CN1199544A - 一种用于植物组织细胞培养的接种方法及其专用装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物组织细胞培养接种方法及专用装置。该装置采用反应器内设置多层塔板,板间以软联结件相连,接种口位于反应器侧壁的下部;反应器顶部有一个或若干培养基输送口,底部有气体分布器;反应器外部的输送装置与输送口和培养基连通,在培养、反应过程中起输送培养基的作用。接种时,在无菌条件下逐层提升塔板,逐层接种;本发明适用于植物的组织细胞培养、固定化酶、固定化细胞反应等生化过程。使固定床反应器多层化,充分利用空间;接种操作大大简化,接种均匀,并达到无菌。

Description

一种用于植物组织细胞培养的接种方法及其专用装置

本发明涉及植物组织细胞培养的接种方法及专用装置。

固定床生物反应器最初是应用于以固定化酶或固定化细胞为生物催化剂进行酶促反应的生物反应装置。近年来，随着植物组织培养技术的发展，新型培养反应器的设计越来越重要。根据植物组织培养的经验，在很多情况下固定化的培养方式有利于植物材料的生长、发育。因此固定床式反应器在做为植物组织培养装置愈来愈被人们采用。

传统的植物组织培养方法是：在摇瓶内或小型容器中，用浅层液体培养基浸没培养材料或将材料放在固体培养基上固定培养。这种方法的繁琐操作和低效率，不利于植物组织培养技术的更快发展。因此，许多研究人员开始在新型反应器的设计进行研究，并取得了一些成果。曾有报道，将搅拌式反应器用于植物组织如胚状体的培养上，如参考文献“生物反应器生产胡萝卜体细胞胚”《应用微生物学和生物工艺学》(Production ofcarrot somatic embryos in a bioreactor.Applied Microbiology andBiotechnology 1993，39：465-470.)所描述。根据植物组织细胞的特点设计的新型反应器更是种类繁多，如转鼓式、悬杆搅拌式、喷淋、雾化、径向流等类型的反应器。转鼓式和悬杆搅拌式反应器是采用液体浸没和机械搅拌的培养方式。在结构上，转鼓式反应器自身有一水平轴，通过反应器壳体绕轴的转动实现搅拌，又如文献2“胡萝卜发根在各种生物反应器中生长特性的比较”《应用微生物学和生物工艺学》1989，32：291-294(Comparison of growth properties of carrot hairy root in variousbioreactors.Applied Microbiology and Biotechnology 1989，32：291-294)有所报道。而悬杆搅拌式反应器是对搅拌桨进行了改造，静止状态下，搅拌杆垂直悬挂在反应器内；搅拌时，由于搅拌杆与转轴之间是柔性连接，所以可以形成一定的摆幅，起到搅拌作用，这些在文献3“生物反应器中胡椒体细胞胚的发生”《应用微生物学和生物工艺学》1996，46：327-333中报道过。这两种反应器的剪切力较小，改善了培养的效果。滴淋床、雾化床和径向流反应器都是采用固定化的培养方式，属于固定床，培养不需要搅拌。在培养基的输送方式上，滴淋床是将培养基经喷嘴或分布器变成液滴，滴到植物组织上；雾化床是采用机械的或超声波雾化装置将培养基变成营养雾弥漫至整个培养空间；径向流反应器则是利用泵将培养基提升到反应器顶部，然后培养基流经逐层塔板为植物组织提供营养。由于植物在天然条件下是固定生长的，许多植物组织在生长发育上有极性效应，固定化的培养条件更为有利，因此固定床的研究受到重视。在植物组织培养最为活跃的领域之一的发状根培养上，对各种固定床都作了深入的研究，包括滴淋床在“小型植物根培养生物反应器内的接种和组织分布”《生物工艺学技术》(Biotechnology Techniques)1994，8：639-544)、雾化床等，“在雾化生物反应器中转化根的生长”《应用微生物学和生物工艺学》1992，37：457-462；“用于发根农杆菌转化根生长的新兴生物反应器”《酶学和微生物学技术》(Enzyme and MicrobiologicalTechnology)1992，14：13-17中研究结果显示了这一类反应器较好的性能。

在植物组织培养中最大的问题是容易染菌，因此对操作和环境都要求很高。传统的固定化酶和固定化细胞反应器由于其操作粗放、填料密度大，不适合植物组织培养。由于植物的生长速度较慢(低于微生物)，代谢速率低，底物利用率较差，为了在规模较大的反应器内能充分利用空间，和促进营养物质的运输、传递，最佳的方案是采用多层塔板，将植物材料均匀放在每一层塔板上。塔板的形式根据实际需要可以多种多样；同时，为了提高底物利用率，培养基可以循环使用。这种多层塔板和液体可循环的设计也可以用于固定化酶和固定化细胞反应器，随着固定化酶和固定化细胞技术的发展，对固定床生物反应器的结构、填料技术也要更新。以下文中将植物细胞培养反应器的材料接种和固定化酶、固定化细胞固定床反应器的填料统一称为接种。

