CN1192112C - 突变的单纯疱疹病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

一种单纯疱疹病毒(HSV)，其包括：(i)一段插入到HSV必需基因内的HSV LAT序列；以及(ii)在该HSV株系的内源性LAT区域内的缺失。本发明中的HSV可被用于治疗哺乳动物神经系统的紊乱或损伤。

Description

突变的单纯疱疹病毒及其用途

发明领域

本发明涉及突变的单纯疱疹病毒，其包括插入到必需基因内的HSV潜伏性相关转录(LAT)区域元件，和内源性LAT区域的对应序列内的缺失。本发明也涉及这种突变的单纯疱疹病毒在基因治疗和分析基因功能的方法上的应用。

发明背景

单纯疱疹病毒(HSV)常常被建议作为一种合适的神经系统载体，因为它是神经营养的，而且能够在细胞的终生停留在神经元内。然而野生型的HSV是高度病原性的，因此必须，像大多数病毒载体一样—以某种方式被失活。HSV的病原性影响是由于病毒的裂解性感染，因此将HSV作为一种载体使用需要开发携有突变的菌株，其破坏裂解周期，同时允许建立无症状的潜伏感染。

单纯疱疹病毒(HSV)经常被建议作为神经和非神经来源细胞的一种基因传递载体。HSV可能尤其适用于神经系统的基因传递，因为它可以天然地在这些细胞中处于一种终生潜伏状态，因此如果潜在性治疗基因的表达可以在潜伏期自始至终被维持的话，它则提供了达到终生治疗效果的可能性。由于HSV的基因组长度大，大片段DNA可以插入到基因组中，同时允许多个基因的表达，这对于特定疾病的治疗可能是重要的。然而，在这些优点可以被开发之前，该病毒需要被失活以阻止复制和降低细胞毒性，并且需要开发允许插入基因在潜伏期表达的启动子系统。

为了构造一种HSV载体菌株，可以将必需和非必需基因的组合从基因组中剔除，以使该病毒为非病原性和最低细胞毒性。载体病毒的构造通常是通过缺失一个或另一个或两个必需的即早期基因ICP4和ICP27。这些病毒需要在表达缺失基因的细胞系上生长。可以进行进一步的缺失以降低细胞毒性。为了产生允许基因在潜伏期表达的病毒，所设计的启动子必须允许基因在该时期内继续表达，这已经被证明是在HSV载体开发领域中的一个重要挑战。然而，我们和其他研究人员已经发现许多不同的，各自掺入HSV潜伏性相关转录(LAT)区域的不同元件的启动子系统，其在潜伏期确实存在不同效率水平的基因表达。这些使用一个或另一个LAT启动子(LAP1或LAP2；Goins等，1994)在潜伏期直接驱动基因表达，或者利用来自LAT区域的DNA片段来给予单个或成对的启动子长期的活性。该元件，此处称为LATP2(包括LAP2和其它上游序列；(核苷酸118,866-120,219-GenBankHE1CG))，随后已经表现出不是作为一个真正的启动子发挥作用，而是给予位于其附近的异源启动子长期的活性，当单独使用这些启动子时，它们在潜伏期不具活性。

发明概述

本发明基于我们发现当基于LAT的启动子构建体被插入到HSV基因组的一个必需IE基因区域而不是一个非必需基因区域时(如US5，其进一步从内源性LAT区域中被除去)，掺入了基于LAT元件的启动子系统的HSV突变体基因组的稳定性急剧降低。本发明提供了当这种启动子构建体被插入到一种必需IE基因时可以稳定复制的病毒，这在其它情况下是不可能的。

本发明通过缺失与插入到一种必需IE基因内的启动子构建体中存在的序列对应的内源性LAT序列，以试图克服所得经修饰的HSV基因组稳定性的降低。

特别地，我们已经发现插入到IE必需IE基因(ICP4和/或ICP27)、其内源性LAT区域内的相应元件没有被缺失的、基于LAT的启动子，其重排可以在当这种突变病毒在表达互补基因的细胞系内复制时，通过同源重组实现。这常常导致插入的异源基因以及其它序列从病毒中被缺失。然而，如果相应于已经被插入到ICP4和/或ICP27的LAT序列的元件从内源性的LAT区域中被缺失，则无法检测到重排，而且这种病毒能以一种稳定的模式复制。因此本发明涉及具有插入片段的病毒，插入片段包括插入到基因的基因座LAT区域的元件，优选的是必需IE基因基因座，相应的元件已经被从该病毒的内源性LAT区域中被缺失。这些病毒能以一种稳定的模式复制，这种稳定的复制在其它情况下是不可能的。

因此，本发明提供了一种单纯疱疹病毒(HSV)，其包括：

(i)一段插入到HSV的一个必需基因内的HSV LAT序列；和

(ii)HSV内源性LAT区域上的缺失。

优选的，缺失包括存在于插入的HSV LAT序列中的至少一些序列，优选的是存在于插入的LAT序列中的至少50％的序列，更优选的是至少75％，最优选的是存在于插入的LAT序列中的至少所有的序列。

