CN119161494A - 疫苗稀释液制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫技术领域，尤其涉及疫苗稀释液制备方法和应用。本发明提供了两种融合蛋白，他们组合的组合物能够具有良好的提高疫苗免疫效果的作用，有效延长疫苗免疫持续期，对动物体提供更高效的免疫保护力，同时疫苗稀释液生产工艺简单，成本低。

Description

疫苗稀释液制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，尤其涉及疫苗稀释液制备方法和应用。
背景技术
常用的疫苗分为“冻干苗”、“干粉苗”和“液体苗”三种。疫苗稀释液是指用于对疫苗进行稀释的溶剂或试剂。根据疫苗类型的不同，如冻干苗、干粉苗和液体苗，其所需的稀释液也各不相同。这些稀释液不仅可以帮助疫苗在体内更好地分散，还能为疫苗提供一定的保护和辅助作用。各疫苗生产厂家在对疫苗进行生产时，都有各自专用的稀释液，以保证疫苗的免疫效果。
目前，疫苗稀释液的研发随着疫苗技术的进步而不断发展。当前，疫苗稀释液的研发主要集中在以下几个方面：
优化稀释液成分：根据不同疫苗的特性，研发人员通过优化稀释液的成分，如添加免疫增强剂、佐剂、保护剂等，以提高疫苗的免疫效果和稳定性。
改进稀释液制造工艺：为了提高稀释液的质量和生产效率，许多疫苗制造商致力于改进稀释液的制造工艺，包括提高生产的自动化程度和精细化程度。
拓展稀释液应用领域：随着新型疫苗的不断涌现，疫苗稀释液的应用领域也在不断拓展。除了传统的动物疫苗领域外，一些疫苗稀释液还开始应用于人类疫苗领域。
研发新型稀释液：为了满足不同疫苗的特殊需求，研究人员还在不断研发新型稀释液。这些新型稀释液在成分、稳定性、安全性等方面都具有更高的标准。
尽管疫苗稀释液的研究已经取得了显著的进步，但当前稀释液仍存在一些缺点，例如：半衰期较短或对免疫效果的辅助作用较弱等。并且，针对不同种类的疫苗大多仍需要不同类型的稀释液，给临床使用带来了不便。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供疫苗稀释液制备方法和应用。
本发明提供了两种融合蛋白，分别记作融合蛋白A和融合蛋白B。
本发明提供的融合蛋白A，由IL-2蛋白、NPS蛋白和WT1蛋白中的至少两者组成。
例如，本发明中所述融合蛋白A由IL-2蛋白和NPS蛋白组成，或者由IL-2蛋白和WT1蛋白组成，或者由NPS蛋白和WT1蛋白组成，或者由IL-2蛋白、NPS蛋白和WT1蛋白组成。
本发明对IL-2蛋白、NPS蛋白和WT1蛋白的来源不做限定，例如，本发明实施例中，其来自于鸡。
具体实施例中，所述IL-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者在如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
具体实施例中，所述NPS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者在如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
具体实施例中，所述WT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或者在如SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
本发明提供的融合蛋白A中，IL-2蛋白、NPS蛋白和WT1蛋白的连接顺序为：rIL-2-NPS-WT1、rIL-2-WT1-NPS、rNPS-IL-2-WT1、rNPS-WT1-IL-2、rWT1-IL-2-NPS或rWT1-NPS-IL-2。此外，本发明提供的融合蛋白A还可以为rIL-2-NPS、rNPS-IL-2、rIL-2-WT1或rWT1-IL-2。
本发明将 IL-2与NPS基因和WT1基因串联，获得的融合蛋白能够有助于机体更有效地清除病原体和/或肿瘤细胞，提高免疫防御能力。本发明中的融合蛋白A以来自于鸡的蛋白为例，注射到鸡体内后可以刺激IL-2R受体高水平表达，促进IL-2与IL-2R结合后，通过激活多种信号通路，促进T细胞的增殖和分化，从而增强免疫应答。其次，IL-2R受体表达水平的提高对于NK细胞的活化和功能也至关重要。IL-2通过与NK细胞上的IL-2R结合，激活NK细胞，促进其分泌γ干扰素等细胞因子，从而增强免疫应答，同时改造后的白介素-2蛋白生物学活性和稳定性更高而副作用更低，且其半衰期显著延长。
实验表明，将IL-2蛋白、NPS蛋白和WT1蛋白串联的效果优于将IL-2与NPS串联，或者将IL-2与WT1串联的效果。而蛋白的串联顺序对免疫效果的提高也存在重要影响，实验表明，相对于其他串联顺序，IL-2-NPS-WT1的效果更优秀。
在融合蛋白A中，两个不同的蛋白之间通过linker连接，本发明对多种linker进行了尝试，例如：（G4S）n或（AG）n，结果表明，linker会影响融合蛋白A的生理活性和体内半衰期。其中，（G4S）n作为linker更能有效延长疫苗免疫持续期，作为优选，所述IL-2蛋白与NPS蛋白通过GGGGSGGGGS连接，所述NPS蛋白与WT1蛋白通过GGGGSGGGGS连接。
本发明还提供了一种小肽，其氨基酸序列为RRRYY（SEQ ID NO.13）。实验表明，该小肽插入蛋白中，特别是蛋白的N端，有利于进一步提高蛋白的生物学活性，特别是有利于进一步延长半衰期。
本发明提供了氨基酸序列为RRRYY小肽在提高含有IL-2片段的蛋白的生理活性中的应用。
本发明提供的融合蛋白A还包括氨基酸序列为RRRYY的小肽。作为优选，所述融合蛋白A的N段包括氨基酸序列为RRRYY的小肽。更优选的，所述IL-2蛋白的N端还包括RRRYY片段。
在一些具体实施例中，所述融合蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；或者在如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。（记作IL-2*-NPS-WT1）。
进一步的，本发明还提供了融合蛋白B，其由CaIFN-γ蛋白和GATA3蛋白组成。
本发明对CaIFN-γ蛋白和GATA3蛋白的来源不做限定，例如，本发明实施例中，其来自于鸡。
具体实施例中，所述CaIFN-γ蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；或者在如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
所述GATA3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；或者在如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
本发明提供的融合蛋白B中，CaIFN-γ蛋白和GATA3蛋白的连接顺序为：rCaIFN-γ-GATA3或rGATA3-CaIFN-γ。
本发明将CaIFN-γ蛋白和GATA3蛋白串联，获得的融合蛋白生物学活性较ChIFN-γ显著提高，半衰期也显著延长，说明该融合蛋白能够有助于机体更有效地清除病原体和/或肿瘤细胞，提高免疫防御能力。
实验表明，CaIFN-γ蛋白和GATA3蛋白的串联顺序对免疫效果的提高存在重要影响，rCaIFN-γ-GATA3的效果更优秀。
在融合蛋白B中，CaIFN-γ蛋白和GATA3蛋白之间通过linker连接，本发明对多种linker进行了尝试，例如：（G4S）n或（AG）n，结果表明，linker会影响融合蛋白B的生理活性和体内半衰期。其中，（G4S）n作为linker更能有效延长疫苗免疫持续期，作为优选，所述CaIFN-γ蛋白与GATA3蛋白通过GGGGSGGGGS连接。
在一些具体实施例中，所述融合蛋白B的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；或者在如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。（记作rCaIFN-γ-GATA3）。
更进一步的，本发明还提供了一种组合物，其包括如前所述的融合蛋白A和如前所述的融合蛋白B。
本发明将改造后IL-2-NPS-WT1和CaIFN-γ-GATA3联合应用，IL-2和IFN-γ相互协同作用，重组 IL-2 和IFN-γ和持续释放，IL-2通过促进T细胞的增殖和分化，为IFN-γ的产生提供了更多的效应细胞。本发明疫苗稀释液可以显著提高疫苗免疫效果，有效延长疫苗免疫持续期，对动物体提供更高效的免疫保护力，同时疫苗稀释液生产工艺简单，成本低。
在本发明中，所述融合蛋白A和融合蛋白B的质量比为1:（0.01~100000）。例如，融合蛋白A和融合蛋白B的质量比为1:0.01，或为1:0.1，或为1:1，或为1:10，或为1:100，或为1:1000，或为1:10000，或为1:20000，或为1:30000，或为1:40000，或为1:50000，或为1:60000，或为1:70000，或为1:80000，或为1:90000，或为1:100000。
本发明所述组合物中，融合蛋白A和融合蛋白B可以混合存在，也可彼此独立存在，本发明对此不做限定。该组合物中，融合蛋白A和融合蛋白B的状态可以独立地为粉末或为溶液，本发明对此亦不做限定。
更进一步的，本发明还提供了生物材料，其包括如下I）~IV）中至少一个：
I)、编码如前所述融合蛋白A的核酸和/或编码如前所述融合蛋白B的核酸；
II）、含有I)所述核酸的质粒载体；
III)、基因组中整合有I)所述的核酸分子的宿主细胞；
IV)、转化或转染有II)所述的质粒载体的宿主细胞。
本发明所述核酸中，凡能编码如前所述的融合蛋白A或B的核酸皆在本发明的保护范围之内。其可为野生型序列，也可为经过密码子优化的序列，本发明对此不做限定。本发明所述的核酸中，可以仅包括如前所述融合蛋白的读码框，也可以包括酶切位点和/或筛选标记的核酸序列，本发明对此也不做限定。
一些实施例中，编码所述IL-2蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.8所示；或者在如SEQID NO.8所示的核酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个核酸的序列；或具有与如前任一项所示的核酸序列同一性80%以上的序列。
一些实施例中，编码所述NPS蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.9所示；或者在如SEQID NO.9所示的核酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个核酸的序列；或具有与如前任一项所示的核酸序列同一性80%以上的序列。
一些实施例中，编码所述WT1蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.10所示；或者在如SEQID NO.10所示的核酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个核酸的序列；或具有与如前任一项所示的核酸序列同一性80%以上的序列。
一些实施例中，编码所述CaIFN-γ蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.11所示；或者在如SEQ ID NO.11所示的核酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个核酸的序列；或具有与如前任一项所示的核酸序列同一性80%以上的序列。
一些实施例中，编码所述GATA3蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.12所示；或者在如SEQ ID NO.12所示的核酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个核酸的序列；或具有与如前任一项所示的核酸序列同一性80%以上的序列。
