CN121320249A - 一种γδT细胞高效扩增方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种γδT细胞高效扩增方法及应用，属于细胞生物学技术领域。扩增方法包括：采用密度梯度离心法分离PBMC，经多聚赖氨酸包被容器初始培养后，通过三段式动态刺激，结合5‑8%自体血清的X‑VIVO 15培养基，最终经抗γδTCR磁珠分选获得高纯度细胞。本发明通过阶梯式因子组合、阶段性容器包被及低血清体系的协同优化，使γδT细胞扩增倍数达150‑180倍，纯化后纯度≥90%，细胞毒性及存活能力显著提升，可高效应用于肿瘤及感染性疾病的免疫治疗，为γδT细胞的临床转化提供稳定技术支持。

Description

一种γδT细胞高效扩增方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其是涉及一种γδT细胞高效扩增方法及应用。

背景技术

γδT细胞是一种特殊的T淋巴细胞亚群，其T细胞受体（TCR）由γ链和δ链组成，与传统的αβT细胞不同，γδT细胞不需要抗原提呈细胞的处理和主要组织相容性复合体（MHC）的限制，可直接识别并杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞等异常细胞，在机体免疫监视和免疫防御中发挥着重要作用。

γδT细胞在外周血中含量较低，仅占T细胞总数的1-5%，难以满足临床治疗的需求，因此需要进行体外扩增。目前，常用的γδT细胞扩增方法主要以唑来膦酸联合IL-2刺激为主，但存在扩增倍数低、纯度不高、细胞活性和细胞毒性不足等问题，限制了其临床应用。

因此，开发一种能够高效扩增γδT细胞，且保证其高纯度、高活性和强细胞毒性的方法，具有重要的临床意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种γδT细胞高效扩增方法及应用，以克服现有技术中γδT细胞扩增效率低、纯度不高、活性和细胞毒性不足等缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种γδT细胞高效扩增方法，包括如下步骤：

S1、外周血单个核细胞PBMC的分离：采集外周血，采用密度梯度离心法分离得到PBMC；

S2、初始培养：将S1得到的PBMC接种于经多聚赖氨酸包被的培养瓶中，加入含5-8%自体血清的X-VIVO 15培养基，调整细胞密度为1-2×10⁶个/mL，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24-48h；

S3、分步刺激培养：

S31、首次刺激：培养至24-48h后，向培养体系中加入唑来膦酸至终浓度5-10μM、IL-2至终浓度500-800IU/mL，继续培养3-4天；

S32、二次刺激：首次刺激结束后，离心收集细胞，用含5-8%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为0.5-1×10⁶个/mL，加入IL-15至终浓度10-20ng/mL、IL-21至终浓度5-10ng/mL，转移至经抗CD3单克隆抗体包被的培养瓶中，继续培养4-5天；

S33、三次刺激：二次刺激结束后，离心收集细胞，用含5-8%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为0.3-0.5×10⁶个/mL，加入IL-2至终浓度300-500IU/mL、IL-15至终浓度5-10ng/mL，继续培养3-4天；

S4、纯化：S3培养结束后，采用抗γδTCR单克隆抗体磁珠分选，得到高纯度γδT细胞。

优选的，S1中，密度梯度离心法采用的离心液为Ficoll-Hypaque，离心条件为2000rpm、20min。

优选的，S2中，多聚赖氨酸包被的具体操作为：将0.01%多聚赖氨酸溶液加入培养瓶，使其铺满瓶底，室温放置30min后，弃去溶液，无菌PBS洗涤2-3次，晾干备用。

优选的，S32中，抗CD3单克隆抗体包被的具体操作是：将抗CD3单克隆抗体用PBS稀释至5-10μg/mL，加入培养瓶，使其铺满瓶底，4℃放置过夜，弃去溶液，无菌PBS洗涤2-3次，晾干备用。

优选的，S3中，每次刺激培养过程中，当培养基颜色变黄或细胞密度超过2×10⁶个/mL时，补充新鲜培养基，维持细胞密度在0.3-2×10⁶个/mL。

优选的，S4中，抗γδTCR单克隆抗体磁珠分选后γδT细胞的纯度≥90%。

另一方面，本发明还提供了一种由上述方法扩增得到的γδT细胞。

另一方面，本发明还提供了一种上述的γδT细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种上述的γδT细胞在制备感染性疾病治疗药物中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种肿瘤治疗药物，包含上述的γδT细胞以及药学上可接受的载体。

