CN1210303C - 人载脂蛋白的多肽及其抗血管增生性疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多肽，尤其是一种人载脂蛋白的多肽及其合成物具有抗血管增生性疾病的功能，血管的异常增生可引发恶性肿瘤。后期糖尿病患者视网膜镜内的血管变化也可引起失明。抗血管内皮细胞增生疗法是医治这些疾病的新途径。载脂蛋白[Apo(a)]是一个巨大的存在于人血液中的糖蛋白。在其庞大的蛋白质分子结构中高含38个饼状结构体。位于最末端，即第38位饼状结构体(AK38)具有抗血管内皮细胞增生功能。根据AK38的氨基酸序列结构，合成并筛选研究了具有抗血管内皮细胞增生活性的多肽体P5及其合成物P51至P57的氨基酸序列及其抗血管增生的作用，易于进行自动化工业生产。

Description

人载脂蛋白的多肽及其抗血管增生性疾病的用途

技术领域

本发明涉及一种多肽，尤其是人的载脂蛋白内含的多肽P5及其合成物具有抗血管增生性疾病的功能。

背景技术

载脂蛋白[Apo(a)]是一个巨大的存在于人血液中的糖蛋白。其生理功能尚未解明(1)。但其DNA和氨基酸序列已被探明(2)。其庞大的蛋白质分子结构中含有38个饼状结构体。这38个饼状结构体成串联形式紧密地结合在一起。

圆饼状结构体是指含有3对内部二硫键形成的具有双环的圆饼形状的构造体。它大约含90个左右的氨基酸，广泛存在于不同的蛋白分子里。该构造最早被发现于凝血素。圆饼状结构体所担当的基本功能为分子与分子之间的相互作用。例如组织型纤溶酶激活剂(TPA)含两个圆饼状结构体。距TPA的C末端最近的一个饼状结构体对血栓具有识别和结合功能，可引导TPA发挥定向特异性溶解血栓效果。

人类载脂蛋白的38个饼状结构体的氨基酸序列及成分有所不同，可分为11个类型。位于饼状结构串联体的最末端，即第38位饼状结构体，并被命名为AK38，具有抗血管内皮细胞生长功能，该结构体在基因库Gene Bank中的登记号为AY039748。

血液循环支撑人体正常细胞的生命存在。血液循环系统由血管构成，最小的血管称为毛细血管，密布全身形成网络，将氧气和营养输送到体内的各个角落。成年人的血管在正常生理条件下相对稳定，不再延伸发展。所以健康人的血液循环网络范围基本上是固定不变的。但是当血液循环网络有不正常加减时，如延伸或短路，都可能引起病症。血管堵塞形成局部断流和短路的病态表现为大脑中风和心肌梗塞等疾病。而血液循环网络的异常延伸可导致肿瘤的恶性发展。

在肿瘤组织内部没有血管存在的情况下，肿瘤不会对人体构成致命威胁。肿瘤组织的恶性生长起因于从肿瘤组织周围的业已存在的血管产生新的毛细血管。围绕肿瘤组织周围的毛细血管内皮细胞受癌细胞分泌物质的刺激开始分裂，它们穿过基底膜和间质就象入侵的癌细胞一样去入侵邻近的癌细胞组织并在癌细胞组织内部生成新的毛细血管。癌细胞在得到新生血管输送养料的供应下快速生长。因其快速生长大量消耗氧气，形成癌细胞组织内部局部的空间性的缺氧状态。而缺氧状态可刺激癌细胞分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)等。这些生长因子激发新一轮的血管增长。这些新生的毛细血管向肿瘤组织内部侵入并延伸，向肿瘤细胞提供生长所必要的氧气和养料，导致肿瘤组织的恶性循环发展。毛细血管的异常增生还可引起软骨组织的损伤和关节膜炎。老年斑点性失明和后期糖尿病患者的视网膜镜疾病也是血管增生的直接后果。抗血管增生疗法被认为是医治这些疾病的新的有效途径。

血管内壁组织是由内皮细胞构成。血管的延伸是内皮

细胞不断繁殖扩张的结果。打击支持肿瘤体恶性增长所需要的新血管，即攻击为肿瘤提供生长所需营养的输送系统的有效途径是控制血管内皮细胞的生长。所以抑制血管内皮细胞生长的技术领域是治疗癌症等血管增生性疾病的新希望。生物工程技术在当代制药工业中被广泛应用，许多蛋白药物被规模化生产。但是，如何浓缩高分子蛋白的功能于较小的多肽体，即进行多肽体疗法，是现代生物医药的一个重要方向。本发明是多肽体工艺和抗血管增生技术的结合。数种抗血管内皮细胞生长剂或因子已经被开发应用于治疗血管增生性疾病。但是有的显示人体毒性如擦里多米德(Thalidomide是一种镇静药，能引起婴儿畸形)。有的只有很弱的抗血管内皮细胞生长活性，例如干扰素和抗雌激素。而新发现的蛋白类抗血管内皮细胞生长因子却不易被基因工程方法生产。所以在保持药物活性的前提下，简便而高效地生产是抗血管生长药物的关健课题。

