CN118599762A - 一种基于去细胞化肺支架的血管化肺癌组织工程模型及其制备方法与应用 - Google Patents
一种基于去细胞化肺支架的血管化肺癌组织工程模型及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于去细胞化肺支架的血管化肺癌组织工程模型及其制备方法与应用，属于肿瘤组织工程技术领域。本发明取肺组织依次灌注TritonX‑100溶液、脱氧胆酸钠溶液和DNA酶溶液后浸泡得到去细胞化肺组织，冷冻干燥过夜后打孔取材得到去细胞化肺支架；将血管类器官消化形成的多细胞悬液和肺癌细胞依次接种至灭菌且预平衡后的去细胞化肺支架上，加入共培养基培养得到所述的血管化肺癌组织工程模型。本发明顺序接种人胚胎干细胞分化而来的血管类器官源性细胞和肺癌细胞于冷冻干燥改良的去细胞化肺支架上，形成的血管化肿瘤组织工程模型不但可进行肿瘤病理生理研究，且有望为体外药物的测试和筛选提供新的体外研究模型。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤组织工程技术领域，尤其涉及一种基于去细胞化肺支架的血管化肺癌组织工程模型及其制备方法与应用。
背景技术
肺癌是当前世界上死亡率最高的恶性肿瘤，其恶性程度与其所处肿瘤微环境密切相关。血管在肿瘤微环境中扮演着关键角色，新生血管为肿瘤细胞增殖提供的氧气和营养物质，同时为肿瘤的血行转移提供条件；不完整的血管壁使药物渗漏，降低药物递送效率。微环境中细胞外基质作为“桥梁”联结不同细胞和细胞外调节因子，为细胞提供粘附和增殖的场所，有利于细胞外调节因子作用发挥。目前二维平面模型在模拟肿瘤细胞外基质中尚有不足，因此亟需构建一种能模拟肿瘤微环境的体外三维模型，以反映肿瘤的发生发展过程。肿瘤组织工程技术将种子细胞与反应细胞外基质的生物支架材料结合起来，癌细胞与血管细胞在生物支架上形成了细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互作用的统一体，为体外模拟肿瘤微环境搭建了平台，为肿瘤病理生理研究提供新的体外研究模型，且同时在体外药物的测试和筛选中有深远应用。
传统肺癌模型中血管化常为内皮细胞，其成分单一，缺乏血管系统内皮细胞与血管相关细胞(周细胞和平滑肌细胞)间相互作用，不能完全模拟在体肿瘤与血管复杂细胞成分之间相互作用的微环境。
生物支架材料影响细胞黏附、分布和增殖，其中细胞外基质是一种反应组织三维微环境的优良的支架材料。现有模型中常用的细胞外基质有人工合成聚合物、单一成分天然材料、基质胶与去细胞化水凝胶，他们有一定的局限性。(1)人工合成聚合物(聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸聚糖等)其缺乏体内样结构和天然成分，(2)天然材料(透明质酸、胶原等)成分单一，与体内细胞外基质复杂成分相距甚远，(3)基质胶与去细胞化水凝胶不具有完整组织结构等缺点。而且现有的基于整肺细胞接种的肺癌组织工程技术其操作繁琐，所需种子细胞及培养基用量较大而限制了其作为药物筛选模型的应用。因此，一种大小适宜、操作便捷的肺去细胞化基质支架亟待建立。
综上，目前亟需开发一种能包含血管复杂细胞种类和细胞外基质成分的反应肿瘤微环境并为血管化肿瘤病理生理研究或体外药物的测试和筛选提供有效支撑的体外模型，以期解决现有技术中的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于去细胞化肺支架的血管化肺癌组织工程模型及其制备方法与应用，利用一种含有反应组织微环境中生物化学组成和生物物理特性，并具有良好的生物相容性以利于种子细胞黏附、增殖的天然去细胞化肺支架，通过接种肺癌细胞和具有更为完善的血管成分与细胞间相互作用的经胚胎干细胞诱导而来的血管类器官源性细胞来构建更为仿生的体外血管化肿瘤，可用于肿瘤病理生理研究，同时可用于体外药物测试和筛选。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种血管化肺癌组织工程模型的制备方法，包括以下步骤：
1)取肺组织依次灌注TritonX-100溶液、脱氧胆酸钠溶液和DNA酶溶液后浸泡得到去细胞化肺组织，将去细胞化肺组织进行冷冻干燥过夜后打孔取材，得到去细胞化肺支架；
