CN1203853C - 粉防己特殊成份抽提物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粉防己特殊成份抽提物及其用途，粉防己特殊成份抽提物包括有粉防己甲素(TETRA；tetrandrine)、防己诺宁(FAN；fangchinoline)、塞卡诺宁(CYC；cyclanoline)、欧柏龙经(OBL；oblongine)等四种生物碱，以及其他具有生理活性之有效成份。由上述四种生物碱及其它具有生理活性的有效成份制成的药剂具有抗炎作用及保护心脏缺氧(血)伤害的作用。

Description

粉防己特殊成份抽提物及其用途

技术领域

本发明涉及一种粉防己特殊成份抽提物及其用途。

背景技术

粉防己特殊成份抽提物(SPRST)之抗发炎作用为其所含的粉防己甲素(Tetrandrine；TETRA)、防己诺宁(Fangchinoline；FAN)及其它有效成份共同作用之结果，因为相当于粉防己特殊成份抽提物(SPRST)所含剂量的粉防己甲素(0.1μg/ml)及防己诺宁(0.1μg/ml)并不能达到粉防己特殊成份抽提物(SPRST；10μg/ml)相同的效果【注：粉防己特殊成份抽提物(SPRST)含1.3％之粉防己甲素(TETRA)及0.7％之防己诺宁(FAN)】。总结粉防己特殊成份抽提物(SPRST)是一个具抗发炎作用低细胞毒性的中药特殊抽提成份，它可经由抑制G蛋白(Gprotein)调控的钙离子内流(calcium influx)及活性自由基(reactiveoxygen species；ROS)之产生而防止嗜中性白血球不会过度活化表现巨黏着分子(Mac-1；CD11b/CD18)而达其抗发炎及保护心脏缺氧伤害(ischemic reperfued injury；I/R)之作用。

防己是一种常用之药植物，在本草拾遗中记载，汉防己主水气，木防己主风气，而在药性本草中记载，汉防己治湿风口面斜手足疼，散留痰，主肺气嗽喘……。后人研究认为属于防己之中药植物有粉防己(Stephania tetrandra S.Moore)，木防己(Cocculus trilobus(Thunb.)DC.)，广防己(Aristolochia weslandi)，汉中防己(Aristolochia heterophylla)，青藤(Sinomenium acutum)。此等植物仅粉防己(S.tetrandra)，木防己(C.trilobus)属于防己科(Menispermaceae)植物。而广防己(A.weslandi)，汉中防己(A.heterophylla)为马兜铃科(Aristolochiaceae)植物。广防己及汉中防己并非防己科植物，乃是防己之谬用。日本则用青藤作为汉中防己(A.heterophylla)之药用。古代之汉中防己(A.heterophylla)是防己科藤本植物粉防己(S.tetrandra)之块根。

在早期中国传统医学上往往仅使用防己，并未叙明是采用汉中防己或木防己。而温病条辨以防己配伍薏苡仁、蚕砂组成宣痹汤，用于治疗风湿痹痛。

中药植物防己所含之成份为生物碱(alkaloids)之双苄基异醌哇啉(bisbenzylisoquinoline)、原小檗碱(protoberberine)、吗啡烷(morphinane)与菲(phenanthrene)等类型。粉防己(S.tetrandra)含有粉防己甲素(Tetrandrine，TETRA)、防己诺宁(fangchinoline，FAN)、塞卡诺宁(cyclanoline，CYC)、欧柏龙经(oblongine，OBL)、缅尼信(menisine)、缅尼丁(menisidine)等成份。木防己(C.trilobus)含有淬罗滨(trilobine)、异淬罗滨(isotrilobine)、玛浮滨(magnoflorine)、萃跋敏(trilobamine)、可罗滨(coclobine)、缅沙林(menisarine)、挪沙林(normenisarine)等成份。马兜铃科之广防己(A.weslandi)及汉中防己(A.heterophylla)则含有马兜铃酸(aristolochic acid)。

依照1992年Tang W与Eisenbrand G在Chinese Drugs of PlantOriginal著作第963-978页称粉防己植物的主要有效药理成份有粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)。依照Chen KK与Chen AL于1935年J.Bio.Chem第109卷第681-685页报导，粉防己甲素(TETRA)结构特征为双苄基异醌哇啉(bis-benzylisoquinoline)之生物碱。Felix JP等人于1992年Biochemistry第31卷第11793-11800页报导粉防己甲素(TETRA)是已知最好的天然钙离子通道阻断剂，而许多学者分别报导许多其他现代药理作用，包括Huang YT与Hong CY于1998年Cardiovasc Drug Rev第16卷第1-15页报导粉防己甲素(TETRA)具有调整心血管系统作用；DeConti RC等人于1975年Cancer Res Am Soc ClinOncol第16卷第96页报导具有抗癌作用，及Shen YC等人于1999年Mol Pharmacol第55卷第186-193页报导粉防己甲素具有抗发炎作用。而防己诺宁(FAN)之现代药理作用，Ma JY等人于1992年Exp Lung Res第18卷第829-843页报导具备抗氧化，及Choi HS等人于2000年JEthnopharmacol第69卷第173-179页报导具有抗发炎作用；Kim HS等人于1997年J Ethnopharmacol第58卷第117-123页报导其钙离子通道阻断及血管舒张作用较粉防己甲素(TETRA)弱。

发明人Yu XC等人于2001年Life Sci第68卷第2863-2872页报导，发现含10％粉防己甲素(TETRA)之粉防己萃取液具保护缺血(氧)心脏之作用，其效价与粉防己甲素(TETRA)相当且又没有典型钙离子通道阻断剂(verapamil)之副作用。

Williams FM于1994年Role of neutrophils in reperfusion injury，in：Immunopharmacology of Neutrophils第245-257页著作指出嗜中性白血球(neutrophil；PMN)的活化粘着(adhesion)及迁徒(transmigration)对缺血(氧)心脏之伤害具重要地位。嗜中性球的粘着作用乃发炎早期之重要现象，Albelda SM等人于1994年FASEB J第8卷第504-512页报导嗜中性球须先粘着于内皮细胞，才能穿出血管壁(transmigration)以浸润发炎组织，执行其保卫功能。Ley K于1996年Cardiovasc Res第32卷第733-742页报导此粘着过程可细分为三期：滚动期(rolling)、活化期(activation)及紧密粘着期(firm adhesion)；不同时期凭藉不同的粘着分子(adhesion molecules)。其中以巨粘着分子(Mac-1或称macrophageadhesion molecule-1，或称CD11b/CD18)参予的紧密粘着(firm adhesion)最为重要。

发明内容

本发明之目的是提供一种粉防己特殊成份抽提物。

本发明之另一目的是提供一种含有粉防己特殊成份抽提物的具抗发炎作用及保护心脏缺氧伤害作用的药物。

本发明之抽提物包括有粉防己甲素、防己诺宁、塞卡诺宁、欧柏龙经四种生物碱，以及其它具有生理活性之有效成份。

本发明之粉防己特殊成份抽提物，其高效液相层析仪图谱之移动相为乙晴(CH₃CN)-磷酸二氢钾盐(KH₂PO₄)缓冲溶液，利用线性梯度冲提，检测波长为280nm；在45分钟内四种成分可完全分离，其定量线性回归议程式及相关系数之浓度在12.5～1637μg/ml范围间，检测极限依S/N＝3规例计算；缓冲溶液KH₂PO₄-H₂O是以KH₂PO₄溶于水，而乙晴(CH₃CN)-磷酸二氢钾盐(KH₂PO₄)缓冲溶液是H₂O∶CH₃CN∶KH₂PO₄＝400ml∶600ml∶5g之比例调配。