本发明中，所述质粒载体用于所述核酸存储、扩增或者用于所述融合蛋白A或B的表达，本发明对此不做限定。一些实施例中，所述载体为质粒载体，其包括pUC系列质粒载体、pBR322质粒载体、pGEM系列质粒载体、pET系列质粒载体、Yeast系列质粒载体或Gateway质粒载体等。一些实施例中，采用pET系列质粒载体对融合蛋白进行表达，作为可行案例，pET系列表达载体选自：pET-23c(+)、 pET-23(+)、 pET-12b(+)、 pET-12c(+)、pET-12a(+)、pET-11b(+)、 pET-11a(+)、 pET-11c(+)、 pET-50b(+)、 pET-49b(+)、 pET-48b(+)、 pET-47b(+)、 pET-26b(+)、 pET-32a(+)、 pET-21b(+)、 pET-22b(+)、 pET-14b、pET-16b、pET-15b、pET-19b、pET-20b(+)、 pET-21d(+)、 pET-21c(+)、 pET-21b(+)、 pET-21a(+)、pET-24a(+)、 pET-24d(+)、 pET-25b(+)、 pET-27b(+)、 pET-28a(+)、 pET-30a(+)、 pET-42a(+)、 pET-43.1c(+)、 pET-43.1b(+)、 pET-43.1a(+)、 pET-44a(+)、 pET-44c(+)、 pET-46pET-37b(+)、 pET303/CT-His、pET302/NT-His、pET300/NT-DEST、pET301/CT-DEST、pET-5b(+)、 pET-17b、pET102/D-TOPO、pET-5a(+)、 pET-31b(+)、 pET-3b(+)、 pET-43.1、pET-41、pET-41a(+)、 pET-28b(+)、 pET-42b(+)、 pET-3a(+)、 pET-23d(+)、 pET-41b(+)、 pET-44b(+)、 pET-42c(+)、 pET-41c(+)、 pET-45b(+)、 pET-33b(+)、 pET-39b(+)、 pET-32、pET-40b(+)、 pET-32c(+)、 pET-32b(+)、 pET-30、pET-32、pET-30c(+)、 pET-29c(+)、pET-29b(+)、 pET-30、pET-24c(+)、 pET-24b(+)、 pET-24(+)、 pET-29a(+)或pET-11d(+)。
本发明中，所述宿主用于如前所述质粒载体的保存、扩增或所述融合蛋白的表达。本发明中，所述宿主为真核生物宿主或原核生物宿主，所述真核生物宿主包括但不限于酵母菌、昆虫细胞、肾上皮细胞，所述原核生物宿主包括但不限于大肠杆菌。本发明实施例中，所述宿主为大肠杆菌的BL21（DE3）、BL21(DE3) pLysS、DH5α、JM109、JM110、TOP10、HB101、Xl1-Blue。
更进一步的，本发明还提供了如前所述融合蛋白的制备方法，其包括培养如前所述的宿主，获得含有所述融合蛋白的产物。作为优选，所述制备方法中还包括富集和纯化的步骤。
更进一步的，本发明还提供了如前任一项所述融合蛋白A、所述的融合蛋白B、所述的组合物和/或所述的生物材料在制备疫苗稀释液中的应用。
更进一步的，本发明提供的疫苗稀释液，其包括：如前所述融合蛋白A、如前所述融合蛋白B和/或如前所述的组合物。
本发明所述的疫苗稀释液中，还包括：缓冲液、水相和油相。
本发明中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS）、醋酸盐缓冲液（HAc-NaAc）、柠檬酸盐缓冲液（Citrate buffer）、硼酸缓冲液（Borate buffer）、巴比妥缓冲液（Barbitalbuffer）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris buffer）、碳酸盐缓冲液（Carbonate buffer）或HEPES缓冲液。一些实施例中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。具体实施例中，所述磷酸盐缓冲液由水和如下浓度的组分组成：8.0g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na2HPO4、0.24g/LKH2PO4；
本发明中，所述水相包括水还可以包括其他辅料。一些实施例中，所述水相中，包括水和谷氨酰胺、牛黄、葡萄糖氧化酶、维生素C和吐温；其中，吐温为吐温20、吐温40、吐温60或吐温80。具体实施例中，所述水相由水和如下浓度的组分组成：谷氨酰胺10g/L、牛黄0.2g/L，葡萄糖氧化酶1g/L，维生素C 5mg/L和4wt%吐温；
本发明中，所述油相包括矿物油，还可以包括月桂酸单甘酯和维生素E。具体实施例中，所述油相中，月桂酸单甘酯的浓度为0.5mg/L，维生素E的浓度为0.5mg/L。
本发明中，所述缓冲液、水相和油相的质量比为（1~10）:（1~10）:（1~10）。例如，缓冲液、水相和油相的质量比为（1~10）:（1~10）:1、或为（1~10）:（1~10）:2、或为（1~10）:（1~10）:3、或为（1~10）:（1~10）:5、或为（1~10）:（1~10）:6、或为（1~10）:（1~10）:7、或为（1~10）:（1~10）:8、或为（1~10）:（1~10）:9、或为（1~10）:（1~10）:10、或为（1~10）:1:（1~10）、或为（1~10）:2:（1~10）、或为（1~10）:3:（1~10）、或为（1~10）:4:（1~10）、或为（1~10）:5:（1~10）、或为（1~10）:6:（1~10）、或为（1~10）:7:（1~10）、或为（1~10）:8:（1~10）、或为（1~10）:9:（1~10）、或为（1~10）:10:（1~10）、或为1:（1~10）:（1~10）、或为2:（1~10）:（1~10）、或为3:（1~10）:（1~10）、或为4:（1~10）:（1~10）、或为5:（1~10）:（1~10）、或为6:（1~10）:（1~10）、或为7:（1~10）:（1~10）、或为8:（1~10）:（1~10）、或为9:（1~10）:（1~10）、或为10:（1~10）:（1~10）。一些实施例中，所述缓冲液、水相和油相的质量比为3:2:1。
本发明中，所述稀释液中融合蛋白A的浓度为1×10-4mg/L~2×10-4mg/L，融合蛋白B的浓度为1~5mg/L。一些实施例中，所述稀释液中融合蛋白A的浓度为1.34×10-4mg/L，融合蛋白B的浓度为2.67mg/L。
更进一步的，本发明还提供了如前所述疫苗稀释液的制备方法，其包括：
以缓冲液溶解如前所述的组合物，获得蛋白溶液；
将油相与水相混合后，经乳化获得乳化液；
将乳化液与所述蛋白溶液混合，制得所述疫苗稀释液。
本发明中，所述疫苗稀释液有三个组分：重组蛋白组合物、缓冲液、乳化液，在三个组分制备获得后即可立即配制成所述疫苗稀释液，本发明对此不做限定，此时疫苗稀释液保存期为12个月。作为优选，所述疫苗稀释液三个组分可以独立保存，在与疫苗混合使用时再进行配制，即现用现配，此时，各组分保存期为24个月，即疫苗稀释液保存期为24个月。
本发明中，所述乳化采用本领域常见的乳化方法即可。实施例中，所述乳化采用高剪切乳化机。作为优选，所述乳化的条件包括：4000r/min高剪切乳化处理30min。
更进一步的，本发明提供了所述疫苗稀释液或所述制备方法制得的疫苗稀释液，在稀释疫苗中的应用。
本发明中，所述疫苗为活疫苗、灭活疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗。
本发明中，所述疫苗为针对人类，或针对哺乳动物，或针对禽类的疫苗。例如，本发明中，所述疫苗的受试者哺乳动物，所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。或者，所述受试者为禽类，所述禽类包括鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、鹌鹑、珍珠鸡、鸬鹚、孔雀、天鹅、鸵鸟、鹦鹉、鹧鸪、鹈鹕、鹤、松鸡、野鸭、雉鸡、斑鸠和/或鸸鹋。
本发明，所述疫苗为针对感染性疾病的疫苗和/或针对肿瘤的疫苗。
所述针对感染性疾病的疫苗包括但不限于禽流感疫苗、新城疫疫苗、鸡痘疫苗、鸡传染性法氏囊炎疫苗、禽霍乱菌疫苗、马立克氏病疫苗、禽鹅细小病毒病疫苗、Newcastle病疫苗、结核病疫苗、鸭病毒性肝炎疫苗、禽脑脊髓炎疫苗、鸭瘟疫苗、小鹅瘟疫苗、番鸭细小病毒病疫苗、禽支原体病疫苗、禽曲霉菌病疫苗、鸡球虫病疫苗、火鸡鼻气管炎疫苗、传染性喉气管炎疫苗或禽沙门氏菌病疫苗。
所述针对肿瘤的疫苗包括但不限于宫颈癌疫苗、前列腺癌疫苗或肺癌疫苗等。
作为可行性案例，所述活疫苗为鸡传染性法氏囊活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗和/或鸡新城疫活疫苗；
作为可行性案例，所述灭活疫苗为禽流感病毒灭活疫苗和/或新城疫灭活疫苗；
作为可行性案例，所述亚单位疫苗为禽流感病毒基因工程亚单位疫苗和/或新城疫病毒基因重组亚单位疫苗。
本发明还提供了一种疫苗，其包括如前所述疫苗稀释液或如前所述制备方法制得的疫苗稀释液。
本发明所述的疫苗中，稀释液如前所述，免疫原选自本领域任意种类的免疫原，例如活疫苗、灭活疫苗、重组蛋白和/或核酸，本发明对此做限定。
本发明所述疫苗的制备方法包括，以如前所述疫苗稀释液或如前所述制备方法制得的疫苗稀释液，对疫苗进行稀释。
本发明还提供了一种防治疾病的方法，其包括给予如前所述的疫苗。
本发明所述防治包括预防和/或治疗。所述给予的方式包括注射和/或口服。
本发明提供了两种融合蛋白，他们组合的组合物能够具有良好的提高疫苗免疫效果的作用，有效延长疫苗免疫持续期，对动物体提供更高效的免疫保护力，同时疫苗稀释液生产工艺简单，成本低。
附图说明
图 1示pET-IL-2-NPS-WT1质粒的电泳图，其中，M：DL5000marker；1：酶切片段；2：水对照；
图2示IL-2-NPS-WT1的蛋白表达WB结果，其中，M：蛋白Marker；1：重组菌；2：未诱导表达菌体；
图3 示pET-CaIFN-γ-GATA3质粒的电泳图，其中，M：DL5000marker；1：酶切片段；2：水对照；
图4是CaIFN-γ-GATA3的蛋白表达WB结果，其中，M：蛋白Marker；1：重组菌；2：未诱导表达菌体；
图5示本发明技术路线图。
具体实施方式
本发明提供了疫苗稀释液制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非本发明另外定义，与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。
本文术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。
术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
所述白细胞介素-2（interleukine-2,IL-2）是非常重要的具有广泛生物学活性的免疫调节因子之一，其由特异性抗原或致丝裂素激活的T-淋巴细胞或T淋巴细胞系分泌产生的Th1型淋巴细胞因子。能激活T细胞和促进B细胞分化和分泌抗体，并诱导T细胞和NK细胞分泌γ干扰素，增强单核细胞以及自然杀伤细胞（NK）的杀伤活性，可以提高动物机体细胞免疫和体液免疫能力，在机体的免疫反应中具有重要的调节作用。
神经肽S（Neuropeptide S，NPS）基因，是一种由特定氨基酸序列构成的神经肽。其在遗传学和生物学研究中扮演着重要角色，包括参与免疫调节。本研究发现，NPS可通过调节免疫细胞的活性或功能状态，进而促进或抑制某些细胞因子的分泌。