LAT序列已经插入到其中的必需基因优选的是包括一个缺失，如在一个必需基因的编码区域和/或内源性调控序列上的一个缺失。插入到必需IE基因上是优选的。

本发明的单纯疱疹病毒可以被用于，例如，在治疗神经系统的疾病或损伤(包括帕金森氏病)、脊髓损伤或中风、或眼睛、心脏或骨骼肌的疾病、或恶性肿瘤的方法中传递治疗基因。本发明也涉及研究基因在哺乳动物细胞中的功能的方法，如鉴定补偿细胞机能不良的基因、或研究在野生型或突变的哺乳动物细胞中表达突变基因的影响。本发明的方法尤其可以被用于对疾病所涉及的基因进行功能研究。

本发明进一步提供了本发明的一种HSV，其携有一个异源基因。术语异源基因包括任何在HSV基因组中没有被发现的基因。异源基因可以是一种野生型基因的任何等位基因的变体，或者其可能是一种突变基因。异源基因优选的是与允许上述异源基因在哺乳动物细胞中表达的控制序列可操作连接，所述细胞优选的是中枢或周围神经系统的细胞，或眼睛、心脏或骨骼肌的细胞，更优选的是中枢或周围神经系统的细胞。本发明的HSV可以因此被用于将一种异源基因传递到哺乳动物细胞内，所述基因将在所述细胞内表达。这种载体在多种应用中都是有用的，如，在基因治疗、或在体外分析方法或HSV基因调控的研究中。

该异源基因优选的是编码一种具有治疗作用的多肽，包括具细胞毒性或能够将一种药物前体转变为一种细胞毒化合物的多肽。

本发明进一步提供了本发明的单纯疱疹病毒，其携有一个异源基因，用于人类和动物的治疗。例如，这些病毒可以被用于治疗神经系统的疾病或损伤(包括帕金森氏病)、脊髓损伤或中风或眼睛、心脏或骨骼肌的疾病、或恶性肿瘤。

本发明的HSV也可以被用于研究哺乳动物细胞中的基因功能的方法中，例如用于鉴定补偿细胞营养不良的基因、或研究突变基因在野生型或突变的哺乳动物细胞中表达的影响。本发明的方法尤其可以被用于对疾病所涉及的基因进行功能研究。

本发明也提供了一种构建本发明中的单纯疱疹病毒的方法，上述方法包括：

(i)将一段HSV LAT序列插入到该病毒的一个必需基因内；以及

(ii)缺失该病毒的至少部分LAT区域。

在该HSV的LAT区域的缺失，优选的是包括至少部分或更优选的是包括全部与存在于插入的HSV LAT序列内的序列相应的内源性序列。

发明详述

A LAT序列

LAT序列在本文中的定义是包括所有来自HSV1株系17+的5,490到9,214和117,159到120,882位之间的核苷酸序列(GenBanKHE1CG)，和来自其它HSV1株系和所有HSV2株系的同源区域。

LAT P2区域在本文中的定义是HSV1株系17-中的HSV1核苷酸118866到120219位(GenBank HE1CG：来自PstI-BstXI位点)，以及该区域的片段或衍生物，包括HSV2和其它HSV1株系的同源区域，这些区域可以向与它们连接的启动子提供长期的表达能力，或者它们本身可以驱动长期的基因表达。

B.病毒株系

本发明中的单纯疱疹病毒可以来自，例如，HSV1或HSV2株系，或它们(优选的是HSV1)的衍生物。衍生物包括含有来自HSV1和HSV2株系的DNA的型内(inter-type)重组体。衍生物优选的是与HSV1或HSV2基因组至少具有70％序列同源性，较优选的是至少80％，更优选的是至少90或95％。其它可以被用于获得本发明的病毒的衍生物包括已经在ICP4和/或ICP27上具有突变的株系，如株系d120，其在ICP4上具有一个缺失(DeLuca等，1985)。在ICP27上具有缺失的HSV株系也已经被构建，例如Reef Hardy和Sandri-Goldin，1994以及Rice和Knipe，1990(株系d27-1)。在ICP4和ICP27上均具有缺失的株系如US-A-5,658,724.和Samaniego等，1995(株系d92)所描述。使用这些株系将减少构建本发明的突变HSV株系所需要的步骤。

用于描述不同HSV基因的术语如Coffin和Latchman，1996中所述。

C.补偿性细胞系

本发明的病毒在表达必需基因的细胞系内复制。表达ICP4细胞系的例子包括E5细胞(DeLuca等1985)或B4细胞(见实施例2)，优选的是B4细胞。表达ICP27细胞系的例子包括V27细胞(Rice和Knipe，1990)、2-2细胞(Smith等，1992)或B130/2细胞(见实施例1和WO98/04726)，优选的是B130/2细胞。

表达必需基因的细胞系的构建可以通过将一种载体(优选是一种质粒载体，其包括一种可以在上述细胞内表达的功能性的HSV必需基因)和一种载体(优选的是质粒载体，编码一种选择性标记，如新霉素抗性)一起共转染哺乳动物细胞(例如Vero或BHK细胞)。然后筛选具有选择性标记的克隆以进一步确定哪个克隆也表达该功能性的必需基因，所述筛选基于它们支持缺乏该必需基因的HSV株系的生长的能力，使用的是本领域技术人员所了解的方法。