一种具抗发炎作用之粉防己特殊成份抽提物，其包括粉防己甲素、防己诺宁、塞卡诺宁、欧柏龙经四种生物碱，以及其它具有生理活性之有效成份。

一种具保护心脏缺氧伤害作用之粉防己特殊成份抽提物，其包括粉防己甲素、防己诺宁、塞卡诺宁、欧柏龙经四种生物碱，以及其它具有生理活性之有效成份。

附图说明

图1是高效液相层析仪图谱

(1)欧柏龙经(oblongine，OBL)

(2)塞卡诺宁(cyclanoline，CYC)

(3)防己诺宁(fangchinoline，FAN)

(4)粉防己甲素(tetrandrine，TETRA)

图2是弗贾安(fMLP)与粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)并用抑制嗜中性球粘着(adhesion)于人类纤维蛋白原。^*表示与弗贾安(fMLP)单独处理组经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’s test)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.弗贾安(fMLP)并用防己诺宁(FAN)

2.弗贾安(fMLP)并用粉防己甲素(TETRA)

3.弗贾安(fMLP)并用粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

图3是白三烯素(LTB₄)与粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)并用抑制嗜中性球粘着于人类纤维蛋白原。^*表示与白三烯素(LTB₄)单独处理组经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’s test)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.白三烯素并用防己诺宁(FAN)

2.白三烯素并用粉防己甲素(TETRA)

3.白三烯素并用粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

图4是弗贾安(fMLP)与粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)并用抑制嗜中性球(PMN)迁徒(transmigration)。^*表示与弗贾安(fMLP)单独处理组经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’s test)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.弗贾安(fMLP)并用防己诺宁(FAN)

2.弗贾安(fMLP)并用粉防己甲素(TETRA)

3.弗贾安(fMLP)并用粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

图5是白三烯素(LTB₄)与粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)并用抑制嗜中性球(PMN)迁徒。^*表示与白三烯素(LTB₄)单独处理组经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’s test)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.白三烯素并用防己诺宁(FAN)

2.白三烯素并用粉防己甲素(TETRA)

3.白三烯素并用粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

图6是弗贾安(fMLP)与粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)并用抑制嗜中性球(PMN)巨粘着分子(Mac-1，CD11b/CD18)的表现之统计图。^*表示与弗贾安(fMLP)单独处理组经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’s test)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.对照组(无任何药物处理)

2.弗贾安(fMLP)

3.弗贾安(fMLP)并用5μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

4.弗贾安(fMLP)并用10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

5.弗贾安(fMLP)并用5μg/ml粉防己甲素(TETRA)

6.弗贾安(fMLP)并用10μg/ml粉防己甲素(TETRA)

7.弗贾安(fMLP)并用5μg/ml防己诺宁(FAN)

8.弗贾安(fMLP)并用10μg/ml防己诺宁(FAN)

图7是白三烯素(LTB₄)与粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)并用抑制嗜中性球(PMN)巨粘着分子(Mac-1，CD11b/CD18)表现之统计图。^*表示与白三烯素(LTB₄)单独处理组经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’s test)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.对照组(无任何药物处理)

2.白三烯素(LTB₄)

3.白三烯素(LTB₄)并用5μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

4.白三烯素(LTB₄)并用10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

5.白三烯素(LTB₄)并用5μg/ml粉防己甲素(TETRA)

6.白三烯素(LTB₄)并用10μg/ml粉防己甲素(TETRA)

7.白三烯素(LTB₄)并用5μg/ml防己诺宁(FAN)

8.白三烯素(LTB₄)并用10μg/ml防己诺宁(FAN)

图8是典型流式细胞分析图，说明细胞内过氧化氢(H₂O₂)之产生。

1.对照组(无任何药物处理)

2.弗贾安(fMLP)

3.弗贾安(fMLP)并用粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

图9是典型流式细胞分析图，说明细胞内超氧阴离子(O₂ ^·-)之产生。

1.对照组(无任何药物处理)

2.弗贾安(fMLP)

3.弗贾安(fMLP)并用粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

图10是粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)抑制超氧阴离子(O₂ ^·-)及过氧化氢(H₂O₂)产生之统计图。^*表示与弗贾安(fMLP)单独处理组激发之过氧化氢(H₂O₂)(DCF萤光)及超氧阴离子(O₂ ^·-)(EB萤光)经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’s test)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.对照组(无任何药物处理)

2.弗贾安(fMLP)

3.弗贾安并用5μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

4.弗贾安并用10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

5.弗贾安并用5μg/ml粉防己甲素(TETRA)

6.弗贾安并用10μg/ml粉防己甲素(TETRA)

7.弗贾安并用5μg/ml防己诺宁(FAN)

8.弗贾安并用10μg/ml防己诺宁(FAN)

图11是六十分钟之时程分析(time course monitoring)预处理粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)可以抑制弗贾安(fMLP)所激发之嗜中性球细胞内酸碱值(pH)骤增之统计图。数据为酸碱值(pH)平均值±平均值标准误差(n＝6)。

1.弗贾安(fMLP)

2.弗贾安并用钙离子通道阻断剂(verapamil)

3.弗贾安并用防己诺宁(FAN)

4.弗贾安并用粉防己甲素(TETRA)

5.弗贾安并用粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

图12是预处理粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)可以限制弗贾安(fMLP)所激发之嗜中性球细胞内钙离子([Ca]i)骤增之统计图。数据为钙离子浓度变化净值(net increase)之平均值±平均值标准误差(n＝6)。

1.弗贾安(fMLP)

2.弗贾安并用百日咳毒素(PTX)

3.弗贾安并用钙离子通道阻断剂(verapamil)

4.弗贾安并用5μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

5.弗贾安并用10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

6.弗贾安并用5μg/ml粉防己甲素(TETRA)

7.弗贾安并用10μg/ml粉防己甲素(TETRA)

8.弗贾安并用5μg/ml防己诺宁(FAN)

9.弗贾安并用10μg/ml防己诺宁(FAN)

图13是预处理粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)可以限制白三烯素(LTB₄)所激发之嗜中性球细胞内钙离子([Ca]i)骤增的统计图。数据为钙离子浓度变化净值(net increase)之平均值±平均值标准误差(n＝6)。

1.白三烯素(LTB₄)

2.白三烯素并用百日咳毒素(PTX)

3.白三烯素并用5μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

4.白三烯素并用10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

5.白三烯素并用5μg/ml粉防己甲素(TETRA)

6.白三烯素并用10μg/ml粉防己甲素(TETRA)

7.白三烯素并用5μg/ml防己诺宁(FAN)

8.白三烯素并用10μg/ml防己诺宁(FAN)

图14是粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)对G蛋白(G protein)之作用的统计图。单独G蛋白活化剂氟化铝阴离子(AlF₄ ^-)会造成细胞内钙离子浓度增高，此作用可被百日咳毒素(PTX)逆转。^*表示与G蛋白活化剂(AlF₄ ^-)单独处理组经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’s test)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.氟化铝阴离子(AlF₄ ^-)

2.氟化铝阴离子并用百日咳毒素(PTX)

3.氟化铝阴离子并用5μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

4.氟化铝阴离子并用10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

5.氟化铝阴离子并用5μg/ml粉防己甲素(TETRA)

6.氟化铝阴离子并用10μg/ml粉防己甲素(TETRA)