因此，本发明一种γδT细胞高效扩增方法及应用，具有以下有益效果：

（1）扩增效率显著提高：采用三段式动态刺激策略，结合阶梯式细胞因子组合，使γδT细胞扩增倍数达100-200倍，较传统单一因子刺激方法（30-50倍）提升3-4倍，且对数生长期延长至8-9天，解决了现有技术中细胞增殖后期易进入平台期的问题。

（2）细胞纯度大幅提升：通过多聚赖氨酸初始包被与抗CD3单克隆抗体阶段性交联的协同作用，配合抗γδTCR磁珠分选，使纯化后细胞纯度≥90%，显著高于传统方法（70-80%），且避免了异种血清导致的杂质细胞污染。

（3）细胞功能与存活能力增强：低血清（5-8%自体血清）培养体系减少了抑制性成分，结合精准的细胞因子时序调控，使扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤率达75%-82%（传统方法约50%），IFN-γ分泌量提升2.5倍；同时细胞体外存活时间延长至14天以上，凋亡率降低至10%-12%，解决了现有技术中细胞活性随培养时间下降的缺陷。

（4）操作稳定性与临床适用性优异：方法全程采用标准化操作，供体间差异系数≤15%，且避免使用异种血清，降低了免疫排斥风险，易于规模化生产，为γδT细胞在肿瘤免疫治疗及感染性疾病治疗中的临床应用提供了高效、稳定的技术支持。

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。

实施例中所用的仪器设备、试剂材料均通过商业途径获得。

实施例1

一种γδT细胞高效扩增方法，包括如下步骤：

S1、PBMC的分离：取外周血50mL，加入等量无菌PBS稀释，缓慢叠加于20mL Ficoll-Hypaque离心液上层，2000rpm离心20min。离心后，吸取中间白膜层，用无菌PBS洗涤2次（1500rpm，10min），得到PBMC。

S2、初始培养：将PBMC用含5%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁶个/mL，接种于经多聚赖氨酸包被的T25培养瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养48h。

多聚赖氨酸包被操作：将0.01%多聚赖氨酸溶液加入T25培养瓶，使其铺满瓶底，室温放置30min后，弃去溶液，无菌PBS洗涤3次，晾干备用。

S3、分步刺激培养：

S31、首次刺激：培养48h后，向培养瓶中加入唑来膦酸至终浓度5μM、IL-2至终浓度500IU/mL，继续培养3天。

S32、二次刺激：首次刺激结束后，1500rpm离心10min收集细胞，用含5%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为0.5×10⁶个/mL，加入IL-15至终浓度10ng/mL、IL-21至终浓度5ng/mL，转移至经抗CD3单克隆抗体包被的T75培养瓶中，继续培养4天。

抗CD3单克隆抗体包被操作：将抗CD3单克隆抗体用PBS稀释至5μg/mL，加入T75培养瓶，使其铺满瓶底，4℃放置过夜，弃去溶液，无菌PBS洗涤3次，晾干备用。

S33、三次刺激：二次刺激结束后，1500rpm离心10min收集细胞，用含5%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为0.3×10⁶个/mL，加入IL-2至终浓度300IU/mL、IL-15至终浓度5ng/mL，继续培养3天。

培养过程中，每天观察细胞状态，当培养基颜色变黄或细胞密度超过2×10⁶个/mL时，补充新鲜培养基。

S4、纯化：培养结束后，收集细胞，采用抗γδTCR单克隆抗体磁珠进行分选，具体操作按照说明书进行，得到γδT细胞。

实施例2

一种γδT细胞高效扩增方法，包括如下步骤：

S1、PBMC的分离，具体方法与实施例1相同，得到PBMC。

S2、初始培养：将PBMC用含5%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁶个/mL，接种于经多聚赖氨酸包被的T25培养瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养48h。