WT1（Wilms’tumor gene 1）基因是一个具有多功能的基因，在多种组织和器官中表达，与其他基因和信号通路相互作用，参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等关键过程。WT1基因可能通过调控T细胞的分化和活化，影响干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）等细胞因子的表达水平，从而参与免疫应答的调节。
γ-干扰素(Chicken interferon-gamma, ChIFN-γ) 属于II型干扰素。主要由淋巴T 细胞产生，少部分由NK 细胞产生，IFN-γ本身并不能直接杀伤病毒，而是作用于靶细胞，激活靶细胞内的基因后合成具有抗病毒作用的蛋白而发挥其活性，因而其具有广谱抗病毒活性。还具有免疫调节的作用，主要通过主要组织相容性复合体II( MHC II) 类分子促进抗原提呈细胞与淋巴T 细胞的相互作用发挥免疫调节作用。能够抑制肿瘤病毒的增殖、促进肿瘤细胞凋亡和激活先天免疫及特异性免疫应答，从而发挥抗肿瘤作用。
GATA3（GATA-binding protein 3 ，GATA3）是一种重要的转录因子。在鸡的生长发育过程中具有多种重要功能，GATA3 对于 T 淋巴细胞的发育和分化起着关键的调控作用。它能促进 T 细胞向 Th2 细胞（辅助性 T 细胞 2 型）分化，可以调控多种免疫相关细胞因子的表达，间接调节了IFN-γ的表达或功能。
本文术语“同一性”可通过以下方式计算获得：为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的“同一性”百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数随所述序列共有的相同位置变化而变化。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。又例如，使用GCG软件包中的GAP程序(在www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
本发明中，所述同一性80%以上是指同一性大于85%、或大于90%、或大于95%、或大于96%、或大于97%、或大于98%、或大于98%、或大于99%、或大于99.5%、或大于99.8%、或大于99.9%。
本发明中涉及的数值范围与参数已尽可能精确地呈现在具体实施例中。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有数值范围或具体数据在一定范围内皆可存在一定合理的偏差，例如：±10%、±5%、±1%或±0.5%之内。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例
1 IL-2-NPS-WT1基因的设计与合成
参考GenBank已公布的鸡IL-2基因（Genbank：AM231331.1）、鸡NPS基因序列（Genbank：XM_046920688.1）和WT1基因序列（Genbank：NM_205216.2）三个基因序列：
IL-2的氨基酸序列为：
MCKVLIFGCISVAMLMTTAYGASLSSAKRKPLQTLIKDLEILENIKNKIHLELYTPTETQECTQQTLQCYLGEVVTLKKETEDDTEIKEEFVTAIQNIEKNLKSLTGLNHTGSECKICGANNKKKFPDFLHELTNFVRYLQK（SEQ ID NO.1）
密码子优化后编码IL-2的核酸序列为：
ATGTGCAAAGTTCTGATCTTCGGCTGTATTTCTGTAGCAATGCTGATGACTACCGCTTATGGTGCATCTCTGTCTTCCGCAAAAAGGAAACCGCTGCAGACCTTAATCAAGGATTTAGAAATCTTGGAAAATATCAAGAACAAGATTCATCTGGAGCTGTACACCCCAACTGAGACCCAGGAGTGCACCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGTGAAGTGGTTACTCTGAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTGAAATTAAAGAAGAATTCGTAACTGCTATTCAGAACATCGAAAAGAACCTGAAGAGCCTGACGGGTCTGAACCACACCGGTAGCGAATGCAAGATCTGTGGTGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCGGATTTTCTGCATGAACTGACCAACTTTGTGAGATATCTGCAGAAA（SEQ ID NO.8）
鸡NPS的氨基酸序列为：
MISLCRLNLLFILWMSAMFVCSGYPVGPSMSSNPFYLNCQLYGKSDYCLVLLNSCLAKVGRSEEVALLEPHLEMPFNKRSFRNGVGSGIKKTSFRRAKS（SEQ ID NO.2）
密码子优化后编码鸡NPS核酸序列为：
ATGATCAGCCTGTGCAGGCTGAACCTGCTGTTCATCCTGTGGATGTCTGCTATGTTTGTGTGCTCTGGTTACCCAGTTGGCCCATCCATGAGCAGCAACCCGTTCTATTTGAACTGCCAGCTGTACGGTAAATCTGATTACTGCCTGGTGCTGCTGAACAGCTGCTTAGCCAAGGTGGGCAGGAGCGAAGAGGTGGCTCTGCTGGAGCCGCACCTGGAGATGCCGTTCAACAAACGTTCCTTTCGCAACGGTGTGGGATCGGGTATTAAAAAAACTTCCTTTCGTAGAGCAAAGTCG（SEQ ID NO.9）
WT1的氨基酸序列为：
MGSDVRDLNALLPSVPSLPGNSNCAMPVSSAAQWAPVLDFPPGASYGSLGPHSFIKQEPSWNGSDPHEEQYLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGAPPPSQPPSGQARMFPNGPYLPNCLESQQAIRNQGYGTVAFDGTPSYGHTPSHHAAQFTNHSFKHEDPMSQQPSLGDQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYNSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGSTLKGHTTGYENENHSAPMLYSCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTIVRSASETNEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL（SEQ ID NO.3）
密码子优化后编码WT的核酸序列为
ATGGGTTCCGACGTTCGTGACCTGAACGCGCTGCTGCCCTCCGTGCCGTCCCTGCCGGGCAACAGCAACTGCGCCATGCCGGTGAGCAGCGCTGCTCAGTGGGCTCCGGTCCTGGACTTCCCGCCGGGTGCCTCCTACGGCTCGCTGGGTCCGCACTCCTTCATCAAGCAGGAACCGAGCTGGAACGGTTCGGACCCGCACGAGGAGCAGTACCTGAGCGCTTTCACCGTCCACTTCTCCGGTCAGTTCACGGGCACGGCCGGTGCCTGCCGCTACGGTCCGTTCGGCGCCCCGCCGCCGAGCCAGCCGCCGTCCGGCCAGGCCAGGATGTTCCCGAACGGTCCGTACCTGCCGAACTGCCTGGAGAGCCAGCAAGCCATTCGCAACCAGGGTTACGGCACCGTGGCCTTTGACGGTACTCCGAGCTACGGCCACACGCCGTCTCACCACGCCGCTCAGTTTACGAACCACTCTTTCAAACACGAAGACCCGATGAGCCAGCAGCCATCTCTGGGTGACCAGCAGTACTCGGTGCCGCCTCCGGTGTACGGCTGTCACACCCCGACGGACAGCTGCACGGGCAGCCAGGCCCTGCTCCTGCGTACCCCGTACAACAGCGACAATTTGTACCAGATGACGTCTCAGCTGGAATGCATGACCTGGAACCAAATGAACCTGGGTTCCACGCTGAAGGGCCATACGACCGGATATGAAAACGAGAACCACAGTGCTCCGATGTTATACAGCTGTGGTGCCCAATACAGAATCCACACCCATGGTGTCTTTAGAGGCATCCAAGATGTCCGTCGTGTGCCAGGAGTAGCTCCGACTATTGTCCGTTCAGCAAGCGAGACCAACGAAAAACGCCCGTTCATGTGTGCCTACCCGGGCTGCAACAAGCGTTACTTCAAGCTGTCCCATCTGCAGATGCACAGCAGAAAGCACACTGGTGAAAAACCATATCAGTGTGATTTTAAGGACTGTGAACGTAGATTTTCTCGTTCAGACCAACTGAAACGTCACCAAAGACGACACACCGGTGTGAAACCGTTCCAGTGTAAAACCTGTCAGAGAAAGTTCTCCAGATCTGATCATCTGAAGACTCATACCAGGACTCATACCGGTAAAACCAGTGAAAAGCCTGTCAGCTGCCGTTGGCCGAGCTGTCAAAAAAAACTGGCCAGGTCTGATGAATTAGTCCGTCACCACAACATGCACCAGAGGAACATGACTAAACTGCAGTTGGCCCTGTAA（SEQ ID NO.10）
将鸡IL-2与NPS和WT1三个基因序列按照不同的顺序进行串联，linker为GGGGSGGGGS(GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGG CAGC)，获得片段为：
1）、rIL-2-NPS-WT1
2）、rIL-2-WT1-NPS
3）、rNPS-IL-2-WT1
4）、rNPS-WT1-IL-2
5）、rWT1-IL-2-NPS
6）、rWT1-NPS-IL-2
此外，
对鸡IL-2基因序列进行改造，在起始密码子后插入CGTCGTCGTTATTAT，将改造后鸡IL-2与NPS和WT1三个基因序列以linker GGGGSGGGGS(GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC)将三个基因串联，获得片段为rIL-2*-NPS-WT1。
以rIL-2*-NPS-WT1为例，其核酸序列为（下划线标记为插入序列， 标记为linker，总长度为2055bp）
