CN1240485A - 青霉素g或v、头孢菌素g或v以及它们的衍生物的生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个生产青霉素G或V或者头孢菌素G或V衍生物的发酵工艺,其中用特定苯基丁酸衍生物作为侧链的前体。在所述苯基丁酸衍生物中,酰基链通过成对碳原子来延长,特定取代基位于ω－和/或ω－1位。相应的苯氧基丁酸衍生物用于制备青霉素V或头孢菌素V的衍生物。任选地,将青霉素G或V或者头孢菌素G或V的化合物脱酰基化来制备它们的脱酰基对应物。

Description

青霉素G或V、头孢菌素G或V以及它们的衍生物的生产工艺

                      发明领域

本发明涉及β-内酰胺的发酵生产领域。

                      发明背景

β-内酰胺类抗生素是抗生素化合物中最重要的一类，具有很长的临床使用历史。在这一类中最突出的是青霉素类和头孢菌素类。这些化合物分别由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和Acremoniumchrysogenum产生。

作为经典的菌株改进技术的结果，产黄青霉和Acremoniumchrysogenum的抗生素产率在过去数十年有了显著的提高。随着对青霉素类和头孢菌素类的生物合成路线了解的增加和DNA重组技术的出现，用于生产菌株的改善和这些化合物的体内衍生的新工具已经出现。

大部分参与β-内酰胺生物合成的酶已被鉴别，而且相关的基因已被克隆，如Ingolia和Queener所述，医药研究综述(Med.Res.Rev.)9(1989)，245-264(生物合成路线和酶)，和Aharonowitz，Cohen和Martin所述，微生物年鉴(Ann.Rev.Microbiol.)46(1992)，461-495(基因克隆)。

在产黄青霉菌株中青霉素生物合成的头两步是由三个氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)缩合成三肽LLD-ACV，然后环化此三肽形成异青霉素N。这个化合物包含典型的β-内酰胺结构。

青霉素生物合成的头两步在产生青霉素、头霉素和头孢菌素的真菌和细菌中很普遍。

第三步是通过酰基转移酶(AT)的作用由疏水侧链置换L-5-氨基-5-羧基戊酸的亲水D-α-氨基己二酸侧链。如EP-A-0448180中所述，由AT催化的酶促置换反应发生在微生物体的细胞器内。

在头孢菌素产生菌中，第三步是由差向异构酶异构化异青霉素N成为青霉素N，然后由扩环酶将青霉素特有的五元环结构转化成头孢菌素特有的六元环结构。

具有工业价值的唯一直接发酵的青霉素只有青霉素V和青霉素G，其是在产黄青霉菌株的发酵过程中分别加入疏水性的侧链前体苯氧基乙酸或苯基乙酸，从而由苯氧基乙酸或苯基乙酸取代天然β-内酰胺的侧链而产生。

在苯基乙酸之后，苯基丁酸和一些衍生物被引入到青霉素G的生产中，虽然所述的酸产生青霉素G的产率比苯基乙酸大大降低(Behrens等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)175(1948)，793-809；Arnstein和Grant，细菌综述(Bacteriol.Rev.)20(1956)133-147)。

本发明令人吃惊的显示特定的苯基丁酸衍生物可以甚至比苯基乙酸还高的效率产生青霉素G。

                     发明详述

本发明公开了一些苯基丁酸衍生物，即其中的酰基链通过成对碳原子来延长，并且其中特定的取代基位于酰基链的ω-和/或ω-1位，这些苯基丁酸衍生物在N-苯乙酰基青霉烷和头孢烯化合物的发酵生产中能有利地用作侧链的前体。

本发明还公开了一些特定的苯基丁酸衍生物的苯氧基衍生物的用途，其用于N-苯氧乙酰基青霉烷和头孢烯化合物的生产。

特别是，本发明公开了N-苯乙酰基或N-苯氧乙酰基青霉烷或头孢烯化合物的发酵生产工艺，其中在以ω-和/或(ω-1)-位取代的苯基链烷酸作为侧链前体存在下进行发酵，所述的ω-和/或(ω-1)-位取代的苯基链烷酸具有如下的结构式1的结构：

其中：-   -R₁和-R₃选自-OH、＝O或-H，而-R₁和-R₃可以相同或不同，前提为

-R₁和-R₃不能都是-H或＝O，-   如果-R₁或-R₃分别是-OH或-H，则-R₂或-R₄分别是-H，-   如果-R₁或-R₃分别是＝O，则-R₂或-R₄分别就不存在，-   -R₅是-OR₆或-NH₂，其中R₆选自-H、-CH₃或-CH₂CH₃，-   m是0或1，-   n是从1到15的奇数，碳链中任选地包含一个或多个双键。

