CN1228477A - 鸡传染性支气管炎病毒基因型的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属肾型传染性支气管炎病毒基因型检测方法。本发明设计四种引物：P1:5′ TTGAAAACTGAAC AAAAGACA－3′P2：5′GATGTCATATTATTAACACACTGA－3′P3：5′TACTACTACCAAAGTGCC－3′P4:5′CCATAACTAACATAAGGGCAA－3′对传染性支气管炎病毒反转录产物进行快速检测。传统的检测方法要求有多种标准血清、需时较长等缺点。本发明将上述四种引物分两组配对进行PCR反应,以94℃2分钟→35个循环:94℃60秒,45℃90秒,72℃90秒→72℃7分钟这样的反应程序进行PCR后,电泳、紫外检测仪直接检测。该方法快速、简便、准确。可用于传染性支气管炎的基因型诊断。
Description
本发明属鸡的传染性支气管炎病毒(IBV)基因型的检测方法。本发明设计四种引物采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，以下简称PCR)技术对鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious Bronchitis，以下简称IBV)的S1基因(即纤突蛋白基因)进行体外扩增，电泳直接检测，根据电泳结果判断IBV的基因型。
IBV可导致鸡产生传染性支气管炎，临床上可分为呼吸型和肾病型，并可导致雏鸡死亡，在我国每年可造成数亿元的损失。传统的检测方法是利用进行中和试验进行血清分型。该方法的缺点是在需各种标准血清和大量的实验室工作，且耗时长。因此建立一种能鉴定IBV基因型的快速简便的方法对于雏鸡的IB防治十分必要。
本发明通过分析IBV-S1基因的碱基组成，建立了一种直接检测IBV-S1基因，用于基因分型诊断方法，通过简单操作即可分辨出被测试病毒的基因型。
本发明设计四种引物(P1～P4)，对IBV核酸的反转录产物DNA在PCR仪上进行扩增。引物的碱基序列分别是：
P1:5′TTGAAAACTGAACAAAAGACA-3′
P2:5′GATGTCATATTATTAACACACTGA-3′
P3:5′TACTACTACCAAAGTGCC-3′
P4:5′CCATAACTAACATAACGGGCAA-3′
PCR反应物方法分别为：1号管P1与P2各0.5um；二号管P3与P4各0.5um,dNTPs(dATP,dTTP,dGTP和dCTP)：各400uM,MgCl2:1.5mM,KCl:50mM,Tris-HCl(pH8.4):10mM,Taq DNA聚合酶：2u
每管PCR反应体积：25ul
PCR反应条件：
94℃2分钟→35个循环：94℃60秒,45℃90秒，72℃90秒→72℃7分钟
PCR产物在1％琼脂糖胶上以4V/cm电压电泳2小时，经EB染色后紫外检测，进行基因型判定：肾型IBV1号管无PCR产物2号管有一条1573bp产物。
本发明的优点是快速、简便、准确。从取样到检测出结果一般仅需1天时间。该方法容易掌握，特异性为100％。
本发明的操作流程如下：
待测病毒→核酸提取→反转录(引物P4)→取5ul产物→混匀PCR反应成分后，覆上一层矿物油→设置反应条件进行PCR反应→PCR反应产物点样、电泳→紫外检测，确定基因型。
实施实例：传染性支气管炎病毒IBVZ株的基因型诊断：
1．提取IBV病毒核酸
2．进行反转录
3．进行PCR
在0.25mlPCR薄壁反应管中依次加入下列成分：
1号管：P1(20uM):1ul P2(20uM):1ul
2号管：P3(20uM):1ul P4(20uM):1ul
dNTPs(2.5mM):4ul
10 PCR缓冲液(含15mM MgCl2):2.5ul
双蒸水(无菌)5.5ul
Taq DNA聚合酶(2u/ul):1ul
反转录产物(100～500ng/ul):5ul
混匀后加1滴矿物油，放入PCR仪中按一下条件进行扩增：
94℃2分钟→35个循环：94℃60秒，45℃90秒，72℃90秒→72℃7分钟→4℃保存，反应结束后取10ul产物在1％琼脂糖凝胶上以4V/cm电压降电泳2小时，经EB染色后在紫外检测仪上检测，如只有2号管的产物出现一条带，由此确定肾型传染性支气管炎病毒；如出现1号和2号管均有产物，则为呼吸型。
Claims (5)
1、一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因型的方法，通过设计引物、引物配对及反应温度和时间，其特征在于测试传染性支气管炎病毒S1基因的变异，以确定IBV的基因型。
2、根据权利要求1所述的IBV-S1基因的检测方法，其特征在于四种引物中的两种的碱基序列为P2:5＇GATGTCATATTATTAACACACTGA-3′；P3:5′TACTACTACCAAAGTGCC-3′。
3、根据权利要求1所述的IBV-S1基因的检测方法，其特征在于P1与P2组合，P3与P4组合。
4、根据权利要求1所述的IBV-S1基因型的检测方法，其特征在于聚合酶链式反应(PCR)的反应条件为：94℃2分钟→35个循环：94℃60秒，45℃90秒，72℃90秒→72℃7分钟。
5、根据权利要求1所述的IBV-S1基因型的检测方法，其特征在于P1与P2没有PCR产物，P3与P4可出现一条长度为1573pb的产物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 98122176 CN1228477A (zh) | 1998-12-30 | 1998-12-30 | 鸡传染性支气管炎病毒基因型的检测方法 |
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| CN 98122176 CN1228477A (zh) | 1998-12-30 | 1998-12-30 | 鸡传染性支气管炎病毒基因型的检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN 98122176 Pending CN1228477A (zh) | 1998-12-30 | 1998-12-30 | 鸡传染性支气管炎病毒基因型的检测方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN1228477A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102719567A (zh) * | 2012-07-05 | 2012-10-10 | 广东温氏食品集团有限公司 | 禽传染性支气管炎病毒h120毒株的pcr检测引物及检测方法 |
| CN108315488A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-07-24 | 山东新希望六和集团有限公司 | 用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的引物、rt-pcr检测试剂盒及方法、应用 |
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1998
- 1998-12-30 CN CN 98122176 patent/CN1228477A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102719567A (zh) * | 2012-07-05 | 2012-10-10 | 广东温氏食品集团有限公司 | 禽传染性支气管炎病毒h120毒株的pcr检测引物及检测方法 |
| CN108315488A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-07-24 | 山东新希望六和集团有限公司 | 用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒毒株类型的引物、rt-pcr检测试剂盒及方法、应用 |
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