CN1217190C - 引起精神障碍的中枢神经系统疾病中smr1－nep相互作用的调节 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及调节SMR1-肽和金属肽酶之间的相互作用的制剂在制备用于预防或治疗引起精神障碍(mental disorders)的中枢神经系统疾病的药物中的用途。
Description
本发明涉及引起精神障碍(如受损的人际关系和行为障碍)的中枢神经系统疾病的预防和治疗方法，所述方法包括调节SMR1-肽和金属肽酶(metallopeptidase)之间的相互作用。
本发明人此前描述了一种新的大鼠下颌下腺蛋白，即SMR1(submandibular rat 1 protein)，其具有激素原(prohormone)的结构，且其合成受雄激素的调控(Rosinsky-Chupin等，1988，美国科学院院报；85(22)：8553-7，和PCT专利申请No.WO 90/03981)。编码SMR1的基因属于一种新的多基因家族，即VCS家族，其定位于大鼠14号染色体p21-p22区带(Courty等，1996，Mol.Biol.Evol.13(6)：758-66；Rosinsky-Chupin等，1995，Mamm.Genome 6(2)：153-4)，且其对应的人类基因已经被描述(Isemura等，1997，J.Biochem 121：1025-1030；Isemura等，1994，J.Biochem 115：1101-1106；Isemura等，1979，J.Biochem 86：79-86；Dickinson等，1996，Curr Eye Res，15：377-386)。该基因具有类似于多种激素前体基因的结构(Rosinsky-Chupin等，1990，DNA Cell.Biol.9(8)：553-9)。SMR1的mRNA在雄性大鼠的颌下腺(submaxillary gland，SMG)的腺泡细胞以及前列腺中的表达具有高度的组织、年龄和性别特异性(Rosinsky-Chupin等，1993，Histochem.Cytochem.41(11)：1645-9)。在体内，SMR1以组织和性别特异性的方式经过在成对的碱性氨基酸部位的加工而成为成熟的肽产物，该方式与肽类激素的前体的成熟途径类似(Rougeot等，1994，Eur.J.Biochem 219(3)：765-73)。具有相关结构的肽是由SMR1经成对的精氨酸残基的裂解而产生的，如十一氨基酸多肽：VRGPRRQHNPR；六肽：RQHNPR；以及五肽：QHNPR，其在体内通过成对的碱性氨基酸转换酶如Furine转换酶对成对的碱性氨基酸残基进行加工后由前体达到选择性的成熟——以组织、年龄和性别相关的方式不同程度的积聚——并在多因素的神经内分泌调控下释放至局部以及全身(Rougeot等，1994)。
在这种情况下，自SMR1产生的最终的成熟的肽，即SMR1-五肽(SMR1-QHNPR)，主要地作为对雄激素的应答而被合成，并在基础状态下组成性地释放于血液中，同时作为对环境应激的应答可被迅速地释放，这取决于调控SMG的分泌反应性的雄激素受体的激活状态。
继而，循环中的SMR1-五肽在体内被外周的靶组织通过特异性的结合位点摄取，主要是在肾脏、骨骼和牙齿。
该肽的靶位点主要位于离子捕获、转运和调节的主要组织，这一点提示SMR1-五肽在体内调节矿物离子的自稳态过程中可能具有局部以及全身性的作用。此外，由于受雄激素调节的SMR1-五肽在存在环境应激时被迅速释放，这促使本发明人假设这种SMG-特异性的信号肽可能参与介导了动态自稳态应答的整合性重建：所述应答针对于雄性大鼠特异性的行为特征如进攻性和/或性行为中的应激条件，以及与雌性特异性的生理特征如妊娠和哺乳相关的应激条件。
WO 98/37100公开了SMR1蛋白的成熟产物，特别是具有结构通式XQHNPR的肽，可识别与矿物离子浓度密切相关的器官中的特异性靶位点。这一发现促使本发明人推测SMR1-肽(特别是SMR1-五肽、六肽或十一肽)在调节体液和组织中的金属离子的浓度方面具有活性作用，并因此推测此类肽在所有与矿物离子失衡相关的代谢异常中具有治疗作用。
也就是说，所公开的具有治疗作用的肽可用于治疗或预防由体液或组织内的矿物离子失衡所引起的骨骼、牙齿、肾脏、小肠、胰腺、胃或唾液腺的疾病，即甲状旁腺功能亢进或低下、骨质疏松、胰腺炎、颌下腺结石、肾结石或骨营养不良。
根据上述假设，采取了一种行为药理学的方法。SMR1-肽，特别是SMR1-五肽，被发现可在成熟雄性大鼠诱导剂量依赖性的性行为的增强，而其进攻性冲动行为则较对照大鼠减少(PCT专利申请WO01/00221)。
为阐明SMR1-肽的作用途径，对肽受体位点的分子特征的研究是不可或缺的步骤之一。放射性标记的SMR1-五肽经由全身性施用可达到的此膜结合位点已经得到分离，特别是在肾脏的外层髓质。对其氨基酸序列的鉴定显示出在体内能结合所述的肽的该细胞表面分子是一种膜金属肽酶，更确切地说是一种哺乳动物的II型整合性膜含锌内肽酶，即中性内肽酶24-11或NEP，也称为脑啡肽酶，属于Neprilysin亚家族，其在多种肽能性信号的功能效力中具有关键性的作用。此外，大鼠肾脏的NEP和SMR1-五肽在体内的相互作用已经通过纯化的兔肾NEP得到证实。
此外，体内研究发现，在大鼠的整体水平上，循环中的放射性标记的SMR1-五肽可达到的靶器官的分布与已知的合成的NEP抑制剂(3HHACBO-Gly)的分布之间存在良好的(拓扑学及动力学)相关性(Sales等，1991，Regulatory Peptides.33，209-22)。另外，一些发现支持SMR1-肽是一种由SMG衍生的、NEP活性的天然的调节剂，特别是一种抑制剂：
1-已经发现SMR1-五肽的组织摄取在体内具有药物动力学和生物化学的稳定性，
2-鉴于NEP优选地在X-Phe键对肽进行裂解，SMR1-肽不具有作为NEP的底物所需的残基，以及
3-SMR1-五肽具有强效的锌螯合基团，所述的锌螯合基团已经用于设计有效的合成的NEP抑制剂。
鉴于存在众多的生理学NEP底物(即肽激素：脑啡肽、P物质、缓激肽、血管紧张素II以及心房利尿钠肽(atrial natriuretic peptide))，NEP/SRM1-肽相互作用的生理学结果被认为可以影响对中枢和外周的疼痛感觉、炎症现象、动脉的张力和/或矿物质交换的控制(Roques等，1993，下文)。
中性内肽酶NEP 24-11在哺乳动物的神经和周围组织中均有分布，在外周，其在肾脏和胎盘尤其丰富。在此类组织中，细胞表面的金属肽酶NEP参与了神经肽、系统性免疫调节肽以及肽激素的分泌后处理和代谢。通过对循环的或分泌的调节肽的活性水平进行控制，NEP调控了这些肽的生理学受体介导的作用。因此，膜链NEP参与了对以下激素活性的调节：强效血管活性肽如P物质、缓激肽(BK)、心房利尿钠肽(ANP)以及血管紧张素II(AII)；强效的炎症/免疫调节肽如P物质、BK以及fMet-Leu-Phe(fMLP)；强效的阿片神经肽如Met-和Leu-脑啡肽(Enk)和强效的离子交换及体液自稳态调节肽如ANP、C-型利尿钠肽(C-type Natriuretic Peptide，CNP)和B-型利尿钠肽(BNP)。然而，此类肽的水平仅在它们被紧张性释放或是由刺激触发而释放的区域随着NEP诱导的形成/降解而改变。从整体角度来看，NEP的生物活性是调控的肽能信号(peptidergicsignal)的活性水平，所述的肽能信号参与调节了动脉压、炎症现象和水矿物质内稳态，同时也调控了对痛觉的处理。从临床角度来看，这证实了NEP可作为各种疾病状态的一种药物靶向。