CN118879552B - 一种耐氟贝莱斯芽孢杆菌及其制备的菌剂 - Google Patents

一种耐氟贝莱斯芽孢杆菌及其制备的菌剂

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Abstract

本发明公开了一种耐氟贝莱斯芽孢杆菌及其制备的菌剂；该菌株属于贝莱斯芽孢杆菌，命名为Bacillus velezensis Y500，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTC)，其保藏号为CCTCC NO:M 2024562，保藏日期为2024.3.25。该微生物的生长适宜温度为15‑37℃，生长适宜的pH值范围为5.0‑9.0。有益效果：该菌株对于氟元素具有很好的耐受性，可以对氟元素进行吸附和积累，该菌株以及保留此活性菌种的传代株能够应用于水体除氟和茶叶降氟处理，为改善氟污染、提高茶叶品质提供研究思路。

Description

一种耐氟贝莱斯芽孢杆菌及其制备的菌剂
技术领域
本发明涉及微生物菌株技术领域，具体涉及一种耐氟贝莱斯芽孢杆菌及其制备的菌剂。
背景技术
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是2005年才被认定的芽孢杆菌属新种。贝莱斯芽孢杆菌广泛分布于空气、土壤、江河湖泊、动物肠道、植物根系及组织等环境中，为需氧或兼性厌氧菌，有鞭毛，可运动。在盐浓度为12％，温度15～45℃，pH5～10的培养条件下均可生长。虽然贝莱斯芽孢杆菌的发现时间短暂，但关于贝莱斯芽孢杆菌的研究报道却日益增多。国内外研究表明，贝莱斯芽孢杆菌具有拮抗植物病原真菌和细菌作用，是一种高效的、可以开发利用的新型生防细菌，在生物防治上具有无限挖掘潜力。
茶树的栽培管理是茶园品质中的重要一环，通过茶园施肥降低茶叶氟含量也是重要的手段之一，主要包含了生石灰降氟、低浓度铝肥、硒肥降氟。通过化学施肥影响绿色生态茶园、有机茶园的建设，而生物肥料优势明显，性价比高，前景广阔，更为绿色环保可持续。虽然微生物菌肥市场日趋成熟，选择广泛，组合多样，但是关于茶树内生菌肥降氟报道较少。茶树内生菌研究越来越广泛深科，利用茶树自身菌种特点，进行耐氟菌群的筛选，并进行茶树降氟试验，对茶产业的发展具有良好的经济和生态价值。
公布号为CN117757700A的中国专利申请文献，公开了一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用，该贝莱斯芽孢杆菌的拉丁名为Bacillus velezensis，保藏编号为GDMCC NO.63555；利用该专利提供的贝莱斯芽孢杆菌及其制备的菌剂，应用于植物根际可以有效应防治植物病害、促进植物生长，为农业生产、生物防治和环境治理提供了新的手段。但该专利并没有公开本发明的耐氟贝莱斯芽孢杆菌。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种耐氟贝莱斯芽孢杆菌。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
本发明的第一方面提出一株贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis Y500，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTC)，其保藏号为CCTCC NO:M 2024562，保藏日期为2024年3月25日。
有益效果：本发明提供一种耐氟贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensisY500，菌落呈现乳白色的圆形状态，质地粘稠，表面光滑稍凸，好氧，pH在5.0-9.0，温度在15-37℃正常生存。该菌株对于氟元素具有很好的耐受性，可以对氟元素进行吸附和积累，该菌株以及保留此活性菌种的传代株能够应用于水体除氟和茶叶降氟处理，为改善氟污染、提高茶叶品质提供研究思路。
优选的，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，该菌株的生长适宜温度为15-37℃，生长的适宜pH值范围为5.0-9.0。
优选的，该菌株的培养物为LB培养基，扩大培养中的接种量为1％。
本发明的第二方面提出一种微生物菌剂，其包含上述的贝莱斯芽孢杆菌。
优选的，还包含辅料。
优选的，所述菌剂为粉剂、颗粒剂或悬浮剂。
本发明的第三方面提出上述微生物菌剂在吸附氟元素中的应用。
优选的，所述氟元素的浓度≤600mg/L。
优选的，所述氟元素的浓度为500mg/L。
本发明的优点在于：
本发明提出的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis Y500，菌落呈现乳白色的圆形状态，质地粘稠，表面光滑稍凸，好氧，pH在5.0-9.0，温度在15-37℃正常生存。该菌株以及保留此活性菌种的传代株对于氟元素具有很好的耐受性，可以对氟元素进行吸附和积累，能够应用于水体除氟和茶叶降氟处理，为改善氟污染、提高茶叶品质提供研究思路。