如以上所描述的构建细胞系，其不允许缺乏一种特定必需基因的突变HSV株系回复到一种具有功能性必需基因的株系，必须确保含有该功能性必需基因的载体尽可能地，不含有与保留在突变病毒内的序列重叠(即，与其同源)的序列。优选地，完全没有重叠。

D.突变的方法

在通过几种本领域熟知的技术插入LAT序列之前，可以使必需基因功能性失活。例如，它们可以通过缺失、取代或插入被功能性失活，优选的是通过缺失。缺失可以除去基因的部分或整个基因。例如，可以仅缺失一个核苷酸，导致移码。然而，优选的是进行较大的缺失，如全部编码和非编码序列的至少25％，更优选的是50％(或者可选地，以绝对的术语，至少10个核苷酸，更优选的是至少100个核苷酸，最优选的，至少1000个核苷酸)。尤其优选的是除去整个基因和一些侧翼序列。插入的序列可以包括以上所描述的LAT序列和以下描述的异源基因。

缺失也可以是除去HSV的LAT区域的部分或全部。这些缺失可以如以下所描述的进行。

在单纯疱疹病毒内进行的突变可以通过本领域技术人员所熟知的同源重组的方法。例如，将HSV基因组DNA与一种载体(优选的是质粒载体，含有同源的HSV序列，在其侧翼为突变序列)一起共转染。该突变序列可以包括缺失、插入或取代，所有这些都可以通过常规的技术构建。插入可以包括选择性标记的基因，如lacZ，以通过，如β-半乳糖苷酶活性筛选重组体病毒。

E.异源基因和启动子

本发明的突变HSV株系可以被修饰以携有一个异源基因，也就是除了存在于HSV基因组内的基因以外的基因。术语“异源基因”包括除了存在于HSV基因组内的基因以外的任何基因。异源基因可以是某一野生型基因的任何等位基因的变体，或者其可以是一个突变基因。术语“基因”是用于涵盖至少可以被转录的的核苷酸序列。因此，编码mRNA、tRNA和rRNA的序列均被包括在该定义内。就启动子而言，该序列可以为有义或反义方向。根据熟知的技术，反义构建体可以被用于抑制一种基因在细胞内的表达。编码mRNA的序列将随意地包括部分或全部5’和/或3’自然地转录但不翻译的侧翼序列，或要不然包括与翻译的编码序列相关的序列。其可以进一步随意地包括一般与转录的序列相关的相关转录调控序列，如转录终止信号、多聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。

可以通过将HSV株系与，例如质粒载体(如携有异源基因的质粒，所述基因的侧翼为HSV序列)同源重组将该异源基因插入到HSV基因组内。该异源基因可以采用本领域熟知的克隆技术被引入到一个合适的带有HSV序列的质粒载体上。该异源基因可以在任何位点被插入到HSV基因组内，只要该病毒仍然可以复制即可。优选的是该异源基因被插入到一个必需基因内，优选的是ICP4或ICP27。

该异源基因的转录序列优选的是与一段允许该异源基因在哺乳动物细胞内表达的操纵序列可操作连接，优选的是中枢和周围神经系统的细胞。术语“可操作连接”是指并列，其中所描述组分之间的关系允许它们以其特定的方式发挥功能。一段控制序列与一段编码序列“可操作连接”是以这样一种方式连接，使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完成。

控制序列包括一个允许该异源基因表达的启动子和一个终止转录的信号。启动子选自在哺乳动物、尤其是人细胞内发挥功能的启动子。该启动子可以来自真核基因的启动子序列。例如，其可以是来自该异源基因将在其中表达的细胞的基因组的启动子，所述细胞优选的是哺乳动物中枢或周围神经系统的细胞。至于真核启动子，它们可以是以普遍存在的方式(如β-肌动蛋白、微管蛋白的启动子)或者，可选择地，以组织特异性方式(如丙酮酸激酶基因的启动子)发挥功能。它们也可以是响应特定刺激的启动子，如与甾类激素受体结合的启动子。也可以使用病毒启动子，如Moloney鼠白血病病毒长末端重复序列(MMLV LTR)启动子或HSV基因的启动子。

HSV LAT启动子，和含有LAT启动子区域元件的启动子是尤其优选的，因为有可能在潜伏期获得异源基因的长期表达。特别地，实质上由一段LAT P2区域组成的表达盒，其本身并不充当启动子，以该次序连接一个启动子和一个异源基因是尤其优选的。

术语“长期表达”是用于表示一个异源基因在一个被本发明的单纯疱疹病毒感染的细胞内的表达，甚至是在该单纯疱疹病毒已经进入潜伏期之后的表达。优选在感染之后至少两周，更优选地是至少一或两个月，尤其优选的是在细胞的终生表达。

表达盒可以进一步包括第二个启动子和第二个异源基因，它们以该次序与上述HSV LAT P2区域可操作连接，其取向与第一个启动子和第一个异源基因相反，其中上述第二个启动子和第二个异源基因与该第一个启动子和第一个异源基因相同或不同。因此，一对取向相反的启动子/异源基因构建体在一个单个的LAT P2区域侧翼，以允许成对的异源基因(其可以相同或不同，被相同或不同的启动子驱动)长期表达。此外，在合适的生理条件下，第一个异源基因的产物可以调控第二个异源基因的表达(或反之亦然)。