2)将胶原酶消化血管类器官后形成的多细胞悬液接种至灭菌且预平衡后的去细胞化肺支架上，使细胞贴附后加入共培养基培养；然后再将肺癌细胞接种至去细胞化肺支架上，使细胞贴附后加入共培养基培养得到所述的血管化肺癌组织工程模型；
所述肺癌细胞和血管类器官细胞的细胞数目比为0.5～2：0.5～2，每个去细胞化肺支架上细胞接种总数量不少于2×105。
优选的，所述冷冻干燥的条件为：在-25～-15℃预冷2～24h后，在
-50～-60℃的温度下冻干4～48h。
优选的，所述去细胞化肺基质支架为直径3～7mm，厚度0.5～2mm的圆柱形结构。
优选的，所述TritonX-100溶液的体积分数为0.5～2％，所述TritonX-100溶液和肺组织的体积质量比为3～5mL:1～1.5g，所述TritonX-100溶液浸泡的时间为12～24h；
所述脱氧胆酸钠溶液的浓度为15～25mg/mL，所述脱氧胆酸钠溶液和肺组织的体积质量比为3～5mL:1～1.5g，所述脱氧胆酸钠溶液浸泡的时间为12～24h；
所述DNA酶溶液的浓度为25～35μg/mL，所述DNA酶溶液和肺组织的体积质量比为3～5mL:1～1.5g，所述DNA酶溶液浸泡的时间为1～2h。
优选的，所述血管类器官的制备方法包括以下步骤：
1)将H9人胚胎干细胞在Y-27632的mTeSRTM培养基中培养0.5～1.5d形成拟胚体；
2)将形成拟胚体的H9人胚胎干细胞在第一分化培养基中培养2～4d形成中胚层；
3)将形成中胚层的H9人胚胎干细胞在第二分化培养基中培养2～4d得到血管类器官；
所述第一分化培养基包括基础培养基和以下组分：10～15μM CHIR 99021、25～35ng/mL BMP-4、0.3～0.7mL N2添加剂、0.5～1.5mL B27添加剂；
所述第二分化培养基包括基础培养基和以下组分：80～120ng/mL VEGF-A、1～3μMForskolin、0.3～0.7mL N2添加剂、0.5～1.5mL B27添加剂；
所述基础培养基由DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基组成，所述DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的体积比为0.5～2：0.5～2。
优选的，步骤2)中所述胶原酶的浓度为0.5～2mg/mL；所述消化的时间为10～30min。
优选的，所述灭菌处理为将多细胞悬液接种至70～80％乙醇中1～3h，所述预平衡为用含血清DMEM/F-12培养基预平衡12～48h。
优选的，所述细胞贴附的条件为在30～40℃，3～8％CO2的条件下使细胞贴附0.5～2h，所述血管类器官细胞加入共培养基培养的时间为5～7d，所述肺癌细胞加入共培养基培养的时间为3～5d。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的血管化肺癌组织工程模型。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的血管化肺癌组织工程模型或所述的血管化肺癌组织工程模型在血管化肿瘤病理生理研究或体外药物的测试、筛选中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的去细胞化肺支架含有天然组织所特有的各细胞外基质成分(糖胺聚糖与蛋白聚糖，胶原纤维与弹性纤维等)，同时可作为各种细胞因子和信号分子的“储库”，其优良的生物相容性体现为无需胶原或基质胶包被而支持细胞在其上的黏附和生长。
本发明通过对去细胞化肺组织进行冷冻干操作以提升其机械性能，便于对其加工形成一定形状和厚度的去细胞化肺支架，最终获得大小适中且均一，生物相容性优良且操作便捷的组织工程支架。
本发明的血管类器官其克服了传统血管化肺癌模型中单一内皮细胞缺乏与血管相关细胞(周细胞和血管平滑肌细胞等)间相互作用的缺点，为肿瘤血管化提供了理想种子细胞来源。顺序接种人胚胎干细胞分化而来的血管类器官源性细胞和肺癌细胞于冷冻干燥改良的去细胞化肺支架上，形成的血管化肿瘤组织工程模型不但可进行肿瘤病理生理研究，且有望为体外药物的测试和筛选提供新的体外研究模型。
附图说明
图1为本发明实施例1制备去细胞化小鼠肺支架制备示意图；
图2为未去细胞化和去细胞化小鼠肺组织大体观及残余DNA检测；a.大体观结果；b.残余DNA结果；