附图说明
图1为不同pH值处理下芽孢杆菌活性和LB培养基pH值变化图；
图2为不同F处理浓度下芽孢杆菌活性和LB培养基pH值变化图；
图3为不同F处理浓度下芽孢杆菌的活性、除氟率、吸附量、pH值及其胞内外含氟量的变化图；
图4为在不同F处理下芽孢杆菌对舒茶早茶苗叶片氟含量的影响图；
图5为芽孢杆菌对舒茶早和湖北群体种茶树叶片氟含量的影响图；图中“*”代表p<0.05,“**”代表p<0.01,“***”代表p<0.001，“****”代表p<0.0001。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1：
茶树耐氟内生菌的筛选：
从湖北赤壁群体种茶园取样，在超净台中将用纯水洗涤后的叶片整片放置在70％的乙醇中保持2min，并使其完全淹没。然后无菌水洗涤4次，之后用Cl-浓度为3％的次氯酸钠浸泡3min，最后使用无菌水洗涤3次。取无菌滤纸吸取多余水分，无菌剪刀剪碎叶片，放入无菌研钵中并加入少量的无菌石英砂研磨。接着加入10倍体积的磷酸缓冲液(pH＝7)匀浆，静置5min，取悬液进行10倍系列稀释，共计6个浓度。每个浓度各取100μL涂抹在含20ml LB的固体培养基上，其F浓度为50mg/L，每个梯度重复3次。封口膜密封，倒置在37℃中恒温培养箱中暗培养。为验证植株体外灭菌过程的有效性，取100μL最后一遍洗涤过的无菌水均匀涂布于LB固体培养基上做对照，37℃恒温培养一周，以无任何菌落生长的对照作为有效的体表灭菌。将不同稀释梯度的50mg/L氟处理组分离到的内生细菌接种到含氟量为100mg/L的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中倒置培养。之后以50mg/L为间隔逐渐提高F浓度并同时进行分离纯化，将得到的菌种鉴定保存。
经过进行16SrDNA菌种鉴定的结果为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)并在2024年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTC)，其保藏号为CCTCC NO:M2024562，另命名为Bacillus velezensis Y500。
其16S rDNA序列如下所示：
AGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGT
AACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAA
TACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACC
ACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAA
GGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC
ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAA
GTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTG
TTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAA
CCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAA
GCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGAT
GTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGT
GCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGA
GGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGA
AAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATG
AGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCA
CTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC
CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC
AGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAG
TGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC
CGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGG
TGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCC
CTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAAC
CGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAAC
TCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAAT
ACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGC(SEQ ID NO.1)
测试贝莱斯芽孢杆菌的在不同pH下生长状况:
调整LB培养基的酸碱度，使用4.1mol/L的NaOH和10％的硝酸调其pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10，设置3个重复，无菌处理后接种1％的贝莱斯芽孢杆菌于含100mLLB液体的三角瓶中，并将其置于恒温振荡培养箱中37℃，150r/min培养，5天后测定其pH和活性变化。结果如图1的B所示，贝莱斯芽孢杆菌在pH为5、6、7、8、9之间生长变化较为活跃，其中最适宜生长的pH值为6。
将菌液于离心机中6000r/10min离心，测定其上清液pH值的变化，结果如图1的A中所示，与设定结果相比，培养基初始pH值为5、6和7的上清液的pH值显著上升，而培养基初始pH为9和10的上清液的pH值有所降低，由此可知贝莱斯芽孢杆菌的生长可以影响培养环境的pH，以适应环境的变化。
测试贝莱斯芽孢杆菌的最低抑制浓度(MIC)和酸碱度变化：
用氟化钠配置不同F浓度(0、5、20、50、100、200、300、400、500、600、700mg/L)的LB培养基并置于250mL的三角瓶中，测定其各自培养基的pH，灭菌后再次测定含氟量，并挑取1环贝莱斯芽孢杆菌接种，置于恒温振荡培养箱中37℃，150r/min暗培养24h，从接种的第8个小时开始，每隔2个小时取培养液样本测定其OD600的变化，结果如图2所示。从图2的A中可以看出该菌株在含氟培养基中24小时的活性变化，贝莱斯芽孢杆菌在不同F浓度处理下和不同时间段活性趋势不同，除去含F浓度为700mg/L的菌株从始至终停止生长外，在16h之前F浓度越低生长越快；在18h时芽孢杆菌整体处于低活性时段，此后整体呈现上升趋势；在20h后，不同F浓度处理下芽孢杆菌的生长速率发生变化，特别是22h时的0F、5F、20F和50F(此处50F即表示50mg/L，其余同理)处理组的菌株生长趋缓，而500F和600F处理组的芽孢杆菌生长迅猛，其余F浓度处理组下芽孢杆菌生长速度也明显加快。
将不同F处理组的贝莱斯芽孢杆菌菌液于离心机中6000r/10min离心，测定其上清液pH值的变化。如图B中可见，在CK组(无菌)处理组中，随着F浓度的增加，LB培养基pH值有所变化，但是所有处理组均处于弱酸性条件下。而接入贝莱斯芽孢杆菌处理后，除去含F浓度为700mg/L的菌株外，其他LB培养基的pH均发生显著变化，且所有处理组均处于碱性环境中。结合图1可知，贝莱斯芽孢杆菌的生长可以改变LB培养基的pH值，使得溶液的pH值在9左右，呈现碱性；在培养基经F处理后，0F、5F、20F、50F、100F、200F、300F、400F组的pH值在8左右，变化显著，而500F和600F组的pH值小于8，增幅较小。
结合图1和图2，推测贝莱斯芽孢杆菌对环境中的pH适应性较强，该菌株可能通过自身生长代谢影响生存环境的酸碱变化，进而提高自身对环境中氟化物耐受性。
测试贝莱斯芽孢杆菌对F的吸附和积累能力：
设置LB培养基的F浓度分别为0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L，超声溶解后，调整其pH为5.0±0.02，各处理3次重复。无菌处理后再次测定不同F处理组的实际含氟量。无菌条件下，准确挑取1环的strain Y500接入到100mL的无菌LB培养基中，放入恒温培养箱中37℃，150r/min下振荡暗培养120h。先取200μL测其OD600值，然后将剩下菌液在50mL无菌离心管中6000r/min离心10min，取2mL上清液测定pH变化，再一部分上清液和TISAB缓冲液以体积1：1混匀，用氟离子选择电极测定残余F浓度后代入公式(1-1)计算除氟率。沉淀的细菌使用0.85％ NaCl洗涤3次，70℃彻底干燥后，测定细菌干重后代入公式(1-2)计算菌体对F的吸附量。结果如图3的A、B和C所示，与含F浓度为0mg/L的对照组相比，含F浓度为5、10、20、50mg/L处理组的菌株活性均有所增加，说明F可能参与该菌株的生长发育；菌体对F的吸附量随着F浓度的增加而增加，而上清液的除氟率随着F浓度的增加而降低，整体的除氟率在1-4％之间。上清液的pH值整体显著上升，培养基由弱酸性转变为碱性。