7.氟化铝阴离子并用5μg/ml防己诺宁(FAN)

8.氟化铝阴离子并用10μg/ml防己诺宁(FAN)

图15是粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)对G蛋白之作用的统计图。单独G蛋白活化剂(AlF₄ ^-)会造成细胞之粘着(adhesion)，此作用可被百日咳毒素(PTX)逆转。^*表示与G蛋白活化剂(AlF₄ ^-)单独处理组经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’s test)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.氟化铝阴离子(AlF₄ ^-)

2.氟化铝阴离子并用百日咳毒素(PTX)

3.氟化铝阴离子并用5μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

4.氟化铝阴离子并用10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

5.氟化铝阴离子并用5μg/ml粉防己甲素(TETRA)

6.氟化铝阴离子并用10μg/ml粉防己甲素(TETRA)

7.氟化铝阴离子并用5μg/ml防己诺宁(FAN)

8.氟化铝阴离子并用10μg/ml防己诺宁(FAN)

图16是各种溶剂所萃取之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)对嗜中性球细胞内活性自由基之超氧阴离子(O₂ ^·-)抑制作用之统计比较图。

普罗芷(PMA，phorbol-12-myristate-13-acetate)所诱发的嗜中性球超氧阴离子(O₂ ^·-)可被SPRST/H₂O/EtOH、SPRST/EtOH及SPRST/CH₂Cl₂/EtOH等三种过程不同之溶剂萃取物所抑制。细胞在各种溶剂所萃取之粉防己特殊成份抽提物(100μg/ml)存在下以100ng/ml普罗芷(PMA)激发超氧阴离子(O₂ ^·-)(EB萤光)的产生，以流式细胞仪(flow cytometry)分别于FL-2(EB)监测之结果。控制组并不处以任何药物。数据以平均萤光值(mean channel fluorescence；MCF)表示。^*表示与普罗芷(PMA)单独处理组经达纳单因子变异事后检定(Dunnett’stest)比较具统计差异(P＜0.05)。

1.对照组(无任何药物处理)

2.普罗芷(PMA)

3.SPRST/H₂O

4.SPRST/H₂O/EtOH

5.SPRST/EtOH

6.SPRST/EtOH/H₂O

7.SPRST/EtOH/CH₂Cl₂

8.SPRST/CH₂Cl₂

9.SPRST/CH₂Cl₂/EtOH

10.SPRST/CH₂Cl₂/H₂O

图17是各种药物及萃取之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)对嗜中性球之细胞毒性评估(cytotoxicity)。普罗芷(PMA，phorbol-12-myristate-13-acetate)及其拮抗剂(staurosporine)所诱发的嗜中性球细胞毒性与粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份之毒性比较。数据为死亡率之平均值表示。

1.对照组

2.普罗芷(PMA)

3.拮抗剂(Staurosporine)

4.1μg/ml防己诺宁(FAN)

5.5μg/ml防己诺宁(FAN)

6.10μg/ml防己诺宁(FAN)

7.1μg/ml粉防己甲素(TETRA)

8.5μg/ml粉防己甲素(TETRA)

9.10μg/ml粉防己甲素(TETRA)

10.1μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

11.5μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

12.10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)

13.1μg/ml粉防己甲素(TETRA)并用1μg/ml防己诺宁(FAN)

14.2.5μg/ml粉防己甲素(TETRA)并用2.5μg/ml防己诺宁(FAN)

15.5μg/ml粉防己甲素(TETRA)并用5μg/ml防己诺宁(FAN)

具体实施方式

本发明之粉防己是购自一般中药市场，经鉴定为防己科藤本植物粉防己(Stephania tetrandra S.Moore)之块根。本发明之抽提物是将药材经水或混合各种适当比例之有机溶媒萃取干燥。而一般常用于中药之连续性萃取，也能适用于本发明。通常萃取之有机溶媒，有乙醇(EtOH)、二氯甲烷(CH₂Cl₂)、丙酮(acetone)。萃取干燥之产物，以管柱经单一有机溶媒，或是两种、多种有机溶媒组成之混合溶媒为冲提液进行分离。一般适宜作为充填管柱之胆体有矽胶(silica gel)、达龙(diaion)、绥华迪(sephadex)、C-18。所谓单一有机溶媒，或是两种、多种有机溶媒组成之混合溶媒，可选用甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、二氯甲烷(CH₂Cl₂)、丙酮(acetone)、水、甲苯(toluene)之两种或是三种有机溶媒，以各种比例为冲提液。

以各种溶剂所萃取之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)对嗜中性球细胞内活性自由基之超氧阴离子(O₂ ^·-)抑制作用之比较。

以普罗芷(PMA，phorbol-12-myristate-13-acetate)诱发嗜中性球超氧阴离子(O₂ ^·-)产生。细胞先以SPRST/H₂O/EtOH、SPRST/EtOH及SPRST/CH₂Cl₂/EtOH等三种过程不同之溶剂萃取物(100μg/ml)存在下预作用10分钟。以100ng/ml普罗芷(PMA)激发超氧阴离子(O₂ ^·-)(EB萤光)的产生，以流式细胞仪分别于FL-2(EB)监测30分钟之结果；控制组并不处以任何药物。结果显示经由乙醇萃取之萃取物组，包括SPRST/EtOH、SPRST/H₂O/EtOH、SPRST/CH₂Cl₂/EtOH等三种萃取物皆显著抑制嗜中性球超氧阴离子(O₂ ^·-)之产生，如图16所示。其中SPRST/H₂O/EtOH表示粉防己特殊成份抽提物(SPRST)，是经过水(H₂O)萃取后之药材再以乙醇(EtOH)萃取后干燥所得产物。SPRST/EtOH表示粉防己特殊成份抽提物(SPRST)是经过乙醇(EtOH)萃取后干燥所得的产物。SPRST/CH₂Cl₂/EtOH表示粉防己特殊成份抽提物(SPRST)是经过二氯甲烷(CH₂Cl₂)萃取后之药材再以乙醇(EtOH)萃取后干燥所得产物。

本发明之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)，是由粉防己(Stephaniatetrandra S.Moore)之块根运用本发明之抽提方法制备。应用HitachiModel L-7100高效液相层析仪(HPLC)，移动相为乙晴(CH₃CN)-磷酸二氢钾盐(KH₂PO₄)缓冲溶液，利用线性梯度冲提，检测波长为280nm；在45分钟内四种成分可完全分离，其定量线性回归方程式及相关系数之浓度在12.5～1637μg/ml范围间，检测极限依S/N＝3规例计算。缓冲溶液KH₂PO₄-H₂O是以5gKH₂PO₄溶于1000ml水，而乙晴(CH₃CN)-磷酸二氢钾盐(KH₂PO₄)缓冲溶液是H₂O∶CH₃CN∶KH₂PO₄＝400ml∶600ml∶5g之比例调配。