图3为未去细胞化小鼠肺组织和本发明实施例1去细胞化后小鼠肺组织H&E染色、SEM扫描电镜、Weigert染色、阿利新蓝染色和免疫荧光染色检测结果图；
图4为二维A549单独培养组、三维A549单独培养组和三维血管化肺癌共培养组血管化肺癌组织工程模型的细胞表征；a.免疫荧光染色结果；b.qPCR检测结果；
图5为DDP作用去细胞化肺支架后对细胞凋亡的影响；
图6为NaHS作用后对血管化肺癌组织工程模型细胞外基质的影响；
图7为NaHS作用后对去细胞化肺支架上间质细胞的影响；a.免疫荧光染色结果；b.qPCR检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种血管化肺癌组织工程模型的制备方法，包括以下步骤：
1)取肺组织依次灌注TritonX-100溶液、脱氧胆酸钠溶液和DNA酶溶液后浸泡得到去细胞化肺组织，将去细胞化肺组织进行冷冻干燥过夜后打孔取材，得到去细胞化肺支架；
2)将胶原酶消化血管类器官后形成的多细胞悬液接种至灭菌且预平衡后的去细胞化肺支架上，使细胞贴附后加入共培养基培养；然后再将肺癌细胞接种至去细胞化肺支架上，使细胞贴附后加入共培养基培养得到所述的血管化肺癌组织工程模型；
所述肺癌细胞和血管类器官细胞的细胞数目比优选为0.5～2：0.5～2，进一步优选为0.8～1.5：0.8～1.5；每个去细胞化肺支架上细胞接种总数量不少于2×105。
在本发明中，取肺组织依次灌注TritonX-100溶液、脱氧胆酸钠溶液和DNA酶溶液后浸泡得到去细胞化肺组织，将去细胞化肺组织进行冷冻干燥过夜后打孔取材，得到去细胞化肺支架。所述TritonX-100溶液的体积分数优选为0.5～2％，进一步优选为0.8～1.5％；所述TritonX-100溶液和肺组织的体积质量比优选为3～5mL:1～1.5g，进一步优选为3.5～4.5mL:1.2～1.4g所述灌注TritonX-100溶液后浸泡的时间优选为12～24h，进一步优选为15～20h；所述脱氧胆酸钠溶液的浓度优选为15～25mg/mL，进一步优选为18～22mg/mL；所述脱氧胆酸钠溶液和肺组织的体积质量比为3～5mL:1～1.5g，进一步优选为3.5～4.5mL:1.2～1.4g；所述灌注脱氧胆酸钠溶液后浸泡的时间优选为12～24h，进一步优选为15～20h；所述DNA酶溶液的浓度为25～35μg/mL，所述DNA酶溶液和肺组织的体积质量比为3～5mL:1～1.5g，进一步优选为3.5～4.5mL:1.2～1.4g；所述灌注DNA酶溶液后浸泡的时间为1～2h；DNA酶溶液浸泡后依次使用70～80％酒精和1～3％双抗的PBS溶液浸泡，所述酒精的体积分数进一步优选为72～78％；所述PBS溶液中双抗的体积分数优选为1.2～2.8％；所述酒精和双抗的PBS溶液的浸泡时间均优选为10～20min，进一步优选为12～18min。所述酒精作用为杀菌，灭菌后去细胞化肺支架可于1～3％双抗的PBS溶液中浸泡，4℃条件下保存约1w。所述冷冻干燥的条件优选为在-25～-15℃预冷2～24h后，在-50～-60℃的温度下冻干4～48h，进一步优选为-22～-18℃预冷5～20h后，在-52～-58℃的温度下冻干8～40h；用标准打孔器对冻干后的去细胞化肺进行打孔取材得到去细胞化肺支架，所述去细胞化肺基质支架优选为直径3～7mm，厚度0.5～2mm的圆柱形结构，所述直径进一步优选为4～6mm，所述厚度进一步优选为0.8～1.8mm。
在本发明中，将胶原酶消化血管类器官后形成的多细胞悬液接种至灭菌且预平衡后的去细胞化肺支架上，使细胞贴附后加入共培养基培养；然后再将肺癌细胞接种至去细胞化肺支架上，使细胞贴附后加入共培养基培养得到所述的血管化肺癌组织工程模型。
在本发明中，所述胶原酶的浓度优选为0.5～2mg/mL，进一步优选为0.8～1.8mg/mL；所述消化的时间优选为10～30min，进一步优选为15～25min；所述血管类器官的制备方法包括以下步骤：
1)将H9人胚胎干细胞在Y-27632的mTeSRTM培养基中培养0.5～1.5d形成拟胚体；所述培养时间优选为1d；
2)将形成拟胚体的H9人胚胎干细胞在第一分化培养基中培养2～4d形成中胚层；所述培养时间优选为3d；
3)将形成中胚层的H9人胚胎干细胞在第二分化培养基中培养2～4d得到血管类器官，所述培养时间优选为3d。