表达盒可以采用本领域技术人员所知的常规克隆技术被构建(见，例如，Sambrook等，1989.分子克隆-实验室手册；冷泉港出版社)。此外，含有这种表达盒的特定HSV株系的构建如实施例中所描述。

LAT P2区域此处定义为HSV1核苷酸118866到120219位(GenBank HE1CG：来自Pstl-BstXl位点)，该区域的片段或衍生物，包括HSV2的同源区域，其可以向与其连接的启动子提供长期表达的能力。

至于启动子，也有利的是其为可诱导的，以致该异源基因的表达水平可以在细胞的终生被调控。可诱导表示使用启动子所获得的表达水平可以被调控。例如，在一个优选的实施方案中，其中不止一个异源基因被插入到HSV基因组内，一个启动子将包括一个对以前所报道(Gossen和Bujard，1992.Gossen等，1995)的tet相抑蛋白/VP16转录激活物融合蛋白有反应、并驱动其表达将被调控的异源基因的启动子。第二个启动子将包括一个驱动tet相抑蛋白/VP16融合蛋白表达的强启动子(如，CMV IE启动子)。因此在该实施例中，第一个异源基因的表达将取决于四环素的存在或缺乏。

另外，这些启动子中的任何一种可以通过加入另一个调控序列进行修饰，如增强子序列(包括LAT区域的元件)。也可使用嵌合的启动子，其包括来自以上所描述的两个或更多不同启动子的序列元件，如MMLV LTR/LAT融合启动子(Lokensgard等，1994)或含有LAT区域元件的启动子(见上文)。

该异源基因可以编码，例如，参与调控细胞分裂的蛋白质，如促有丝分裂生长因子，包括神经营养生长因子(如脑源神经营养因子、神经胶质细胞来源的神经营养因子、NGF、NT3、NT4和NT5、GAP43)、细胞因子(如α、β或γ-干扰素、包括IL-1、IL-2的白介素、肿瘤坏死因子、或胰岛素样生长因子I或II)、蛋白激酶(如MAP激酶)、蛋白磷酸酶和以上任何的细胞受体。该异源基因也可以编码参与细胞代谢途径的酶，如参与氨基酸生物合成或降解的酶(如酪氨酸羟化酶)、嘌呤或嘧啶生物合成或降解的酶、以及神经递质(如多巴胺)生物合成或降解的酶、或参与这些途径的调控的蛋白质，如蛋白激酶和磷酸酶。该异源基因也可以编码参与它们的调控的转录因子或蛋白，如Brn3家族的成员(包括Brn3a、Brn3b和Brn3c)或Rb家族的pocket蛋白如Rb或p107、膜蛋白(如视紫质)、结构蛋白(如肌营养不良蛋白)或热激蛋白如hsp27、hsp65、hsp70和hsp90。

优选的，该异源基因编码肌一种具有治疗作用的多肽，或者其功能或功能的缺乏对疾病的过程可能较重要的多肽。例如，在所描述蛋白质中，酪氨酸羟化酶可以被用于治疗帕金森氏病，视紫质可以被用于治疗眼部病症，营养不良蛋白可以被用于治疗肌营养不良，以及热激蛋白可以被用于治疗与局部缺血(ischaemic)压力相关的心脏和脑部紊乱。具有治疗用途的多肽也可以包括细胞毒多肽如蓖麻毒素，或者可以将一种药物前体转化为一种细胞毒化合物的酶类，它们可以被用于，如病毒介导的酶药物前体治疗或基因介导的酶前体药物治疗的方法。在后一种情况下，理想的是确保该酶具有一个合适的信号序列以将其导向细胞表面，优选的是允许该酶暴露在细胞表面的外部、同时依然锚定在细胞表面的信号序列。合适的酶包括细菌硝基还原酶，如WO93/08288中所公布的大肠杆菌硝基还原酶或羧肽酶，尤其是如WO88/07378中所公布的羧肽酶CPG2。其它的酶可以参见EP-A-415731。合适的药物前体包括氮芥药物前体和其它化合物，如WO88/07378、WO89/10140、WO90/02729和WO93/08288(引入本文作为参考)中所描述的化合物。

异源基因也可以编码作为疫苗使用的抗原性多肽。优选的是该抗原性多肽来自病原性生物，如细菌或病毒，或来自肿瘤。

异源基因也可以包括标记基因(如编码β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白)或其产物调节其它基因表达的基因(如，转录调节因子，包括以上所描述的tet相抑蛋白/VP16转录激活物融合蛋白)。

基因治疗和其它治疗上的应用有可能需要施用多个基因。多个基因的表达对于治疗多种疾病可能是有利的—如使用多个神经营养因子。HSV是唯一合适的，因为其不具有其它病毒载体系统的限制性包装能力。因此可以在其基因组内部容纳多个异源基因。这可以通过，如，至少两种途径达到。例如，可以将不止一个的异源基因和相关控制序列导入一个特定的HSV株系内。也有可能采用远离位于中心的LAT P2元件、以相反取向面对的成对启动子(相同或不同的启动子)，这些启动子各自驱动如以上所描述的一个异源基因(相同或不同的异源基因)的表达。

F.施用

本发明的突变单纯疱疹病毒因此可以被用于将一种治疗基因传递给需治疗的患者或动物。使用本发明的突变单纯疱疹病毒传递治疗基因可以被用于治疗如，帕金森氏病、神经系统的障碍、脊髓损伤、中风或恶性肿瘤，如神经胶质瘤。