如图1高效液相层析仪图谱所示，本发明之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)含有欧柏龙经(Oblongine，OBL)、塞卡诺宁(cyclanoline，CYC)、防己诺宁(Fangchinoline，FAN)、粉防己甲素(Tetrandrine，TETRA)四种显著成分，如图1(B)高效液相层析仪图谱所示，由其积分面积可换算出粉防己特殊成份抽提物(SPRST)中含有欧柏龙经(OBL)、塞卡诺宁(CYC)、防己诺宁(FAN)、粉防己甲素(TETRA)四种显著成分为总抽提物之5～20％w/w。高效液相层析仪图谱中四种显著成分之滞留时间(retention time)分别为欧柏龙经(OBL)10.11(分)、塞卡诺宁(CYC)11.71(分)、防己诺宁(FAN)26.69(分)、粉防己甲素(TETRA)32.69(分)。而粉防己特殊成份抽提物(SPRST)中并未含有马兜铃酸(aristolochic acid)，因为在本发明之高效液相层析仪操作条件中马兜铃酸之滞留时间(retention time)在62(分)以后(63.12分)，仪器灵敏度为2μg。图1(A)所示为单纯溶媒之高效液相层析仪图谱，显示在5至50分之滞留时间(retention time)内溶媒无峰谱出现；比较图1(A)至图1(C)之高效液相层析仪图谱，显示本发明之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)中并未含有马兜铃酸(aristolochic acid)，因本发明使用之粉防己正品在62(分)以后并未出现马兜铃酸。马兜铃酸为粉防己误用之马兜铃科植物已知的有毒成份，此分析结果除作为粉防己特殊成份抽提物(SPRST)之品质管制条件外，亦剔除马兜铃科植物参入粉防己正品之机会。

由于中药防己之类似植物颇多，本发明中粉防己是防己科藤本植物粉防己(Stephania tet randra S.Moore)之块根。而本发明之所谓粉防己特殊成份抽提物(SPRST)，经实验证实含有粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)、塞卡诺宁(CYC)、欧柏龙经(OBL)等四种生物碱，以及其他具有生理活性之有效成份。

粉防己特殊成份抽提物SPRST(只含1.35％粉防己甲素(TETRA)及0.7％防己诺宁)对G蛋白之抑制效果不下于其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)，因此推测有其它未知药效成份共同参予粉防己特殊成份抽提物(SPRST)的作用。由于粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)在药物合理浓度(1-10μg/ml)下即能有效抑制嗜中性球的发炎现象，因此粉防己特殊成份抽提物及其活性成份未来可应用于临床治疗或预防诸如嗜中性球早期不当活化所引发之相关发炎疾病。

1-10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)能有效的抑制弗贾安(fMLP，N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine)及白三烯素(LTB₄，leukotriene B₄)所诱发嗜中性白血球(PMN)之粘着(adhesion)及迁徒(transmigration)作用，并呈现有剂量反应关系(concentration-dependentresponse)。粉防己特殊成份抽提物(SPRST)所含有两个已知的药效成份；粉防己甲素(Tetrandrine；TETRA)及防己诺宁(Fangchinoline；FAN)，在1-10μg/ml相同剂量范围内亦具有类似粉防己特殊成份抽提物(SPRST)的效果。本发明证实粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)皆可以抑制弗贾安(fMLP)及白三烯素(LTB₄)所诱发的巨粘着分子(Mac-1)表现及活性自由基(ROS)的产生；巨粘着分子(Mac-1)表现受活性自由基(ROS)调控，而活性自由基(ROS)的产生源自于嗜中性白血球(PMN)细胞内恩菲氧化酶(NADPHoxidase)之活化，欲活化此酶则须维持细胞质适度碱化(alkalization)；粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)以及一种钙通道阻断剂(Verapamil)四者不仅都可以阻断弗贾安(fMLP)诱发的细胞内钙离子增加(calcium influx)，亦有效的抑制弗贾安(fMLP)造成之细胞质碱化现象，因此我们推测粉防己特殊成份抽提物(SPRST)等的作用可能与阻断钙离依存(calcium-dependent)的G蛋白径路有关；以G蛋白活化剂(AlF₄ ^-)直接活化G蛋白明显激发细胞质内钙离子增加及细胞粘着，而此二现象几乎完全被G蛋白抑制剂百日咳毒素(pertussis toxin；PTX)所逆转(reverse)；粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)亦可部分拮抗此二现象。综合这些结果可推测粉防己特殊成份抽提物(SPRST)保护心脏缺氧伤害的作用可归功于它抑制嗜中性白血球(PMN)粘着及迁徒的效果，此效果可能是粉防己特殊成份抽提物(SPRST)内所含的粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)及其它有效成份的共同作用成果。因为粉防己特殊成份抽提物(SPRST)只含1.3％之粉防己甲素(TETRA)及0.7％防己诺宁(FAN)，以相当于粉防己特殊成份抽提物(SPRST)含量之粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)剂量(0.1μg/ml)并不能达到粉防己特殊成份抽提物(SPRST)的相同效果。总而言之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)是一个具抗发炎作用的中药特殊抽提成份，它可经由抑制G蛋白调控的钙离子内流及活性自由基(ROS)之产生而防止嗜中性白血球(PMN)不会过度活化表现巨粘着分子(Mac-1)而达其抗炎及保护心脏缺氧伤害之作用。

下述从正常成人周边血液循环中分离出嗜中性白血球(PMN)，利用嗜中性白血球(PMN)之发炎反应来探讨粉防己特殊成份抽提物(SPRST)之药理活性。主要进行的各种活性测试为：(1)嗜中性球粘着(adhesion)；(2)嗜中性球迁徒(transmigration)；(3)嗜中性球表面巨粘着分子(Mac-1)之表现；(4)细胞毒性(cytotoxicity)评估。

粉防己特殊成份抽提物(SPRST)与其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)之细胞毒性分析

如图17所示，比较单独投予粉防己特殊成份抽提物(SPRST)或其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)及并用粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)所造成之嗜中性白血球之细胞毒性。结果显示粉防己特殊成份抽提物(SPRST)之细胞毒性远小于其活性成份粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)；以最高有效浓度(10μg/ml)而言其细胞毒性分别为：SPRST(0.64±0.14％)、TETRA(1.24±0.17％)、FAN(0.84±0.11％)；但并用TETRA及FAN毒性则高达1.5±0.23％。在无任何药物下之细胞自然死亡率为0.65±0.28％，显示即使在最高有效作用浓度下，SPRST比起TETRA、FAN及TETRA合并FAN并无显著之细胞毒性。

粉防己特殊成份抽提物及其活性成份粉防己甲素、防己诺宁抑制巨粘着分子(Mac-1)凭藉之嗜中性球粘着及迁徒现象

弗贾安(fMLP)及白三烯素(LTB₄)可以诱发嗜中性球巨粘着分子(Mac-1)大量表现，而粘着于纤维蛋白覆盖之表面(Everitt et al.，1996)。本发明发现嗜中性球经1μM弗贾安(fMLP)及0.1μM白三烯素(LTB₄)刺激过后，如图2、图3、图4、图5所示，其对纤维蛋白原之粘着量及迁徒量增加2-3倍之多，粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)对此二现象确实有抑制作用，且呈现剂量相关之反应关系。单独粉防己特殊成份抽提物及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)对此细胞自发性粘着值并不影响。细胞预处理这些药物后存活率仍大于95％，与未处理这些药物并无差异，因此这些药物在1-10μg/ml之剂量范围内对细胞并无毒性。(毒性试验见图17)。

为了解粉防己特殊成份抽提物对细胞粘着的抑制，是否经由抑制嗜中性白血球(PMN)表面巨粘着分子(Mac-1；CD11b/CD18)的表现。本发明进一步分析弗贾安(fMLP；图6)及白三烯素(LTB₄；图7)所诱发的巨粘着分子(Mac-1)增加现象会不会被本粉防己制剂所抑制。其是以PE-CD11b萤光抗体进行染色，用流式细胞仪于FL-2测得结果；巨粘着分子(Mac-1)的表现以平均萤光值(mean channel fluorescence；MCF)表示，控制组并不处以任何药物。结果如巨粘着分子(Mac-1)之图6、图7显示粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)对巨粘着分子(Mac-1)增加现象具有抑制作用，且由图6、7显示抑制作用随剂量增加而增加。