本发明的目的之一在于克服多层塔板式反应器内的空间分隔，给直接接种造成的空间障碍；(由于植物组织材料自身的一些特点，如体积较大、流动性差、分散不易均匀、容易感染微生物等)，本发明的目的之二是为了能够使植物培养材料均匀地接种到每一层塔板上，并保证操作无微生物污染；此外也为了大大降低劳动强度和提高效率。从而，提供了一种植物培养的接种方法和它的专用装置。

本发明的任务是这样实现的：本发明提供的专用装置为多层塔板式固定床生物反应器，它包括：反应器壳体1、塔板2、软联结件3、输送头4、气体分布器5、接种口6、排气口和滤膜7、输送装置8、管道9、材料或填料10、接种液或培养基或反应液11。(见图1)其组成为：

1.反应器接种口位于反应器的侧壁上靠下的部位，并密封。接种口的大小、形状可以根据需要进行设计。

2.反应器内设置多层塔板，塔板可以是各种形式，包括网、板、筛板、盘等，也可以是支持、固定其它塔板的框架。塔板与塔板之间以软联结方式相连。所谓软联结可以是链环、钩子软丝等任何柔软而结实的联结型式。

3.接种前塔板叠落于反应器底部时，第一层塔板应低于接种口下缘；而当塔板全部展开时，各层塔板在反应器内沿轴向等距离或按实际需要分布，塔板间距依照不同植物培养材料的需要或固定化酶、固定化细胞反应填料的要求而有所不同。使塔板展开和落下的牵引方式可以是机械的或电磁的等任何方式。

4.反应器顶部有一个或若干个(根据需要)培养基或营养液输送头。培养基的供应可以以液态、雾态等任何形式。

5.反应器底部有一气体分布器，浸没在液体内，作用是在接种过程中使液体震荡搅拌，并在培养过程中供气。

6.反应器外有培养基或反应液输送装置，该装置可以是各种型式。它一端与反应器底部相连，接通培养基，另一端与反应器顶部输送头连通。

    本发明的植物组织细胞培养的接种方法是在本发明的专有装置—

多层塔板式固定床生物反应器内进行，反应器如图1所示。其步骤如

下：

1.接种前，把接种液充满在固定床生物反应器的下部11内，接种液液面要低于接种口下缘，再把所有塔板叠落于反应器底部，并浸没于接种液液面以下，接种液可以是无菌蒸馏水，也可以直接用培养基或反应液。

2.将反应器整个放在无菌环境里，或只将接种口插入无菌操作室内，打开接种口。

3.将植物组织材料(块或段)或固定化酶、固定化细胞反应填料由接种口放入反应器，悬浮于接种液内，然后通气振荡混匀。(图2a)

4.提升第一层塔板，提出液面，植物材料或反应填料尽落于塔板上。此时第一层塔板高于接种口，而第二层塔板仍在液面以下。(图2b)

5.重复3的操作，然后继续提升第一层塔板，带动第二层塔板，将其提出液面。照此依次操作，将所有塔板都接满植物材料或反应填料。(图2c，d，e)

6.密封接种口。如果原接种液是无菌蒸馏水，则换为培养基或反应液，然后进行培养或反应。即在培养、反应过程中，培养基或反应液可以循环反复使用。(图2f)

7.培养或反应结束后，如果需要无菌条件下取出培养材料或反应填料，可以重复2的操作，并按照类似接种时的方法，逐层放下塔板，使每层塔板依次经过接种口，在无菌条件下逐层取出培养材料或反应填料。

本发明的优点在于：可以实现在固定床生物反应器内逐层接入植物材料或反应填料，材料在每一层塔板上都能均匀分布，而且整个接种过程可以在无菌条件下进行。该方法适用于植物的组织细胞培养、固定化酶、固定化细胞等培养和反应过程；在反应器型式上适用于培养基和反应液的雾化、喷淋、滴流、径向流、溢流床等类型的生物反应器。此外，如果需要无菌取出材料，也可以实现逐层取材，并保证无菌。从过程的效率和劳动强度来看，它显著优于传统的植物组织培养方法，大大简化了操作过程、提高了效率、降低了劳动强度。同时，也为无菌要求较高或有其它要求的固定化酶、固定化细胞多层塔板式固定床反应器的接种提供了方法。