例如，通过抑制NEP，从而提高中枢或外周的内源性阿片肽，可由此获得止痛剂或抗腹泻剂，或通过抑制内源性AII的形成以及BK和ANP的灭活，可由此获得抗高血压、利尿钠和利尿剂。通过应用NEP抑制剂而改变内源性肽的浓度的主要优势在于所产生的药理学效应是仅仅通过天然的效应分子刺激其受体而诱导产生的，并且是严格地依赖于在环境、行为和病理生理性应激条件下、由紧张性或刺激诱发的天然效应分子的释放(Roques等，1993，Pharmacological Reviews.45，87-146)。应当着重强调的是，在此类应激条件下，天然的潜在的NEP调节剂SMR1-肽也会迅速而紧张性地释放、分布、并被其全身的靶组织摄取，特别是在肾脏的NEP位点(Rougeot等，1997)。由此，SMR1-肽可以在体内被动力性地生物利用以调节NEP的活性，从而使得针对应激而产生的局部和全身性的炎症性、血管收缩和/或离子内稳态的应答达到最佳。这一整体性的观点与下面的假设一致，即循环的颌下腺(SMG)衍生因子可以参与对生理性或病理性的“应激状态”(损伤、创伤或感染)的内稳态应答的整体重建，而非保持静息的内稳态的稳定状态(Rougeot等，2000，Peptides.21，443-55)。
通常而言，生理学重要性的证据表明存在一个颈交感干(CervicalSympathetic Trunk(CST))-SMG神经内分泌轴，其在生理适应中发挥整合作用，并维持哺乳动物的内稳态，特别是在如发生组织损伤、炎症、以及进攻行为的啮齿动物中所见的“应激条件”下。实验室得来的数据提供了令人信服的证据，支持SMR1-肽是一种新的信号调节剂，适应于性别和种属特异性的环境、行为和生理特征，在紧急情况下被紧张性和动力学性地动员，通过对膜结合的NEP活性的调节使得局部和全身性的疼痛性、炎症性、血管收缩和/或离子内稳态的应答达到最佳。另外，SMR1-肽作为目前发现的首个天然的外周NEP活性的调节剂，由于该金属肽酶的高度保守性，特别是在大鼠、兔和人之间具有≥90％的序列相同性(Genbank access numberP08473，Malfroy等，FEBS Lett，1988，229(1)，206-210；Genbank accessnumber NP258428，Bonvouloir等，DNA Cell Biol，2001，20(8)，493-498；Genbank access number NP036740，Malfroy等，Biochem Biophys Res.Commun，1987，144，59-66)，似乎可以被设计为一种新型的治疗分子。
本发明人提供的证据连同NEP序列的惊人的相同性进一步提示SMR1-肽可以作为膜金属肽酶，特别是锌金属肽酶的天然调节剂/抑制剂。
因此本发明的一个主题是用于预防或治疗引起精神障碍的中枢神经系统疾病的方法，所述的方法包含对SMR1肽与金属肽酶的相互作用的调节。
本发明的另一个主题是调节SMR1肽与金属肽酶的相互作用的制剂在制备用于预防或治疗引起精神障碍的中枢神经系统疾病的药物中的应用。
金属肽酶
除NEP以外，哺乳动物的膜金属肽酶的例子有内皮素(Endothelin)-转换酶(ECE)、特别是ECE1和ECE2、红细胞表面抗原KELL和X-连锁性低血磷性佝偻病(hypophosphatemic rickets)相关的PEX基因产物，以及血管紧张素转换酶(ACE)。
天然的NEP底物主要是肽类激素：脑啡肽、P物质、缓激肽、血管紧张素II和心房利尿钠肽，这些激素在对中枢和外周的痛觉感受、炎症现象和/或动脉紧张度的调控方面具有关键性的作用。
调节剂
“调节剂”应被理解为该制剂能够增强或降低金属肽酶的活性或阻断内源性SMR1-肽与该金属肽酶之间的正常的相互作用。
“内源性”是指一种分子(在此为SMR1-肽)，其天然地表达或成熟于准备接受治疗的病人的组织中。
根据本发明，调节SMR1-肽与该金属肽酶之间的相互作用的制剂可通过筛选方法而得到鉴定，并且/或者，例如考虑到内源性SMR1蛋白和肽的结构，而进行设计。
为了设计调节剂，可以考虑SMR1蛋白、由SMR1产生的肽，或称为SMR1蛋白的成熟产物、或所述的蛋白或所述的成熟产物的具有生物活性的衍生物之一的结构。
还可以进一步考虑具有下列通式(1)的化合物：
X1QHX2X3X4
其中X1代表一个氢原子或X1代表选自如下的一个氨基酸链：X1＝R或G，X1＝RR，或X1＝PRR，或X1＝GPRR，或X1＝RGPRR，或X1＝VRGPRR，X2提供N，G或D，X3提供P或L，以及X4提供R或T。
优选的肽包含具有如下序列的肽：
来自褐鼠(Rattus norvegius)的QHNPR、RQHNPR和VRGPRRQHNPR，
来自黑鼠(Rattus rattus)的QHNLR和RQHNLR，
来自小鼠的GQHGPR和GQHDPT。
在上述的氨基酸序列中：
Q代表谷氨酰胺，
H代表组氨酸，
N代表天冬酰胺，
G代表甘氨酸，
P代表脯氨酸，
R代表精氨酸，
L代表亮氨酸，
T代表苏氨酸，
D代表天冬氨酸，以及
V代表缬氨酸。
能够调节内源性SMR1-肽与金属肽酶之间的相互作用的制剂包括肽或其他有机分子。其可以是一种化合物或化合物的混合物，如天然提取物。该调节剂的结构可以是已被描述的或是未知的，条件是该调节剂具有调节SMR1-肽与金属肽酶之间的相互作用的能力。
在本发明中，“肽”是一种分子，其由通过肽键彼此以线性排列方式相连接的线性排列的氨基酸残基组成。此线性排列可任选地为环形，即该线性肽的两端或肽内的氨基酸侧链可以结合，例如通过化学键。本发明的此类肽可包括自3到500个氨基酸，且可以进一步包括二级、三级或四级结构，以及与其他的肽或其他的非肽类分子的分子间结合。此类分子间结合可以但不限于通过共价键(例如通过二硫键)、或通过螯合作用、静电相互作用、疏水相互作用、氢键、离子-偶极(ion-dipole)相互作用、偶极-偶极(dipole-dipole)相互作用、或上述的任何组合。
本发明的肽可以用本领域已知的技术方便地合成(见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)。
模拟肽(peptidomimetic)也是所需的化合物。
优选的模拟肽保留了原有肽的结合特异性和/或生理学活性，如上所述。在此，“模拟肽”是指一种有机分子，其模拟肽的一些特性，优选地，其模拟肽的结合特异性和/或生理学活性。优选的模拟肽是通过对本发明的肽进行结构修饰而获得的，优选地使用非天然氨基酸、D氨基酸替代L氨基酸、构象限制、同配(isosteric)替代、环化、或其他修饰。其他优选的修饰包括但不限于那些其中的一个或多个肽键被非肽键所替代，和/或一个或多个氨基酸侧链被一个不同的化学结构所替代，或一个或多个N-端、C-端或一个或多个侧链被保护基团所保护，和/或在氨基酸链中引入双键和/或环化和/或立体特异性(stereospecificity)以增加强度和/或结合亲和力。
其他进一步优选的修饰包括那些旨在增强对酶性降解的抗性、提高其特别是在神经系统和生殖系统的组织中的生物利用度、以及更一般而言改善其药理动力学特征，并特别包含：
-保护NH2和COOH亲水基团，其通过使用亲脂性醇进行酯化作用(COOH)、或通过酰胺化(COOH)、和/或通过乙酰化(NH2)、或在NH2端添加羧基烷基或芳香疏水链；
-CO-NH肽键的相互转化或还原异构体或酰胺官能团的甲基(或酮亚甲基(ketomethylene)，亚甲氧基(methyleneoxy)，羟基乙烯(hydroxyethylene))化物；
-用L氨基酸替代D氨基酸；
-氨基酸肽链二聚化。