所述第一分化培养基包括基础培养基和以下组分：10～15μM CHIR 99021、25～35ng/mL BMP-4、0.3～0.7mL N2添加剂、0.5～1.5mL B27添加剂；所述CHIR 99021的浓度优选为11～14μM，所述BMP-4的浓度优选为28～32ng/mL，所述N2添加剂的用量优选为0.4～0.6mL，所述B27添加剂的用量优选为0.7～1.3mL；
所述第二分化培养基包括基础培养基和以下组分：80～120ng/mL VEGF-A、1～3μMForskolin、0.3～0.7mL N2添加剂、0.5～1.5mL B27添加剂；所述VEGF-A的浓度优选为90～110ng/mL，所述Forskolin的浓度优选为1.5～2.5μM，所述N2添加剂的用量优选为0.4～0.6mL，所述B27添加剂的用量优选为0.7～1.3mL；
所述基础培养基由DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基组成，所述DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的体积比优选为0.5～2：0.5～2，进一步优选为0.8～1.8：0.8～1.8。
所述灭菌处理为将多细胞悬液接种至70～80％乙醇中1～3h，所述乙醇的体积分数优选为72～78％，所述灭菌时间优选为1.5～2.5h；所述预平衡为用含血清DMEM/F-12培养基预平衡12～48h，所述平衡时间优选为15～45h；所述细胞贴附的条件优选为在30～40℃，3～8％CO2的条件下使细胞贴附0.5～2h，进一步优选为在32～38℃，4～7％CO2的条件下使细胞贴附0.8～1.8h所述血管类器官细胞加入共培养基培养的时间优选为5～7d，进一步优选为6d；所述肺癌细胞加入共培养基培养的时间优选为3～5d，进一步优选为4d。所述共培养基为血管类器官培养和肺癌细胞培养基按照体积比0.5～2：0.5～2混合而成，所述体积比优选为0.8～1.5：0.8～1.5；所述血管类器官培养基优选为添加了80～120ng/mLVEGF-A、80～120ng/mL FGF-2和10～20％FBS的StemPro-34SFM培养基，所述VEGF-A的浓度进一步优选为90～110ng/mL，所述FGF-2的浓度进一步优选为90～110ng/mL，所述FBS的体积分数进一步优选为12～18％；所述肺癌细胞培养基优选为添加了10～20％FBS和0.5～2％双抗的DMEM/F12培养基，所述FBS的体积分数进一步优选为12～18％，所述双抗的体积分数进一步优选为0.8～1.5％。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的血管化肺癌组织工程模型。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的血管化肺癌组织工程模型或所述的血管化肺癌组织工程模型在血管化肿瘤病理生理研究或体外药物的测试、筛选中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、去细胞化肺基质支架的制备
(1)25g左右小鼠，经腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)待麻醉完全后，经腹腔注射300μL肝素生理盐水(100U/mL)，使小鼠全身肝素化。抓住小鼠耳朵将其身体浸泡在75％乙醇中数秒，开胸取出肺脏。取高压后的20G针头插入气管内并固定结扎。5mL注射器吸取3mL肝素生理盐水，从气管注入；再吸取3mL PBS，从气管注入并重复三次；吸取3mL 1％v/v的Triton x-100浴液，从气管注入并重复三次后，肺组织浸泡其中，室温过夜。5mL注射器吸取3mL 20mg/mL脱氧胆酸钠溶液，从气管注入并重复三次后，肺组织浸泡其中，室温过夜。5mL注射器吸取3mL 30μg/mL DNA酶溶液，从气管注入并重复三次后，肺组织浸泡其中，室温1h；更换75％酒精从灌注并浸泡其中，室温15min；2％双抗的PBS灌注并浸泡其中，室温15min，得到新鲜小鼠去细胞化肺。
(2)用手术剪将小鼠各肺叶分离后放于载玻片上并置于6孔板中，并将其放入冷冻干燥机中在-20℃预冷12h后在-55℃冻干48h，然后用标准打孔器对冻干后去细胞化肺进行打孔取材，制得直径5mm，厚度0.5～2mm的去细胞化肺支架。制备流程图如图1所示。