式中：R为吸附率(％)，C0和Ct分别为上清液初始的实际F浓度和吸附后的F浓度(mg/L)；q为吸附量(mg/g)，V为溶液体积(mL)，m为菌体干重(g)。
将上述试验中干燥后的细菌用无菌水洗涤两次，然后采用0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)10mL涡旋2min，6000r/min离心10min，取上清液和TISAB缓冲液体积1：1混匀，用氟离子选择电极测定后代入公式(1-3)计算菌株的胞外含氟量，结果如图3的D所示，随着F浓度的提升，菌株的胞外F含量逐步上升，与0F相比变化显著。
将最后剩余的沉淀细菌，放进烘箱再次70℃干燥，取完全干燥后的细菌0.1000g(精确到0.0001g)，放入到30mL的镍坩埚中，加入1.00g固体NaOH并混匀，加盖后放入马弗炉中300℃/30min，600℃/1h，碱熔消解后，关掉马弗炉，待其降至室温，取出坩埚，加入5.0mL体积分数为10％的稀硝酸溶液洗涤坩埚内壁，调节pH至8.0-9.0，转移样品至50mL容量瓶中并定容，混匀后滤纸过滤，取过滤液与TISAB缓冲液以体积1：1混匀，用氟离子选择电极测定后代入公式(1-4)计算其胞内的含氟量，结果如图3的D所示，随着F浓度的提高，菌株对F的胞内积累能力逐渐提高。结合菌株胞外和胞内含F量的变化来看，在不同F浓度处理下，贝莱斯芽胞杆菌对F的胞内累积和胞外附着能力与生长环境的氟浓度呈正比，两者的变化趋势一致。
贝莱斯芽孢杆菌的菌株悬液制备：
将贝莱斯芽孢杆菌放入LB培养基中，37℃/150r培养至OD600值为1时，6000r/10min离心，弃去上清液，无菌水洗涤后，再次6000r/10min离心后，使用无菌水稀释，使其营养液或水溶液的含菌量为2×10-4CFU。
茶树营养液配置和使用
营养液的母液配置如表1-1所示，使用时稀释至所需浓度如表1-2所示，并使用16.8mol/L的NaOH和20％的硝酸调节其pH值，范围如表所示。
表1-1营养液母液配制
表1-2营养液稀释浓度
TISAB缓冲溶液配置：取58g的NaCl和68g的Na3C6H5O7·2H2O置于烧杯，加入700mL的超纯水混匀并超声溶解，于通风橱内添加57mL冰乙酸混匀并静置10min，使用16.8mol/L的NaOH调节其pH值为5.2-5.3之间，转移至容量瓶并定容至1L，冷却至室温后使用。
水溶氟含量测定：称取茶样0.1500g(精确到0.0001g)放入50ml离心管中，加入20ml超纯水，放入100℃的水浴锅中水浴30min，取出并冷却至室温，滤纸过滤，按照1:1的体积比例添加茶叶样品和TISAB缓冲溶液，于离心管中混匀，用氟离子电极测定其含氟量后代入公式(1-3)计算最终水溶氟含量。
式中：X为样品的最终F浓度(mg/kg)，A为样品测定氟浓度(mg/L)，A0为空白液测定氟浓度(mg/L)，V为样品总体积(mL)，m为样品质量(g)。
总氟含量测定：分别称取1-3叶和4-6叶的粉末约0.2500g(精确至0.0001g)茶叶试样放入30ml的镍坩埚中，加入2.5g固体NaOH并混匀，加盖后放入马弗炉中逐步升温，300℃/30min，600℃/1h，碱熔消解后，关掉马弗炉，待其降至室温，取出坩埚，加入5.0mL体积分数为10％的稀硝酸溶液，洗涤坩埚内壁，将洗涤液转移置烧杯中，调节其pH至8.0-9.0，然后转移样品至50mL容量瓶中并使用超纯水定容，混匀后滤纸过滤，取其滤液与TISAB缓冲液以体积1：1比例混匀，用氟离子选择电极测定其含氟量后代入公式(1-4)计算最终的总氟含量。
式中：ω为样品最终的F浓度(mg/kg)，A为样品测定氟浓度(mg/L)，A0为空白液测定氟浓度(mg/L)，m为样品质量(g),V为样品提取液总体积(mL)。
水培实验
在不同F处理下，接种芽孢杆菌能够影响茶苗叶片的氟含量变化。如图4所示，从A柱状图中可以看出，在不同浓度的氟处理组中(0、5、10mg·L-1)，与各自的对照组相比，芽孢杆菌处理后的茶苗1-3叶的水溶氟含量显著下降(p<0.05)，除氟率分别达到了21.20％、25.01％和32.20％；由B柱状图可知，与各自的对照组相比，芽孢杆菌处理后的茶苗4-6叶的水溶氟含量有所下降，特别是0F和10F处理组的水溶氟含量显著降低(p<0.05)，分别达到了12.30％和9.97％；由C图和D图中的结果可知，在不同F处理组中，接种芽孢杆菌后的茶苗1-3叶和4-6叶的总氟含量均有所降低，特别是10F处理组，其1-3叶和4-6叶的总氟降低效果显著(p<0.001)，分别达到了26.62％和34.46％，而0F和5F处理组的叶片总氟含量虽有所降低但并无显著性。具体除氟效果如下表1-3所示。
表1-3不同氟浓度处理下芽孢杆菌的除氟率
表1-4氟胁迫下舒茶早茶树幼苗不同部位富集系数
