CN1220774C

CN1220774C - 一种pcr方法

Info

Publication number: CN1220774C
Application number: CN 03101874
Authority: CN
Inventors: 安成才; 严远鑫; 栗力; 古佳玉; 谭桂宏; 陈章良
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University; Beijing University of Technology
Priority date: 2003-01-28
Filing date: 2003-01-28
Publication date: 2005-09-28
Anticipated expiration: 2023-01-28
Also published as: CN1521263A

Abstract

本发明提供了一种PCR方法，它包括以下步骤：1)利用末端转移酶将基因组DNA加Poly d(T)_n尾；2)将DNA片段用产生3’-突出端的限制性内切酶进行酶切，产生3’突出末端DNA片段；3)利用DNA聚合酶，以产生3’突出末端的DNA片段为模板与已知序列区的特异引物进行单向PCR反应；4)单向PCR反应特异靶目标DNA的3’-末端多附加一个A碱基、然后与带有3’-T尾的T-linker连接；5)以已知区特异引物和T-linker内的引物扩增目标DNA分子。本发明PCR方法具有简单快速、特异性高、通用性强、重复性好、一次扩增片段较长且成本低廉等优点。可广泛适用于分子生物学研究中多种目的的染色体步查，如转基因动、植物及微生物中外源基因插入位点的鉴定、基因未知区段新基因的分离等。

Description

一种PCR方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域中的一种PCR方法。

背景技术

通过PCR步查法获得插入位点的毗邻序列较传统的建库筛选相比，操作简便、快捷且成本低廉，是分离与已知序列毗邻的未知序列或新基因的首选实验方法。现有的PCR步查法，如inverse PCR、连接介导PCR、TAIL-PCR等存在着方法过于复杂、受酶切位点的限制、扩增的片段小(达不到研究者所要求的长度)、特异性差等弊端，常常扩增不到研究者所需要的DNA片段。

目前用于分离与已知序列毗邻的未知序列的PCR方法已报道有几十种，按其采用的原理，可归纳为如图1所示的三种：

1、反向PCR(Inverse PCR)(Triglia T et al.，1988；Ochman H et al.，1988；Arveiler B et al.，1991；Huang SH 1994；Akiyama K et al，2000)：将未知序列端反折回来，与已知序列相连接，再用已知序列上的两引物作PCR。反向PCR主要有两个技术问题：(1)要求在已知序列和未知序列端有相同的酶切位点，当一端没有或两端皆没有合适的酶切位点时，反向PCR不适用。(2)当两端皆存在合适的酶切位点时，反向PCR也不十分有效，因为连接反应多发生于分子间，分子内连接(环化)的几率很小。

2、连接介导的PCR(ligation-mediated PCR)(Mueller PR et al.，1989；PfeiferGP et al.，1989；Rosenthal A et al，1990；Dai SM et al，2000)。连接介导的PCR是在未知序列端连接上一个接头，用已知序列端的特异引物和未知序列端的接头引物作PCR扩增。这类PCR方法的共同特点是特异性差，虽然已发展了多种用于这类PCR的接头(如图2所示)，以提高其特异性，但这些接头的采用并未显著地改善这类PCR方法的特异性。

3、随机退火的PCR(randomly primed PCR)(Frohman MA et al，1988；Loh EYet al，1989；Ohara O et al，1989；Shyamala V et al，1989；Parker JD et al，1991；Liu YG et al.，1995；1995)：这类PCR也有两个技术问题，1)这类PCR要求在未知序列端有简并引物(arbitrary degenarated primer)的结合位点，而实际情况是在很多情况下在未知序列端缺乏简并引物的结合位点。2)非特异性扩增问题十分突出，在多数情况下非特异性扩增掩盖了特异性扩增，从而得不到所需要的特异性PCR扩增产物的条带。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种高特异性、高成功率的PCR方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案，如图3所示：一种PCR方法，它包括以下步骤：

