CN118591544A - 用于制备抗体药物偶联物的连接子、化合物及用途 - Google Patents

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CN118591544A CN202380018747.7A CN202380018747A CN118591544A CN 118591544 A CN118591544 A CN 118591544A CN 202380018747 A CN202380018747 A CN 202380018747A CN 118591544 A CN118591544 A CN 118591544A
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Abstract

本公开属于医药技术领域，具体来说，本公开涉及如式(I)所示的化合物、如式(II)所示的连接子，以及如式(I)所示的化合物、如式(II)所示的连接子在制备抗体药物偶联物中的用途。式(I)所示的化合物能够通过其甘氨酸接头连接抗体，得到抗体药物偶联物，抗体药物偶联物在体内及体外均能发挥高效、特异的肿瘤细胞杀伤活性，显著抑制不同类型的肿瘤生长，且不具有明显的细胞毒性，在肿瘤治疗领域具有重要的应用前景。

Description

用于制备抗体药物偶联物的连接子、化合物及用途
本公开要求如下专利申请的优先权：于2022年01月28日提交中国专利局、申请号为202210108098.7的中国专利申请，于2022年06月30日提交中国专利局、申请号为202210771649.8的中国专利申请；上述专利申请的全部内容通过引用结合在本公开中。
技术领域
本公开属于医药技术领域，具体来说，本公开涉及如式(I)所示的化合物、如式(II)所示的连接子，以及如式(I)所示的化合物、如式(II)所示的连接子在制备抗体药物偶联物中的用途。
背景技术
抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugates，ADC)是由抗体与细胞毒性药物通过特定的连接子共价连接而形成的新型靶向药物。其中，抗体作为靶向载体运送细胞毒性药物即“效应分子”或“弹头”至目标作用部位后，与目标细胞表面抗原特异性结合，经内吞进入细胞内部，同时将小分子药物带入细胞内部，然后经酶解或连接子的自身断裂释放细胞毒性药物杀伤目标细胞。与化疗和联合治疗相比，ADC药物的药物活性高，并且具有高的选择性，能显著减少脱靶毒性。近年来，Brentuximab vedotin(Adcetris，SGN-35)和Trastuzumab emtansine(Kadcyla，T-DM1)等ADC药物在临床引用中体现了很好的安全性和有效性，ADC药物已成为疾病靶向治疗领域的研究热点和重要发展方向。
艾日布林(Eribulin)是由卫材(Eisai)研发的微管蛋白聚合抑制剂，艾日布林作为合成的大田软海绵素(halichondrin B)类似物，具有独特的结合特性。艾日布林结构如下：
艾日布林被认为通过抑制阻止细胞分裂的微管动力学的生长期发挥作用。此外，非临床研究显示了艾日布林在肿瘤微环境中的独特作用，如增加肿瘤核心区域的血管灌注和渗透性，改善上皮细胞状态，降低乳腺癌细胞的迁移能力等。目前，艾日布林已在包括欧洲、美洲和亚洲在内的70多个国家和地区获得批准，在中国于2019年获批上市。艾日布林具有高的肿瘤抑制、杀伤活性，因此，将艾日布林与抗体偶联，对于实现肿瘤细胞的特异性杀伤，具有重要意义。
ADC药物由抗体(antibody)、连接子(linker)和细胞毒性药物(toxin)三部分组成。抗体决定药物作用的细胞类型和靶点；细胞毒素可以是可致细胞死亡、引诱细胞凋亡或减少细胞生存力的任何化合物；而连接子则是将两者有机结合的桥梁，是ADC药物设计的最核心部分，是实现靶向释药的关键。
化学偶联是目前主要应用的偶联方法，主要利用抗体中的赖氨酸或半胱氨酸残基与细胞毒性药物共价连接的方式实现偶联，例如，通过巯基与马来酰亚胺形成的硫代琥珀酰亚胺结构实现小分子药物与抗体的连接。然而，硫代琥珀酰亚胺结构并不稳定，在生物体内会与其它反应性巯基发生交换，导致细胞毒性药物的提前释放。一方面对正常组织造成毒性，另一方面也降低了ADC药物达到靶细胞后的药物效能。
连接子对于ADC药物的稳定性、药物活性等起到关键作用，发现更多适合偶联抗体与细胞毒性药物的连接子，是目前亟需解决的重要问题。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，例如，需要开发更多适合连接抗体与细胞毒性药物的连接子，以提高ADC药物的稳定性和药物活性。为此，本公开提供了一种结构新颖的连接子，连接子与艾日布林连接形成如式(I)所示的化合物。式(I)所示的化合物能够连接抗体形成抗体药物偶联物，进而特异性靶向肿瘤细胞等目标细胞并发挥高的靶细胞杀伤活性，在肿瘤等疾病的治疗中具有重要的应用前景。
用于解决问题的方案
第一方面，本公开提供了如式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药：
其中，L1为(Gly)p-(Z1)a-，p为1-10的任一整数；a为0-20的任一整数，若存在，每一个Z1各自独立地为任意种类的氨基酸残基；
L2为-NH-R1-(CH2)c-C(＝O)-，其中R1为-(CH2-CH2-X)b-，b为1-10的任一整数，每一个X各自独立地为-CH2-、-NH-、-O-或-S-，c为1-5的任一整数；
L3为 其中m为1-5的任一整数，优选为2；R2为-(CH2-CH2-Y)d-，d为1-10的任一整数，每一个Y各自独立地为-CH2-、-NH-、-O-或-S-；
L1的羧基端连接L2的氨基端，L2的羧基端连接L3的氨基端。
在一些实施方式中，根据本公开所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其中，