所有这些变化均为本领域所熟知，因此，假如这些肽序列在此得到公开，可以使得本领域技术人员能够设计并生产出具有与此类肽相似或更佳的结合特征的模拟肽(见例如Horwell等，Bioorg.Med.Chem.4：1573(1996)；Liskamp等，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 1：113(1994)；Gante等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：1699(1994)；Seebach等，Helv.Chim.Acta 79：913(1996))。
本发明所用的肽的制备通过液相或固相肽合成的常规方式进行，将待结合的不同的氨基酸残基顺序连接(在液相为从N-端至C-端，或在固相为从C-端至N-端)，其中的N-端以及反应性侧链被预先用常规基团封闭。
对于固相合成，可以特别地应用如Merrifield所述的技术。或者，也可应用Houbenweyl在1974所述的技术。
更多的细节可参考WO 98/37100。
本发明的治疗方法中所用的肽可通过基因工程方法获得。PCT专利申请No.WO 90/03891(Rougeon等)描述了编码完整的146个氨基酸的SMR1蛋白的cDNA的核酸序列。对于SMR1-肽的具有生物活性的肽的衍生物，例如X1QHX2X3X4的衍生物，本领域技术人员可参考通用文献以确定一种可用于合成所需的肽的适当的密码子。
下面描述的方法可使得本领域技术人员能够选择并纯化这些具有生物活性的衍生物，所述的衍生物所结合的靶向与本发明的SMR1-肽相同，并具有本发明的SMR1-肽的激动剂或拮抗剂的生物活性。
本发明的调节剂可以是蛋白、肽、激素、抗体或合成的化合物，所述的化合物可以是肽或非肽类化合物，其可通过有机化学的常规方法进行合成。
对本发明的调节剂进行筛选不但可通过分析候选配体分子与QHNPR五肽的NEP结合位点的结合，而且可通过检测由该候选分子诱导其靶向发生的代谢改变而实现，所述的代谢改变例如为通过蛋白激酶或腺苷酸环化酶的信号转导所引起的初级或次级信使的合成和/或释放，以及G蛋白家族的蛋白的激活，或NEP的酶活性的变化，特别是天然的NEP底物的代谢。
候选分子的结合分析通常在4℃-25℃或37℃进行。为便于下文中所述方案的表述，使用QHNPR五肽来替代或与候选分子进行竞争。
因此，本发明的另一个目的是筛选特异性结合QHNPR五肽的NEP结合位点的配体分子的方法，其包含如下步骤：
a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或靶器官标本或组织样品(冰冻切片或切片或膜制备物或粗匀浆物)；
b)加入该待测定的候选分子与半饱和浓度的标记的五肽竞争；
c)将步骤a)的所述的细胞培养物、器官标本或组织样品与所述的候选分子在利于特异性结合发生的条件下孵育足够的时间；
d)定量分析在存在不同浓度的标记的候选分子的情况下(优选为10-10至10-5M)，特异性结合到所述的细胞培养物、器官标本或组织样品的标记物。
上述方法中的半饱和浓度是指可结合50％的NEP结合位点的标记的QHNPR五肽的浓度。
该方法还可用来定义候选分子相对于QHNPR的相对亲和力。
本发明的另一个目的是一种用于确定配体分子与QHNPR五肽的NEP结合位点发生特异性结合的相对亲和力的方法，其包含对每个候选分子进行上述a)，b)，c)和d)的步骤，并进一步包含步骤e)，该步骤将步骤d)的经定量分析的各个候选分子的亲和力与另一个候选分子进行比较。
本发明的另一个目的是一种用于确定配体分子与QHNPR五肽的NEP结合位点发生特异性结合的亲和力的方法，其包含如下步骤：
a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或靶器官标本或组织样品(冰冻切片或切片或膜制备物或粗匀浆物)；
b)加入预先经过放射性或非放射性标记物标记的候选分子；
c)将步骤a)的所述的细胞培养物、器官标本或组织样品与所述的标记的候选分子在利于特异性结合发生的条件下孵育足够的时间；以及
d)定量分析在存在不同浓度的标记的候选分子的情况下(优选为10-10至10-5M)，特异性结合到所述的细胞培养物、器官标本或组织样品的标记物。
该候选的配体分子可以是放射性标记的(32P、35S、3H、125I等)或是非放射性标记的(生物素、地高辛、荧光素等)。
因此，本发明还涉及筛选对QHNPR五肽的NEP结合位点具有激动剂生物活性的配体分子的方法，其包含如下步骤：
a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或靶器官标本或组织样品(冰冻切片或切片或膜制备物或粗匀浆物)；
b)在存在候选分子(优选为10-10至10-5M)、半饱和浓度的QHNPR和NEP底物的情况下，孵育其浓度可满足在初始速率的条件下(例如在实施例1的材料与方法中所定义的那样)对NEP的酶活性进行测定的步骤a)的所述细胞培养物或器官标本或组织样品，孵育的时间足以使得NEP底物在初始速率条件下发生水解；
c)分别在有或没有所述的候选配体分子以及有或没有QHNPR的情况下，通过测定NEP底物水解的程度对步骤a)的生物物质中的NEP的活性进行定量分析。
在上述方法中，半饱和浓度是指使NEP底物的降解降低一半的QHNPR五肽的浓度。
本发明的另一个目的包含一种用于筛选对QHNPR五肽的NEP结合位点具有拮抗剂生物活性的配体分子的方法，其包含一些步骤：
a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或靶器官标本或组织样品(冰冻切片或切片或膜制备物或粗匀浆物)；
b)在存在次最大浓度的XQHNPR肽、特别是QHNPR肽以及NEP底物的情况下，在存在候选分子的情况下，孵育其浓度可满足在初始速率的条件下对NEP的酶活性进行测定的步骤a)的所述细胞培养物或器官标本或组织样品，孵育的时间足以使得NEP底物在初始速率条件下发生水解；
c)分别在有或没有所述的候选配体分子以及有或没有QHNPR的情况下，通过测定NEP底物水解的程度对步骤a)的生物物质中的NEP的水解活性进行定量分析。
在上述方法的一个优选的实施方案中，次最大浓度是指能够使所述底物的降解降低至少50％且优选地为至少75％的五肽的浓度。
如上所述，另一个代谢分析可以评价候选配体分子的激动剂或拮抗剂活性，其包含将候选配体分子与原代细胞培养物、已有的细胞系、或来自大鼠、小鼠或人的组织样品、以及内源性或外源性的NEP底物进行孵育，对NEP底物的水解进行定量或定性或既定量又定性的测定。
优选地，用于本发明的筛选方法的组织样品是大鼠脊髓的膜制备物或切片，已知该组织适合用于进行NEP活性分析。
这一过程也可应用于来自小鼠或人的组织和/或细胞，或是用人的NEP cDNA转染的细胞系。
根据本发明的方法，本发明的肽或模拟肽可以多种途径施用。在一些优选的实施方案中，可通过肠外施用，最优选静脉施用。在其他优选的实施方案中，可以通过鼻内、口服、舌下、经粘膜、气道内、或经由惰性的或离子导入贴膜而施用。
所施用的的肽或模拟肽的剂量取决于特定的病人、病情、以及施用途径，并且可以根据经过提高治疗剂量后上述病理性异常情况的减轻或消除的情况，对施用剂量进行经验性判断。优选的剂量为大约0.1μg/kg-大约1mg/kg，更优选地为大约1μg/kg-大约100μg/kg，且最优选地为大约1μg/kg-大约50μg/kg。
中枢神经系统疾病
本发明的重点在于预防或治疗引起哺乳动物精神障碍的中枢神经系统(CNS)疾病。
在本发明中，术语“哺乳动物”取其分类学上的通常含义并特别说明其包括人。
本发明中的CNS疾病是指包括人际关系和行为障碍性疾病在内的精神障碍。
PCT专利申请WO 01/00221记载了多种精神障碍。本发明提供了可减轻或消除精神障碍的症状的新的治疗途径。