1)利用末端转移酶将基因组DNA加Poly d(T)_n尾；

2)将DNA片段用产生3’-突出端的限制性内切酶进行酶切，产生3’突出末端DNA片段；

3)利用DNA聚合酶，以产生3’突出末端的DNA片段为模板与已知序列区的特异引物进行单向PCR反应；

4)单向PCR反应特异靶目标DNA的3’-末端多附加一个A碱基、然后与带有3’-T尾的T-linker连接；

5)以已知区特异引物和T-linker内的引物扩增目标DNA分子。

上述方法可以称为T-linker PCR。

通过末端转移酶[Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)]加Poly d(T)尾，可以消除基因组DNA在提取过程中所造成的物理性断片的5’-突出末端和平末端结构。

单向PCR反应，可在较高的温度和Taq酶的作用下只复制含有已知区特异引物靶基因的DNA片段(特异DNA模板)。

单向PCR反应中特异靶目标DNA的3’-末端多附加一个A碱基(3’-A)，可以使不具有已知区特异引物结合位点的其他DNA片段(非特异DNA模板)分子保持不变。在特异靶目标DNA的3’-末端多附加一个A碱基(3’-A)，不具有已知区特异引物结合位点的其他DNA片段(非特异DNA模板)则无法附加3’-A，可保持分子不变。

所述与T-linker特异性连接是利用T₄ DNA连接酶，将新复制的具有3’-A末端的靶目标DNA片段与接头(T-linker)特异性连接，形成靶目标DNA分子与T-linker(A/T)相连接的特异DNA分子。

3’-末端突出一个T碱基(3’-T)的T-linker可根据扩增的DNA，采用常规引物设计方法进行设计，如：

5’---GTAGGTGTGTGGAGGATGCTGAGCGAGGT-3’

3’-TCATCCACACACCTCCTACGACTCGCTCCA-5’等均可。

所述扩增反应是以已知区特异引物和T-linker内的引物扩增目标DNA分子。所述扩增反应优选为进行第一轮和第二轮两轮扩增反应；所述第一轮扩增反应是以已知区第一特异引物(S₁)和T-linker内第一引物(W₁)扩增目标DNA分子；所述第二轮扩增反应是以已知区内侧第二特异引物(S₂)和T-linker内侧第二引物(W₂)进一步扩增目标DNA分子。

为了根据两个内侧特异引物(S₂、S₃)所扩增DNA片段的大小差异来辨认PCR产物是否为特异性分子，所述第二轮扩增反应中，用已知区内侧第三特异引物(S₃)与T-linker内侧第二引物(W₂)作平行的第二轮扩增反应。

T-linker PCR是基于特异性连接的PCR技术，连接方式为T/A连接。T-linker PCR与连接介导的PCR方法比较如图4所示，从图中可以看出：前者将接头3’-末端的T碱基特异性地连接到目标DNA分子尾端的A碱基，故特异引物S和接头引物W之间的PCR扩增特异性很高。而后者接头与所有的DNA分子间皆发生连接反应，两个接头引物WP之间PCR扩增反应极大地影响或掩盖了目标DNA分子的扩增。