2、血管类器官的制备
(1)拟胚体形成：低粘附6孔板接种75％细胞融合度的H9人胚胎干细胞，加入Y-27632的mTeSRTM培养基，37℃，5％CO2培养箱培养1d；
(2)中胚层诱导：H9人胚胎干细胞集落消化后离心，弃上清，用添加了CHIR 99021、BMP-4、N2添加剂和B27添加剂的1：1DMEM/F12培养基：Neurobasal培养基的混合培养基重悬沉淀后加入低粘附24孔板，37℃，5％CO2培养箱培养3d，每天换液；
(3)血管谱系诱导：将12孔板中的细胞转移至15mL离心管内后经重力沉降，弃上清，用添加了VEGF-A、Forskolin、N2添加剂和B27添加剂的1：1DMEM/F12培养基：Neurobasal培养基的混合培养基重悬沉淀后加入低粘附24孔板，37℃，5％CO2培养箱培养3d，每天换液。
3、血管化肺癌组织工程模型的构建
1mg/mL胶原酶消化血管类器官15min后形成1×105多细胞悬液接种至75％乙醇灭菌1h且DMEM/F12培养基预平衡后的去细胞化肺支架上，37℃，5％CO2培养箱中使细胞贴附1h，后加入共培养基培养6d，每隔一天更换一次培养基；然后接种1×105肺癌细胞A549于支架上，37℃，5％CO2培养箱中使细胞贴附1h，后加入共培养基后继续培养4d，每隔一天更换一次培养基。上述共培养基为血管类器官培养基于肺癌细胞培养基按照体积比1：1混合而成，血管类器官培养基为添加了100ng/mLVEGF-A、100ng/mL FGF-2和15％FBS的StemPro-34SFM培养基，肺癌细胞系A549培养基为添加了15％FBS和1％双抗的DMEM/F12培养基。
上述肺癌细胞是将肺腺癌细胞株A549常规培养于DMEM/F12培养基添加10％FBS，1％抗生素，细胞生长至85～90％融合度时采用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化传代，传代比例为1:5。
实施例2
去细胞化肺支架的检测
1、肺组织DNA提取及含量测定：称取25mg野生型小鼠正常肺组织与实施例1制备得到的去细胞化肺支架，加入裂解液(0.2％Triton-X-100/MgCl2)，用无菌组织剪剪碎肺组织并于裂解液中裂解，离心(4℃，12000rmp/s)15min，收集上清。根据DNA提取试剂盒操作说明提取DNA并测定其含量，设定未加DNA溶液的DNA-free水为空白孔对照，酶标仪测定对应480nm波长处的OD值，绘制相应柱状图。
实验结果：如图2所示。对比野生型小鼠肺组织，经去细胞化处理后的肺支架呈乳白半透明状，且保留了完整肺组织外部结构形态。
野生型小鼠肺组织DNA含量为155.1ng/mg，而去细胞化小鼠肺组织DNA含量为4.15ng/mg，符合去细胞化支架小于50ng/mg的评价标准，表明本发明所用去细胞化方法有效。
2、染色以及电镜检测
(1)苏木素-伊红(Hematoxylin eosin,H&E)染色：收集野生型小鼠正常肺组织与实施例1制备得到的去细胞化肺支架，经1.固定(样品经PBS清洗，4％多聚甲醛4℃过夜后，PBS清洗3次)；2.乙醇梯度脱水(70％→80％→95％→100％，各梯度30min)、二甲苯透明(二甲苯I15min、二甲苯II 15min)；3.包埋、切片及烤片(常规石蜡包埋，硬固后切片机切割蜡块为5μm厚度切片，烘箱60℃烤片1h)；4.脱蜡至水(二甲苯I→二甲苯II→二甲苯/100％乙醇→100％乙醇→100％乙醇→95％乙醇→80％乙醇→70％乙醇→蒸馏水，各梯度10min)；5.染色：苏木素染色10-15min，自来水洗去多余苏木素染液，0.5％-1％盐酸酒精分色数秒至数十秒，氨水返蓝，0.5％-1％氢氧化铵返蓝，伊红染色2-3min；6.脱水、透明(70％、80％、90％乙醇中数秒到数十秒，95％乙醇1min，100％乙醇I、II各10min，二甲苯I、II各10min)；7.封片(中性树胶封片)等一系列步骤制得H&E切片后于正置光学显微镜下观察。
(2)扫描电镜(SEM)：收集野生型小鼠正常肺组织与实施例1制备得到的去细胞化肺支架，经1.表面清洁(0.1M磷酸盐缓冲液清洗3次，每次15min)；2.前固定(2.5％戊二醛4℃固定2h)；3.冲洗(0.1M磷酸盐缓冲液清洗3次，每次15min)；4.后固定(1％锇酸4℃固定1h)；5.冲洗(0.1M磷酸盐缓冲液清洗3次，每次15min)；6.丙酮梯度脱水(50％→70％→80％→90％→100％，各梯度15min)；7.冷冻干燥24h；8.喷金处理等一系列步骤制得样品后于扫描电镜下观察其表面形貌。