ATGcgtcgtcgttattatATGTGCAAAGTTCTGATCTTCGGCTGTATTTCTGTAGCAATGCTGATGACTACCGCTTATGGTGCATCTCTGTCTTCCGCAAAAAGGAAACCGCTGCAGACCTTAATCAAGGATTTAGAAATCTTGGAAAATATCAAGAACAAGATTCATCTGGAGCTGTACACCCCAACTGAGACCCAGGAGTGCACCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGTGAAGTG4GTTACTCTGAAGAAAGAAACTGAAGATGACACTGAAATTAAAGAAGAATTCGTAACTGCTATTCAGAACATCGAAAAGAACCTGAAGAGCCTGACGGGTCTGAACCACACCGGTAGCGAATGCAAGATCTGTGGTGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCGGATTTTCTGCATGAACTGACC4AACTTTGTGAGATATCTGCAGAAAgg cggcggcggcagcggcggcggcggcagcATGATC4AGCCTGTGCAGGCTGAACCTGCTGTTCATCCTGTGGATGTCTGCTATGTTTGTGTGCTCT4GGTTACCCAGTTGGCCCATCCATGAGCAGCAACCCGTTCTATTTGAACTGCCAGCTGTACGGTAAATCTGATTACTGCCTGGTGCTGCTGAACAGCTGCTTAGCCAAGGTGGGCAGGAGCGAAGAGGTGGCTCTGCTGGAGCCGCACCTGGAGATGCCGTTCAACAAACGTTCCTTTCGCAACGGTGTGGGATCGGGTATTAAAAAAACTTCCTTTCGTAGAGCAAAGTCGggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcATGGGTTCCGACGTTCGTGACCTGAACGCGCTGCTGCCC4TCCGTGCCGTCCCTGCCGGGCAACAGCAACTGCGCCATGCCGGTGAGCAGCGCTGCTCAGTGGGCTCCGGTCCTGGACTTCCCGCCGGGTGCCTCCTACGGCTCGCTGGGTCCGCACTCCTTCATCAAGCAGGAACCGAGCTGGAACGGTTCGGACCCGCACGAGGAGCAGTACCTGAGCGCTTTCACCGTCCACTTCTCCGGTCAGTTCACGGGCACGGCCGGTGCCTGCCGCTACGGTCCGTTCGGCGCCCCGCCGCCGAGCCAGCCGCCGTCCGGCCAGGCCAGGATGTTCCCGAAC4GGTCCGTACCTGCCGAACTGCCTGGAGAGCCAGCAAGCCATTCGCAACCAGGGTTACGGCACCGTGGCCTTTGACGGTACTCCGAGCTACGGCCACACGCCGTCTCACCACGCCGCTCAGTTTACGAACCACTCTTTCAAACACGAAGACCCGATGAGCCAGCAGCCATCTCTGGGTGACCAGCAGTACTCGGTGCCGCCTCCGGTGTACGGCTGTCACACCCCGACGGACAGCTGCACGGGCAGCCAGGCCCTGCTCCTGCGTACCCCGTACAACAGCGACAATTTGTACCAGATGACG44TCTCAGCTGGAATGCATGACCTGGAACCAAATGAACCTGGGTTCCACGCTGAAGGGCCATACGACCGGATATGAAAACGAGAACCACAGTGCTCCGATGTTATACAGCTGTGGTGCCCAATACAGAATCCACACCCATGGTGTCTTTAGAGGCATCCAAGATGTCCGTCGTGTGCCAGGAGTAGCTCCGACTATTGTCCGTTCAGCAAGCGAGACCAACGAAAAACGCCCGTTCATGTGTGCCTACCCGGGCTGCAACAAGCGTTACTTCAAGCTGTCCCATCTGCAGATGCACAGCAGA4AAGCACACTGGTGAAAAACCATATCAGTGTGATTTTAAGGACTGTGAACGTAGATTTTCTCGTTCAGACCAACTGAAACGTCACCAAAGACGACACACCGGTGTGAAACCGTTCCAGTGTAAAACCTGTCAGAGAAAGTTCTCCAGATCTGATCATCTGAAGACTCATACCAGGACTCATACCGGTAAAACCAGTGAAAAGCCTGTCAGCTGCCGTTGGCCGAGCTGTCAAAAAAAACTGGCCAGGTCTGATGAATTAGTCCGTCACCACAACATGCACCAGAGGAACATGACTAAACTG4CAGTTGGCCCTGTAA
rIL-2*-NPS-WT1氨基酸序列
MrrryyMCKVLIFGCISVAMLMTTAYGASLSSAKRKPLQTLIKDLEILENIKNKIHLELYTPTETQECTQQTLQCYLGEVVTLKKETEDDTEIKEEFVTAIQNIEKNLKSLTGLNHTGSECKICGANNKKKFPDFLHELTNFVRYLQKggggsggggsMISLCRLNLLFILWMSAMFVCSGYPVGPSMSSNPFYLNCQLYGKSDYCLVLLNSCLAKVGRSEEVALLEPHLEMPFNKRSFRNGVGSGIKKTSFRRAKSggggsggggsMGSDVRDLNALLPSVPSLPGNSNCAMPVSSAAQWAPVLDFPPGASYGSLGPHSFIKQEPSWNGSDPHEEQYLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGAPPPSQPPSGQARMFPNGPYLPNCLESQQAIRNQGYGTVAFDGTPSYGHTPSHHAAQFTNHSFKHEDPMSQQPSLGDQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYNSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGSTLKGHTTGYENENHSAPMLYSCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTIVRSASETNEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL（SEQ ID NO.4）
在上述连接获得的片段的5'端和3'端分别加入NdeI酶切位点CATATG和XhoI酶切位点CTCGAG。
2 CaIFN-γ-GATA3蛋白基因的设计与合成
参照鸡γ-干扰素CaIFN-γ基因序列（Genbank：NM_205149.2）和GATA3基因序列（Genbank：NM_001397223.1）：
鸡γ-干扰素CaIFN-γ的氨基酸序列为：
MTCQTYNLFVLSVIMIYYGHTASSLNLVQLQDDIDKLKADFNSSHSDVADGGPIIVEKLKNWTERNEKRIILSQVSMYLEMLENTDKSKPHIKHISEELYTLKNNLPDGVKKVKDIMDLAKLPMNDLRIQRKAANELFSILQKLVDPPSFKRKRSQSQRRCNC（SEQ ID NO.5）
密码子优化后，编码鸡γ-干扰素CaIFN-γ的核酸序列
ATGACTTGCCAGACTTACAACTTGTTTGTTCTGTCTGTCATCATGATTTATTATGGACATACTGCATCTTCTCTGAACCTGGTTCAGCTGCAGGATGATATCGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCTAGTCATTCTGATGTAGCTGACGGTGGTCCGATTATTGTAGAGAAACTGAAAAACTGGACCGAGAGAAACGAGAAAAGGATCATCCTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACCTGGAAATGCTGGAAAACACTGACAAGTCTAAGCCGCACATCAAACACATCTCTGAGGAGCTGTATACTCTGAAAAACAACCTGCCGGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCTCCCGATGAACGACCTGCGTATCCAGCGCAAAGCCGCGAACGAACTCTTCAGCATCCTGCAGAAGCTGGTGGATCCGCCGAGCTTCAAACGTAAACGTAGCCAGTCTCAGCGTCGTTGCAACTGC（SEQ ID NO.11）
GATA3的氨基酸序列为
MEVSTDQPRWVSHHHPAVLNGQHPDSHHPTLGHTYMDPTQYPLAEEVDVLFNIDGQGNPVPPYYGNSVRATVQRYPTAHHGSQVCRPPLLHGSLPWLDGSKALSSHHSASPWNLSPFSKTSIHHSSPGPLSVYPPASSSTLSAGHSSPHLFTFPPTPPKDVSPDPSISTPGSTGSTRQDEKECIKYQVSLADTMKLESSHSRSSMASLGGATSSAHHPITTYPPYVPEYSSGLFPPSSLLGGSPTGFGCKSRPKARSSTGRECVNCGATSTPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGQNRPLIKPKRRLSAARRAGTSCANCQTTTTTLWRRNANGDPVCNACGLYYKLHNINRPLTMKKEGIQTRNRKMSSKSKKCKKVHDNLEDFPKSSSFNPAALSRHMSSISHISPFSHSSHMLTTPTPMHPPSSLSFGPHHPSSMVTAMG（SEQID NO.6）
编码GATA3的核酸序列为
ATGGAGGTCTCCACGGACCAACCGCGGTGGGTGAGCCACCACCACCCGGCCGTGCTCAATGGGCAGCACCCGGACTCCCACCACCCCACTCTTGGCCATACCTACATGGACCCCACGCAGTATCCTCTCGCCGAGGAAGTGGATGTACTTTTTAATATCGACGGACAAGGCAACCCCGTGCCTCCGTATTACGGCAACTCCGTGCGAGCCACCGTGCAGCGGTACCCCACGGCCCATCACGGCAGCCAGGTGTGCCGGCCCCCTCTGCTGCATGGTTCACTGCCGTGGCTGGACGGGAGCAAAGCGCTGAGCAGCCACCACAGCGCTTCCCCTTGGAACCTCAGCCCTTTTTCCAAGACCTCCATCCATCACAGCTCGCCGGGACCCCTCTCCGTTTACCCGCCTGCTTCTTCCTCCACTTTATCCGCCGGTCACTCCAGCCCGCACCTTTTCACCTTCCCACCGACCCCTCCTAAAGATGTGTCCCCGGATCCGTCCATCTCCACTCCTGGCTCCACCGGCTCCACCCGGCAGGATGAGAAGGAATGCATCAAATATCAGGTGTCCCTGGCTGACACCATGAAGCTGGAGTCGTCTCACTCTAGGAGCAGCATGGCCTCGTTAGGAGGAGCCACCTCCTCTGCTCATCACCCCATCACTACTTACCCACCGTATGTCCCCGAATATAGCTCTGGACTTTTTCCCCCCAGCAGCCTCTTAGGAGGATCGCCTACCGGGTTCGGGTGCAAATCACGACCAAAAGCGCGGTCGAGCACAGGCAGGGAGTGTGTAAATTGTGGGGCTACCTCAACCCCTCTGTGGAGAAGAGACGGCACCGGGCACTACTTGTGTAACGCCTGTGGACTCTATCACAAAATGAATGGGCAGAACCGACCCCTGATTAAACCCAAGAGAAGGCTGTCTGCAGCCAGGAGGGCGGGCACGTCCTGTGCTAACTGTCAGACCACCACCACCACCCTGTGGAGGAGAAATGCCAACGGCGATCCTGTCTGTAATGCCTGTGGGCTCTACTACAAGCTGCACAATATTAACAGACCCCTGACTATGAAGAAAGAAGGAATTCAGACCAGAAACCGAAAAATGTCTAGCAAATCCAAAAAGTGCAAAAAGGTCCATGACAACCTTGAAGACTTTCCCAAGAGCAGCTCCTTTAACCCCGCCGCCCTCTCCAGACACATGTCCTCTATCAGCCACATTTCACCCTTCAGTCACTCCAGCCACATGCTGACTACACCGACACCGATGCATCCTCCATCCAGCCTCTCCTTTGGACCTCACCATCCCTCCAGCATGGTCACTGCCATGGGTTAG（SEQ ID NO.12）