多聚赖氨酸包被操作：将0.01%多聚赖氨酸溶液加入T25培养瓶，使其铺满瓶底，室温放置30min后，弃去溶液，无菌PBS洗涤3次，晾干备用。

S3、分步刺激培养：

S31、首次刺激：培养48h后，向培养瓶中加入唑来膦酸至终浓度5μM、IL-2至终浓度800IU/mL，继续培养3天。

S32、二次刺激：首次刺激结束后，1500rpm离心10min收集细胞，用含5%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为0.5×10⁶个/mL，加入IL-15至终浓度20ng/mL、IL-21至终浓度10ng/mL，转移至经抗CD3单克隆抗体包被的T75培养瓶中，继续培养4天。

抗CD3单克隆抗体包被操作：将抗CD3单克隆抗体用PBS稀释至5μg/mL，加入T75培养瓶，使其铺满瓶底，4℃放置过夜，弃去溶液，无菌PBS洗涤3次，晾干备用。

S33、三次刺激：二次刺激结束后，1500rpm离心10min收集细胞，用含5%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为0.3×10⁶个/mL，加入IL-2至终浓度500IU/mL、IL-15至终浓度10ng/mL，继续培养3天。

培养过程中，每天观察细胞状态，当培养基颜色变黄或细胞密度超过2×10⁶个/mL时，补充新鲜培养基。

S4、纯化：培养结束后，收集细胞，采用抗γδTCR单克隆抗体磁珠进行分选，具体操作按照说明书进行，得到γδT细胞。

对比例1

一种γδT细胞扩增方法，包括如下步骤：

S1、PBMC的分离：同实施例1的密度梯度离心操作，获得PBMC后用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基重悬。

S2、培养体系：使用未包被的T25培养瓶，接种密度1×10⁶个/mL，培养基含10%FBS、100U/mL青霉素-链霉素、2mM L-谷氨酰胺，37℃、5%CO₂培养。

S3、刺激方式：培养起始即加入唑来膦酸5μM+IL-2 300IU/mL，全程未更换培养基类型及培养容器，当细胞密度超过2×10⁶个/mL时仅补充等量含相同因子的RPMI-1640培养基，连续培养10天。

S4、纯化步骤：同实施例1的磁珠分选方法，但分选时机为培养第10天。

对比例2

一种γδT细胞扩增方法，包括如下步骤：

S1、PBMC分离与初始培养：同实施例1的步骤。

S2、刺激方式：自培养第1天起持续添加混合因子（唑来膦酸5μM+IL-2 500IU/mL+IL-15 10ng/mL），全程使用同一多聚赖氨酸包被的培养瓶，未进行二次刺激的容器更换及因子组合调整，培养期间按实施例1的密度标准补充新鲜培养基，总培养时长10天。

S3、纯化步骤：同实施例1。

对比例3

一种γδT细胞扩增方法，包括如下步骤：

S1、PBMC分离与初始培养：同实施例1的步骤。

S2、培养容器处理：全程使用0.01%多聚赖氨酸包被的培养瓶（T25换T75时仍采用相同包被方式），未进行抗CD3单克隆抗体包被处理。

S3、刺激方案：严格遵循实施例1的三段式因子添加时序（唑来膦酸5μM+IL-2500IU/mL→IL-15 10ng/mL+IL-21 5ng/mL→IL-2 300IU/mL+IL-15 5ng/mL），细胞密度控制、培养基补充方式均与实施例1一致。

S4、纯化步骤：同实施例1。

测试例1

扩增效率检测：

采用Countstar细胞计数仪每日监测细胞数量，计算扩增倍数，通过每日细胞密度监测确定对数生长期持续时间。结果如下表1所示：

表1 扩增效率

结果显示：本发明实施例的扩增倍数显著高于对比例（p<0.01），其中实施例2因采用更高浓度因子组合，扩增效果最优，说明阶梯式高浓度因子组合能有效延长细胞对数生长期。