在此，“患有精神障碍”是指表现出至少一种在临床上可观察到的行为或生理特征，所述的特征通常被视为精神障碍的症状。术语“减轻或消除精神障碍的症状”指的是通常被视为精神障碍的症状的一种或多种行为或生理特征出现了在临床上可观察到的有益的改变。精神病学专家工作组撰写的手册提供了精神障碍的诊断标准。该手册由美国精神病学协会出版，《精神疾病的诊断及统计学手册》(1992年)。以下所讨论的疾病均属常见疾病，这在该手册的此类疾病的治疗中有述。因此，在以下讨论中对这些疾病仅做简单的叙述。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍是一种回避障碍(avoidance disorder)。在此，“回避障碍”指的是这样一种疾病，其必要的特征为广泛的社会不适应感、担心负面评价且严重缺乏自信，包括过分畏惧与陌生人接触。本发明特别涉及回避障碍型人格，其定义为广泛的社会抑制、失败感、并对负面评价过于敏感，这开始于少年时代早期，并存在于生活的各个方面(DSMP-IV-TR编码301.82，《精神疾病的诊断及统计学手册》(美国精神病学协会，1992年)，718-21页)。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍是认知障碍(decreased awareness disorder)。在此，“认知障碍”指的是这样一种疾病，其特征为对其他人的存在和感情缺乏认知(如把人当作一件家具；察觉不到别人的痛苦)。这些疾病可以是孤独症的基础。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍是注意缺陷障碍/多动症(attention deficit/hyperactivity disorder)。在此，“注缺陷障碍/多动症”指的是这样一种障碍，其主要的特征为持续性的与年龄不相称的、显著的注意力分散。其还包括混合型、显著的注意力分散型、以及多动-冲动型(DSMP-IV-TR编码314.01，314.00，314.01，《精神疾病的诊断及统计学手册》(美国精神病学协会，1992年)，87-93页)。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍是唤醒障碍(arousaldisorder)。在此，“唤醒障碍”是指反应性依恋障碍(reactive attachmentdisorder)，例如无法进行大多数的社会交往或是对其缺乏反应。在儿童，这可导致称为“发音停顿(failure to thrive)”或“长期孤儿院生活的不良影响(hospitalism)”的严重情况。对环境兴趣减退是反应性依恋障碍的另一种基础，通常表现为对眼睛、面孔或声音缺乏视觉追踪，对目标不伸手。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍是对外界的人际交流活动和关系受损(impaired interpersonal functioning and relationship tothe external world)。在此，“对外界的人际交流活动和关系受损”是指其他的人际交流问题，例如与同事或情侣难于相处。此类障碍包括精神分裂症的人格障碍，这是一种对社会关系的普遍的冷淡，以及情感经历和情感表达的受限，同时也包括精神分裂症或抑郁症。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍是情绪障碍，尤其是指精神抑郁性障碍(精神，编码300.4，《精神疾病的诊断及统计学手册》(美国精神病学协会，1992年)，380-1页)，以及非特指的抑郁症(精神，《精神疾病的诊断及统计学手册》(美国精神病学协会，1992年)，381-2页)；非特指的循环情感性精神障碍(cyclothymic disorder)和双向性精神障碍(bipolar disorder)(精神，编码分别为301.13和296.80，《精神疾病的诊断及统计学手册》(美国精神病学协会，1992年)，400页)。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍是与性相关的社会活动受损。在此，“与性相关的社会活动受损”是指与性伴侣之间的社会关系受到削弱，而这会影响到职业活动。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍是性行为障碍。在此，“性行为障碍”包括性行为和性别认定障碍，特别是指性欲低下(H.S.D.D.，精神，编码302.71，《精神疾病的诊断及统计学手册》(美国精神病学协会，1992年)，543-40页)，其定义为性幻想和性欲的持续性或反复性低下或缺乏，并进一步包括对性交活动的不充分感，例如早泻。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍是单纯型恐怖症(精神，编码300.29，443-9页)，社交恐怖症(精神，编码300.23，450页)，强迫症(精神，编码300.3，456-63页)，或急性应激障碍(精神，编码308.3，471-2页)，参见《精神疾病的诊断及统计学手册》(美国精神病学协会，1992年)。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍进一步涉及疼痛障碍，其可以是心理因素相关的，或是心理因素和普通医学情况相关的，或是普通医学情况相关的(精神，编码307.80，《精神疾病的诊断及统计学手册》(美国精神病学协会，1992年)，499-503页)。
在特定的优选实施方案中，所述的精神障碍包含一种以上的这些障碍的症状。
在下面的附图和实施例中，将对本发明进行详细的阐述，但本发明并不仅仅局限于这些特定实施方案的范围。
附图说明
图1-A：在有或没有10μM的合成的NEP抑制剂磷酸阿米酮的情况下，脊髓膜蛋白浓度对P物质水解(25nM)的影响。各点代表的是在终体积为250μl的Tris/HCl缓冲液中，在30℃经脊髓膜孵育15分钟后，发生水解的3H-P物质的百分数。
图1-B：在有或没有终浓度为10μM的各种肽酶抑制剂(ACE抑制剂卡托普利、CPB和DPPIV抑制剂、GEMSA和DPPIV抑制剂)的情况下，由大鼠的脊髓膜制备物引起的P物质水解(12.5nM)的时间过程。各点代表的是在终体积为250μl的Tris/HCl缓冲液中，在25℃经250μg膜蛋白孵育后，发生水解的3H-P物质的百分数。
图2：在有或没有终浓度为10μM的各种肽酶抑制剂(NEP抑制剂磷酸阿米酮、NEP抑制剂Thiorphan、CPB和DPPIV抑制剂、GEMSA和DPPIV抑制剂、单独SMR1-QHNPR或SMR1-QHNPR与CPB和DPPIV抑制剂组合)的情况下，脊髓切片中的Met-脑啡肽酶(Met-enkephalinase)活性。对照代表在无组织切片时Met-脑啡肽的回收。
图2-A：数值代表在终体积为1ml的KRBG缓冲液中，与1mg新鲜组织切片在25℃孵育20分钟后回收，经RIA分析测定得到的完整的和免疫反应性Met-脑啡肽的浓度(μM)(2次测定的平均值)。
图2-B：数值代表在终体积为1ml的KRBG缓冲液中，与1mg新鲜组织切片在25℃孵育20分钟后回收，经RP-HPLC分析(峰值在保留时间的18.9分钟)测定得到的完整的Met-脑啡肽的量(2次测定的平均值)。
图3-A：在有或没有终浓度为10μM的各种肽酶抑制剂(NEP抑制剂磷酸阿米酮、NEP抑制剂Thiorphan、CPB和DPPIV抑制剂、GEMSA和DPPIV抑制剂、单独SMR1-QHNPR或SMR1-QHNPR与CPB和DPPIV抑制剂组合)的情况下，由大鼠的脊髓切片引起的P物质水解(25nM)。对照代表在无组织切片的情况下3H-P物质的水解。各点代表的是在终体积为1ml的KRBG缓冲液中，在25℃，经1mg新鲜组织切片孵育后，发生水解的3H-P物质的百分数。