粉防己特殊成份抽提物内活性自由基(ROS)产生以及巨粘着分子(Mac-1)表现与细胞粘着之关系

已知嗜中性白血球(PMN)藉由表面所表现的之巨粘着分子(Mac-1；CD11b/CD18)进行粘着及迁徒，且此粘着分子之表现受自身释放的活性自由基(reactive oxygen species；ROS)所调控。因Fraticelli(1996)等学者亦认为包括超氧阴离子(O₂ ^·-)及过氧化氢(H₂O₂)所谓之活性自由基(ROS)会刺激巨粘着分子(Mac-1)的表现，进而促进嗜中性球的粘着。由于粉防己特殊成份抽提物(SPRST)之粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)，在相同剂量范围内，此两种成份亦具有类似粉防己特殊成份抽提物(SPRST)的效果，因此接着检验是否粉防己特殊成份抽提物(SPRST)可抑制巨粘着分子(Mac-1)表现、细胞的粘着、迁徒。同时以超氧岐化(superoxide dismutase；SOD)及过氧化氢(catalase)等活性自由基(ROS)清除剂做正对照组(positive control)检验是否透过抑制活性自由基(ROS)的产生而达成抑制巨粘着分子(Mac-1)表现以及细胞的粘着、迁徒。

本实验利用流式细胞分析法同步监测活性自由基(ROS)产生(ShenYC等人于1998年Europ J Pharmacol第343卷第79-86页报导)，此法以EB(ethydium bromide)萤光代表超氧阴离子(O₂ ^·-)的量，以DCF(2’，7’-dichlorofluorescein)萤光代表过氧化氢(H₂O₂)的量。结果活性自由基(ROS)在弗贾安(fMLP)或普罗芷(PMA)刺激后便立即迅速蓄积。如图8、图9所示弗贾安(fMLP)所诱发的EB及DCF萤光值约在20-40分钟达到最高点。如图10所示粉防己特殊成份抽提物及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)对活性自由基(ROS)产生现象确实有抑制作用，且呈现剂量相关之反应关系。而10μg/ml粉防己特殊成份抽提物，如图8、图0所示于第30分钟仍可效抑制此二种活性自由基(ROS)的产生；对照超氧岐化(SOD)及过氧化氢(catalase，CATS)，它们也显著抑制DCF(图8)及EB(图9)萤光的增加，同时也对弗贾安(fMLP)诱发的巨粘着分子(Mac-1)增加及细胞粘着都有明显抑制效果，并用超氧岐化(SOD)及过氧化氢(CATS)抑制效果则更好(本发明人Shen YC等人于1998年Europ J Pharmacol第343卷第79-86页报导)。

粉防己特殊成份抽提物对弗贾安(fMLP)诱发之细胞内酸碱值(pH)变化之影响

弗贾安(fMLP)可诱发嗜中性白血球细胞之活性自由基(ROS)产生乃是一种钙离子依赖性之反应，同时短暂升高细胞内酸碱值(pH)，以维持活性自由基(ROS)之制造酶恩菲氧化酶(NADPH oxidase)之活性。(恩菲氧化酶；NADPH oxidase，nicotinamide adenine dinucleotidephosphate oxidase)。

如图11所示弗贾安(fMLP)活性嗜中性球的同时，也快速且显著地升高细胞内酸碱值(pH)，并维持将近60分钟。如图11所示，粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)，以及钙离子通道阻断剂(verapamil)对此现象皆能有效抑制，暗示某种钙离子依赖性之讯息机制受到这些药物之影响。

粉防己特殊成份抽提物抑制粘着作用与细胞内钙离子变化及巨粘着分子(Mac-1)表现之关系

如图12、13所示，单独投予弗贾安(fMLP；图12)及白三烯素(LTB₄；图13)皆可激发细胞内钙离子大量增加。由于粉防己甲素(TETRS)是有效天然钙离子管道拮抗剂(Felix et al.，1992)，又细胞内钙离子的变化会参与调控巨粘着分子(Mac-1)凭藉之嗜中性球粘着作用(Lawson &Maxfield，1995)，因此进一步探讨粉防己特殊成份抽提物(SPRST)对钙离子变化和粘着现象是否相关。

预处理粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)，如图12、图13所示可以限制弗贾安(fMLP)所激发之嗜中性球细胞内钙离子([Ca⁺⁺]_i)骤增。显示粉防己特殊成份抽提物可以非选择性抑制弗贾安(fMLP)及白三烯素(LTB₄)所激发细胞内钙离子骤增，并呈现浓度相关效应关系，因而排除粉防己特殊成份抽提物作用于专一接受体(receptor)之可能性。

细胞内钙离子骤增主要是藉由接受体活化G蛋白(G-protein)之径路，如图14、图15所示单独投予G蛋白活化剂氟化铝阴离子(AlF₄ ^-)也会造成细胞内钙离子增加(图14)及细胞粘着(图15)，且可以被预处以120分钟G蛋白阻断剂500ng/ml之百日咳毒素(pertussis toxin；PTX)所逆转。细胞若预处理5-10μg/ml之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其活性成份粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)对此二现象亦能有效抑制且具有统计意义。

粉防己特殊成份抽提物(SPRST)有效的抑制弗贾安(fMLP，N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine)及白三烯素(LTB₄，leukotrieneB₄)所诱发嗜中性白血球(PMN)粘着(adhesion)及迁徒(transmigration)，并有剂量反应关系(concentration-dependent response)。粉防己特殊成份抽提物(SPRST)含有两个已知的药效成份：粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)，在相同剂量范围内，此两种成份亦具有类似粉防己特殊成份抽提物(SPRST)的效果。由于已知嗜中性白血球(PMN)表面所表现的巨粘着分子(Mac-1，CD11b/CD18)进行粘着及迁徒，且此粘着分子之表现受自身释放的活性自由基(reactive oxygen species；ROS)所调控。

本发明证实粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)皆可以抑制弗贾安(fMLP)及白三烯素(LTB₄)所诱发的巨粘着分子(Mac-1)表现与活性自由基(ROS)的产生；巨粘着分子(Mac-1)表现受活性自由基(ROS)调控，而活性自由基(ROS)的产生源自于嗜中性白血球(PMN)细胞内恩菲氧化酶(NADPH oxidase)之活化，欲活化恩菲氧化酶(NADPH oxidase)则须维持细胞质适度碱化(alkalization)。粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)以及一种钙通道阻断剂弗帕尔(Verapamil)四者不仅都可以阻断弗贾安(fMLP)诱发的细胞内钙离子增加(calcium influx)，亦有效的抑制弗贾安(fMLP)造成之细胞质碱化现象。

因此可推测粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其所含有之有效成份的作用可能与阻断钙离子依存(calcium-dependent)的G蛋白径路有关；以G蛋白活化剂(AlF₄ ^-)直接活化G蛋白明显激发细胞质内钙离子增加及细胞粘着，而此二现象几乎完全被G蛋白抑制剂百日咳毒素(pertussis toxin；PTX)所逆转(reverse)；粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)亦可部分拮抗此二现象。