多肽体和蛋白质的基本组成单位都是氨基酸。通过一个氨基酸分子的羧基(COOH)和另一个氨基酸分子的氨基(NH₂)相缩合形成肽键。二肽体是由肽键连接两个氨基酸分子而成的化合物。多肽体由两个以上的氨基酸分子缩合而成的化合物。细胞中存在众多的长短及成分各异的天然多肽体，构成多样的生化反应，体现特异的细胞生命活动。较长而又有立体构造的多肽体通常被称谓蛋白质。目前，由程控和生化有机合成原理构成的自动化生产技术可聚合80个左右的氨基酸。在这里所论述的多肽体是指含28个氨基酸以下的分子。

发明内容

相对于工程蛋白，短小的多肽体更容易被合成和大量生产。因此本发明提供了多肽体抗血管生长技术。同时，我们知道人体同源性的多肽体通常不引起免役反应。所以本发明要注重筛选具有抗血管内皮细胞生长活性的人体同源性多肽体。

技术方案：

以人类载脂蛋白的圆饼状结构体为蓝本筛选具有抗血管内皮细胞生长活性的多肽P5及其合成物P51至P57，研究其氨基酸序列和抗血管增生作用。

具体方法：本发明所涉及之多肽体由Fmoc方法合成(3，4)然后通过逆相C18高压液相色谱分离仪(HPLC)提纯。纯化后的多肽体并经过质量分析图谱(MS)进行确定。然后，使用BCE细胞测量多肽体对血管内皮细胞增殖的抑制活性(5)。多肽体对BCE生长的抑制程度相对于对照组生长的50％时的浓度被称为IC₅₀。

多肽体是根据上述AK38载脂蛋白的氨基酸序列合成(图1)。多肽体及氨基酸皆采用国际常规IUPAC-IUB命名符号表示(6)。分子两端Ac和NH₂分别表示醋酸基和氨基，担任多肽体N端和C端的保护使命。

载脂蛋白的多肽体的分子组成如下：(其氨基酸序列见图1)

P1：

Ac-Ile-Val-Pro-Ser-Leu-Gly-Pro-Pro-Ser-Glu-Gln-Asp-NH₂

P2：

Ac-Met-Phe-Gly-Gln-Gly-Lys-Tyr-Arg-Gly-Lys-Lys-Ala-Thr-

Thr-Val-Thr-Thr-Val-Thr-Pro-NH₂

P3：

Ac-Gln-Glu-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Thr-

Phe-Ile-Pro-Gly-Thr-Asn-Lys-Trp-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-

Tyr-NH₂

P4：

Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ile-Asn-Gly-Pro-Trp-NH₂

P5：

Ac-Tyr-Thr-Met-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Phe-Asp-Tyr-NH₂

P6：

Ac-Asp-Ile-Pro-Leu-NH₂

P7：

Ac-Ala-Ser-Ser-Ser-Phe-Asp-NH₂

这些多肽体的大小长短不一，并非无规则性选择。它们有个共同点：即它们是圆饼状结构体的每两个相邻的半胱氨酸之间的氨基酸序列。所以它们不含半胱氨酸，可避免在分子间或内部形成二硫键。

通过对这些多肽体的抗血管内皮细胞生长活性分析发现：多肽体P1，P2，P6及P7都几乎没有活性；P3只显示出微弱的活性；P4有活性；P5多肽体则显示出最强的抗血管内皮细胞生长活性(图2)。P5的IC50为0.1微摩尔浓度(图3)。

活性最强的P5多肽体的理论分子量为1488.66Da。合成的P5多肽体的质量图谱显示其质量为1489.41Da(图4)。实际测量值的精确范围符合理论计算的分子量。

P5多肽体含有11个氨基酸。为了更小地缩小多肽体的分子量，在P5多肽体的基础上合成了多肽体P51至P57。它们的分子组成相关性如图5所示。在这些多肽体中，有的分子结构保持了P5多肽体的抗血管内皮细胞活性(图6)。