图3-B：SMR1 QHNPR对由大鼠的脊髓膜制备物引起的P物质(12.5nM)代谢的浓度依赖性抑制作用。与NEP抑制剂磷酸阿米酮，CPB和DPPIV抑制剂，GEMSA+DPPIV抑制剂的比较。QHNPR肽单独所产生的抑制活性或QHNPR肽与CPB和DPPIV抑制剂组合所产生的抑制活性的比较。各点代表的是在终体积为250μl的Tris/HCl缓冲液中，在25℃经250μg膜蛋白孵育10分钟后，完整的3H-P物质的回收百分数(2次测定的平均值)。
图4：行为绝望测验中的测验和重复测验阶段的静止不动时间的图形表述。
实施例
实施例1：离体测定肽与NEP相互作用所产生的功能结果
在Met-脑啡肽和P物质的细胞外水平，用大鼠的神经组织的膜制备物和新鲜切片分析SMR1-五肽对外源性NEP敏感性肽的保护作用结果。
1.材料与方法
1.1.动物和组织制备物
使用性成熟的雄性Wistar大鼠(Iffa Credo)(7-9周龄)。直到实验日之前，这些大鼠被置于稳定的环境温度(24℃)和光照周期(8h开/20h关)的条件下，并可随意获得食物和水。实验当日，将实验动物以戊巴比妥(Sanofi，45mg/kg体重，腹腔注射)或氯胺酮(Imalgene 500，Rhone Merieux，150mg/kg体重，腹腔注射)麻醉，或选择二氧化碳窒息，然后以心脏穿刺处死
·新鲜组织切片
取出脏器，在冰上切开，去除神经纤维和脂肪组织，然后以冷的含有氧化葡萄糖和碳酸氢钠Krebs Ringer(KRBG)溶液洗涤，该溶液的组分如下：120mM NaCl，5mM KCl，1.2mM KH2PO4，27.5mMNaHCO3，2.6mM CaCl2，0.67mM MgSO4，5.9mM glucose。组织切片可用手术刀手工制备(厚度1-2mm)，或用″Tissue Chopper″制备(厚度1mm)。将切片分散至反应试管中，并用冰冷的氧化KRBG连续洗涤3次。然后将其作为酶的来源，置于添加了10μM Bestatin(膜氨基肽酶APN的抑制剂，Roche)的KRBG缓冲液中，在4℃、95％O2-5％CO2环境中保存，直至使用前。
·膜制备物
将切开并经过冰冷的KRBG洗涤的器官置于10倍体积(体积/重量)的50mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.2)中，用Teflon玻璃匀浆器在4℃进行匀浆(3X5秒)。以1000Xg，4℃第一次离心5分钟，以去除沉淀中的组织碎片和细胞核。将上清液以100,000Xg，5℃进行第二次离心，以便将膜成分浓缩于沉淀中，沉淀以冷的Tris/HCl缓冲液漂洗3次，而后用Kontes匀浆器重悬于新鲜的缓冲液中，分装并保存于-80℃至少3个月，作为酶的来源备用。
1.2蛋白测定
使用Bio-Rad DC蛋白分析(Bio-Rad)来测定组织和膜蛋白浓度。如同Lowry分析，Bio-Rad试剂盒也基于样品的蛋白成分与碱性酒石酸铜溶液和Folin试剂间发生的反应。在加入试剂后15分钟至2小时之间于750nm处读取吸光度。以稀释至蛋白浓度为0.2至1.44mg/ml的标准BSA(牛血清白蛋白)溶液来得到标准曲线。
1.3.测定NEP的酶活性
1.3.1.NEP来源-底物和抑制剂
为进行NEP肽酶活性分析实验，首先建立一个离体模型，其使用的是神经组织的膜和新鲜组织切片制备物的孵育产物，即大鼠脊髓的背区，已知其适合用于分析NEP肽酶的活性。使用参与疼痛反应信号途径的两个底物，即神经肽Met-脑啡肽和P物质，来测定NEP敏感性肽的代谢率。我们使用天然的Met-脑啡肽(Peninsula，10μM)和氚标记的P物质：[(3，43H)Pro2-Sar9-Met(O2)11]-P物质，其具有的特定的放射性为40Ci/mmol(NEN，12.5-25nM)。
我们的目的是测定这些底物的NEP特异性内切蛋白酶解(endoproteolysis)。为此，在每次检测中，均要在有或没有特异性的合成的NEP抑制剂的情况下(10μM磷酸阿米酮，Roche和/或1-10μM Thiorphan，Sigma)分析底物的水解情况，同时，在所有的检测中均存在APN的抑制剂，即Bestatin(10μM)。此外，为研究SMR1-QHNPR的功能作用，上述反应是在SMR1-肽单独存在或SMR1-肽与膜肽酶的抑制剂(即羧肽酶B抑制剂(GEMSA，10μM，Sigma)和二肽肽酶IV抑制剂(DPPIV抑制剂，10μM，Roche)，所述的抑制剂可通过裂解QHNPR肽的C-端而使之失活)组合存在的情况下进行的。
1.3.2.酶活性分析
·新鲜的组织切片
首先，在有或没有NEP抑制剂的情况下，将新鲜组织的切片置于含有10μM bestatin的KRBG介质中，在25℃、30℃或37℃的恒温搅拌水浴箱中，在95％O2-5％CO2的环境下，进行预孵育。预孵育15分钟后，将原有的介质更换为只含有底物或含有底物和NEP抑制剂或SMR1-QHNPR的新鲜的介质，在与预孵育相同的条件下进行孵育。孵育5-30分钟后，将介质转移至含有盐酸的冰冷的试管中，盐酸的终浓度为0.1N。将样品置于-30℃，直至对其完整底物及其代谢成分进行测定。
孵育的温度和时间以及底物和组织酶的浓度可根据结果进行限定，这样使得NEP的水解活性可在初始速率的条件下进行测定。
·膜制备物
在有或没有NEP抑制剂的情况下，将膜制备物置于含有10μMbestatin的50mM Tris/HCl(pH7.2)中，在25℃、30℃或37℃的恒温搅拌水浴箱中进行预孵育。预孵育10分钟后，只加入底物或加入底物和NEP抑制剂或SMR1-QHNPR，在与预孵育相同的条件下进行孵育。孵育结束后，将反应体系冷却至4℃以终止反应，并加入盐酸使盐酸的终浓度为0.3N。将样品置于-30℃，直至对其完整底物及其代谢成分进行测定。
孵育的温度和时间以及底物和膜酶的浓度可根据结果进行限定，这样使得NEP的水解活性可在初始速率的条件下进行测定。
1.3.3.底物及其代谢物的检测
对完整的底物及其代谢物进行分离、测定和定量采用了不同的技术(这取决于底物是否为放射性标记的)：前两种基于选择性分离反应产物的反向层析(C-18 Sep-Pak柱体和RP-HPLC)，第三种基于特异性测定底物的放射免疫分析(RIA)。
·The C-18 Sep-Pak柱体
使用C-18 Sep-Pak柱体(Waters)对放射性标记的肽的水解情况进行分析：其根据各种化合物的极性的不同来分离化合物。肽的代谢物与完整的肽底物相比，其疏水特征降低甚至消失，因此该固相提取方法可将底物自其代谢物中分离出来。
分两个步骤洗脱放射性标记的P物质的3H-代谢物，第一步骤使用H2O-0.1％TFA，第二步骤使用20％甲醇-0.1％TFA，而完整的3H-P物质通过第三步骤使用70-100％的甲醇-0.1％TFA进行洗脱。通过液态闪烁光谱法(liquid scintillation spectrometry)来测定洗脱下来并被分离的化合物的放射性。
·RP-HPLC(反向高效液相层析法)
HPLC具有很高的分辨率，可对浓度最低为1 to 10μM的非放射性肽进行分离，并可结合分光光度仪分析对其进行检测。C-18RP-HPLC与C-18 Sep-Pak cartridge基于同样的原理。用层析分析来研究Met-脑啡肽的水解，使用的是填充了5μm直径的珠的C-18LUNA分析柱(150×4.6mm内径，AIT)。