综合上述结果可推测粉防己特殊成份抽提物(SPRST)保护心脏缺氧伤害的作用，是经由该特殊成份抽提物抑制嗜中性白血球(PMN)粘着及迁徒的效果；此效果可能是粉防己特殊成份抽提物(SPRST)内所含的粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)及其它有效成份的共同作用成果。因为以0.1μg/ml相对量的粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)模拟粉防己特殊成份抽提物(SPRST)内粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)之含量【SPRST含1.3％之粉防己甲素(TETRA)及0.7％之防己诺宁(FAN)】，并不能达到与粉防己特殊成份抽提物(SPRST)相同的效果。总结而言，粉防己特殊成份抽提物(SPRST)是一个具抗发炎作用的中药特殊抽提物成份，它可经由抑制G蛋白调控的钙离子内流及活性氧自由基的产生而防嗜中性白血球不会过度活化表现巨粘着分子(Mac-1)而达其抗发炎及保护心脏缺氧伤害之作用。

本发明欲探讨粉防己萃取液特殊成份抽提物(SPRST)具心脏保护之可能机制。首先假设粉防己特殊成份抽提物(SPRST)具保护缺血(氧)心脏伤害之功能，与其防止(或抑制)血中嗜中性白血球(polymorphonuclear neutrophil；PMN)活化而产生发炎反应有密切关系。因此本发明从正常成人周边血液循环中分离出嗜中性白血球(PMN)，利用嗜中性白血球(PMN)之发炎反应来探讨粉防己特殊成份抽提物(SPRST)之药理机制。

1-10μg/ml粉防己特殊成份抽提物(SPRST)有效的抑制弗贾安(fMLP)及白三烯素(LTB₄)所诱发嗜中性白血球(PMN)粘着(adhesion)及迁徒(transmigration)，并有剂量效应关系(concentration-dependentresponse)。

粉防己特殊成份抽提物(SPRST)含有两个已知的药效成份：粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)，在1-10μg/ml相同剂量范围内，粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)亦具有类似粉防己特殊成份抽提物(SPRST)的效果。

综上所述，本发明具备创造性、新颖性：(1)本发明可进一步充分利用粉防己之有效成份(2)并且比纯化出来的粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)在相同作用浓度下药效更显著且毒性更低(3)利用高效液相层析(HPLC)对粉防己特殊成份抽提物(SPRST)做快速化学组成之品质鉴别以确定本发明不含马兜铃科植物及其它防己科植物有毒成份(4)流式细胞分析(flow cytometry)之应用可从事快速有效之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)抗发炎生物活性之品质管制(5)本发明以化学成份及抗发炎生物活性之双向品质管制为确保粉防己特殊成份抽提物(SPRST)优良品质之先进科学方法。

本发明之组合物是以含有粉防己甲素(TETRA)、防己诺宁(FAN)及其它有效成份之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)，或是经由本发明制法所制备之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)为主成分，依照必要时添加各种赋形剂、载体、或稀释剂与制药上可容许酸之加成盐形成具有药效之组成物。该等制剂可为供口服给药、直肠投与之因体剂型、液体剂型，或非经肠道使用之注射剂型，或直接涂敷患处之软膏剂型。该等固体剂型是依习知之制剂方法于添加淀粉、羧酸甲基纤维素纳之类崩散剂，乙醇、甘油等类粘合剂，或硬脂酸镁、乳糖而制成锭剂或充填于胶囊或制成栓剂之类固体制剂。使用权用本发明组合物之水溶液、盐溶液以磷酸盐类缓冲液调整酸碱度使其pH值达适当程度，而于添加助剂、乳化剂制成注射剂或其它液剂。本发明组合物或制药上可容许酸之加成盐混和各种基剂依习知之制剂方法亦可制成软膏剂型。以本发明之组合物为主成分所制备之药学组合物可运用于哺乳类动物产生主成分之药效，一般投药剂量可随症状需要调配，通常为每人每次50～300mg，每天3次。

            粉防己特殊成份抽提物的制取实施例

实施例1

100g经粉碎之粉防己，浸泡于1500ml之95％乙醇(EtOH)溶液于80℃进行萃取，每次5小时，共5次。取40ml每次萃取所得之萃取液作为分析液，将各次之其余萃取液减压浓缩再进行萃取。

实施例2

100g经粉碎之粉防己，浸泡于1500ml之二氯甲烷(CH₂Cl₂)溶液于80℃进行萃取，每次5小时，共5次。取40ml每次萃取所得之萃取液以95％乙醇(EtOH)进行萃取，将各次之其余萃取液减压浓缩再进行萃取后之溶液作为分析液。

实施例3

100g经粉碎之粉防己，浸泡于1500ml之95％乙醇(EtOH)溶液于80℃进行萃取，5小时将萃取液减压浓缩。

实施例4

100g经粉碎之粉防己，浸泡于1500ml之95％乙醇(EtOH)溶液于80℃进行萃取，每次5小时，共5次。取40ml每次萃取所得之萃取液作为分析液，将各次之其余萃取液减压浓缩再以甲醇(MeOH)进行萃取。

实施例5

药品先溶在0.1N HCl溶液中制成10mM的贮备溶液

本发明之粉防己特殊成份抽提物(SPRST)，及其所含的粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)，是由粉防己(Stephania tetrandra S.Moor)之块根运用本发明之抽提方法制备。药品先溶在0.1N HCl溶液中制成10mM的贮备溶液

SPRST/H₂O/EtOH表示粉防己特殊成份抽提物是经过水(H₂O)萃取后之药材再以乙醇(EtOH)萃取后干燥所得产物，其它以此类推。

实施例6

应用Hitachi Model L-7100高效液相层析仪，采用cosmosil5C18-AR-II，4.6×250mm之C₁₈逆向层析管柱，移动相为乙晴(CH₃CN)-磷酸二氢盐(KH₂PO₄)缓冲溶液，利用线性梯度冲提，检测波长为280nm；以上述四种成分作为外插标准；在45分钟内四种成分可完全分离，其定量线性回归方程式及相关系数之浓度在12.5～1637μg/ml范围间，检测极限依S/N＝3规例计算，四种标准品粉防己甲素(TETRA；tetrandrine)、防己诺宁(FAN；fangchinoline)、塞卡诺宁(CYC；cyclanoline)、欧柏龙经(OBL；oblongine)分别为0.95，0.95，0.95及1.69μg/ml。

A＝KH₂PO₄-H₂O(5g∶1000ml)

B＝H₂O-CH₃CN-KH₂PO₄(400ml∶600ml∶5g)

实施例7

组合物之锭剂剂型

组 合 物                            50mg

乳    糖                            30mg

淀    粉                            4mg

硬脂酸镁                            6mg

玉 米 粉                            10mg

依照上述处方可制得含有组合物之锭剂剂型。

          嗜中性球(neutrophil；PMN)的制备

从健康成人志愿者采集静脉血液，以肝素(heparin)(20unit/ml)当抗凝血剂。采用分克(Ficoll)梯度离心法分离嗜中性球，离心后以低张溶液把残留的红血球涨破去除(Boyum于1974年Tissue Antigens第4卷第269-274页报导)。简述如下：于50ml离心管混合等体积之血液及3％dextran，室温中静置20-30分钟待大部分红血球沉降后，小心收集上层富含白血球之血浆在4℃，250×g离心15分钟，收集细胞沉淀物打散以磷酸缓冲液生理食盐水(PBS，phosphate buffered saline)重新悬浮(约8ml)。把此细胞悬浮液轻轻注入事先装有6ml、密度为1.077g/ml之分克(Ficoll)溶液(Histopaque 1077，Sigma)上层，注意此二层溶液不能稍有混杂，以免后续白血球分离不完全。再于20℃，400×g连续离心40分钟，去除上层所有液体，所留下之细胞沉淀物便是嗜中性白血球，参杂些许红血球。打散细胞沉淀物以6ml的0.2％氯化钠(NaCl)加以悬浮30秒，迅速加入6ml的1.8％氯化钠(NaCl)使溶液回复等张，此时红血球几乎完全涨碎，再于20℃，120×g离心3分钟，所得细胞沉淀物以磷酸缓冲液生理食盐水(PBS，phosphate buffered saline)清洗一次，最后取1-2万颗细胞用细胞标本离心制片机(cytospin)打片，经金莎(Giemsa)溶液染色，在显微镜下观察细胞形态，做细胞纯度检验，几乎完全是多核的嗜中性球(PMNs)，纯度一般大于95％。经制备好之嗜中性球最后悬浮于翰克平衡液(Hank’s balanced salt solution；HBSS)溶液中备用，一般细胞浓度调整为1-2×10⁶/ml。以下所有实验除特别说明外，药物与细胞悬浮液反应的体积比为1∶100(10μl in 1.0ml)。