附图说明

图1.AK38载脂蛋白的多肽的氨基酸序列图

AK38基因cDNA序列及其对应的氨基酸序列如图所示。划线部分展示多肽体所对应的位置。6个半胱氨酸为7个(P1-P7)多肽体的分界点。

图2.多肽体的抗血管内皮细胞活性示意图

图中X轴为多肽(0.75微摩尔浓度)

Y轴为内皮细胞(BCE)增殖(％)(BCE为Endothelial Cellsof Blood vessel血管内皮细胞的缩写)

图中所示为7个多肽体对BCE细胞生长的不同抑制作用。每个多肽体的浓度为0.75微摩尔浓度。结果为三组试验的平均值。

图3.多肽体P5的浓度和活性关系的示意图

图中X轴为多肽的微摩尔浓度

Y轴为内皮细胞(BCE)增殖(％)

图中所示不同浓度的多肽体P5的生物活性。多肽体对BCE生长的抑制程度以其相对于对照组生长程度的百分比表示。

图4多肽体P5的分子质量图谱

X轴为质量(m/z)，Y轴为计数值(counts)。加速电压：20千伏特。质量1489.41Da的波峰为多肽体F5的单体。

图5.多肽P5及P51至P57的氨基酸序列图

P51为P5的N端部分，P52为P51的置换体，P53至P56为P51的置换和添减突变体，P57为P5的C端部分。

图6.P5和P51至P57多肽体的活性比较图

图中X轴为多肽(0.75微摩尔浓度)

Y轴为内皮细胞(BCE)增殖(％)

图中所示P5及其置换和添减突变体对BCE细胞生长的抑制活性。每个多肽体的浓度为0.75微摩尔浓度(三组试验平均值)。

下面结合实施例作进一步说明：

具体实施方式

实施例1

使用多肽体合成仪(应用生物化学：Applied Biosystems 433A)。

(A)安装含Asp多肽合成peptide synthesis园柱，25微摩尔，然后按下列程序进行合成。

(B)冲洗：用二甲基甲酰胺DMF(N，Ndimethylformamide)5分钟；

(C)去除保护基：含有20％哌啶(piperidine)的DMF溶液15分钟；

(D)冲洗：DMF 5分钟；(E)活性化用：HBTU(O-苯并三吡咯基-N，N，N’，N’-四甲基糖醛  六氟磷酸盐)/HBTU(O-benzotriazoly]-N，N，N’，N’-tetramethyl-uronium hexafluorophosphat，25微摩尔)/HOBT(1-羟基苯并三吡咯HOBT(1-hydroxybenzo-triazole，25微摩尔)/DIEA(二异丙基乙胺)/DIEA(diisopropylethylamine，50微摩尔)30分钟；(F)结合：0.1毫摩尔Gln在DMF30分钟；(G)冲洗：DMF5分钟；(H)重复步骤(E)-(G)。在步骤(F)结合氨基酸按下面顺序：Glu，Ser，Pro，Pro，Gly，Leu，Ser，Pro，Val，最后Ile。之后用THF四羟基呋喃(tetrahydrofuran)冲洗5分钟，干燥10分钟。游离多肽体：用新鲜的溶液含50微升苯硫基甲烷(thioanisole)，25微升蒸馏水，25微升乙二硫醇(ethanedithiol)和0.9微升TFA四氢呋喃(tetrahydrofuran)，0℃ 15分钟，23℃，2小时。

实施例2

如下步骤和实施例1不同：步骤(A)使用含Pro合成柱。步骤(F)按下面顺序：Thr，Gly，Thr，Val，Thr，Thr，Ala，Lys，Lys，Gly，Arg，Tyr，Gly，Lys，Gly，Asn，Gly，Phe和Met。

实施例3

如下步骤和实施例1不同；步骤(A)使用含Tyr的合成柱。步骤(F)按下面顺序：Asn，Lys，Glu，Leu，Gly，Ala，Trp，Lys，Asn，Thr，Gly，Pro，Ile，Phe，Thr，Ser，His，Arg，His，Pro，Glu，Gln，Ala，Ala，Trp，Glu和Gln。