一种施用基因治疗的方法包括如以上所描述的，将治疗基因插入到本发明的突变单纯疱疹病毒的基因组内，然后将所得到的重组病毒与一种药物可接受的载体或稀释剂混合以生产一种药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗的盐溶液，如磷酸缓冲盐水。可以配制组合物以进行非肠道、肌内、静脉内、皮下、眼内或经皮给药。

施用该药物组合物的方式使得含有用于基因治疗的治疗基因的突变病毒可以在适当的区域掺入细胞。例如，当基因治疗的目标是中枢或周围神经系统时，该组合物可以被施用到突触末梢所在的部位。一般通过立体定位接种将该药物组合物施用到脑部。当该药物组合物是被施用到眼部时，视网膜下注射是典型施用的技术。

所施用病毒的量的范围为从10⁴到10¹⁰pfu，优选的是从10⁵到10⁸pfu，更优选的是约10⁶到10⁷pfu。当注射时，典型的是将1至10微升的病毒在一种药物可接受的合适的载体或稀释剂内施用。

所描述的给药路径和剂量仅作为一种引导，因为熟练的医师将很容易为任何特定的病人和病情确定给药的最优路径和剂量。

G.分析方法学

本发明的突变单纯疱疹病毒也可以被用于科学研究的方法中。因此，本发明的另一个方面涉及在体外或体内分析基因在哺乳动物细胞内的功能的方法。异源基因功能的确定可以通过以下方法进行，其包括：

(a)将所述异源基因导入本发明的突变的单纯疱疹病毒内；

(b)将所得到的病毒导入哺乳动物细胞系内；以及

(c)确定所述异源基因在所述哺乳动物细胞系内表达的影响。

例如，该细胞系可能在细胞分裂中具有温度敏感性缺陷。当一种含有本发明的异源基因的HSV株系被导入该缺陷型细胞系，并且该细胞系在限制性温度下生长时，熟练技术人员将很容易能够确定该异源基因是否能够补偿该细胞分裂上的缺陷。类似地，可以应用其它已知的技术来确定异源基因的表达是否能够纠正哺乳动物细胞系内可见的突变表型。

本方法也可以被用于实现一种异源基因的系统性诱变，以确定由该基因编码的蛋白质的哪一区域参与恢复该突变表型。

本方法也可以被用于动物，如携有所谓的“基因敲除”的小鼠。使用本发明的一种突变HSV株系可以将野生型异源基因导入该动物体内，使用本领域已知的各种行为学、组织化学或生物化学的分析来确定对动物的影响。可选择地，可以将一种突变的异源基因导入野生型或“基因敲除”动物体内以确定是否引发了与疾病相关的病理学。一个例子是使用编码朊病毒的基因来引发啮齿类动物中枢神经系统内的Creutzfeld-Jacob和其它朊病毒型疾病。其它疾病模式可以包括Alzheimer病、运动神经元疾病或帕金森氏病的模式。

因为由于HSV基因组的大容量，有可能将至少两种不同的异源基因导入一个细胞内，所以也有可能研究两个或更多个基因产物之间的相互作用。

因此，本发明中的方法尤其可以被用于疾病所涉及基因的功能研究。

本发明将结合以下实施例进行描述，其仅作为说明而非限制性。

实施例

参考实施例1-ICP4-补偿细胞系(B4)的制备。

一种允许ICP4缺失病毒生长的补偿型细胞系(B4)的构建是通过将质粒pICP4 DNA和新霉素抗性编码质粒pMamNeo(Invitrogen)共转染到BHK细胞并筛选新霉素抗性克隆来完成的。质粒pICP4含有一段来自HSV1基因组的DdeI-SphI片段(核苷酸126,764-131,730)，其包括ICP4编码区域和启动子，该片段被克隆于pSP72(Promega)的EcoRV和SphI位点之间。

选择一种高度允许HSV1 ICP4缺失突变体(B4)生长的克隆以进行病毒生长。

参考实施例2-ICP27-补偿细胞系(B130/2)的制备。

一种允许ICP27缺失的病毒生长并在补偿序列和上述ICP27缺失病毒之间没有重叠(因此阻止了在病毒生长过程中，通过同源重组对ICP27的修复)的补偿型细胞系(B130/2)，其产生是通过将质粒pSG130BS(Sekulovich等。1988)DNA和新霉素抗性编码质粒pMamNeo(Invitrogen)共转染到BHK细胞内并筛选新霉素抗性克隆来完成的。选择一种高度允许HSV-1 ICP27缺失突变体(B130/2)生长的克隆以允许病毒生长。PSG130BS携有来自HSV1的BamHI/SacI片段(核苷酸113322-115743)，其编码完整的ICP27编码序列和部分UL55。