RP-HPLC采用的是一步30分钟的线性梯度，其范围从H2O-0.1％TFA到100％乙腈-0.1％TFA，流速在1ml/min，以使得两种Met-脑啡肽代谢物与完整的底物得到分离。通过在254nm连续监测柱体流出物的UV吸光度对上述分离物进行鉴定并测定其相对量(峰的高度)。
·RIA分析(放射免疫分析)
RIA为精确的分析方法，可对化合物进行定量分析，所述的化合物的浓度在1到100nM之间或更低。在此使用了竞争性RIA系统：结合于抗体的放射性抗原的量的下降方式与标准溶液或样品中含有的抗原的量呈反比。通过免疫沉淀将游离的放射性抗原自放射性抗原-抗体复合物中分离出去。
通过对最初的Met-脑啡肽底物消失情况的定量分析来监测脑啡肽NEP的活性。第一抗体是针对Met-脑啡肽的C-端的兔抗体(其与代谢物或其他肽的交叉反应性是1％)(Goros等，J.Neurochem.(1978)，31；29-39.大鼠脑内的甲硫氨酸和亮氨酸脑啡肽的放射性免疫分析以及与放射性受体分析估计的内啡肽的比较)。第二抗体是针对兔免疫球蛋白的马抗体。放射性抗原是碘化的Met-脑啡肽(125I-Met-Enk脑啡肽)，估计其特定的放射性为3000Ci/mmol。
简要地，Met-脑啡肽的RIA分析在100mM Tns/HCl(pH8.6，含0.1％BSA和0.1％Triton X 100)中进行。将标准(1-100nM)或样品(100μl)，稀释的抗Met-脑啡肽抗体(100μl，1/2000)和125I-Met-Enk(10000cpm，100μl)在4℃孵育过夜。在存在聚乙二醇6000(6％)的情况下，用第二抗兔免疫球蛋白进行免疫沉淀以将结合成分和游离成分分开。经过离心，用gamma分光计对沉淀中结合的放射性进行定量分析。
2.结果
为详细说明SMR1-QHNPR对NEP酶活性的抑制作用，有必要先建立一个实验方案，以便能够在初始速率测量的条件下进行P物质或Met-脑啡肽的水解。
2.1.寻找NEP内肽酶活性的初始速率测量的实验条件
2.1.1.天然Met-脑啡肽的水解
在第一系列的实验中，将脊髓组织的切片和膜制备物分别置于终体积为1ml的KRBG中(在30℃)和终体积为0.25ml的Tris/HCI(50mM，pH7.2)中(在37℃)进行孵育。
·RP-HPLC分析
经校准，RP-HPLC层析系统提示标准Met-脑啡肽在保留时间18.8分钟时洗脱出来。对于样品，在存在NEP特异性抑制剂时，其峰的高度显著地升高：该峰代表了完整的Met-脑啡肽底物，其保留时间为18.8±0.2分钟。相反，保留时间为5.8±0.2分钟和12.8±0.1分钟的两个峰分别代表代谢物Tyr-Gly-Gly和Phe-Met，其在无NEP抑制剂的情况下出现。该结果说明脊髓组织的酶已经在肽的Gly-Phe肽键处将底物裂解，这代表了脑啡肽酶的活性。
在膜制备物以及新鲜的组织切片水平，外源性Met-脑啡肽的高度NEP特异性的水解出现于37℃孵育后10分钟：脊髓脑啡肽酶活性导致Met-脑啡肽峰的消失，而当存在10μM磷酸阿米酮或1μMThiorphan时，情况相反(80-90％被抑制)。此外，在上述情况下，这两种特异性NEP抑制剂在37℃孵育10到30分钟期间均可将脑啡肽酶的活性几乎完全抑制。
由于在37℃孵育10分钟即可明确达到最大的水解，因此在随后的实验中孵育温度随之降低到30℃，继而25℃。这对于在30℃孵育的新鲜组织切片是有效的，Met-脑啡肽水解的程度随时间(0-30分钟)而升高。对于在30℃孵育的膜制备物结果相同，还可以注意到，随着酶浓度的增加(自0到2mg/ml)，水解的程度也随之增高。但是没有明确的线性关系。
实际上，HPLC层析结合分光光度计分析是一种半定量技术，单纯测定峰的高度或面积不足以精确到计算定量的比例关系。因此，接下来使用了特异性定量RIA测定方法来对Met-脑啡肽进行精确定量分析。
2.1.2.修饰的氚标记的P物质的水解
建立了用于在初始速率测量条件下研究由含有NEP的神经组织引起的底物(即Met-脑啡肽和P物质)的水解的实验参数。
就此，首先测定的是，在30℃孵育15分钟后，大鼠脊髓的膜蛋白浓度(终浓度自0.03到1mg/ml)对P物质(25nM)水解的影响。如图1-A所示，3H-P物质降解的程度(以初始底物浓度的百分数表示)以与膜蛋白浓度呈线性函数关系的方式成比例地自2升高到25％。在有或没有10μM磷酸阿米酮的情况下均存在密切的相关性(分别为r＝0.99，n＝7和r＝0.98，n＝7)。此外，在相同的实验条件下，加入磷酸阿米酮可使P物质的降解明显减少(对外源性肽产生50-65％的保护作用)。
相似地，在25℃时，P物质水解的程度(12.5nM)作为孵育时间(5-20分钟)的函数也得到了研究。膜蛋白的浓度选择为1mg/ml。脊髓膜引起的P物质的代谢随孵育时间的延长呈线性增加，其相关性为r＝0.97，n＝18(图1-B)。卡托普利(10μM)为一种有效的血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，其也能够裂解P物质，卡托普利对膜制备物的酶的活性没有影响，对于CPB和DPPIV酶的有效抑制剂(C-端SMR1-QHNPR代谢的保护性化合物)也是一样。
如此看来，含有NEP的脊髓组织引起P物质水解的初始速率测定的条件已经建立了。然而，两种NEP抑制剂(磷酸阿米酮和Thiorphan)的活性作为孵育时间的函数似乎并不成比例地稳定。因此，将针对与孵育时间的相关性，就SMR1-QHNPR肽对NEP活性的影响进行系统的研究。
2.1.3.记录
下表给出的实验条件可用于研究在初始速率测定条件下，离体的脊髓组织所引起的Met-脑啡肽和P物质的代谢。
| 预孵育时间 | 10分钟(膜制备物)；15分钟(新鲜组织切片) |
| 孵育时间 | 5-30分钟 |
| 温度 | 25℃ |
| 膜或组织蛋白(脊髓)的终浓度 | 1mg/ml |
| 底物浓度 | P物质：12.5nM；Met-脑啡肽：10μM(HPLC)，20nM(RIA) |
| 反应体积 | 1ml(新鲜组织切片)；250μl(膜制备物) |
| 分离代谢物的技术 | Sep-Pak+液体闪烁计(3H-P物质)；RP-HPLC和RIA(Met-脑啡肽) |
| 缓冲液 | Trls-HCI 50mM，pH7.2+BSA 0.1％+Bestatln10μM(膜制备物)；KRBG+BSA 0.1％+Bestatin 10μM(氧化的，环境为95％02-5％CO2)(新鲜组织切片) |
2.2研究SMR1-QHNPR肽与NEP相互作用引起的功能结果
2.2.1 NEP脊髓引起的Met-脑啡肽的降解
首先测定的是，在如2.1.3中多记载的实验条件下，固定浓度的SMRI-QHNPR(10μM)对脊髓切片的Met-脑啡肽酶活性的影响。
·RP-HPLC分析
如图2-B所示，HPLC分析显示在25℃孵育20分钟内，脊髓切片引起的Met-脑啡肽底物的高度NEP特异性水解。磷酸阿米酮在浓度为10μM时可使Met-脑啡肽酶的活性得到完全的抑制，而加入Thiorphan(10μM)可减少Met-脑啡肽的降解达80％。
在同一个实验中，QHNPR肽在10μM的浓度下，其单独或与CPB和DPPIV蛋白酶的抑制剂组合应用，显示出70或80％的抑制活性；因此，当两者的浓度相同时，SMR1-五肽能够与脑啡肽-五肽竞争NEP结合位点。对于脊髓膜制备物引起的P物质降解，单独应用CPB和DDPIV的抑制剂对新鲜的脊髓切片引起的Met-脑啡肽的降解没有任何内在抑制活性。此外，它们显然不需要自新鲜脊髓组织切片中可能存在的肽酶活性中保护SMR1-QHNPR其自身，特别是在其C-端。
为精确地定量分析NEP活性以及抑制，对同一个实验借助于特异性Met-脑啡肽RIA进行分析。
·RIA分析