将CaIFN-γ与GATA3基因序列按照不同的顺序进行串联，以linker GGGGSGGGGS(GG CGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGG CAGC)串联，参照大肠杆菌偏爱性进行密码子优化，并在5’端加上NdeI酶切位点CATATG，3’端加上XhoI酶切位点CTCGAG，获得片段记作：
1）、rCaIFN-γ-GATA3
2）、rGATA3-CaIFN-γ
以CaIFN-γ-GATA3为例，其基因合成序列如下：（标记为linker，1854bp）
ATGACTTGCCAGACTTACAACTTGTTTGTTCTGTCTGTCATCATGATTTATTATGGACATACTGCATCTTCTCTGAACCTGGTTCAGCTGCAGGATGATATCGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCTAGTCATTCTGATGTAGCTGACGGTGGTCCGATTATTGTAGAGAAACTGAAAAACTGGACCGAGAGAAACGAGAAAAGGATCATCCTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACCTGGAAATGCTGGAAAACACTGACAAGTCTAAGCCGCACATCAAACACATCTCTGAGGAGCTGTATACTCTGAAAAACAACCTGCCGGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCTCCCGATGAACGACCTGCGTATCCAGCGCAAAGCCGCGAACGAACTCTTCAGCATCCTGCAGAAGCTGGTGGATCCGCCGAGCTTCAAACGTAAACGTAGCCAGTCTCAGCGTCGTTGCAACTGCggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcATGGAGGTCTCCACGGACCAACCGCGGTGGGTGAGCCACCACCACCCGGCCGTGCTCAATGGGCAGCACCCGGACTCCCACCACCCCACTCTTGGCCATACCTACATGGACCCCACGCAGTATCCTCTCGCCGAGGAAGTGGATGTACTTTTTAATATCGACGGACAAGGCAACCCCGTGCCTCCGTATTACGGCAACTCCGTGCGAGCCACCGTGCAGCGGTACCCCACGGCCCATCACGGCAGCCAGGTGTGCCGGCCCCCTCTGCTGCATGGTTCACTGCCGTGGCTGGACGGGAGCAAAGCGCTGAGCAGCCACCACAGCGCTTCCCCTTGGAACCTCAGCCCTTTTTCCAAGACCTCCATCCATCACAGCTCGCCGGGACCCCTCTCCGTTTACCCGCCTGCTTCTTCCTCCACTTTATCCGCCGGTCACTCCAGCCCGCACCTTTTCACCTTCCCACCGACCCCTCCTAAAGATGTGTCCCCGGATCCGTCCATCTCCACTCCTGGCTCCACCGGCTCCACCCGGCAGGATGAGAAGGAATGCATCAAATATCAGGTGTCCCTGGCTGACACCATGAAGCTGGAGTCGTCTCACTCTAGGAGCAGCATGGCCTCGTTAGGAGGAGCCACCTCCTCTGCTCATCACCCCATCACTACTTACCCACCGTATGTCCCCGAATATAGCTCTGGACTTTTTCCCCCCAGCAGCCTCTTAGGAGGATCGCCTACCGGGTTCGGGTGCAAATCACGACCAAAAGCGCGGTCGAGCACAGGCAGGGAGTGTGTAAATTGTGGGGCTACCTCAACCCCTCTGTGGAGAAGAGACGGCACCGGGCACTACTTGTGTAACGCCTGTGGACTCTATCACAAAATGAATGGGCAGAACCGACCCCTGATTAAACCCAAGAGAAGGCTGTCTGCAGCCAGGAGGGCGGGCACGTCCTGTGCTAACTGTCAGACCACCACCACCACCCTGTGGAGGAGAAATGCCAACGGCGATCCTGTCTGTAATGCCTGTGGGCTCTACTACAAGCTGCACAATATTAACAGACCCCTGACTATGAAGAAAGAAGGAATTCAGACCAGAAACCGAAAAATGTCTAGCAAATCCAAAAAGTGCAAAAAGGTCCATGACAACCTTGAAGACTTTCCCAAGAGCAGCTCCTTTAACCCCGCCGCCCTCTCCAGACACATG1681TCCTCTATCAGCCACATTTCACCCTTCAGTCACTCCAGCCACATGCTGACTACACCGACACCGATGCATCCTCCATCCAGCCTCTCCTTTGGACCTCACCATCCCTCCAGCATGGTCACTGCCATGGGTTAG
氨基酸序列
MTCQTYNLFVLSVIMIYYGHTASSLNLVQLQDDIDKLKADFNSSHSDVADGGPIIVEKLKNWTERNEKRIILSQIVSMYLEMLENTDKSKPHIKHISEELYTLKNNLPDGVKKVKDIMDLAKLPMNDLRIQRKAANELFSILQKLVDPPSFKRKRSQSQRRCNCggggsggggsMEVSTDQPRWVSHHHPAVLNGQHPDSHHPTLGHTYMDPTQYPLAEEVDVLFNIDGQGNPVPPYYGNSVRATVQRYPTAHHGSQVCRPPLLHGSLPWLDGSKALSSHHSASPWNLSPFSKTSIHHSSPGPLSVYPPASSSTLSAGHSSPHLFTFPPTPPKDVSPDPSISTPGSTGSTRQDEKECIKYQVSLADTMKLESSHSRSSMASLGGATSSAHHPITTYPPYVPEYSSGLFPPSSLLGGSPTGFGCKSRPKARSSTGRECVNCGATSTPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGQNRPLIKPKRRLSAARRAGTSCANCQTTTTTLWRRNANGDPVCNACGLYYKLHNINRPLTMKKEGIQTRNRKMSSKSKKCKKVHDNLEDFPKSSSFNPAALSRHMSSISHISPFSHSSHMLTTPTPMHPPSSLSFGPHHPSSMVTAMG（SEQ ID NO.7）
3 IL-2-NPS-WT1蛋白原核表达纯化
3.1 IL-2-NPS-WT1融合表达载体构建
（1）目的基因酶切：用限制性内切酶Nde I和Xho I对合成的IL-2-NPS-WT1基因双酶切，酶切体系（20µl）：IL-2-NPS-WT1基因 1µl，Nde I 1µl，Xho I 1µl，10×Buffer 2µl，ddH2O 15µl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒进行回收并纯化。
（2）载体酶切：选用载体pET30a(+)，用限制性内切酶Nde I和Xho I对载体pET30a(+)双酶切，酶切体系（20µl）：pET30a(+) 1µl，Nde I 1µl，Xho I 1µl，10×Buffer 2µl，ddH2O 15µl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。
（3）目的基因与载体的连接：将IL-2-NPS-WT1基因酶切产物和载体pET30a(+)酶切产物用T4连接酶进行连接，连接体系（10µl）：10×Buffer 1µl，pET30a(+)酶切产物 2µl，干扰素基因酶切产物 2µl，T4 DNA连接酶 1µl，ddH2O 4µl，在冰上操作，混合后于16℃连接过夜。
（4）转化：取10µl连接产物加入到含100µl大肠杆菌 DH5α感受态细胞的离心管中，混匀后冰浴30min，转到42℃恒温水浴热击90s，取出后立即冰浴2min，向每个离心管中加入LB液体培养基500µl，于37℃，200 r/min培养1h，取100µl涂布含有卡那霉素的平板，37℃倒置培养过夜14h。
（5）质粒提取：挑取平板上的单菌落，接种到含有卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，200r/min培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，用Nde I与Xho I双酶切重组质粒，经琼脂糖电泳出现约5kb的pET30a(+)载体条带和2055bp的外源片段，大小与预期完全符合，电泳结果见图1。重组质粒命名为pET-IL-2-NPS-WT1。
3.2 发酵培养 pET-IL-2-NPS-WT1质粒转化BL21(DE3)，挑取单个菌落，接种至适量的含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min 振荡培养过夜；菌液按培养基量的2%接种于灭菌发酵罐中，37℃通气培养，控制发酵罐搅拌速度500～700r/min、溶氧为60%～90%，pH值7.0；待菌体生长至对数生长中期，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃下诱导5h。
3.3 菌体破碎 培养结束后，离心收集菌体沉淀，用PBS洗涤2次，制成10%的PBS悬液，在2～8℃下用高压匀浆机破碎细菌，破碎后的菌液，以8000r/min离心15min，收集包涵体。
3.4 重组蛋白的纯化 用含2M尿素的缓冲液洗涤包涵体，磁力搅拌器洗涤30min，4℃条件下，8000r/min离心10min，去上清后重复洗涤一次。 加入8mol/L尿素溶解洗涤包涵体，于冰浴中超声清洗30min，8000r/min离心20min去沉淀，取上清即为包涵体溶解液，溶液4℃过夜，将溶液在超滤复性设备上进行复性，按5～10体积换液，复性结束后，经8000r/min，离心去沉淀，收集上清液就是所需蛋白溶液，将蛋白液以0.3ml/min的速度加入层析柱中，用pH 7.0磷酸盐缓冲液以1ml/min的速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在280nm波长下进行检测，收集目标洗脱峰，0.22μm的滤膜过滤除菌。采用紫外分光光度计法，测定蛋白含量≥3.8mg/ml。
3.5 重组蛋白的western-blot鉴定 上述重组蛋白SDS-PAGE电泳后，经100V，70min转至PVDF膜，TBST洗膜2次，1%BSA封闭液37℃封闭1.5h后TBST洗膜3次，兔源IL-2单克隆抗体作为一抗，加入1:1000稀释液，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入1:4000稀释的羊抗兔IgG（HRP）二抗，TBS洗膜3次后用DAB显色试剂盒检测，诱导后重组菌体中的重组蛋白大小为75.3kDa，与IL-2-NPS-WT1融合蛋白大小一致（图2）。
4 CaIFN-γ-GATA3蛋白原核表达纯化
4.1 CaIFN-γ-GATA3载体的构建
（1）目的基因酶切：用限制性内切酶Nde I和Xho I对合成的CaIFN-γ-GATA3基因双酶切，酶切体系（20µl）：CaIFN-γ-GATA3基因 1µl，Nde I 1µl，Xho I 1µl，10×Buffer 2µl，ddH2O 15µl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒进行回收并纯化。
（2）载体酶切：选用载体pET30a(+)，用限制性内切酶Nde I和Xho I对载体pET30a(+)双酶切，酶切体系（20µl）：pET30a(+) 1µl，Nde I 1µl，Xho I 1µl，10×Buffer 2µl，ddH2O 15µl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。