实施例1-含有LAT序列的启动子被插入其中以缺失ICP27、但在内源 性的LAT区域没有缺失的HSV株系不能够稳定复制。

(a)一段来自质粒pR20.5的表达盒，由以相反的背靠背取向排列并被一段HSV LAT区域序列(核苷酸118,866-120,219)隔开的一段RSV/lacZ/pA和一段CMV/GFP/pA序列组成，通过标准的方法使该盒与纯化后的基因组HSV1株系17+的DNA同源重组以插入到ICP27基因座。该pR20.5表达盒首先以两种取向被插入到一种含有ICP27侧翼区域的质粒(pΔ27)内，从而允许两种具有与在内源性LAT区域附近的LAT序列取向相同或相反的HSV LAT序列的病毒产生。缺失这些病毒的整个ICP27基因。当一段编码SrfI的寡核苷酸被插入到该pR20.5表达盒的任一边时，该表达盒可以通过SrfI从其pGEM5(Promega)质粒的骨架上被切除下来。RSV启动子从pRc/RSV(Invitrogen)上被切除、lacZ/pA来自pCH110(Pharmacia)、CMV/pA来自pcDNA3(Invitrogen)以及GFP来自pEGFP-N1(Clontech)，使用它们构建质粒pR20.5。pΔ27的构建首先是通过将一段EcoRI-NotI片段从HSV1的限制性片段EcoRI B(核苷酸110095-131534)上亚克隆下来，该过程包括将ICP27基因插入到pGEM5(Promega)以及通过用MluI消化和重新连接(religation)缺失编码ICP27(UL54)、UL55和UL56的MluI片段。然后将该pR20.5表达盒插入目前唯一的MluI位点。

在荧光显微镜下通过选择表达绿色GFP的噬菌斑来对病毒进行噬斑纯化，原种的制备使用了B130/2细胞(在上文参考实施例2中所描述)。所得到的病毒原种(17+/pR20.5/27和17+/pR20/27rev)无法对BHK细胞(其不能补偿ICP27缺失)形成生产性感染。

病毒原种的制备是通过将单个的噬菌斑接种到六孔板的一个孔内，收集该原种并接种到新的六孔板内来完成的。然后将来自这些板的原种滴定到B130/2细胞内。在每个过程之后计算绿色(在荧光显微镜下)、蓝色(在X-gal染色以检测lacZ之后)和白色的噬菌斑数。对于17+/pR20.5/27，GFP基因在插入的LAT序列和内源性LAT区域之间，对于17+/pR20/27rev，lacZ基因在插入的和内源性LAT序列之间。

结果

在病毒原种的生长和滴定之后，发现不是所有的噬菌斑均表达GFP和lacZ基因。对于17-/pR20.5/27，发现虽然所有的噬菌斑均表达lacZ，但大约2％不再表达GFP。这暗示着在病毒生长的过程中，在插入的和内源性的LAT序列(此处它们的取向相同)之间存在同源重组，以相对较低的水平缺失了包括GFP在内的间插序列。至于17+/PR20/27rev，其中插入的和附近的内源性LAT序列以与对方相反的取向排列，大多数噬菌斑仍然表达lacZ和GFP。然而，大约有1％不表达lacZ或GFP或两个插入基因均不表达，这暗示着当以与对方相反的取向排列时，在插入的和内源性的LAT序列之间发生了更为复杂的重组机制，其可以导致一个或另一个或更罕见地是两个插入基因的缺失。

(b)如以上a)所述的将一段表达盒插入到pΔ27内，该盒由以下组分组成：一段LAT序列(DdeI-Ddel：核苷酸118180至118768)，其后跟随一段来自pJ4(Morgenstern和Land 1990)的MMLV LTR启动子，二者被一段大约700bp的质粒间隔序列(NdeI-SmaI来自pGEM3zf-Promega)，其后跟随一段来自pCH110(Pharmacia)的lacZ/pA序列隔开。该质粒被称为pR18/27。此处LAT序列以相同的取向在内源性LAT区域的附近。构建一种病毒(17+/pR18/27)，并如以上所描述的使用B130/2细胞培养原种，此处通过X-gal染色选择lacZ的表达。X-gal染色之后再次滴定原种并计算蓝色和白色ICP27缺失的噬菌斑数目。

结果

在如所描述的两个连续传代步骤之后，所得到的噬菌斑大约有3％不再表达lacZ。这暗示着插入的和内源性的LAT区域之间的同源重组已经导致了间插序列(包括lacZ基因)的缺失。

实施例2-含有LAT序列的启动子被插入到其中以缺失ICP4但不缺 失内源性LAT区域的HSV株系不能够稳定复制

通过将pR20.5表达盒插入到ICP4侧翼区域(质粒pΔ4)以产生质粒pR20.5/4，并与纯化的基因组HSV1株系17+DNA同源重组到B4细胞内(如参考实施例1中所描述的构建)，以将pR20.5盒插入到HSV1的ICP4基因座，同时伴随着ICP4的缺失。pΔ4由下列组分组成：pSP72(Promega)中的ICP4侧翼序列核苷酸123,459-126,774(Sau3a-Sau3a)和核苷酸131,730-134,792(SphI-KpnI)，二者被来自pSP72的XbaI和SalI位点分开。pICP4含有来自HSV1、被克隆至pSP72的EcoRV和SphI位点之间的DdeI-SphI片段(核苷酸126,764-131,730)。所得到的病毒(17+/pR20.5/4)不能够在BHK细胞(其不补偿ICP4的缺失)内生长。