富集系数是指某处理部位元素含量与外源添加该元素浓度的比值，富集系数越高，表明植物吸收该元素的能力越强。如表1-4所示，舒茶早茶苗在不同浓度氟处理下，不同部位的富集系数在54.19-198.97之间，其中茶树4-6叶的富集系数整体高于1-3叶的富集系数，老叶富集能力大于嫩叶。在接种芽孢杆菌后，叶片的富集系数发生变化，与CK组相比，茶树叶片的富集系数整体降低，说明贝莱斯芽孢杆菌可以干预茶树对氟的富集。结合图4和表1-3的结果，推测贝莱斯芽孢杆菌能够影响茶树对氟化物的吸收利用，减少叶片中的氟含量，且该菌株在高氟胁迫下的降氟效果更显著。
田间验证试验
1、该菌株在2023年6-8月的安徽省宣城市宁国县的舒茶早茶园中进行田间验证试验，设置CK组、芽孢杆菌组，隔行设置隔离带，重复5次，每个重复10棵茶树，每组50棵茶树。每10d根部灌菌1次(500mL/棵/次，每组共计25L，菌液含菌量为2×10-4CFU)，共6次，时长2个月。将收获的1-3叶和4-6叶进行105℃干燥2小时，磨样测定并计算其水溶氟和总氟含量。
2、该菌株在2023年10-12月的湖北省赤壁市的赵李桥茶厂的群体种茶园中进行田间验证试验，设置CK组、芽孢杆菌组，隔行设置隔离带，重复5次，每组30m2，每个重复间隔1m2。每12d根部灌菌1次(1000mL/m2/次，每组共计30L，菌液含菌量为2×10-4CFU)，共5次，时长2个月。将收获的1-3叶和4-6叶进行105℃干燥2小时，磨样测定并计算其水溶氟和总氟含量。
图5中的A和B图分别表示宣城宁国茶园舒茶早茶树叶片体内水溶氟和总氟含量的变化，与CK组相比，接种芽孢杆菌后使得茶树叶片的水溶氟和总氟含量均有所下降。其中由图5的A柱状图中可知，该菌株促使茶树1-3叶和4-6叶水溶含量显著下降(p<0.01)，其降氟率达到了40.40％和21.83％。由图5中的B柱状图的结果可知，与CK组相比，接种芽孢杆菌使得茶树总氟含量有所下降，尤其是4-6叶总氟含量下降显著(p<0.05)，其降氟率达到了21.67％。
图5中的C和D图分别表示湖北群体种茶树1-3叶和4-6叶水溶氟和总氟含量的变化。如C图所示，与CK组相比，接种芽孢杆菌后，茶树1-3叶的水溶氟含量有所降低，但是无统计学意义；而4-6叶水溶氟含量显著降低(p<0.0001)，其除氟率约为35.22％。如D图所示，与CK组相比，接种芽孢杆菌后，茶树1-3叶和4-6叶的总氟含量均显著降低(p<0.001)，降氟率分别达到了25.24％和21.88％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillusvelezensis Y500，其特征在于，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTC），其保藏号为CCTCC NO: M 2024562，保藏日期为2024年3月25日。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillusvelezensis Y500，其特征在于，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillusvelezensis Y500，其特征在于，该菌株的生长适宜温度为15-37℃，生长的适宜pH值范围为5.0-9.0。
4.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillusvelezensis Y500，其特征在于，该菌株的培养物为LB培养基，扩大培养中的接种量为1%。
5.一种微生物菌剂，其包含权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillusvelezensis Y500。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，还包含辅料。
7.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂为粉剂、颗粒剂或悬浮剂。
8.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂为粉剂。
9.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂为颗粒剂。
10.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂为悬浮剂。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117757657A (zh) * 2022-11-11 2024-03-26 慕恩（广州）生物科技有限公司 一株扭托甲基杆菌及其微生物菌剂的应用
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