(3)Weigert弹力纤维染色：野生型小鼠正常肺组织及实施例1制备得到的去细胞化肺支架的石蜡切片脱蜡至水(二甲苯I→二甲苯II→二甲苯/100％乙醇→100％乙醇→100％乙醇→95％乙醇→80％乙醇→70％乙醇→蒸馏水，各梯度10min)，Weigert氧化剂氧化5min，稍水洗后用漂白剂漂白1-2min，流水冲洗2min后95％乙醇稍洗，Weigert间苯二酚品红染液室温染色1-3h，酸性分化液分化2-3s至无染液脱下，流水冲洗10min，VG染色液复染30s，稍水洗后用95％乙醇迅速分化和脱水，乙醇脱水后二甲苯透明，中性树胶封片后正置光学显微镜下观察并拍照。
(4)阿利新蓝染色：野生型小鼠正常肺组织及实施例1制备得到的去细胞化肺支架的石蜡切片脱蜡至水(二甲苯I→二甲苯II→二甲苯/100％乙醇→100％乙醇→100％乙醇→95％乙醇→80％乙醇→70％乙醇→蒸馏水，各梯度10min)，阿利新蓝染色试剂盒进行染色:阿利新蓝酸化液(A液)染色3min后，阿利新蓝染色液(B液)染色20min，流水冲洗5min，于核固红染色液(C液)复染8-10min，流水冲洗1min，乙醇脱水(70％、80％、90％乙醇中数秒到数十秒，95％乙醇1min，100％乙醇I、II各10min)，二甲苯透明(二甲苯I、II各10min)，中性树胶封片后正置光学显微镜下观察并拍照。
(5)免疫荧光化学染色：野生型小鼠正常肺组织及实施例1制备得到的去细胞化肺支架的石蜡切片脱蜡至水(二甲苯I→二甲苯II→二甲苯/100％乙醇→100％乙醇→100％乙醇→95％乙醇→80％乙醇→70％乙醇→蒸馏水，各梯度10min)，高压抗原热修复，PBS清洗3次(每次5min)，封闭血清封闭30min后弃去，配制1：100稀释浓度的CollagenIII抗体稀释液并滴加于切片组织上4℃孵育过夜，PBS清洗3次(每次5min)，1：200稀释浓度的荧光二抗室温孵育1h，PBS清洗3次(每次5min)，DAPI染液染核15min，PBS清洗3次(每次5min)，荧光抗体封片剂封片后荧光显微镜下观察并拍照。
实验结果：如图3所示。扫描电镜H&E染色可见野生型小鼠肺组织可见大量细胞分布于肺泡及肺泡囊等结构，而冻干去细胞化肺支架保留肺泡及肺泡囊等结构且无细胞残留。
对比野生型小鼠肺组织，Weigert弹力纤维染色显示：冻干去细胞化肺支架保留大量小鼠肺组织的弹性纤维(紫色至紫黑色)和胶原纤维(红色)；
阿利新蓝染色显示：冻干去细胞化肺支架保留大量小鼠肺组织的酸性黏蛋白、蛋白多糖和透明质酸(蓝色)，且无细胞核(红色)残留；
免疫荧光化学染色(Collagen III)显示：冻干去细胞化肺支架保留大量小鼠肺组织III型胶原蛋白(红色)，且无细胞核(蓝色)残留。以上染色均可见冻干去细胞化肺支架保留肺泡及肺泡囊等结构。
以上结果表明本发明所用去细胞化方法有效且保留肺组织细胞外基质成分及三维空间结构。
实施例3
血管化肺癌组织工程模型的应用
1、三维共培养对细胞迁移能力的影响
(1)免疫荧光化学染色：分别收集单独培养的二维孔板中的A549细胞、去细胞化肺支架上的A549细胞、以及A549细胞和血管类器官消化的单细胞于去细胞化肺支架上共培养10d的样本，经1.固定(样品经PBS清洗，4％多聚甲醛4℃过夜后，PBS清洗3次)；2.封闭血清封闭2h后弃去(勿清洗切片)；3.配置1：100稀释浓度的CK7和CD31抗体稀释液4℃孵育过夜，PBS清洗3次(每次15min)；4.配置1：200荧光二抗的混合抗体稀释液4℃孵育过夜，PBS清洗3次(每次15min)；5.配置1：200稀释浓度的DAPI染液染核40min，PBS清洗3次(每次5min)，荧光抗体封闭剂封闭，荧光显微镜下观察并拍照。
(2)实时定量qPCR(real-time qPCR)：收集实施例3-1(1)中制备得到的样品，PBS清洗样品后加入TRIZOL裂解细胞，后提取RNA并检测纯度；使用PrimeScriptTM RTMasterMix试剂将RNA逆转录为cDNA；使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行qPCR扩增，检测MMP-9和Snail基因表达情况。引物名称及序列如表1所示。