如以前，病毒的原种的制备是通过将单个的噬菌斑接种到六孔板的单个孔内，收集该原种并接种到新的六孔板内来完成的。然后使用这些原种接种175cm²培养瓶。然后将来自平板和培养瓶的原种滴定到B4细胞内。在每个步骤之后再次计算绿色(在荧光显微镜下)、蓝色(在X-gal染色以鉴定lacZ之后)和白色噬菌斑的数目。在17+/pR20.5/4中，插入的位点(ICP4)表示内源性的和插入的LAT序列取向相反，彼此通过GFP基因和ICP0、RL1和ORFP的编码序列以及其它特征不太清楚的编码序列分割开来。通过内源性的和插入的LAT序列之间的同源重组缺失ICP0(虽然可能不是RL1 OPFP或其它序列)将有望产生一种与含有IE1的病毒相比，具有明显减弱的生长特征的病毒。

结果

对从六孔板中制备的病毒原种的滴度没有显示出可检测到的lacZ或GFP基因的缺失。然而当将目前已经被连续传代3次的原种从大培养瓶中滴定时，可以检测到少量数目的噬菌斑不再表达一个或另一个或两个基因，虽然决不使用高MOI感染来产生已经被滴定的原种。因此大约有0.5％的噬菌斑不再表达GFP或lacZ基因，以及大约有0.1％不再表达任一种基因。可以得出结论，即在ICP4两种拷贝内的插入的LAT序列和存在于基因组的长重复区域的内源性LAT序列中的一个或另一个或两个拷贝之间的同源重组，使得重组机制可以发生，其可以允许缺失一个或另一个或两个插入的标记基因。

实施例3-其中含有LAT序列的启动子插入到US5的HSV株系可以 稳定复制

pR20.5表达盒插入到HSV1的US5基因座是通过将pR20.5盒插入到US5侧翼区域(质粒pΔUS5)得到质粒pR20.5/pΔUS5，接着通过与纯化过的基因组HSV1株系17+DNA同源重组到BHK细胞内以得到病毒株系17+/pR20.5/US5来完成的。质粒pΔUS5的制备是通过将HSV1中的一段包括US5编码区域的BamHI-EcoNI片段(核苷酸136,289至131,328)，克隆到质粒pAT153内来完成的。pR20.5被插入到US5基因内的核苷137,945位上的唯一SacI位点上。在17+/pR20.5/US5内，没有必需基因被缺失，因此不需要补偿缺失的细胞。

如以前，在噬菌斑纯化之后，病毒原种的制备是通过将单个噬菌斑接种到六孔板的单个孔内，收集该原种并接种到新的六孔板内来完成的。连续传代被持续五次，然后接种到175cm²培养瓶内。将来自培养板和培养瓶的原种滴定到BHK细胞并计算绿、蓝和白色噬菌斑的数目。

结果

在所有情况下，从六孔板或175cm²培养瓶中滴定的病毒均不显示可检测得到的lacZ或GFP基因的缺失，即使是在连续传代之后。

实施例1至3的结论

将LAT序列插入到HSV的ICP27或ICP4基因座内导致不稳定的HSV基因组的形成，因为它们可以通过内源性的和插入的LAT序列之间的同源重组被重排，即使间插序列的缺失有可能会产生与背景病毒相比具有生长缺陷的病毒。另一方面，将LAT序列插入到US5基因座(其所在的位点是在HSV基因组内，从内源性LAT序列而不是ICP27或ICP4中去除的位点)，不产生稳定复制在其中被阻止的病毒。

实施例4-其中来自LAT区域(其与插入到该基因组其它位点的序列 相应)的序列被缺失的HSV株系能够以稳定的模式复制

(a)构建一种病毒，在插入另一个序列之前，其中相应于pR20.5表达盒LAT序列的LAT序列被从两个内源性的LAT区域缺失。该病毒(17+/p2-)的构建是通过在LAT区域的两个BstXI位点之间(在核苷酸120,217和120,406位上切下的BstXI位点)插入一段CMV/lacZ表达盒，并且通过质粒pR19lacZ与基因组HSV1株系17+DNA同源重组挑选表达lacZ的噬菌斑来完成的。然后缺失CMV/lacZ表达盒加上LAT序列(核苷酸118,769至120,469)，所述缺失是通过与一个含有侧翼区域的第二质粒(pΔP2)一起同源重组以缺失必需的序列，并选择白色(在X-gal染色之后)非lacZ表达的噬菌斑来完成的。pR19lacZ的构建是通过将一段CMV/lacZ/多聚A表达盒在BstXI位点之间插入到pNot3.5内来完成的，pNot3.5由一段来自LAT区域被克隆到pGem5(Promega)NotI位点上的3.5kb NotI片段(核苷酸118,439至122,025组成)。pΔP2由下列组分组成：来自LAT区域的DdeI片段(核苷酸118,180至118,768)，其后跟随克隆到pGem5内的HpaI-NotI片段(核苷酸120,470-122,025)，二者被SacI、KpnI和AvaI多接头衍生的位点隔开。通过Southern印迹检测17+/p2-，以确证来自基因组长重复区域的LAT序列的两个拷贝均被缺失。然后使用如实施例2中的质粒pR20.5 27将pR20.5表达盒插入到ICP27基因座内。所得到的病毒(17+/P2-/pR20.5/27)不能在BHK(其不补偿ICP27的缺失)细胞内生长。