应当理解，苯基链烷酸碳链长度的上限主要由脂肪酰基被β-氧化攻击的效率来决定。适当地，可用链可长达约18个碳原子，暗示n是从1到15的奇数。优选地，n为从1到9，更优选为从1到5的奇数。最优选的n为1。

优选的，-R₁或-R₃是＝O或-OH，暗示-R₂或-R₄不存在或是-H，-R₃和-R₄是-H，-R₅是-OH，m是0或1，且n是1。更优选的，-R₁是＝O或-OH，暗示-R₂不存在或是-H，-R₃和-R₄是-H，-R₅是-OR₆，其中R₆是-H，m是0或1，且n是1。最优选地，以3-苯甲酰基丙酸作为侧链前体，即-R₁是＝O，-R₂不存在，-R₃和-R₄是-H，-R₅是-OH，m是0，且n是1。

在本发明的工艺中，3-苯甲酰基丙酸是优选的侧链前体，因为该化合物可方便的从相对便宜的成分合成(Sommerville和Allen，Org.Synth.Coll.Vol.II(1943)，81-83)。

在本发明的工艺中当使用产黄青霉菌株时生产青霉素G或V。

已表明，苯基丁酸衍生物3-苯甲酰基丙酸具有比苯基丁酸高得多的产生青霉素G的效率，更重要地，甚至具有比苯基乙酸高得多的效率。

本发明另外设想了在发酵过程中应用本发明的前体生产头孢菌素G或V衍生物，方法是使用重组的青霉烷或头孢烯产生菌株，即重组的产黄青霉或Acremonium chrysogenum菌株。取决于在本发明的发酵工艺中使用的特定的重组菌株，生产出了不同的头孢菌素G或V化合物。

脱乙酰氧基头孢菌素G或V衍生物由例如重组的表达扩环酶的产黄青霉菌株，即拥有包含扩环酶基因的表达盒的产黄青霉菌株来生产(见EP0532341或WO95/04149公开的表达扩环酶的产黄青霉菌株)。另外，WO96/38580也与此相关，它公开了在表达扩环酶的产黄青霉菌株体内青霉素G可被扩环。

如果重组的表达扩环酶的产黄青霉菌株拥有一个或多个包含另外的有关头孢菌素生物合成基因的表达盒，就能生产除脱乙酰氧基化合物之外的其它的头孢菌素G或V衍生物，其中这些基因编码诸如羟化酶的基因和/或编码乙酰转移酶的基因。另外除脱乙酰氧基化合物之外其它的头孢菌素G或V衍生物也可用重组表达酰基转移酶基因的A.chrysogenum菌株来生产。

本发明的工艺通过于合适的发酵培养基中发酵合适的青霉烷或头孢烯产生菌株，即上述的真菌来进行。所用的发酵条件在本发明中并不关键，只要发酵在结构式1的苯基或苯氧丁酸衍生物作为侧链的前体存在下进行。例如可使用公开于EP 0532341中的发酵条件。

在发酵工艺之后，发酵产生的青霉素G或V或者头孢菌素G或V衍生物可用熟练技术人员了解的任何合适的技术从发酵液中回收。

任选地，青霉素G或V或者头孢菌素G或V衍生物可通过脱酰基形成相应的脱酰基青霉素即6-氨基青霉烷酸(6-APA)，或脱酰基头孢菌素如7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基去乙酰基头孢烷酸(7-ADAC)或7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。可以用任何合适的方法脱酰基化。优选的，脱酰基化是使用适当的酶通过一步酶催化过程完成。用于青霉素G或头孢菌素G衍生物的脱酰基化的合适的酶有来自于大肠杆菌或A.faecalis的酰基转移酶，用于青霉素V或头孢菌素V化合物的脱酰基化的合适的酶是来自于真菌诸如镰孢霉(Fusarium)的酰基转移酶。为了重复利用酶，优选地使用固定化酶。

在本发明的一种优选的实施方案中，于存在3-苯甲酰基丙酸盐作为侧链前体的合适的培养基中发酵产黄青霉。分离菌体后所得的发酵液用HPLC和/或质子NMR分析青霉素的存在。显示青霉素G是发酵液中存在的唯一的青霉素。另外，令人惊奇的发现3-苯甲酰基丙酸盐比苯基乙酸盐产生青霉素G的效率更高。

                  实施例1

以3-苯甲酰基丙酸作为侧链前体生产青霉素G菌株

产黄青霉Wisconsin 54-1255(ATCC 28089)溶液

前体溶液：10％(w/v)前体，用1MKOH调节pH至6.5，使用前过滤除菌。生长条件

通过在摇瓶中产黄青霉Wisconsin 54-1255菌株的二级发酵制备青霉素。在种子阶段，加入2×10⁸个孢子至50ml/500ml种子培养基摇瓶中开始发酵，培养基组成如下(单位g/l)：葡萄糖，30；硫酸铵，10；磷酸二氢钾，10；微量元素溶液I(七水硫酸镁，25；七水硫酸铁，10；五水硫酸铜，0.5；七水硫酸锌，2；硫酸钠，50；一水硫酸锰，2；二水氯化钙，5)，10(ml/l)(灭菌前pH6.5)。