表1引物名称及序列
实验结果：如图4所示。相比于传统的二维平面培养模型和三维单独A549培养模型，本发明中三维血管化肺癌组织工程模型中A549细胞标志物(CK7)表达明显增多，CD31+的内皮细胞数量明显增多，说明本发明三维血管化肺癌组织工程模型培养环境更有利于细胞的黏附和生长。
qPCR结果显示，相较于二维A549单独培养组和三维A549单独培养组，三维血管化肺癌组织工程模型组显著上调MMP9以及Snail基因表达，说明该模型可应用于细胞迁移相关研究。
2、药物测试
(1)细胞凋亡染色检测：收集共培养10d的实施例1制备得到的血管化肺癌组织工程模型，于化疗药物中作用48h(此处以化疗药物顺铂DDP为例)，按照细胞凋亡染色试剂盒操作说明书配制Annexin V/PI染料，于37℃培养箱避光孵育2h，PBS清洗3次去除多余染料，激光共聚焦显微镜下观察细胞凋亡情况并拍照。
(2)苏木素-伊红(Hematoxylin eosin,H&E)染色：收集共培养10d的实施例1制备得到的血管化肺癌组织工程模型，DDP作用48h，收集样本，按照实施例2苏木素-伊红染色的一系列步骤制得H&E切片后于正置光学显微镜下观察。
实验结果：如图5所示。未加药处理组，细胞凋亡数目较少，少见荧光阳性细胞，而加入DDP作用48h后，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧，AnnexinV与磷脂酰丝氨酸结合，早期凋亡细胞呈绿色荧光数目增多。而凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色数目增多。
H&E染色结果与免疫荧光结果相一致，可见DDP作用去细胞化肺支架上细胞数目减少。以上结果表明，该血管化肺癌组织工程模型可应用于药物筛选。
3、三维共培养对细胞外基质的影响
扫描电镜(SEM)：共培养10d的实施例1制备得到的血管化肺癌组织工程模型经NaHS处理48h后收集样品，经实施例2扫描电镜的一系列步骤制得样品后于扫描电镜下观察其表面形貌。
实验结果：如图6所示。NaHS处理后三维去细胞化肺支架中细胞外基质成分增多。
通过ImageJ软件统计细胞外基质孔隙率，结果显示，其孔隙率明显下降。以上结果表明，该血管化肺癌组织工程模型可应用于细胞外基质相关研究领域。
4、三维共培养对间质细胞的影响
(1)免疫荧光化学染色：共培养10d的实施例1制备得到的血管化肺癌组织工程模型经NaHS处理48h后收集样品，经1.固定(样品经PBS清洗，4％多聚甲醛4℃过夜后，PBS清洗3次)；2.封闭血清封闭2h后弃去；3.配置1：100稀释浓度的CD31抗体稀释液4℃孵育过夜，PBS清洗3次(每次15min)；4.配置1：200荧光二抗的混合抗体稀释液4℃孵育过夜，PBS清洗3次(每次15min)；5.配置1：200稀释浓度的DAPI染液染核40min，PBS清洗3次(每次5min)，荧光抗体封闭剂封闭，荧光显微镜下观察并拍照。
(2)实时定量qPCR(real-time qPCR)：共培养10d的实施例1制备得到的血管化肺癌组织工程模型经NaHS处理48h后收集样品，PBS清洗样品后加入TRIZOL裂解细胞，后提取RNA并检测纯度；使用PrimeScriptTM RT MasterMix试剂将RNA逆转录为cDNA；使用SYBRPremix Ex Taq试剂盒进行qPCR扩增，检测PECAM-1、PDGFR和α-SMA基因表达情况。引物名称及序列如表2所示。
表2引物名称及序列
实验结果：如图7所示。在共培养至第10d的三维血管化肺癌组织工程模型中，加入NaHS刺激48h，对样品进行固定并进行免疫荧光化学染色后于荧光显微镜下观察，结果显示，NaHS刺激后CD31+细胞数目明显增多，提示以NaHS为供体的H2S可以促进内皮细胞CD31的表达。
qPCR结果显示，与免疫荧光结果相一致，NaHS为供体的H2S可以促进内皮细胞标志物PECAM-1基因表达上调。此外，还可以促进周细胞标志物PDGFR和血管平滑肌标志物α-SMA的表达量，说明该血管化肺癌组织工程模型可应用于肿瘤微环境中间质细胞的研究。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种血管化肺癌组织工程模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取肺组织依次灌注TritonX-100溶液、脱氧胆酸钠溶液和DNA酶溶液后浸泡得到去细胞化肺组织，将去细胞化肺组织进行冷冻干燥过夜后打孔取材，得到去细胞化肺支架；