病毒原种的再次制备是通过将单个的噬菌斑接种到六孔板的一个孔内，收集该原种并接种到新的六孔板内来完成的。使用来自这些的原种接种175cm²培养瓶，然后将来自这二者的原种均滴定到B130/2细胞内。在每个步骤之后再次计算绿色(在荧光显微镜下)、蓝色(在X-gal染色以检测lacZ之后)和白色噬菌斑的数目。

结果

在病毒原种生长和滴定之后，当任一病毒原种被滴定出来以后，发现目前所有的噬菌斑均表达lacZ基因。这暗示着插入的和内源性的LAT序列之间的同源重组不再发生，因此允许了该病毒的稳定复制。

b)使用实施例2中的质粒pR20.5/4将pR20.5表达盒也插入到17+/p2-的ICP4基因座上。所得到的病毒(17-/P2-/pR20.5/4)不能够在BHK细胞(其不补偿ICP4缺失)内生长。

如以前，病毒原种的制备是通过将单个的噬菌斑接种到六孔板的单个孔内，收集该原种并接种到新的六孔板内来完成的。连续传代持续五次，然后接种175cm²培养瓶。来自培养板和培养瓶的原种均如以前一样滴定到B4/27/4细胞内并计算绿、蓝和白色噬菌斑的数目。

结果

从初始的六孔板内制备的病毒原种的滴度没有显示出可检测的lacZ或GFP基因的缺失。当滴定在接种到大培养瓶之前已经被连续传代超出五次的原种时，仅可以检测到表达GFP及lacZ的噬菌斑，没有观察到仅表达一种或另一种或两种均不表达的噬菌斑。这暗示着先前缺失与插入到pR20.5的序列相应的内源性LAT序列，已经再次提供了一种比内源性LAT序列在其中没有首先被缺失的病毒的稳定性更大的病毒，因此允许了该病毒的稳定复制。

                     参考文献

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Lokensgard JR等病毒学杂志1994；68：7148-7158。

Claims (24)

1.一种单纯疱疹病毒HSV，包括一段插入到该HSV的一个必需立即早期基因内的HSV LAT序列；其中存在于插入的LAT序列内的至少75％序列从该HSV的内源性LAT区域缺失。

2.根据权利要求1的病毒，其中的必需立即早期基因是ICP27。

3.根据权利要求1的病毒，其中的必需立即早期基因是ICP4。

4.根据权利要求1的病毒，其中存在于插入的LAT序列内的所有序列都从该HSV的内源性LAT区域缺失。

5.根据以上权利要求中的任一项的病毒，其中的LAT序列由HSV1株系17+的核苷酸118866到120219和/或核苷酸117159到118865，或者是另一种HSV株系的同源序列组成。

6.根据权利要求1-4中的任一项的病毒，其选自HSV1株系、HSV2株系或它们的衍生物。

7.根据权利要求6的病毒，其是HSV1株系。

8.根据权利要求1的病毒，其携有至少一个异源基因。

9.根据权利要求8的病毒，其中所述异源基因与一段插入的HSVLAT序列可操作连接。

10.根据权利要求8的病毒，其中所述异源基因与一段允许上述异源基因在哺乳动物细胞内表达的调控序列可操作连接。

11.根据权利要求10的病毒，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物的中枢或周围神经系统的细胞。

12.根据权利要求10的病毒，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物的眼、心脏或骨骼肌的细胞。

13.根据权利要求8的病毒，其中所述异源基因编码具有治疗作用的多肽。

14.根据权利要求13的病毒，其中所述基因编码的多肽具有细胞毒性。

15.根据权利要求13的病毒，其中所述基因编码的多肽可以将药物前体转变为具细胞毒性的化合物。

16.根据权利要求13的病毒，其中的异源基因选自编码参与细胞分裂调控的蛋白质、参与代谢途径的酶、转录因子和热激蛋白的基因。

17.根据权利要求8到16中的任一项的病毒，可用于将上述异源基因传递到哺乳动物细胞内。

18.根据权利要求8到16中的任一项的单纯疱疹病毒用于制备治疗哺乳动物神经系统的紊乱或损伤的药物的用途。

19.药物组合物，其由权利要求8的病毒，和药物可接受的载体或稀释剂组成。

20.一种用于研究异源基因在哺乳动物细胞内的功能的方法，该方法包括：

(a)将所述异源基因导入权利要求1的单纯疱疹病毒内；

(b)将所得到的单纯疱疹病毒导入体外哺乳动物细胞内；以及

(c)确定所述异源基因在所述哺乳动物细胞内表达的效果。

21.根据权利要求20的方法，其中所述异源基因是涉及引发疾病的野生型或突变型基因。

22.根据权利要求20或21的方法，其中所述哺乳动物细胞是功能障碍性的，所述异源基因为野生型，以及所述异源基因的表达效果是通过分析细胞功能进行确定的。

23.根据权利要求20或21的方法，其中所述哺乳动物细胞具有一个或多个被突变失活的内源性基因。

24.用于产生权利要求1的单纯疱疹病毒的方法，上述方法包括：

(i)将该HSV LAT序列插入该病毒的必需立即早期基因内；以及

(ii)从该病毒的内源性LAT区域缺失插入的LAT序列内的至少75％序列。