CN1204145C - 人血管内皮细胞生成抑制因子的制备工艺及其制品在抗肿瘤血管生成治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种人重组血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品在抗肿瘤血管生成治疗中的应用，它是通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选得到的基因片段，通过基因克隆方法在酵母菌中发酵、表达、及纯化过程得到纯品，其具有高效表达、可溶性、无需复性、修饰及糖基化的特性，能抑制肿瘤血管内皮细胞增殖，对多种肿瘤具有治疗作用。

Description

人血管内皮细胞生成抑制因子的制备工艺及其制品在 抗肿瘤血管生成治疗中的应用

本发明属于基因工程领域，特别涉及人血管内皮细胞生成抑制因子的制备工艺及其制品在抗肿瘤血管生成治疗中的应用。

癌症在全世界已成为仅次于的脑血管疾病的人类第二大杀手，是目前世界上最难征服的疾病之一。目前实体肿瘤临床治疗方法是多种多样，但绝大部分是针对肿瘤细胞进行治疗。用抑制剂或阻断剂来阻断或抑制实体肿瘤血管再生及血液供应方面的疗法较少，用人重组血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白进行抗肿瘤血管再生治疗尚未见报道。另外人重组的内皮细胞生成抑制因子大多是在大肠肝菌中表达，其表达量仅为15-20mg/升菌液，且可溶性差，生物活性低。

本发明的目的在于提供一种在酵母菌中高效表达的、可溶性的、无需复性、修饰及糖基化的、高活性人血管内皮细胞生成抑制因子，用于抑制肿瘤血管再生，以阻断肿瘤血液供应及营养来源，肿瘤细胞凋亡坏死，使实体肿瘤萎缩，以达到在临床治疗肿瘤的目的。

本发明制备工艺的步骤如下：

a.通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选得到人胶原蛋白十八--human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先制备两种引物分别为CTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGCCAC和GCGGCCGCTTACTACTTGGAGGCAGTC，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环而得到人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin的基因片段；

b.将该基因克隆入TA Vectohk质粒中，通过XhoI，NotI两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的基因片段，再克隆入pPICZαA质粒中的上述两种内切酶位点中；

c.将该基因载体pPICZαA质粒转染于酵母菌中，经筛选得到高效基因工程酵母菌株；

d.经发酵诱导表达的菌液采用超滤、浓缩、高速离心、亲和柱层析及凝胶过滤等手段纯化而得到人重组血管内皮细胞生成抑制因子蛋白质；

e.将纯化得到的人重组血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛肾上腺毛细血管内皮细胞培养液中，培养3天后通过细胞计数和细胞染色方法，测定抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。

上述得到的制品具有以下特性：

a.其基因载体为pPICZαA质粒，其质粒表达启动子为醇氧化酶(AOX1)，替换酵母天然的醇氧化酶基因；

b.pPICZαA内构建α-因子带有分泌信号肽序列，可使目的蛋白分泌于细胞外；

c.其基因工程宿主酵母菌为甲醇诱导型；

d.其制品为可溶性的、无需复性和修饰的具有生物活性的蛋白质。

人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin蛋白在抗肿瘤血管生成治疗中的应用：其制品作为单制剂制备成生物制品并根据它们的抗肿瘤血管再生作用而用于治疗实体肿瘤。

本发明与现有技术相比较具有如下优点：

(1)人重组血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白用于抑制人实体肿瘤血管再生优于用鼠重组Endsotatin蛋白，这是因为采用人重组血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin的基因产物用于治疗人实体肿瘤是属于同源性，不易被人体所排斥。

(2)人重组血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin基因是在酵母菌中表达，属甲醇诱导型，表达量高达60-80mg/升菌液，其蛋白产物属分泌型，为可溶性无须复性和修饰的高活性天然状态蛋白质。

(3)人重组血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白专一性抑制增殖的毛细血管内皮细胞，对人体其它细胞无抑制作用，因此使肿瘤血管不能再生。导致肿瘤组织在没有血管供给血液和营养物质的状态下不断的死亡和萎缩，实验已证实了这种结论。