             嗜中性球粘着(adhesion)之测定

以弗贾安(fMLP)或白三烯素(LTB₄)活化嗜中性球之粘着并测定如下：先用磷酸缓冲液生理食盐水(phosophate buffered saline；PBS)调配成50μg/ml浓度之250μl纤维蛋白原(fibrinogen)置入24孔组织培养盘中，于室温中约培置两小时后使纤维蛋白原覆盖于盘面，吸除上层多余液体以翰克平衡液(HBSS)清洗一次，用1％牛血清蛋白(bovine serumalbumin；BSA)做盘面隔断(blocking)处理，以免细胞与盘面产生非选择性粘着。经隔断(blocking)一小时后以含0.1％非离子活性剂-20(tween-20)之翰克平衡液(HBSS)清洗二次，不含非离子活性剂-20(tween-20)之翰克平衡液(HBSS)清洗一次，如此便完成培养盘之前处理。

制备好嗜中性球悬浮液1.0ml(5×10⁵/ml)轻轻加入培养盘中，预先和粉防己特殊成份抽提物(SPRST)等药物(最终浓度1-10μg/ml)，于37℃培养10分钟，再与1μM弗贾安(fMLP)或0.1μM白三烯素(LTB₄)于37℃反应15分钟。将未粘着细胞完全吸除，并轻轻以500μl温磷酸缓冲液生理食盐水(PBS，phosphate buffered saline)(含1mM Ca²⁺)清洗两次。粘着在盘面的细胞用0.25％之细胞膜之染剂(rose bengal)(Jenget al.，1996)溶液于室温中染色10分钟。吸除多余的染色液，盘面以磷酸缓冲液生理食盐水(PBS)清洗两次，最后用250μl之50％乙醇溶液于37℃培养30分钟去溶解吸附于细胞膜之染剂(rose bengal)，待所有染剂已完全溶出后，取200μl于96孔盘中以微盘分析仪(micro-platereader(EL311sx))于波长570nm测定溶液OD值，扣除溶液背景吸光值即为测定值，最后以OD₅₇₀×100当成细胞粘着程度之量化指标。或嗜中性球先以双羧醯荧光素(BCECF-AM)萤光剂标示，于实验结束时以萤光侦读机(Cytofluor 2300，Millipore R)设定激发光485nm萤光530nm读取粘着在盘面的细胞萤光强度(BCECF)代表粘着的细胞量。

          嗜中性球迁徒(transmigration)之测定

修改Krull M等人于1999年J Immunol第162卷第4834-4841页报导测量嗜中性球迁徒的方法；先把直径6.5mm宽为5μm孔径之迁徒盘(Transwell；Corning Costar，USA)内垫片(insert)衬上一层人类纤维蛋白原(fibrinogen；20μg/ml，100μl)以做为嗜中性球粘着之基础。实验进行前先把嗜中性球以BCECF-AN(2’，7’-bis-(2-carboxyethyl)-5，6-earboxyfluorescein acetoxymethyl ester)萤光剂标示，然后再与试验药品粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、防己诺宁(FAN)、粉防己甲素(TETRA)于37℃先作10分钟后，取100μl置入迁徒盘上层内垫片内，并于下层加入发炎诱导物质1.0μM弗贾安(fMLP)或0.1μM白三烯素(LTB₄)，在37℃培养箱中培养60分钟，最后嗜中性球会因发炎物质之诱导而迁徒进入下层，其数量可以萤光强度(BCECF)来定量，以萤光侦读机(cytofluor2300，Millipore R)设定激发光485nm萤光530nm读取萤光强度。

嗜中性球表面巨粘着分子(adhesion molecule)Mac-1表现之测量

Mac-1的表现是采Endemann等学者(Endemann等于1996年JPharmacol Exp Ther第276卷第5-12页报导)的方法略微修改后加以应用。经试验药品粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、防己诺宁(FAN)及粉防己甲素(TETRA)处理过之嗜中性球细胞悬浮液以100ng/ml普罗芷(PMA)、1μM弗贾安(fMLP)或0.1μM白三烯素(LTB₄)作用20-40分钟，离心取细胞沉淀(pellet)，重新悬浮于1ml冰的并含有10％经热去活化之胎牛血清及10mM sodium axide(NaN₃)磷酸缓冲液生理食盐水(PBS，phosphate buffered saline)中。以下进行巨粘着分子(Mac-1)之萤光染色所有步骤完全在冰上进行。把上述细胞悬浮液与巨粘着分子(Mac-1)初级抗体(mouse anti-human CD11b，IgG₁；Pharmingen)培养60分钟，或是以非专一性抗体(IgG₁，Sigma)取代巨粘着分子(Mac-1)初级抗体做抗体背景值对照用，以冰磷酸缓冲液生理食盐水(PBS)-FCS-azide清洗两次，带有巨粘着分子(Mac-1)初级抗体之细胞再与FITC萤光标示之二级抗体(goat anti-mouse，IgG)避光作用30分钟。用含5％胎牛血清之磷酸缓冲液生理食盐水(PBS，phosphate bufferedsaline)清洗二次。最后细胞悬浮于1％之para-formaldehyde流式细胞专用缓冲液(sheath fluid)中，用流式细胞仪(FACSort；Becton Dickinson)分析细胞巨粘着分子(Mac-1)之表现量。数据是以测得之萤光值(meanchannel fluorescence)代表巨粘着分子(Mac-1)含量，并在Cell Quest^软件辅助下计算。

细胞内活性氧自由基(ROS)包括超氧阴离子(O₂ ^·-)及过氧化氢(H₂O₂)含量测定

根据Robinson等学者(Robinson等于1994年Flow Cytometry第437-442页报导)所发表以流式细胞分析法进行细胞内活性氧(包括超氧阴离子(O₂ ^·-)及过氧化氢(H₂O₂)的测定。取1.5ml细胞悬浮液(2×10⁶/ml)与1.5μl之20mM双氯荧光酯(DCFH-DA)(2’，7’-dichlorofluorescin diacetate；Molecular Probe)于37℃温浴10分钟，或是加入1.5μl之10mM氢菲喃双胺(HE)(hydroethidium；MolecularProbe)温浴10分钟。氢菲喃双胺(HE)本身可直接进入细胞，当被超氧离子氧化形成溴菲喃双胺(EB)(ethidium bromide)时会嵌入DNA，可于波长590nm(FL2)侦测到萤光。经上述双氯荧光酯(DCFH-DA)及氢菲喃双胺(HE)标示过之细胞，以试验药品粉防己特殊成份抽提物(SPRST)、防己诺宁(FAN)、粉防己甲素(TETRA)预处理10分钟，再经弗贾安(fMLP)、白三烯素(LTB₄)或普罗芷(PMA)激发而产生大量过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O₂ ^·-)，藉由上述反应产生双氯荧光素(DCF)(2’，7’-dichlorofluorescein)及溴菲喃双胺(EB)(ethidiumbromide)萤光，并监测萤光强度之变化反推过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O₂ ^·-)的相对含量，以流式细胞仪侦测之萤光值表示。