T-linker PCR与现有PCR方法相比，具有简单快速、特异性高、通用性强、重复性好、一次扩增片段较长且成本低廉等优点。

T-linker PCR可广泛适用于分子生物学研究中多种目的的染色体步查，如转基因动、植物及微生物中外源基因插入位点的鉴定、基因未知区段新基因的分离等。

附图说明

图1为现有步查PCR方法的原理图

图2为连接介导PCR方法所采用的接头方式示意图

图3为T-linker PCR的原理图

图4为T-linker PCR与连接介导PCR方法比较图

图5为T-linker PCR方法对S8下游基因的第一步PCR扩增DNA片段电泳图

图6为T-linker PCR方法对S8下游基因的第二步PCR扩增DNA片段电泳图

图7为转基因水稻S8-1下游基因步查结果的图示分析

具体实施方式

实施例1：用本发明的PCR方法对转基因水稻S8-1下游基因进行步查分析。

以S8尾端的3个特异性引物dw1、dw2、dw3向S8的下游作walking，结果如图5所示。图中I、II、III为引物dw1、dw2、dw3，I和II之间有216bp的距离，II和III之间有174bp的距离；A、B、C、D为5μg的S8-1基因组DNA分别经7.5、11、15、30U的Hha I酶切30分钟后连接T-linker，并作T-linker PCR扩增；1、2、3、4分别为扩增获得的特异片段F1(1.0kb)、F2(0.8kb)、F3(0.6kb)和F4(＜0.2kb)。前三个分别对应S8基因的三个拷贝S8a、S8b、S8c，F4为三者共有的一段载体片断。结果表明采用4碱基限制性内切酶HhaI的不同浓度进行不完全酶切(7.5-30U/5μgDNA，30分钟)后，T-linker PCR得到的条带相似，说明酶切完全与否对T-linker-PCR扩增的影响不大。经对F1、F2和F3作多序列比较(alignment)并与GenBank进行数据比较分析(blast)结果：

F1(1.0kb)：1bp-558bp为载体序列，第558核苷酸之后的序列为S8-1水稻基因组中S8a的毗邻序列。该序列毗邻又分为两部分，一部分为第559-705核苷酸，与E.coli的trfA相似(98％)，另一部分为第706-966核苷酸，与E.coli的gapC基因相似(98％)，步查结果的图示分析如图7所示。

F2(0.8kb)：载体序列，来源于S8b。

F3(0.6kb)和F3’(0.6kbdU)：F3和F3’两者序列相同(F3比F3’多80bp)，来源于S8c。F3的1-364bp为载体序列，364bp之后为S8c在水稻基因组中的毗邻序列，与E.coli的一段基因组序列相似(98％)，为putative NADH dehydrogenase nuoG(推测的NADH脱氢酶nuoG)，步查结果的图示分析如图7所示。

以第一步得到的F2(0.8kb)的尾端序列再次设计合成3个特异性引物dw8、dw9、dw10：

dw8：5’-GCTGCAAATGTTACTGAATACAAGTATGTCC-3’

dw9：5’-TTATGAACTTTCCTTTATGTAATTTTCCAG-3’

dw10：5’-GGCTGCCATTTTTGGGGTGAGG-3’

沿S8b继续向S8的下游作PCR步行，获得10个特异片段，结果如图6所示。对其中的3个大片段：F5(2.0kb)、F6(1.6kb)和F7(1.2kb)进行了测序。经分析证明它们分别来源于S8b、S8b-2和S8b-3。

将F5、F6和F7作多序列比较(alignment)并与GenBank数据库进行比较分析(blast)，步查结果的图示分析如图7所示。

F5(2.0kb)：载体序列，为S8b在片段F2下游的延伸序列。

F6(1.6kb)：1bp-900bp为载体序列，第901bp-1616bp为S8b-2在水稻基因组中的毗邻序列，该序列为人、拟南芥、水稻、E.coli、鼠等物种共有的转座序列。

F7(1.2kb)：1bp-965bp为载体序列，第966bp-1213bp为S8b-3在水稻基因组中的毗邻序列，第1004bp-1213bp与杂交水稻基因组(华大)的contig329的一段相同(99％)，但GenBank中找不到与插入序列同源的序列。

Claims

1、一种PCR方法，它包括以下步骤：

1)利用末端转移酶将基因组DNA加Poly d(T)_n尾；

5)以已知区特异引物和T-linker内的引物扩增目标DNA分子。

2、根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于：所述扩增反应为第一轮和第二轮两轮扩增反应；所述第一轮扩增反应是以已知区第一特异引物(S₁)和T-linker内第一引物(W₁)扩增目标DNA分子；所述第二轮扩增反应是以已知区内侧第二特异引物(S₂)和T-linker内侧第二引物(W₂)进一步扩增目标DNA分子。

3、根据权利要求2所述的PCR方法，其特征在于：所述第二轮扩增反应中，用已知区内侧第三特异引物(S₃)与T-linker内侧第二引物(W₂)作平行的第二轮扩增反应。

4、权利要求1-3中的任意一项PCR方法在染色体步查中的应用。