实施例：本发明的制备工艺主要是经过基因克隆、酵母菌发酵、纯化过程而得到的制品，其步骤如下：

a.通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选而得到人胶原蛋白十八--human type XVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先制备两种引物分别为CTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGCCAC和GCGGCCGCTTACTACTTGGAGGCAGTC，以1微升人胎儿肾脏细胞cDNA为模板，加入上述两种引物各2微升(浓度为每微升0.1微克)，加入5微升2.5MdNTP、5微升10×PCR缓冲液，各1微升Taq或PwoDNA聚合酶，在PCR仪上94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共计30个循环，然后用15％琼脂糖凝胶电泳分离得到人重组血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin基因。

b.将该基因克隆入TA Vectohk质粒中，通过XhoI，NotI两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的基因片段，再克隆入pPICZαA质粒中的上述两种内切酶位点中；

c.将该基因载体pPICZαA质粒转染于酵母菌中，经筛选得到高效表达的基因工程酵母菌株；

d.经发酵诱导表达的菌液采用超滤、浓缩、高速离心、亲和柱层析、凝胶过滤等手段纯化而得到人重组血管内皮细胞生成抑制因子蛋白质(蛋白质氨基酸序列及基因片段见附表—人血管内皮细胞生成抑制因子—Endostatin基因，氨基酸全序列)。

e.采用牛肾上腺毛细血管内皮细胞(BCE)培养至24孔培养板上，细胞浓度为12500个细胞/孔，每孔加入1纳克bFGF和不同浓度的人重组血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白，培养3天后通过细胞计数和细胞染色方法来测定抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。

上述所得制品具有以下特性：

a.其基因载体为pPICZαA质粒，其质粒表达启动子为醇氧化酶(AOX1)，替换酵母天然的醇氧化酶基因；

b.pPICZαA质粒内构建α-因子带有分泌信号肽序列，可使目的蛋白分泌于细胞外；

c.其基因工程宿主酵母菌为甲醇诱导型；

d.其制品为可溶性的、无需复性和修饰的具有生物活性的蛋白质；

将上述制品用于抗肿瘤血管生成治疗，以动物实验为例：将小鼠皮下接种肿瘤细胞，使肿瘤长至100mm³左右时，将小鼠随机分组，分别皮下注射高、中、低三种不同计量的人重组血管内皮细胞生成抑制因子--Endostatin蛋白及生理盐水(对照组)，连续注射20天，实验结果表明人重组血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin对多种肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用，肿瘤组织明显萎缩。

                               人血管内皮细胞生成抑制因子—

                                EndoStatin基因，氨基酸全序列

ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCT GTT TTA TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT CGT CCA

  TAC TCT AAA GGA AGT TAA AAA TGA CGA CAA AAT AAG CGT CGT AGG AGG CGT AAT CGA CGA GGT

Met Arg Pho Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro

  GTC AAC ACT ACA ACA GAA GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC TCA

  CAG TTG TGA TGT TGT CTT CTA CTT TGC CGT GTT TAA GGC CGA CTT CGA CAG TAG CCA ATG AGT

Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser

  GAT TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA AAT AAC GGG TTA

  CTA AAT CTT CCC CTA AAG CTA CAA CGA CAA AAC GGT AAA AGG TTG TCG TGT TTA TTG CCC AAT

Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu

                                                                      Xhol(1184)

  TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT GCC AGC ATT GCT GCT AAA GAA GAA GGG GTA TCT CTC GAG AAA

  AAC AAA TAT TTA TGA TGA TAA CGG TCG TAA CGA CGA TTT CTT CTT CCC CAT AGA GAG CTC TTT

Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys

            ↓Start 12t AA

  AGA GAG GCT CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG CTC CAC CTG GTT GCG CTC AAC AGC CCC

  TCT CTC CGA GTG TCG GTG GCG CTG AAG GTC GGC CAC GAG GTG GAC CAA CGC GAG TTG TCG GGG

Arg Glu Ala His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro

  CTG TCA GGC GGC ATG CGG GGC ATC CGC GGG GCC GAC TTC CAG TGC TTC CAG CAG GCG CGG GCC

  GAC AGT CCG CCG TAC GCC CCG TAG GCG CCC CGG CTG AAG GTC ACG AAG GTC GTC CGC GCC CGG

Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala

  GTG GGG CTG GCG GGC ACC TTC CGC GCC TTC CTG TCC TCG CGC CTG CAG GAC CTG TAC AGC ATC

  CAC CCC GAC CGC CCG TGG AAG GCG CGG AAG GAC AGG AGC GCG GAC GTC CTG GAC ATG TCG TAG

Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile

  GTG CGC CGT GCC GAC CGC GCA GCC GTG CCC ATC GTC AAC CTC AAG GAC GAG CTG CTG TTT CCC

  CAC GCG GCA CGG CTG GCG CGT CGG CAC GGG TAG CAG TTG GAG TTC CTG CTC GAC GAC AAA GGG

Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro

  AGC TGG GAG GCT CTG TTC TCA GGC TCT GAG GGT CCG CTG AAG CCC GGG GCA CGC ATC TTC TCC

  TCG ACC CTC CGA GAC AAG AGT CCG AGA CTC CCA GGC GAC TTC GGG CCC CGT GCG TAG AAG AGG

Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Aal Arg Ile Phe Ser

                  Aatll(1520)

  TTT GAC GGC AAG GAC GTC CTG AGG CAC CCC ACC TGG CCC CAG AAG AGC GTG TGG CAT GGC TCG

  AAA CTG CCG TTC CTG CAG GAC TCC GTG GGG TGG ACC GGG GTC TTC TCG CAC ACC GTA CCG AGC

Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser

  GAC CCC AAC GGG CGC AGG CTG ACC GAG AGC TAC TGT GAG ACG TGG CGG ACG GAG GCT CCC TCG

  CTG GGG TTG CCC GCG TCC GAC TGG CTC TCG ATG ACA CTC TGC ACC GCC TGC CTC CGA GGG AGC

Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser

  GCC ACG GGC CAG GCC TCC TCG CTG CTG GGG GGC AGG CTC CTG GGG CAG AGT GCC GCG AGC TGC

  CGG TGC CCG GTC CGG AGG AGC GAC GAC CCC CCG TCC GAG GAC CCC GTC TCA CGG CGC TCG ACG

Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys

  CAT CAC GCC TAC ATC GTG CTC TGC ATT GAG AAC AGC TTC ATG ACT GCC TCC AAG TAG TAA

  GTA GTG CGG ATG TAG CAC GAG ACG TAA CTC TTG TCG AAG TAC TGA CGG AGG TTC ATC ATT

His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys……

Claims (1)

1.一种人血管内皮细胞生成抑制因子—Endostatin的制备工艺，是经过基因克隆、酵母菌发酵和纯化过程制备而得，其步骤如下：

a.通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选得到人胶原蛋白十八--human typeXVIII collagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先制备两种引物分别为CTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGCCAC和GCGGCCGCTTACTACTTGGAGGCAGTC，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环而得到人血管内皮细胞生成抑制因子—Endostatin的基因片段；

b.将该基因克隆入TA Vectohk质粒中，通过XhoI，NotI两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的基因片段，再克隆入pPICZ α A质粒中的上述两种内切酶位点中；

c.将该基因载体pPICZ α A质粒转染于酵母菌中，经筛选得到高效基因工程酵母菌株；

d.经发酵诱导表达的菌液采用超滤、浓缩、高速离心、亲和柱层析及凝胶过滤等手段纯化而得到人重组血管内皮细胞生成抑制因子蛋白质；

e.将纯化得到的人重组血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛肾上腺毛细血管内皮细胞培养液中，培养3天后通过细胞计数和细胞染色方法，测定抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。