测试例2

纯度检测：

流式细胞术检测：以抗γδTCR-PE及抗CD3-FITC抗体标记细胞，流式细胞仪分析γδTCR⁺CD3⁺双阳性细胞占比，计算纯化前后纯度。结果如下表2所示：

表2 纯度检测

结果显示，本发明实施例纯化后纯度均超过90%，显著高于对比例（p<0.01），证明阶段性交联抗体包被能有效富集γδT细胞。

测试例3

细胞毒性检测：

LDH释放法：按20:1效靶比将扩增细胞与HepG2细胞共培养4h，检测上清LDH活性计算杀伤率；ELISA法测定培养上清中IFN-γ分泌量。结果如下表3所示：

表3 细胞毒性检测

结果显示，实施例细胞毒性显著高于对比例（p<0.01），且细胞因子分泌能力更强，表明本发明方法扩增的细胞功能更优异。

测试例4

细胞存活能力检测：

CFSE标记法：细胞经CFSE染色后培养14天，流式细胞术检测活细胞比例（CFSE⁺PI^-）及凋亡率（Annexin V⁺PI⁺）。结果如下表4所示：

表4 细胞存活能力检测

结果显示，本发明实施例的细胞存活时间显著延长，凋亡率降低，证明分步刺激能有效维持细胞存活能力。

因此，本发明一种γδT细胞高效扩增方法及应用，通过阶梯式刺激因子组合、阶段性交联包被、低血清体系优化的协同作用，实现了γδT细胞的高效扩增，其扩增倍数、纯度、细胞毒性及存活能力均显著优于现有技术。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种γδT细胞高效扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、外周血单个核细胞PBMC的分离：采集外周血，采用密度梯度离心法分离得到PBMC；

S2、初始培养：将S1得到的PBMC接种于经多聚赖氨酸包被的培养瓶中，加入含5-8%自体血清的X-VIVO 15培养基，调整细胞密度为1-2×10⁶个/mL，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24-48h；

S3、分步刺激培养：

S31、首次刺激：培养至24-48h后，向培养体系中加入唑来膦酸至终浓度5-10μM、IL-2至终浓度500-800IU/mL，继续培养3-4天；

S32、二次刺激：首次刺激结束后，离心收集细胞，用含5-8%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为0.5-1×10⁶个/mL，加入IL-15至终浓度10-20ng/mL、IL-21至终浓度5-10ng/mL，转移至经抗CD3单克隆抗体包被的培养瓶中，继续培养4-5天；

S33、三次刺激：二次刺激结束后，离心收集细胞，用含5-8%自体血清的X-VIVO 15培养基重悬，调整细胞密度为0.3-0.5×10⁶个/mL，加入IL-2至终浓度300-500IU/mL、IL-15至终浓度5-10ng/mL，继续培养3-4天；

S4、纯化：S3培养结束后，采用抗γδTCR单克隆抗体磁珠分选，得到高纯度γδT细胞。

2.根据权利要求1所述的一种γδT细胞高效扩增方法，其特征在于：S1中，密度梯度离心法采用的离心液为Ficoll-Hypaque，离心条件为2000rpm、20min。

3.根据权利要求1所述的一种γδT细胞高效扩增方法，其特征在于，S2中，多聚赖氨酸包被的具体操作为：将0.01%多聚赖氨酸溶液加入培养瓶，使其铺满瓶底，室温放置30min后，弃去溶液，无菌PBS洗涤2-3次，晾干备用。

4.根据权利要求1所述的一种γδT细胞高效扩增方法，其特征在于，S32中，抗CD3单克隆抗体包被的具体操作是：将抗CD3单克隆抗体用PBS稀释至5-10μg/mL，加入培养瓶，使其铺满瓶底，4℃放置过夜，弃去溶液，无菌PBS洗涤2-3次，晾干备用。

5.根据权利要求1所述的一种γδT细胞高效扩增方法，其特征在于，S3中，每次刺激培养过程中，当培养基颜色变黄或细胞密度超过2×10⁶个/mL时，补充新鲜培养基，维持细胞密度在0.3-2×10⁶个/mL。

6.根据权利要求1所述的一种γδT细胞高效扩增方法，其特征在于，S4中，抗γδTCR单克隆抗体磁珠分选后γδT细胞的纯度≥90%。

7.一种由权利要求1-6任一项所述方法扩增得到的γδT细胞。

8.权利要求7所述的γδT细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。

9.权利要求7所述的γδT细胞在制备感染性疾病治疗药物中的应用。

10.一种肿瘤治疗药物，其特征在于：包含权利要求7所述的γδT细胞以及药学上可接受的载体。