实施例4

如下步骤和实施例1不同：步骤(A)使用含Trp的合成柱。步骤(F)按下面顺序：Pro，Gly，Asn，Ile，Asp，Gly，Asp，Pro，Asn和Arg。

实施例5

如下步骤和实施例1不同：步骤(A)使用含Tyr的合成柱。步骤(F)按下面顺序：Asp，Phe，Leu，Lys，Arg，Pro，Asn，Met，Thr和Tyr。

实施例6

如下步骤和实施例1不同：步骤(A)使用含Leu的合成柱。步骤(F)按下面顺序：Pro，Ile和Asp。

实施例7

如下步骤和实施例1不同：步骤(A)使用含Asp的合成柱。步骤(F)按下面顺序：Phe，Ser，Ser，Ser和Ala。

实施例8

使用逆相C18高压液相色谱分离仪提纯上述多肽体。分离柱和分析柱的规格分别为20毫米×250毫米和4.6毫米×250毫米。缓冲溶液为A(0.1％TFA+99.9％蒸馏水)和B(0.01％TFA+99.99％乙腈acetonitrile)；梯度：缓冲溶液A(100％)/B(0％)至A(0％)/B(100％)。分离柱和分析柱的流速分别为15毫升/分钟和1毫升/分钟，流程时间分别为45分钟和20分钟。

实施例9

测量多肽体对血管内皮细胞增殖的抑制活性使用了BCE细胞(5)。BCE细胞的培养液含90％DMEM，10％血清(FBS)及0.002微克/毫升的碱性成纤维生长因子(bFGF)。使用24孔平板培养。每孔殖入8,000至10,000只细胞和0.5毫升培养液。12小时后试验区换成含有多肽体的培养液，在37℃继续培养3-5天后计数。

以上根据载脂蛋白[Apo(a)]内含的多肽具有抗血管内皮细胞生长功能的饼状结构体(AK38)的氨基酸序列，合成了一系列多肽体。每个多肽体成分和结构分别由AK38圆饼状结构体的两个相邻的半胱氨酸之间的氨基酸序列组成。从这些多肽体中发现P5具有抗血管内皮细胞生长活性。该多肽体含11个氨基酸：Tyr-Thr-Met-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Phe-Asp-Tyr。在P5多肽体的基础上合成了更小的多肽体P51至P57。P5衍生的多肽体仅含有7-9个氨基酸，所述的多肽N末端和C末端的联结体，所述的多肽的单个重复或多个不同多肽体的联结体，都继承了P5多肽体的生物活性。

本发明的应用：本发明所述的多肽具有抗血管内皮细胞生长活性的功能，应用于治疗肿瘤、血管纤维瘤、肉芽肿病、蛛状痔、遗传出血性毛细血管扩张、血管性血友病及预防和治疗后期糖尿病诱发失明等与血管增生有关的疾病。所述的多肽分子能制成治疗以上疾病的医疗制品，在所述的多肽的氨基酸被削减、增加或置换所产生的分子仍有治疗上述疾病的作用。

参考文献

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(3)Meienhofer J.Hormonal Proteins andPeptides.Academic Press，New York.1973.

(4)Schroder G.Lupke K.The Peptides.Acacemic Press，New York.1965.

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(6)Anonymous.IUPAC-IUB Joint Commission onBiochemical Nomenclature(JCBN).Nomenclatureand symbolism for amino acids and peptides.European Journal of Biochemistry.1984；138：9-37.

参考文献译文：

(1)Mooser V.Seabra MC.Abedin M.Landschulz KT.Marcovina S.Hoobbs H.人尿中的载脂蛋白的园饼状结构体4-抑制片段    临床研究杂志1996；97：858-864.

(2)McLean JW.Tomlinson JE.Kuang WJ.Eaton DL.Chen EY.Fless GM.Scanu AM.Lawn RM.人载脂蛋白的CDNA序列与血纤维蛋白溶酶原是同源的    自然1987；330：132-137.

(3)Meienhofer J.激素蛋白和多肽    纽约科学院出版物1973。

(4)Schroder G.Lupke K.多肽    纽约科学院出版物1965。

(5)Folkman J.Haudenschild CC.Zetter BR.    毛细血管内皮细胞的长期培养    美国国家科学院学报1979；76：5217-5221.

(6)不具名的(集体著作)  有关生物化学的IUPAC-IUB命名联合委员会    用于氨基酸和多肽的命名和符号生物化学的欧洲杂志1984；138：9-37.

Claims (2)

1、一种具有抗血管内皮细胞生长活性的多肽P5及在多肽P5的基础上合成的多肽P51至P57，其特征是所述的多肽的氨基酸序列如下：

P5    Tyr Thr Met Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp Tyr

P51   Tyr Thr Met Asn Pro Arg Lys

P52   Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys

P53   His Val Leu Lys Asn Arg Lys

P54   Gly Val Ile Thr Asn Pro Arg Ile Lys

P55   Gly Val Ile Thr Lys Ile Lys

P56   Gly Val Ile Thr Arg Ile Lys

P57   Pro Arg Lys Leu Phe Asp Tyr。

2.根据权利要求1中的任一多肽在制备用于治疗抗血管增生性疾病的药物中的用途。

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