（3）目的基因与载体的连接：将CaIFN-γ-GATA3基因酶切产物和载体pET30a(+)酶切产物用T4连接酶进行连接，连接体系（10µl）：10×Buffer 1µl，pET30a(+)酶切产物 2µl，干扰素基因酶切产物 2µl，T4 DNA连接酶 1µl，ddH2O 4µl，在冰上操作，混合后于16℃连接过夜。
（4）转化：取10µl连接产物加入到含100µl大肠杆菌 DH5α感受态细胞的离心管中，混匀后冰浴30min，转到42℃恒温水浴热击90s，取出后立即冰浴2min，向每个离心管中加入LB液体培养基500µl，于37℃，200 r/min培养1h，取100µl涂布含有卡那霉素的平板，37℃倒置培养过夜14h。
（5）质粒提取：挑取平板上的单菌落，接种到含有卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，200r/min培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，用Nde I与Xho I双酶切重组质粒，经琼脂糖电泳出现约5kb的pET30a(+)载体条带和1854bp的外源片段，大小与预期完全符合，电泳结果见图3。重组质粒命名为pET-CaIFN-γ-GATA3。
4.2 发酵培养 pET-CaIFN-γ-GATA3质粒转化BL21(DE3)，挑取单个菌落，接种至适量的含50µg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min 振荡培养过夜；菌液按培养基量的2%接种于灭菌发酵罐中，37℃通气培养，控制发酵罐搅拌速度500～700r/min、溶氧为60%～90%，pH值7.0；待菌体生长至对数生长中期，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃下诱导5h。
4.3 菌体破碎 培养结束后，离心收集菌体沉淀，用PBS洗涤2次，制成10%的PBS悬液，在2～8℃下用高压匀浆机破碎细菌，破碎后的菌液，以8000r/min离心15min，收集包涵体。
4.4 重组蛋白的纯化 用含2M尿素的缓冲液洗涤包涵体，磁力搅拌器洗涤30min，4℃条件下，8000r/min离心10min，去上清后重复洗涤一次。 加入8mol/L尿素溶解洗涤包涵体，于冰浴中超声清洗30min，8000r/min离心20min去沉淀，取上清即为包涵体溶解液，溶液4℃过夜，将溶液在超滤复性设备上进行复性，按5～10体积换液，复性结束后，经8000r/min，离心去沉淀，收集上清液就是所需蛋白溶液，将蛋白液以0.3ml/min的速度加入层析柱中，用pH 7.0磷酸盐缓冲液以1ml/min的速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在280nm波长下进行检测，收集目标洗脱峰，0.22μm的滤膜过滤除菌。采用紫外分光光度计法，测定蛋白含量≥3.8mg/ml。
4.5 重组蛋白的western-blot鉴定 上述重组蛋白SDS-PAGE电泳后，经100V，70min转至PVDF膜，TBST洗膜2次，1%BSA封闭液37℃封闭1.5h后TBST洗膜3次，兔抗CaIFN-γ为一抗，加入1:1000稀释液，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入1:4000稀释的山羊抗兔IgG-HRP二抗，TBS洗膜3次后用DAB显色试剂盒检测，诱导后重组菌体中的重组蛋白大小为67.8kd，与预期蛋白大小一致（图4）。
5 蛋白生物学活性测定
5.1 rIL-2-NPS-WT1蛋白生物活性测定
对试验过程中IL-2与NPS、WT1不同组合方式、不同串联方式获得的重组蛋白进行生物活性测定。同时也比较了linker1（GGGGSGGGGS (GG CGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC)） 和linker2（AGAGAG( GCCGGTGCCGGTGCCGGT)）对融合蛋白生物学活性的影响。
以重组人白细胞介素-2生物学活性测定的国家标准品作对照品，在无菌条件下，将对照品、使用linker1制备的rIL-2-NPS-WT1、rIL-2*-NPS-WT1、rIL-2-WT1-NPS 、rNPS-IL-2-WT1、rNPS-WT1-IL-2、rWT1-IL-2-NPS 、rWT1-NPS-IL-2、rIL-2-NPS、rNPS-IL-2、rIL-2-WT1、rWT1-IL-2、rIL-2蛋白和使用linker2制备的rIL-2-NPS-WT1、rIL-2*-NPS-WT1、rIL-2-WT1-NPS 、rNPS-IL-2-WT1、rNPS-WT1-IL-2、rWT1-IL-2-NPS 、rWT1-NPS-IL-2、rIL-2-NPS、rNPS-IL-2、rIL-2-WT1、rWT1-IL-2、rIL-2蛋白均采用基础培养液稀释成1ml约含200IU，在96孔细胞培养板中，作2倍系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度作2孔。
CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5%CO2条件下培养至足够量，离心收集 CTLL-2细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配制每毫升含有6.0×105个细胞的细胞悬液，于37℃、5%CO2条件下备用，在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50µl，于37℃、5%CO2条件下培养18～24h，然后，每孔加入MTT溶液20µl，于37℃、5%CO2条件下培养4～6h后，每孔加入裂解液150µl，于37℃、5%CO2条件下保温18～24h，以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。具体生物学活性测定结果见表1和表2。
表1 生物学活性测定结果（linke1）
注：*表示此IL-2蛋白中未进行改造，不含CGTCGTCGTTATTAT插入序列。
表2 生物学活性测定结果（linke2）
注：*表示此IL-2蛋白中未进行改造，不含CGTCGTCGTTATTAT插入序列。
本发明的rIL-2-NPS-WT1蛋白的生物学活性显著高于rIL-2*-NPS-WT1、rIL-2-WT1-NPS 、rNPS-IL-2-WT1、rNPS-WT1-IL-2、rWT1-IL-2-NPS 、rWT1-NPS-IL-2、rIL-2-NPS、rNPS-IL-2、rIL-2-WT1、rWT1-IL-2、rIL-2蛋白的生物学活性。研究中通过比较linker1和linker2，发现使用linker1时融合蛋白生物学活性较佳，选择linker1作为本发明linker。
试验确定最优组合为使用linker1（GGGGSGGGGS (GGCGGCGGCGGCAGCGGCGG CGGCGGCAGC)），串联方式为rIL-2-NPS-WT1，且鸡IL-2基因序列起始密码子后插入CGTCGTCGTTATTAT时组合效果最优。
5.2 rCaIFN-γ-GATA3蛋白生物学活性测定
对试验过程中CaIFN-γ与GATA3不同串联方式获得的重组蛋白进行生物活性测定。同时也比较了linker1（GGGGSGGGGS (GG CGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGG CAGC)） 和linker2（AGAGAG( GCCGGTGCCGGTGCCGGT)）对融合蛋白生物学活性的影响。在无菌条件下，将对照干扰素标准品、使用linker1制备的rCaIFN-γ-GATA3、rGATA3-CaIFN-γ、rCaIFN-γ和使用linker2制备的rCaIFN-γ-GATA3、rGATA3-CaIFN-γ、rCaIFN-γ均采用测定培养液稀释至每1ml含1000U，在96孔细胞培养板中作4倍系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度作2孔。CEF细胞在培养基中贴壁生长，按1:2～1:4传代，用完全培养基生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成每毫升含有2.5×105～3.5×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100µl，于37℃、5%CO2孵育4～6h，将稀释完成的待测干扰素制品和对照品参考干扰素制品溶液移入接种CEF细胞的培养板中，每孔100µl，于37℃、5%CO2孵育24h，弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水泡性口炎病毒（VSV，-70℃保存）用攻毒培养液稀释至1000 TCID50/ml，每孔100µl，于37℃、5%CO2孵育24h（镜检供试干扰素制品溶液50%病变点在IU/ml)，当干扰素保护孔CPE不再进展，即可观察结果。
将上述细胞板盖打开，弃去各孔内液体于消毒液中，加结晶紫染色1～2滴/孔，室温放置30min后，用细水流冲洗孔内残余染色液，并吸干残留水分即可记录结果，生物学活性测定结果见表3和表4。
表3 生物学活性测定结果（linker1）
表4 生物学活性测定结果（linker2）
本发明的rCaIFN-γ-GATA3的生物学活性显著高于rCaIFN-γ。研究中通过比较linker1和linker2，发现使用linker1时融合蛋白生物学活性较佳，选择linker1作为本发明linker。
试验确定最优组合为使用linker1（GGGGSGGGGS (GGCGGCGGCGGCAGCGGCGG CGGCGGCAGC)），串联方式为rCaIFN-γ-GATA3时组合效果最优。
6 重组蛋白在鸡体内半衰期测定
6.1 rIL-2-NPS-WT1蛋白在鸡体内半衰期测定
对试验过程中IL-2与NPS、WT1不同组合方式、不同串联方式获得的重组蛋白在鸡体内半衰期进行测定。同时也比较了linker1（GGGGSGGGGS(GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC)）和linker2（AGAGAG( GCCGGTGCCGGTGCCGGT)）对融合蛋白在鸡体内半衰期的影响。将使用linker1制备的rIL-2-NPS-WT1、rIL-2*-NPS-WT1、rIL-2-WT1-NPS 、rNPS-IL-2-WT1、rNPS-WT1-IL-2、rWT1-IL-2-NPS 、rWT1-NPS-IL-2、rIL-2-NPS、rNPS-IL-2、rIL-2-WT1、rWT1-IL-2、rIL-2蛋白和使用linker2制备的rIL-2-NPS-WT1、rIL-2*-NPS-WT1、rIL-2-WT1-NPS 、rNPS-IL-2-WT1、rNPS-WT1-IL-2、rWT1-IL-2-NPS 、rWT1-NPS-IL-2、rIL-2-NPS、rNPS-IL-2、rIL-2-WT1、rWT1-IL-2、rIL-2蛋白，同时进行半衰期检测，选用3～4周龄SPF鸡，分为24组，每组10只，分别肌肉注射24组蛋白，注射剂量均按每kg体重10万单位，采集注射前、注射后1h、2h、4h、6h、8h、12h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h采血，应用HPLC测定血液中IL-2的浓度。结果见表5和表6。
表5 血清中IL-2浓度测定结果(ng/ml)（linker1）
注：（1）*表示此IL-2蛋白中未进行改造，不含CGTCGTCGTTATTAT插入序列。
表中体现IL-2浓度均为10只鸡的算术平均值。
表6 血清中IL-2浓度测定结果(ng/ml)（linker2）
注：（1）*表示此IL-2蛋白中未进行改造，不含CGTCGTCGTTATTAT插入序列。