下面结合附图及实施例对本发明进行详细地说明：

图1是本发明多层塔板式固定床反生物应器结构示意图。

图2是本发明的植物细胞培养材料接种方法工艺流程图。图面说明如下：

1反应器壳体、2塔板、3软联结件、4输送头、5气体分布器、6接种口、7排气口和滤膜、8输送装置、9管道、10、材料或填料、11接种液或培养基或反应液。图中的虚线表示根据需要增加的输送头和管路，可以是若干个。

实施例1：

按图1制做一台具有3个输送头(4)，接种液(11)用蒸馏水充满在反应器底部。采用反应器壳体外形尺寸为高25cm×直径20cm的反应器，内设四层不锈钢丝网为塔板(2)，塔板(2)之间以软丝做软联结件3相连。牵引的方法为：转轴联接在软丝软联结件(3)用转轴转动收起软丝，软丝带动钢丝网，可逐层提升。使用的接种材料(10)有蔬菜茎的切段、柑桔皮的切块和马铃薯无菌组培苗的切段从接种口(6)送入反应器内浮在接种液面上。第一层塔板(2)浸在接种液(11)中后，通过气体分布器(5)向反应器内通入氧气，接种液(11)为蒸馏水，按上述程序重复3次即全部接种完备。结果表明：不管是亲水性的材料(如蔬菜茎的切段)还是疏水性的材料(如柑桔皮的切块)，使用该技术都能达到均匀接种。在用马铃薯无菌组培苗所作的实验中，接种也达到了要求，而且在培养基雾化培养过程中没有污染发生，生长良好。

实施例2：

按图1制做一台具有8层塔板(2)为支持框架，塔板(2)之间软联接件(3)用链联结另外有可移动的接种网，可以取出反应器。其它结构与方案1类似。接种前，各层支持塔板叠落于反应器底部。将反应器整个放在无菌环境里，或只将接种口插入无菌操作室内，打开接种口；无菌条件下将接种网送入反应器，放置在第一层支持塔板上，然后接种；提升第一层塔板，使其高于接种口，而第二层支持塔板仍在适于摆放活动塔板的位置；重复前面的操作并继续提升第一层塔板，带动第二层塔板，将其提起。照此依次操作，将所有塔板都放满植物材料或反应填料。以下操作与接种方法中的描述类似。用植物材料实验，没有发生微生物污染。

Claims (4)

1.一种专用于植物组织细胞培养的多层塔板式固定床生物反应器，包括：反应器壳体、输送头、输送装置、管道组成，其特征在于：还包括在反应器壳体内放多层塔板，塔板间采用软联接件联结，反应器侧下方开有一接种口，并在接种口以下充满接种液或培养液或反应液，反应器壳体底部有一气体分布器，它与壳体外的气体源通过管道联接通，输送装置的管道一头与反应器底部接通，另一端与固定在反应器顶部的多个输送头相连，反应器顶部开有一排气口，排气口上装有泸膜。

2.按权利要求1所述的多层塔板式固定床生物反应器，其特征在于：所述的软联接件包括：链环、钩子、软丝。

3.按权利要求1所述的多层塔板式固定床生物反应器，其特征在于：塔板包括：网、板、筛板、盘、框架。

4.一种用权利要求1所述的多层塔板式固定床生物反应器进行植物组织细胞培养的接种方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)接种前，把接种液充满在固定床生物反应器的下部11内，接种液液面要低于接种口下缘，再把所有塔板叠落于反应器底部，并浸没于接种液液面以下，接种液可以是无菌蒸馏水，或直接用培养基或反应液；

(2)将反应器整个放在无菌环境里，或只将接种口插入无菌操作室内，打开接种口；

(3)将植物组织材料(块或段)或固定化酶、固定化细胞反应填料由接种口放入反应器，悬浮于接种液内，然后通过气体分布器向反应器内通气振荡混匀；

(4)提升第一层塔板，提出液面，植物材料或反应填料尽落于塔板上。此时第一层塔板高于接种口，而第二层塔板仍在液面以下；

(5)重复(3)的操作，然后继续提升第一层塔板，带动第二层塔板将其提出液面，照此依次操作(N层塔板-1等于需重复操作的次数)，将所有塔板都接满植物材料或反应填料；

(6)原接种液是无菌蒸馏水，则换为培养基或反应液，然后进行培养或反应；

(7)培养或反应结束后，需要无菌条件下取出培养材料或反应填料，可以重复(2)的操作，并按照类似接种时的方法，逐层放下塔板，使每层塔板依次经过接种口，在无菌条件下逐层取出培养材料或反应填料。

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