        粉防己特殊成份抽提物的制备及反应之进行

粉防己特殊成份抽提物(SPRST)及其所含的粉防己甲素(TETRA)及防己诺宁(FAN)先溶在0.1N HCl溶液中制成10mM的贮备溶液(stocksolution)，临实验前再以磷酸缓冲液生理食盐水(PBS，phosphate bufferedsaline)溶液做系列稀释成1.0μM-0.1mM。对于G蛋白之研究，细胞先以500ng/ml之G蛋白抑制剂百日咳毒素(pertussis toxin；PTX)37℃温浴120分钟，再加入G蛋白刺激剂AlF₄ ^-(10mM NaF加10μM AlCl₃)或其他刺激剂。

              细胞内钙离子浓度变化的测定

人类嗜中性球悬浮液先与5μM之苄基呋喃2(Fura-2/AM)(MolecularProbes，USA)于37℃温浴45分钟；因苄基呋喃2(Fura-2/AM)为酯化物非常容易进入细胞，当被酸解酶水解成苄基呋喃2(Fura-2/AM)后失去脂溶性，便无法再穿透任何胞器或细胞膜而蓄积在细胞质内。温浴后以无钙之翰克平衡液(HBSS；Hank’s balanced saline solution)清洗二次，再以含钙(2mM)之翰克平衡液(HBSS)重新悬浮，并调整细胞数目为1×10⁷/ml，取此细胞悬浮液2ml置入四面透光之样杯中(cuvettes；Sarsted，Germany)，移入配备避光、恒温、及自动搅拌装置之萤光侦读机(Hitachi F-4500；Hitachi Instruments，CA)回温5分钟。随后加入待测药物培置10分钟，再加入刺激剂AlF₄ ^-(10mM NaF加10μM AlCl₃)或A23187(1μM)或泰丕真(thapsigargin)(1μM)或弗贾安(fMLP)(1μM)以激发细胞内Ca²⁺的释放。苄基呋喃2(Fura-2/AM)本身与细胞内释放出的Ca²⁺结合于适当波长激发下产生萤光，以萤光侦读机记录萤光变化。侦读机在测定萤光时可自光源几乎同时连续发出波长340nm(E₃₄₀)及380nm(E₃₈₀)之激发光，于波长510nm(Em₅₁₀)每0.2秒记录一次萤光。用F-4500软件自动将连续记录所得之萤光强度换算成比值(R)，并根据Grynkiewicz等人(1985)导出的公式，自动计算细胞内Ca²⁺的真实浓度，公式如下：

[Ca²⁺]_I＝K_d(R-R_min)(S_f380)/(R_max-R)(S_b380)

K_d为224nM，即苄基呋喃2(Fura-2/AM)于37℃之解离常数。

R为检品于E₃₄₀及E₃₈₀激发光下之萤光强度比值。

R_max为加入0.2％毛地黄苷(digitonin)溶解细胞膜使苄基呋喃2(Fura-2/AM)与溶液中所有钙离子结合所测得的萤光强度比值。

R_min为加入25mM乙烯甘醇双胺四乙酸(EGTA)去除所有溶液中钙离子后苄基呋喃2(Fura-2/AM)成自由态时测得之萤光强度比值。

S_f380为E₃₈₀激发自由态苄基呋喃2(Fura-2/AM)产生之萤光强度常数。

S_b380为E₃₈₀激发结合态苄基呋喃2(Fura-2/AM)产生之萤光强度常数。

             细胞内酸碱值(pH)之测定

我们修改Boyer & Hedly(于1994年Flow Cytometry第135-148页报导)之方法如下：细胞先以双羧醯荧光酯(BCECF-AM)(2μg/ml)标示(37℃温浴30分钟)，后以磷酸缓冲液生理食盐水(PBS，phosphatebuffered saline)清洗多余之双羧醯荧光酯(BCECF-AM)，然后调整细胞浓度为1×10⁶cells/ml。细胞先处理药物10分钟再加入弗贾安(fMLP)(1μM)于二氧化碳培养箱中恒温(37℃)培养。以流式细胞仪于不同时间监测细胞质萤光之变化。为了测得细胞内之酸碱值(pH)，采用萤光强度比值(ratio)来换算细胞内之酸碱值(pH)。双羧醯荧光素(BCECF)在波长525-535nm的萤光强度与细胞内之酸碱值(pH)正相关，即萤光载强pH值越高，故以波长525nm所测萤光值除以于波长640nm所测得之萤光值(与酸碱值(pH)不相关的萤光值)可得一比值(R)，此R值可以避免实验照光线照射、细胞厚薄不均、仪器不稳定及载入萤光剂浓度不均匀之干扰。另外须以高钾缓冲液制备壹组酸值(pH)值高低(6.8-7.8)不等的缓冲液以取代磷酸缓冲液生理食盐水(PBS，phosphatebuffered saline)为细胞实验缓冲液，以制作检量线，原理如下：当细胞悬浮于不同酸碱值(pH)值缓冲液平衡之时加入尼期辛(nigericin)(一种H⁺/K⁺离子孔道剂)3分钟，此时尼期辛(nigericin)会使得细胞内外K⁺及H⁺离子浓度比值相等，即[K⁺]_内/[K⁺]_外等于[H⁺]_内/[H⁺]_外。因此当即[K⁺]_内＝[K⁺]_外时，[H⁺]_内会等于[H⁺]_外，因此只要测得缓冲液之酸碱值(pH)(Y值)而此时的细胞内对应之细胞于525nm之萤光强度(X值)即为细胞内酸碱值(pH)值之对应值，如此于酸碱值(pH)6.5-7.8测得系列缓冲液所得之对应系列萤光值，即可求得一条酸碱值(pH)对应萤光值之检量线(Y＝aX+b)

                     细胞毒性评估

选择有效药物作用浓度(1-10μg/ml)，于每次实验完成时以锥虫蓝染料(trypan blue)溶液染着死细胞(无法排出染料)，在显微镜下计数死细胞数目(染着蓝色者)，与未染着蓝色者(活细胞)合并计算死亡率为细胞毒性评估之方法。

                       统计分析

实验数据以测量之平均值±平均值标准误差(mean±S.E.M.)表示。根据实验需要分别以单或双因子变异数分析(AVOVA)来检验数据的统计意义。当变异数分析有意义时，以达纳事后检定(post-hoc Dunnett’stest)比较与控制组之间的平均值是否有差异，以P＜0.05视为统计意义之差异。浓度-反应效应(concentration-dependency)关系是以浓度—反应之线性回归斜率对零做Student’s t-test，以P＜0.05视为有统计意义之差异。

Claims (3)

1、一种粉防己特殊成份抽提物，其包括有：粉防己甲素、防诺己宁、塞卡诺宁、欧柏龙经四种生物碱。

2、如权利要求1所述的一种粉防己特殊成份抽提物在制备抗发炎药品中的应用。

3、如权利要求1所述的一种粉防己特殊成份抽提物在制备防止心脏缺氧伤害药品中的应用。

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