表中体现IL-2浓度均为10只鸡的算术平均值。
结果本发明专利的rIL-2-NPS-WT1蛋白半衰期显著高于rIL-2*-NPS-WT1、rIL-2-WT1-NPS 、rNPS-IL-2-WT1、rNPS-WT1-IL-2、rWT1-IL-2-NPS 、rWT1-NPS-IL-2、rIL-2-NPS、rNPS-IL-2、rIL-2-WT1、rWT1-IL-2、rIL-2，研究中通过比较linker1和linker2，发现两种linker对融合蛋白在鸡体内半衰期影响差异不显著，至注射后192h，血清中IL-2的浓度为39和32ng/ml，而未做任何改造的rIL-2在注射后12h血清中IL-2的浓度已经下降至2和3ng/ml，至48h已经完全检测不到。
综合研究中比较linker1和linker2对融合蛋白生物学活性和鸡体内半衰期实验数据，选择linker1作为本发明linker。试验确定最优组合为使用linker1（GGGGSGGGGS(GGCGGCGGCGGCAGCGGCGG CGGCGG CAGC)），串联方式为rIL-2-NPS-WT1，且鸡IL-2基因序列起始密码子后插入CGTCGTCGTTATTAT时组合效果最优。
6.2 rCaIFN-γ-GATA3蛋白在鸡体内半衰期测定
对试验过程中CaIFN-γ与GATA3不同串联方式获得的重组蛋白进行鸡体内半衰期测定。同时也比较了linker1（GGGGSGGGGS (GG CGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGG CAGC)） 和linker2（AGAGAG( GCCGGTGCCGGTGCCGGT)）对融合蛋白在鸡体内半衰期的影响。将本发明使用linker1制备的rCaIFN-γ-GATA3、rGATA3-CaIFN-γ、rCaIFN-γ蛋白和使用linker2制备的rCaIFN-γ-GATA3、rGATA3-CaIFN-γ、rCaIFN-γ蛋白，同时进行半衰期检测，选用3～4周龄SPF鸡，分为6组，每组10只，分别肌肉注射6组蛋白，注射剂量均按每kg体重10万单位，采集注射前、注射后1h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、96h采血，应用HPLC测定血液中重组干扰素的浓度。结果见表7和表8。
表7 血清中干扰素浓度测定结果(ng/ml)（linker1）
注：表中体现干扰素浓度均为10只鸡的算术平均值。
表8 血清中干扰素浓度测定结果(ng/ml)（linker2）
注：表中体现干扰素浓度均为10只鸡的算术平均值。
结果研究中通过比较linker1和linker2，发现两种linker对融合蛋白在鸡体内半衰期影响差异不显著，rCaIFN-γ-GATA3蛋白和rGATA3-CaIFN-γ、rCaIFN-γ 蛋白在注射后1h和2h时血清中干扰素浓度基本一致，但随着注射后检测时间的延长，rCaIFN-γ-GATA3血清中干扰素浓度逐渐升高，致注射后12h，血清中干扰素浓度可达102和100ng/ml，而同期rGATA3-CaIFN-γ注射组血清中干扰素浓度已经降至41和37ng/ml，rCaIFN-γ注射组血清中干扰素浓度已经降至5和3ng/ml，至注射后96h，rCaIFN-γ-GATA3注射组血清中仍可以检测到干扰素，rCaIFN-γ-GATA3蛋白半衰期显著延长。
综合研究中比较linker1和linker2对融合蛋白生物学活性和鸡体内半衰期实验数据，选择linker1作为本发明linker。试验确定最优组合为使用linker1（GGGGSGGGGS(GGCGGCGGCGGCAGCGGCGG CGGCGG CAGC)），串联方式为rCaIFN-γ-GATA3时组合效果最优。
7 疫苗稀释液制备（图5）
X粉：rIL-2*-NPS-WT1和rCaIFN-γ-GATA3蛋白粉按质量比1:20000比例混合。
Y液：为磷酸盐缓冲液：8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。
Z液
水相：每升水中加入谷氨酰胺10g、人工牛黄0.2g，葡萄糖氧化酶1g，维生素C 5mg，以上物质完全溶解后，取94份加入Tween-80 4份，过滤除菌后备用。
油相： 将矿物油121℃、100千帕压强灭菌后，按每升中加入月桂酸单甘酯0.5mg、维生素E 0.5mg备用。
乳化：乳剂缸中加入水相，将油相缓慢加入水相中并搅拌，油相和水相比为1:2，油相加入完毕后使用高剪切乳化机4000r/min乳化处理30min，得到Z液。
稀释液使用时使用Y液溶解X粉（按照每升Y液加入5.35mg X粉），溶解后，然后与Z液按体积比1:1混合均匀。
8 疫苗稀释液体内半衰期测定
稀释液使用时使用Y液溶解X粉，溶解后，然后与Z液按体积比1:1混合均匀。选用3～4周龄SPF鸡10只，肌肉注射疫苗稀释液0.3ml/只，采集注射前、注射后1h、2h、4h、6h、8h、12h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h采血，应用HPLC测定血液中IL-2和CaIFN-γ的浓度。结果见表9。
表9 血清中白介素和干扰素浓度测定结果(ng/ml)
9 疫苗稀释液应用
本发明稀释液可以用作活苗的稀释液，也可以用于灭活疫苗，以及亚单位疫苗、核酸疫苗等基因工程疫苗稀释。均能有效增强动物机体的免疫功能；同时有效地提高常规疫苗免疫效力和延长免疫持续期。
9.1 活苗的稀释液的应用
9.1.1 疫苗稀释液用于鸡传染性法氏囊活疫苗的应用
9.1.1.1 应用方法
按鸡传染性法氏囊活疫苗(冻干型）说明书，分别采用本发明的疫苗稀释液和灭菌生理盐水对鸡传染性法氏囊活疫苗进行稀释；选用10日龄SPF雏鸡60只，第1组疫苗稀释液组，20只；第2组生理盐水稀释组，20只；每只点眼或口服接种疫苗0.3ml，另选20只不接种作空白对照组，分别隔离饲养。于免疫前、免疫后7日、14日、21日、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月采血，测定血清中和抗体效价，统计并分析抗体变化规律。于6个月、7个月分别采用鸡传染性法氏囊毒株攻毒10只，每只点眼攻击强毒至少10个MID，72h将所有鸡扑杀剖检，检测统计法氏囊变化。
9.1.1.2 结果
免疫组试验鸡抗体免疫后逐渐升高，疫苗稀释液组比生理盐水免疫组产生抗体时间早，疫苗稀释液组抗体均高于同期生理盐水稀释组抗体。抗体检测结果具体见表10。
表10 各雏鸡试验组中和抗体检测结果
注：表中数据为20只鸡的算术平均值。
免疫后6个月攻毒时，对照组试验鸡相继出现精神萎顿、羽毛松乱、行动迟缓、拉白色稀便，12/20死亡；疫苗稀释液免疫组鸡均未见临床症状；生理盐水稀释免疫组试验鸡2只出现精神萎顿，拉白色稀便；剖检各组试验鸡观察法氏囊的病变情况，结果显示，疫苗稀释液免疫组试验鸡法氏囊保护率20/20；生理盐水稀释免疫组试验鸡法氏囊保护率18/20；对照组试验鸡法氏囊病变均为阳性。免疫后7个月攻毒时，对照组试验鸡相继出现精神萎顿、羽毛松乱、行动迟缓、拉白色稀便，20/20死亡；疫苗稀释液免疫组鸡2只出现精神萎顿，拉白色稀便；生理盐水稀释免疫组试验鸡12只出现精神萎顿，羽毛松乱、行动迟缓、拉白色稀便，死亡8只；剖检各组试验鸡观察法氏囊的病变情况；结果显示，疫苗稀释液免疫组试验鸡法氏囊保护率18/20；生理盐水稀释免疫组试验鸡法氏囊保护率8/20；对照组试验鸡法氏囊病变均为阳性。攻毒结果表明疫苗稀释液组比生理盐水免疫组抗体高峰期持续时间长，免疫持续期也更长。攻毒统计结果见表11。
表11 各试验组免疫攻毒保护统计结果
9.1.2 疫苗稀释液用于鸡传染性支气管炎活疫苗的应用
9.1.2.1 应用方法
按鸡传染性支气管炎活疫苗(冻干型）疫苗说明书，分别采用本发明的疫苗稀释液和灭菌生理盐水对鸡传染性支气管炎活疫苗进行稀释；选用21日龄SPF鸡60只，第1组疫苗稀释液组，20只；第2组生理盐水稀释组，20只；每只气管内接种疫苗0.3ml，另选20只不接种作空白对照组，分别隔离饲养。于免疫前、免疫后7日、14日、21日、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月采血，测定血清HI抗体效价，统计并分析抗体变化规律。于6个月、7个月分别采用鸡传染性支气管炎病毒毒株攻毒10只，每只滴鼻1~2滴，连续观察10日，统计各试验组鸡死亡情况。
9.1.2.2 结果
免疫后试验鸡中和抗体逐渐升高，疫苗稀释液组抗体均高于同期生理盐水稀释组抗体，且抗体高峰期持续时间长。疫苗稀释液组免疫后抗体滴度可高达1:31.56，各组试验鸡抗体检测结果具体见表12。
表12 各雏鸡试验组HI抗体检测结果
注：表中数据为20只鸡的算术平均值。
免疫后6个月攻毒时，对照组试验鸡20/20死亡；疫苗稀释液免疫组试验鸡传染性支气管炎保护率20/20；生理盐水稀释免疫组试验鸡法氏囊保护率16/20；免疫后7个月攻毒时，对照组试验鸡20/20死亡；疫苗稀释液免疫组试验鸡传染性支气管炎保护率16/20；生理盐水稀释免疫组试验鸡法氏囊保护率4/20；攻毒结果表明疫苗稀释液组比生理盐水免疫组抗体高峰期持续时间长，免疫持续期也更长。攻毒统计结果见表13。
表13 各试验组免疫攻毒保护统计结果
9.1.3 疫苗稀释液用于鸡新城疫活疫苗的应用
9.1.3.1 应用方法
按鸡新城疫活疫苗(冻干型）说明书按疫苗说明书，分别采用本发明的疫苗稀释液和灭菌生理盐水对疫苗进行稀释；选用30~60日龄SPF鸡60只，第1组疫苗稀释液组，20只；第2组生理盐水稀释组，20只；每只鼻滴接种疫苗0.3ml，另选20只不接种作空白对照组，分别隔离饲养。于免疫前、免疫后7日、14日、21日、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月采血，测定血清HI抗体效价，统计并分析抗体变化规律。于4个月、5个月分别采用鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AV1611)毒株攻毒10只，每只肌肉注射0.5ml(104.0ELD50)，观察14日，统计各试验组鸡死亡情况。
9.1.3.2 结果
免疫后试验鸡HI抗体逐渐升高，疫苗稀释液组抗体均高于同期生理盐水稀释组抗体，且抗体高峰期持续时间长。各组试验鸡抗体检测结果具体见表14。
表14 各雏鸡试验组HI抗体检测结果
注：表中数据为20只鸡的算术平均值。
免疫后4个月攻毒时，观察14日，对照组鸡自攻毒后出现精神沉郁、食欲不振、鸡冠发紫、点头呈啄米状、动作失调、排黄绿色和黄白色的稀粪等症状后，20/20死亡；疫苗稀释液免疫组试验鸡全部健活，保护率20/20，生理盐水稀释组死亡4只，其余鸡均健活，保护率16/20；免疫后5个月攻毒时，观察14日，结果对照组鸡自攻毒后出现精神沉郁、食欲不振、鸡冠发紫、点头呈啄米状、动作失调、排黄绿色和黄白色的稀粪等症状后，20/20死亡；疫苗稀释液免疫组试验鸡死亡2只，保护率18/20，生理盐水稀释组死亡12只，保护率8/20；攻毒结果表明疫苗稀释液组比生理盐水免疫组抗体高峰期持续时间长，免疫持续期也更长。攻毒统计结果见表15。
表15 各试验组免疫攻毒保护统计结果
9.2 灭活苗的稀释液的应用
9.2.1 疫苗稀释液用于禽流感病毒灭活疫苗的应用
9.2.1.1 应用方法
分别采用本发明的疫苗稀释液和灭菌生理盐水对禽流感病毒灭活疫苗进行1:1稀释；选用3～4周龄SPF雏鸡60只，第1组疫苗稀释液组，20只；第2组生理盐水稀释组，20只；按照疫苗说明书将稀释的疫苗2倍接种，0.6ml/只。另选20只不接种作空白对照组，分别隔离饲养。首免后14日同样方法剂量加强免疫一次，于二免疫前、二免疫后7日、14日、21日、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月采血，测定血清中和抗体效价，统计并分析抗体变化规律。于5个月、6个月分别采用禽流感病毒毒株攻毒10只，每只静脉注射0.1ml(含108.0ELID50)，攻毒后5日，采集每只鸡泄殖腔拭子，接种9～11日龄SPF鸡胚进行病毒分离，统计病毒分离阳性率。
9.2.1.2 结果