2)将胶原酶消化血管类器官后形成的多细胞悬液接种至灭菌且预平衡后的去细胞化肺支架上，使细胞贴附后加入共培养基培养；然后再将肺癌细胞接种至去细胞化肺支架上，使细胞贴附后加入共培养基培养得到所述的血管化肺癌组织工程模型；
所述肺癌细胞和血管类器官细胞的细胞数目比为0.5～2：0.5～2，每个去细胞化肺支架上细胞接种总数量不少于2×105。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的条件为：在-25～-15℃预冷2～24h后，在-50℃～-60℃的温度下冻干4～48h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述去细胞化肺基质支架为直径3～7mm，厚度0.5～2mm的圆柱形结构。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述TritonX-100溶液的体积分数为0.5～2％，所述TritonX-100溶液和肺组织的体积质量比为3～5mL:1～1.5g，所述TritonX-100溶液浸泡的时间为12～24h；
所述脱氧胆酸钠溶液的浓度为15～25mg/mL，所述脱氧胆酸钠溶液和肺组织的体积质量比为3～5mL:1～1.5g，所述脱氧胆酸钠溶液浸泡的时间为12～24h；
所述DNA酶溶液的浓度为25～35μg/mL，所述DNA酶溶液和肺组织的体积质量比为3～5mL:1～1.5g，所述DNA酶溶液浸泡的时间为1～2h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血管类器官的制备方法包括以下步骤：
1)将H9人胚胎干细胞在Y-27632的mTeSRTM培养基中培养0.5～1.5d形成拟胚体；
2)将形成拟胚体的H9人胚胎干细胞在第一分化培养基中培养2～4d形成中胚层；
3)将形成中胚层的H9人胚胎干细胞在第二分化培养基中培养2～4d得到血管类器官；
所述第一分化培养基包括基础培养基和以下组分：10～15μM CHIR 99021、25～35ng/mL BMP-4、0.3～0.7mL N2添加剂、0.5～1.5mL B27添加剂；
所述第二分化培养基包括基础培养基和以下组分：80～120ng/mL VEGF-A、1～3μMForskolin、0.3～0.7mL N2添加剂、0.5～1.5mL B27添加剂；
所述基础培养基由DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基组成，所述DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的体积比为0.5～2：0.5～2。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述胶原酶的浓度为0.5～2mg/mL；所述消化的时间为10～30min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理为将多细胞悬液接种至70～80％乙醇中1～3h，所述预平衡为用含血清DMEM/F-12培养基预平衡12～48h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞贴附的条件为在30～40℃，3～8％CO2的条件下使细胞贴附0.5～2h，所述血管类器官细胞加入共培养基培养的时间为5～7d，所述肺癌细胞加入共培养基培养的时间为3～5d。
9.权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的血管化肺癌组织工程模型。
10.权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的血管化肺癌组织工程模型或权利要求9所述的血管化肺癌组织工程模型在血管化肿瘤病理生理研究或体外药物测试、筛选中的应用。
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