总体上，通过反向HPLC技术所得到的粗略结果得到了RIA分析的支持(图2-A)。在25℃孵育20分钟期间，磷酸阿米酮，Thiorphan，以及SMR1-QHNPR似乎可很有效地保护Met-脑啡肽免于被NEP降解活性所降解。因此，在10μM的浓度下，它们近乎完全地阻断了新鲜的脊髓组织引起的10μM Met-脑啡肽的降解：保护作用分别为96％，100％和96％。
总之，所有这些结果均显示，在离体情况下，SMRI-QHNPR肽对大鼠神经组织的Met-脑啡肽酶活性具有负调节作用。
2.2.2 NEP脊髓引起P物质降解
·SMR1-QHNPR，抑制NEP对P物质的代谢活性
如同在针对Met-脑啡肽的实验中所述，首先研究QHNPR肽对P物质水解的影响。为此，使用了脊髓切片，并在如2.1.3.中所述的初始速率测定的条件下，进行30分钟的孵育动力学测定。
如图3-A所示，P物质水解反应在初始速率测定条件下可有效进行：发现在物质水解25℃的孵育时间之间存在密切的相关性，r＝0.99。10μM磷酸阿米酮或10μM Thiorphan显示出了相对而言相同的抑制活性(抑制程度60-65％)。发现QHNPR肽(10μM)是抑制有效的抑制剂：其单独使用可抑制75％的P物质的降解，当其与GEMBA(10μM)和DPPIV抑制剂(10μM)组合应用时，抑制达90％以上。但后者显示出对新鲜的脊髓组织引起的P物质的降解具有内在的抑制活性。
另外，在该实验中，抑制剂的效果作为孵育时间的函数在30分钟的孵育期间具有稳定的比例(r＝0.99)。
·测定IC50
如图3-B右栏所示，SMR1-QHNPR对脊髓膜制备物引起的3H-P物质降解的抑制效应的反应曲线，可以对大约1.10M的IC50值进行计算(3H-P物质降解减少一半时的抑制剂浓度)。在同一个实验中，与磷酸阿米酮的比较显示出SMR1-QHNPR对外源性P物质的保护仍与磷酸阿米酮相当(图3-B左栏)。此外，QHNPR肽与CPB和DPPIV的抑制剂组合使用显示出极高的NEP抑制活性，较磷酸阿米酮更显著(图3-B，左栏)。
2.2.3.记录
通过氚标记的底物结合层析分析(P物质)或通过天然底物结合特异性RIA定量分析(Met-脑啡肽)来测定NEP-敏感性肽的代谢率。在NEP酶活性的初始速率测定条件下，加入SMR1-五肽可引起外源性Met-脑啡肽或P物质的代谢几乎被完全抑制：经计算，使得由脊髓组织引起的P物质降解减少一半的SMR1-QHNPR的浓度为1.10M，其抑制效力等同于两个已知的NEP-特异性抑制剂，即Thiorphan和磷酸阿米酮。从这些结果似乎发现，在离体情况下，SMR1-五肽可有效地阻断脊髓NEP诱导的两个参与调控脊髓疼痛感觉的神经肽，即P物质和Met-脑啡肽的降解。
实施例2：SMR1-QHNPR肽在行为绝望测验(behavioral despairtest)中的抗抑郁效应
使用了40只雄性Wistar/AF EOPS大鼠(Iffa Credo BreedingCenter，69-St-Germain sur 1’Arbresle，France)，体重为300-320g。到达后，对这些大鼠进行标记并将其成对地随机分配至F型聚碳酸酯笼中(48×27×20cm，U.A.R.，91-Epinay-Sur-Orge，France)。这些大鼠被安置在有空调的动物房中，温度为22-24℃，可随意获得食物(M25croquettes，Ets Piétrement，77-Provins，France)和水，光照和黑暗每12小时交替。
一周的环境适应期后，称量大鼠的体重并随机分成3个实验组(n＝12)，各组的处理方式和条件均相同。
行为绝望测验分两个阶段进行：
15分钟的测验阶段；
24小时后进行的5分钟的重复测验阶段。
在测验阶段，大鼠要被迫在树脂玻璃圆筒(直径20cm，高50cm，加水至25cm，水温25℃)中游泳，记录其在15分钟内的行为。测验结束后，将大鼠自水中取出，轻轻擦干，然后将其放回笼中。
24小时后进行重复测验，将该大鼠再次置于水中，记录其在5分钟内的行为。
所记录的变量为测验和重复测验过程中的前5分钟内静止不动的时间。
将肽FG-005(SMR1-QHNPR)按照500μg/5ml 0.01N醋酸的比例配制，然后以PBS稀释，在测验结束后即刻以及在次日的重复测验前300分钟和前5分钟时通过大鼠背侧近尾部的静脉进行施用，施用的剂量为50μg和100μg/kg。
| 组 | 大鼠/组 | 处理 | 剂量(μg/kg) | 体积(ml/kg) | 重复测验前施用时间(分钟) |
| 载体 | 10 | 醋酸+PBS | - | 0.7 | 1440，300，5 |
| FG50 | 10 | FG-005 | 50 | 0.7 | 1440，300，5 |
| FG100 | 10 | FG-005 | 100 | 0.7 | 1440，300，5 |
| 8-OH-DPAT | 10 | 8-OH-DPAT | 500 | 1 | 1440，300，30 |
使用阶乘测定中的方差分析(ANOVA in factorial measurements)来证实各组间存在的差异(heterogeneity)。进行双侧概率(bilateralprobability)配对t检验以比较各组中测验与重复测验中的静止不动的时间。结果以平均值±标准误(SEM)表示(图4)。使用Statview5和DeltaGraphPro3.5软件进行统计和图形处理。
方差分析[F(3.36)＝1.57；N.S.]显示，在未经任何处理前，各组的测验1的静止不动时间无差异，而在处理后各组的静止不动时间存在差异[F(3.36)＝13.12；p＜0.001]。
双侧概率配对t检验显示，对照组大鼠在重复测验中的静止不动时间较测验中显著增加。相反，经8-OH-DPAT处理的大鼠在重复测验中的静止不动时间较测验中显著减少。
经剂量为50μg/kg的FG-005处理的大鼠在重复测验中的静止不动时间增加，而经剂量为100μg/kg的FG-005处理的大鼠在重复测验中的静止不动时间减少。但两者均无统计学意义(NS)。
表：测验阶段和重复测验阶段的静止不动时间(平均值±SD)
| 载体 | FG-50 | FG-100 | 8-OH-DPAT | |
| i.v.(n＝10) | 50μg/kg，i.v.(n＝10) | 100μg/kg，i.v.(n＝10) | 0.5mg/kg，i.p.(n＝10) | |
| 测验 | 104.80±11.08 | 119.00±13.79 | 138.30±11.03 | 109.20±11.43 |
| 重复测验 | 187.80±20.41 | 141.20±21.28 | 121.50±17.47 | 31.60±11.51 |
| 配对t检验(双侧概率)(测验vs.重复测验) | t＝4.14；p＜0.005 | t＝1.50；NS | t＝1.20；NS | t＝10.91；p＜0.001 |
在我们的实验条件下，对照组大鼠在重复测验中的静止不动时间较测验中显著延长，这清楚地表明这些大鼠的屈从性，它们不再寻求逃脱这种阴雨潮湿的环境。
在抑郁测验结束后即刻以及在次日的重复测验前300分钟和前5分钟时用剂量为50μg和100μg/kg的肽FG-005处理的大鼠在重复测验中的静止不动时间没有增加。这两组的大鼠在两个阶段显示出相当的游泳活动。由于这些大鼠未表现出行为的屈从性，因此认为肽FG-005在大鼠具有抗抑郁的效应。用作参考物质的8-OH-DPAT，显示出明显的抗屈从效应。
Claims (3)
1.筛选对QHNPR五肽的NEP结合位点具有激动剂生物活性的配体分子的方法，其包含下列步骤：
a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或器官标本或组织样品；