免疫组试验鸡抗体免疫后逐渐升高，疫苗稀释液组比生理盐水免疫组产生抗体时间早，稀释液组抗体均高于同期生理盐水稀释组抗体。抗体检测结果具体见表16。
表16 各雏鸡试验组HI抗体检测结果
注：表中数据为20只鸡的算术平均值。
免疫后5个月攻毒时，空白对照组禽流感病毒分离20/20均为阳性，疫苗稀释液组禽流感病毒分离阳性率为0/20，生理盐水稀释组禽流感病毒分离阳性率为2/20。免疫后6个月攻毒时，空白对照组禽流感病毒分离20/20均为阳性，疫苗稀释液组禽流感病毒分离阳性率为4/20，生理盐水稀释组禽流感病毒分离阳性率为14/20。抗体检测结果具体见表17。
表17 各试验组免疫攻毒保护统计结果
9.2.2 疫苗稀释液用于新城疫病毒灭活疫苗的应用
9.2.2.1 应用方法
分别采用本发明的疫苗稀释液和灭菌生理盐水对新城疫灭活疫苗进行1:1稀释；选用3～4周龄SPF雏鸡60只，第1组疫苗稀释液组，20只；第2组生理盐水稀释组，20只；按照疫苗说明书将稀释的疫苗2倍接种。每只肌肉注射2/10羽份，另选20只不接种作空白对照组，分别隔离饲养。首免后14日同样方法剂量加强免疫一次，于二免疫前、二免疫后7日、14日、21日、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月采血，测定血清HI抗体效价，统计并分析抗体变化规律。于4个月、5个月采用新城疫病毒毒株攻毒，每只肌肉注射0.5ml(104.0ELD50)，观察14日，统计各试验组鸡死亡情况。
9.2.2.2 结果
免疫后试验鸡HI抗体逐渐升高，疫苗稀释液组抗体均高于同期生理盐水稀释组抗体，且抗体高峰期持续时间长。各组试验鸡抗体检测结果具体见表18。
表18 各雏鸡试验组HI抗体检测结果
注：表中数据为20只鸡的算术平均值。
免疫后4个月攻毒时，观察14日，对照组鸡20/20死亡；疫苗稀释液免疫组试验鸡全部健活，保护率20/20，生理盐水稀释组死亡2只，保护率18/20；免疫后5个月攻毒时，观察14日，对照组鸡20/20死亡；疫苗稀释液免疫组试验鸡死亡2只，保护率18/20，生理盐水稀释组死亡16只，其余鸡均健活，保护率4/20；攻毒结果表明疫苗稀释液组比生理盐水免疫组抗体高峰期持续时间长，免疫持续期也更长。攻毒统计结果见表19。
表19 各试验组免疫攻毒保护统计结果
9.3 亚单位疫苗的稀释液的应用
9.3.1 疫苗稀释液用于禽流感病毒基因工程亚单位疫苗的应用
9.3.1.1 应用方法
分别采用本发明的疫苗稀释液和灭菌生理盐水对禽流感病毒基因工程亚单位疫苗进行1:1稀释；选用21～35日龄SPF雏鸡60只，第1组疫苗稀释液组，20只；第2组生理盐水稀释组，20只；按照疫苗说明书将稀释的疫苗2倍接种，每羽肌肉注射0.6ml，另选20只不接种作空白对照组，分别隔离饲养。首免后14日同样方法剂量加强免疫一次，于二免疫前、二免疫后7日、14日、21日、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月采血，测定血清HI抗体效价，统计并分析抗体变化规律。于4个月、5个月采用禽流感病毒毒株攻毒，每只静脉注射0.5ml(含105.0ELID50)，攻毒后5日，采集每只鸡泄殖腔拭子，接种9～11日龄SPF鸡胚进行病毒分离，统计病毒分离阳性率。
9.3.1.2 结果
免疫组试验鸡抗体免疫后逐渐升高，疫苗稀释液组比生理盐水免疫组产生抗体时间早，稀释液组抗体均高于同期生理盐水稀释组抗体。抗体检测结果具体见表20。
表20 各雏鸡试验组HI抗体检测结果
注：表中数据为20只鸡的算术平均值。
免疫后4个月攻毒时，空白对照组禽流感病毒分离20/20均为阳性，疫苗稀释液组禽流感病毒分离阳性率为0/20，生理盐水稀释组禽流感病毒分离阳性率为4/20。免疫后5个月攻毒时，空白对照组禽流感病毒分离20/20均为阳性，疫苗稀释液组禽流感病毒分离阳性率为2/20，生理盐水稀释组禽流感病毒分离阳性率为18/20。抗体检测结果具体见表21。
表21 各试验组免疫攻毒保护统计结果
9.3.2 疫苗稀释液用于新城疫病毒基因重组亚单位疫苗的应用
9.3.2.1 应用方法
分别采用本发明的疫苗稀释液和灭菌生理盐水对新城疫病毒基因重组亚单位疫苗进行1:1稀释；选用4～5周龄SPF雏鸡60只，第1组疫苗稀释液组，20只；第2组生理盐水稀释组，20只；按照疫苗说明书将稀释的疫苗2倍接种。每只肌肉注射0.6ml，另选20只不接种作空白对照组，分别隔离饲养。首免后14日同样方法剂量加强免疫一次，于二免疫前、二免疫后7日、14日、21日、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月采血，测定血清HI抗体效价，统计并分析抗体变化规律。于4个月、5个月分别采用新城疫病毒毒株攻毒10只，每只肌肉注射0.5ml(105.0ELD50)，攻毒后5日，采集每只鸡泄殖腔拭子，接种9～11日龄SPF鸡胚进行病毒分离，统计病毒分离阳性率，病毒分离为阴性的样品，应盲传一代后再次进行判定。
9.3.2.2 结果
免疫后试验鸡HI抗体逐渐升高，疫苗稀释液组抗体均高于同期生理盐水稀释组抗体，且抗体高峰期持续时间长。各组试验鸡抗体检测结果具体见表22。
表22 各雏鸡试验组HI抗体检测结果
注：表中数据为20只鸡的算术平均值。
免疫后4个月攻毒时，空白对照组禽流感病毒分离20/20均为阳性，疫苗稀释液组禽流感病毒分离阳性率为0/20，生理盐水稀释组禽流感病毒分离阳性率为6/20。免疫后5个月攻毒时，空白对照组禽流感病毒分离20/20均为阳性，疫苗稀释液组禽流感病毒分离阳性率为2/20，生理盐水稀释组禽流感病毒分离阳性率为16/20。攻毒结果表明疫苗稀释液组比生理盐水免疫组抗体高峰期持续时间长，免疫持续期也更长。攻毒统计结果见表23。
表23 各试验组免疫攻毒保护统计结果
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (22)

1.融合蛋白A，由顺序连接IL-2蛋白、NPS蛋白和WT1蛋白组成；
所述IL-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述NPS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述WT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白A，其特征在于，所述IL-2蛋白与NPS蛋白通过GGGGSGGGGS连接，所述NPS蛋白与WT1蛋白通过GGGGSGGGGS连接。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白A，其特征在于，所述IL-2蛋白的N端还包括RRRYY片段。
4.根据权利要求1~3任一项所述的融合蛋白A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
5.组合物，其包括权利要求1~4任一项所述的融合蛋白A和融合蛋白B；
所述融合蛋白B由顺序连接的CaIFN-γ蛋白和GATA3蛋白组成；
所述CaIFN-γ蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述GATA3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述CaIFN-γ蛋白与GATA3蛋白通过GGGGSGGGGS连接。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述融合蛋白B的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
8.根据权利要求5~7任一项所述的组合物，其特征在于，所述融合蛋白A和融合蛋白B的质量比为1:20000。
9.生物材料，其包括如下I）~IV）中至少一个：
I)、编码权利要求1~4任一项所述融合蛋白A的核酸和/或编码权利要求5~7任一项所述的融合蛋白B的核酸；
II）、含有I)所述核酸的质粒载体；
III)、基因组中整合有I)所述的核酸分子的宿主细胞；
IV)、转化或转染有II)所述的质粒载体的宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的生物材料，其特征在于，所述核酸中：
编码所述IL-2蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.8所示；
编码所述NPS蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.9所示；
编码所述WT1蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.10所示；
编码所述CaIFN-γ蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.11所示；
编码所述GATA3蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.12所示。
11.权利要求1~4任一项所述融合蛋白A、权利要求5~7任一项所述的组合物和/或权利要求9或10所述的生物材料在制备疫苗稀释液中的应用。
12.疫苗稀释液，其特征在于，包括：权利要求1~4任一项所述融合蛋白A和/或权利要求5~7任一项所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的疫苗稀释液，其特征在于，还包括：缓冲液、水相和油相，其中：
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
所述水相包括水、谷氨酰胺、牛黄、葡萄糖氧化酶、维生素C和吐温；
所述油相包括矿物油、月桂酸单甘酯和维生素E。
14.根据权利要求13所述的疫苗稀释液，其特征在于，
所述磷酸盐缓冲液由水和如下浓度的组分组成：8.0g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/LNa2HPO4、0.24g/L KH2PO4；
所述水相由水和如下浓度的组分组成：谷氨酰胺10g/L、牛黄0.2g/L，葡萄糖氧化酶1g/L，维生素C 5mg/L和4wt%吐温；
所述油相中，月桂酸单甘酯的浓度为0.5mg/L，维生素E的浓度为0.5mg/L。
15.根据权利要求13所述的疫苗稀释液，其特征在于，其中，缓冲液、水相和油相的质量比为3:2:1。
16.根据权利要求12~15任一项所述的疫苗稀释液，其特征在于，其中融合蛋白A的浓度为1.34×10-4mg/L，融合蛋白B的浓度为2.67mg/L。
17.权利要求12~16任一项所述疫苗稀释液的制备方法，其包括：
以缓冲液溶解权利要求5~7任一项所述的组合物，获得蛋白溶液；
将油相与水相混合后，经乳化与所述蛋白溶液混合，制得所述疫苗稀释液。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述乳化的条件包括：4000r/min高剪切乳化处理30min。
19.权利要求12~16任一项所述疫苗稀释液或权利要求17或18所述制备方法制得的疫苗稀释液，在稀释疫苗中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述疫苗为活疫苗、灭活疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，
所述活疫苗为鸡传染性法氏囊活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗和/或鸡新城疫活疫苗；
所述灭活疫苗为禽流感病毒灭活疫苗和/或新城疫灭活疫苗；
所述亚单位疫苗为禽流感病毒基因工程亚单位疫苗和/或新城疫病毒基因重组亚单位疫苗。
22.疫苗，其包括权利要求12~16任一项所述疫苗稀释液或权利要求17或18所述制备方法制得的疫苗稀释液。
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