定顺序加入同一电泳体系(浓缩胶浓度为3％，PH：6.8，分离胶浓度为15％，PH：8.8)中电泳，上槽正极，下槽负极。电压调至50V(约8V/CM)，样品开始进入上层胶中，逐渐被浓缩(约40-50分钟)。当染料前沿进入分离胶(下层)时，电压调至120V，继续电泳，直至溴酚兰达到分离胶底部，调电压至零，切断电源。剥胶并标记。将整块分离胶浸没在0.25％考马斯亮蓝R250溶液中染色5小时。取出凝胶，用水漂洗数次后放入脱色液中脱色。脱色后测量从分离胶起始处到染料区带及蛋白区带中心位置的距离。然后以标准蛋白分子量对数为纵坐标，以相对迁移率(Rm)为横坐标，在半对数坐标纸上作出标准曲线。根据待测蛋白的Rm值在标准曲线上算出其对应的分子量。
2.氨基酸组成分析：
在日立835-50型氨基酸自动分析仪上进行(分析前处理：6NHCL，110℃，20小时水解，样品浓度0.6ml/ml)，由中科院生化所协助完成。其组成如下：
氨基酸 每个分子残基数
Asp 10
Thr 5
Ser 12
Glu 18
Pro 2
Gly 19
Ala 9
Gys 1
Va 17
Net 2
Ile 5
Leu 8
Tyh 3
Fhe 5
Lys 6
His 3
Arg 9
Tota 1124
3.FGF组份生物活性的测定(3H-TdR掺入法)：
取3T3成纤维细胞，0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，用含10％小牛血清的培养液按2×104/mm3密度接种于96孔培养板上，24小时后换含0.5％小牛血清的DMEM培养液，置于37℃，5％CO2饱和湿度条件下继续培养。次日加入倍比稀释的FGF不同组份，同条件下继续培养。48小时后，每孔加含3H-TdR的DMEM液50μl(1μci)，继续培养4小时后结束培养，倾去培养液，加入0.25％胰蛋白酶消化3min，多头细胞搜集器收集细胞于玻璃纤维滤片上，蒸馏水洗6次后，5％三氯醋酸固定，60-80℃烘干1小时，置闪烁液(0.3％PPO和0.03％POPOP的甲苯溶液)中，自动液闪计数仪测各样品管的cpm值。以含FGF组份的蛋白质浓度为横坐标，以每孔的cpm数为纵坐标，描记3H-TdR掺入曲线，其中一个活性单位(ED50)定义为最大刺激活性一半时所需的FGF组份的含量。
aFGF是近年来发现的一种对中胚层来源和神经外胚层来源的细胞均有强烈促增殖作用的多肽生长因子，广泛参与机体生长发育、组织修复、创伤愈合、神经再生和血管生长等过程，除了可用于烧伤创面、溃疡、褥疮等的愈合外，近年来更成为人们尝试促进缺血区侧枝血管的生成达到治愈冠心病的新手段，故aFGF已愈来愈受到医学界的关注。以往由于aFGF提取工艺复杂、得率低，故目前国际aFGF的售价昂贵，约10000美元/毫克，限制了其临床应用。本发明解决了aFGF来源困难的问题，简化了提取工艺，并具有得率高、生物活性好的特点。以从牛心肌中提取的aFGF样的物质为例，其由120～136个氨基酸组成，分子量为13KDa以上，得率为每公斤400～600ug，ED50值为38～100ng，它可作为许多药物的原材料，以生产出不同剂型的、用于不同疾病治疗的药物，造福于人类。
Claims (10)
1、哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)在哺乳动物心脏组织块中加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的酸性抽提液后，将哺乳动物心脏组织块进行匀浆化；(2)对抽提后得到的上清液至少进行一次酸沉淀；(3)将沉淀后得到的粗提物用截留值为8000～12000的透析袋进行透析；(4)对透析得到的上清液进行柱层析和柱亲和层析分离。
2、根据权利要求1所述的哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：所述的酸性抽提液为0.15mol/l硫酸铵溶液，其中含0.5～1.0mmol/l的苯甲基磺酰氟(PMSF)。
3、根据权利要求1或2所述的哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：所述的酸性抽提液中还含有抑肽酶。
4、根据权利要求1所述的哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：对抽提后得到的上清液用固体硫酸铵进行两次盐析沉淀。
5、根据权利要求1所述的哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：步骤(1)是在PH值3.5～4.5的酸度中进行。
6、根据权利要求1所述的哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：步骤(2)是在PH值5.5～6.5的酸度中进行。
7、根据权利要求1所述的哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：各步骤是在0～6℃的温度中进行。
8、根据权利要求1所述的哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：步骤(4)是采用羧甲基纤维素葡聚糖阳离子交换柱层析和柱亲和层析法从透析后的上清液中分离纯化酸性成纤维细胞生长因子样物质。
9、根据权利要求1所述的哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：所收集的透析液在低温下置于聚乙二醛中浓缩，计算总体积，测定蛋白质浓度。
10、根据权利要求1所述的哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，其特征在于：提取的酸性成纤维细胞生长因子样物质采用冷冻干燥后低温保存。
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