b)在存在候选分子、半饱和浓度的QHNPR和NEP底物的情况下，孵育步骤a)的所述细胞培养物或器官标本或组织样品，所述细胞培养物或器官标本或组织样品的浓度可满足在初始速率条件下对NEP的酶活性进行测定，孵育的时间足以使得NEP底物在初始速率条件下发生水解；
c)分别在有或没有所述的候选配体分子以及有或没有QHNPR的情况下，通过测定NEP底物水解的程度对步骤a)的生物物质中的NEP的活性进行定量分析。
2.筛选对QHNPR五肽的NEP结合位点具有拮抗剂生物活性的配体分子的方法，其包含下列步骤：
a)制备含有QHNPR五肽的NEP结合位点的细胞培养物或器官标本或组织样品；
b)在存在次最大浓度的XQHNPR肽以及NEP底物的情况下，在存在候选分子的情况下，孵育其浓度可满足在初始速率条件下对NEP的酶活性进行测定的步骤a)的所述细胞培养物或器官标本或组织样品，孵育的时间足以使得NEP底物在初始速率条件下发生水解；
c)分别在有或没有所述的候选配体分子以及有或没有QHNPR的情况下，通过测定NEP底物水解的程度对步骤a)的生物物质中的NEP的水解活性进行定量分析。
3.权利要求2的方法，其中所述XQHNPR肽是QHNPR肽。
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| EP1747212A4 (en) * | 2004-05-11 | 2009-03-25 | Merck & Co Inc | PROCESS FOR PRODUCING N-SULFINATED AMINO ACID DERIVATIVES |
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| US8969514B2 (en) | 2007-06-04 | 2015-03-03 | Synergy Pharmaceuticals, Inc. | Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of hypercholesterolemia, atherosclerosis, coronary heart disease, gallstone, obesity and other cardiovascular diseases |
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| WO2010065751A2 (en) | 2008-12-03 | 2010-06-10 | Synergy Pharmaceuticals, Inc. | Formulations of guanylate cyclase c agonists and methods of use |
| US8506544B2 (en) | 2010-06-21 | 2013-08-13 | The Procter & Gamble Company | Disposable absorbent pant with efficient design and convenient single-section side stretch panels |
| US9616097B2 (en) | 2010-09-15 | 2017-04-11 | Synergy Pharmaceuticals, Inc. | Formulations of guanylate cyclase C agonists and methods of use |
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| US9486494B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-08 | Synergy Pharmaceuticals, Inc. | Compositions useful for the treatment of gastrointestinal disorders |
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| EA201592263A1 (ru) | 2013-06-05 | 2016-05-31 | Синерджи Фармасьютикалз, Инк. | Ультрачистые агонисты гуанилатциклазы c, способ их получения и использования |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US738778A (en) * | 1903-05-22 | 1903-09-15 | Cottrell C B & Sons Co | Sheet-delivery apparatus for printing and folding machinery. |
| FI881869A (fi) * | 1987-04-25 | 1988-10-26 | Hoechst Ag | Enkastiner: nya glykopeptider med enkefalinashindrande verkan, foerfaranden foer deras framstaellning och deras anvaendning saosom farmaceutiska produkter. |
| FR2637600B1 (fr) | 1988-10-11 | 1992-03-06 | Pasteur Institut | Peptides et polypeptides provenant de la glande sous maxillaire du rat, anticorps monoclonaux et polyclonaux correspondants, hybridomes correspondants et applications de ces produits au diagnostic, a la detection ou a des fins therapeutiques |
| US5550119A (en) * | 1995-03-02 | 1996-08-27 | Ciba-Geigy Corporation | Phosphono substituted tetrazole derivatives as ECE inhibitors |
| US6589750B2 (en) | 1997-02-20 | 2003-07-08 | Institut Pasteur | Therapeutic use of the SMR1 protein, the SMR1 maturation products, specifically the QHNPR pentapeptide as well as its biologically active derivatives |
| ES2315753T3 (es) | 1999-06-23 | 2009-04-01 | Institut Pasteur | Composiciones para el tratamiento de problemas de relaciones interpersonales y trastornos del comportamiento. |
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