种子培养基于25-30℃培养48-72小时，然后用于接种10-20倍体积的生产培养基中，生产培养基组成如下(g/l)：乳糖，80；麦芽糖，20；硫酸钙，4；尿素，3；七水硫酸镁，2；磷酸二氢钾，7；氯化钠，0.5；硫酸铵，6；七水硫酸铁，0.1；微量元素溶液II(五水硫酸铜，0.5；七水硫酸锌，2；一水硫酸锰，2；硫酸钠，50)；(灭菌前pH5.5-6.0)。加入所选的前体(溶液1)至所示的浓度。然后再持续培养120小时。

测定产黄青霉菌株利用不同侧链前体产生青霉素的能力。所用苯基乙酸、丁酸、苯基丁酸和3-苯甲酰基丙酸的终浓度均为0.04％和0.08％(w/v)。在生产阶段结束后收集发酵液的过滤液，用H-NMR测定。

当不加入前体时，培养基中主要累积的β-内酰胺化合物是6-氨基青霉烷酸和异青霉素-N。当加入苯基乙酸、苯基丁酸或3-苯甲酰基丙酸，只产生青霉素G(表1)。使用0.08％(w/v)3-苯甲酰基丙酸产生青霉素-G的产量最高。

                   表1.使用不同侧链前体青霉素的产量

前体	浓度(w/v)	主要β-内酰胺产物1	产量2％
				苯基乙酸	0.04％	青霉素-G	100
0.08％	青霉素-G	80
			苯基丁酸		0.04％	青霉素-G	70
0.08％	青霉素-G	85
				3-苯甲酰基丙酸	0.04％	青霉素-G	90
0.08％	青霉素-G	125

1通过H-NMR测定2相对于最初用0.04％(w/v)的苯基乙酸时青霉素-G的产量

Claims (8)

1.一种用于生产N-苯乙酰基或N-苯氧乙酰基青霉烷或头孢烯化合物的工艺，其任选地包含所述N-苯乙酰基或N-苯氧乙酰基青霉烷或头孢烯化合物的脱酰基过程，包括如下步骤：^*在含具有结构式1的结构的侧链前体的发酵培养基中发酵合适的青霉烷或头孢烯产生菌

其中：-   -R₁和-R₃选自-OH、＝O或-H，-R₁和-R₃可以相同或不同，前提为-R₁

和-R₃不能都是-H或＝O，-   如果-R₁或-R₃分别是-OH或-H，则-R₂或-R₄分别是-H，-   如果-R₁或-R₃分别是＝O，则-R₂或-R₄分别就不存在，-   -R₅是-OR₆或-NH₂，其中R₆选自-H、-CH₃或-CH₂CH₃，-   m是0或1，-   n是从1到15的奇数，碳链中任选地包含一或多个双键，和^*   从发酵液中回收产生的N-苯乙酰基或N-苯氧乙酰基青霉烷或头孢烯化合物，和^*   任选地将N-苯乙酰基或N-苯氧乙酰基青霉烷或头孢烯化合物脱酰基化，并且回收相应的脱酰基化青霉烷或头孢烯化合物。

2.一种如权利要求1的生产N-苯乙酰基青霉烷或头孢烯化合物的工艺，其中使用如结构式1的侧链前体进行发酵，其中m是0。

3.如权利要求2的工艺，其使用如结构式1的侧链前体进行发酵，其中R₁为＝O，R₃和R₄为-H，R₅为-OH，m是0，且n是1。

4.一种如权利要求1的生产N-苯氧乙酰基青霉烷或头孢烯化合物的工艺，其使用如结构式1的侧链前体进行发酵，其中m是1。

5.如权利要求1-4的任意一种生产N-苯乙酰基或N-苯氧乙酰基青霉烷化合物的工艺，其中青霉烷或头孢烯产生菌是产黄青霉，N-苯乙酰基或N-苯氧乙酰基青霉烷化合物是青霉素G或V。

6.如权利要求5的工艺，其中青霉素G或V经脱酰基化产生6-APA。

7.一种如权利要求1-4的任意一种生产N-苯乙酰基或N-苯氧乙酰基头孢烯化合物的工艺，其中青霉烷或头孢烯产生菌是重组的能表达扩环酶的产黄青霉菌，N-苯乙酰基或N-苯氧乙酰基头孢烯化合物是头孢菌素G或V衍生物。

8.如权利要求7的工艺，其中头孢菌素G或V衍生物经脱酰基化产生7-ADCA、7-ADAC或7-ACA。