L3为 其中m为1-5的任一整数，优选为2；R2为-(CH2-CH2-Y)d-，d为1-10的任一整数，每一个Y各自独立地为-CH2-、-NH-、-O-或-S-。
在一些实施方式中，根据本公开所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其中，
L1为(Gly)p-，p为1-10的任一整数，优选为3-5的任一整数；
L2、L3如第一方面中所定义。
在一些实施方式中，根据本公开所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其中，L3选自如下的任意一种：
L1、L2如第一方面中所定义。
在一些实施方式中，根据本公开所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其中，
L3选自如下的任意一种：
在一些实施方式中，根据本公开所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其中，
L2为-NH-R1-(CH2)c-C(＝O)-；
其中R1为-(CH2-CH2-X)b-，b为1-10的任一整数，优选为1-5的任一整数；每一个X各自独立地为-CH2-或-O-；c为1-5的任一整数，优选为1-2的任一整数；
L1、L3如第一方面中所定义。
在一些实施方式中，根据本公开所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其中，
L1-L2-为
其中，w为0-9的任一整数，优选为2-4的任一整数；c为1-5的任一整数，优选为1-2的任一整数；
b为1-5的任一整数，优选为2-4的任一整数，每一个X各自独立地为-CH2-或-O-；并且， 的结构为：
在一些实施方式中，根据本公开所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其中，
L1-L2-为
其中，w为0-9的任一整数，优选为2-4的任一整数；c为1-5的任一整数，优选为1-2的任一整数；
b为1-5的任一整数，优选为2-4的任一整数，每一个X各自独立地为-CH2-或-O-；并且， 的结构为：
在一些实施方式中，本公开提供了如下式(I-1)～(I-6)任一项所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药：
优选如下任一项所示的结构：
第二方面，本公开提供了一种用于偶联抗体与药物化合物的连接子，所述连接子具有如下式(II)所示的结构：
L1-L2-L3-R3 (II)；
其中，R3选自-NH2或-OH；
L1、L2、L3如第一方面所定义。
在一些实施方式中，根据本公开所述的连接子，其中，所述连接子具有如下式(II-1)或(II-2)所示的结构：
其中，R3选自-NH2或-OH；
w为0-9的任一整数，优选为2-4的任一整数；c为1-5的任一整数，优选1-2的任一整数，
b为1-5的任一整数，优选为2-4的任一整数，每一个X各自独立地为-CH2-、-NH-、-O-或-S-。
在一些实施方式中，根据本公开所述的连接子，其中，所述连接子具有如下任一项所示的结构：
第三方面，本公开提供了根据第一方面所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药在制备抗体药物偶联物中的用途；
其中，所述抗体药物偶联物中，根据第一方面所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药通过L1与抗体或抗原结合片段相偶联；
可选地，所述抗体药物偶联物用于预防和/或治疗肿瘤；可选地，所述肿瘤为与HER蛋白家族中的一种或两种以上的蛋白异常表达相关的肿瘤；优选地，所述异常表达的蛋白选自HER2、HER3中的至少一种；
可选地，所述肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌或淋巴瘤。
第四方面，本公开提供了根据第二方面所示的连接子在制备抗体药物偶联物中的用途；
其中，所述抗体药物偶联物中，所述连接子的L1基团连接抗体或抗原结合片段，所述连接子的L3基团连接药物化合物；
可选地，所述抗体药物偶联物用于预防和/或治疗肿瘤；可选地，所述肿瘤为与HER蛋白家族中的一种或两种以上的蛋白异常表达相关的肿瘤；优选地，所述异常表达的蛋白选自HER2、HER3中的至少一种；
可选地，所述肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌或淋巴瘤。
第五方面，本公开提供了一种抗体药物偶联物，其具有如下式(III)所示的结构：
其中，q为2-8的任一整数，优选为4；Ab为抗体或抗原结合片段；
Pep为-(X1)e-Leu-Pro-X2-Thr-，其中e为0-10的任一整数，若存在，每一个X1各自独立地为Gly或Ala；X2为任意种类的氨基酸残基；
L1为-(Gly)p-(Z1)a-，p为1-10的任一整数；a为0-20的任一整数，若存在，每一个Z1各自独立地为任意种类的氨基酸残基；
L2为-NH-R1-(CH2)c-C(＝O)-，其中R1为-(CH2-CH2-X)b-，b为1-10的任一整数，每一个X各自独立地为-CH2-、-NH-、-O-或-S-，c为1-5的任一整数；
L3为
或者，L3为其中m为1-5的任一整数，优选为2；R2为-(CH2-CH2-Y)d-，d为1-10的任一整数，每一个Y各自独立地为-CH2-、-NH-、-O-或-S-；
并且，Pep的氨基端连接Ab的重链或轻链的羧基端，Pep的羧基端连接L1的氨基端，L1的羧基端连接L2的氨基端，L2的羧基端连接L3的氨基端。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，
Pep为-(Gly-Ala)f-Leu-Pro-X2-Thr-，其中f为1-5的任意整数，优选为1；X2选自任意种类的氨基酸残基，优选为Glu残基；
优选地，Pep为-Gly-Ala-Leu-Pro-Glu-Thr-，其中Pep的氨基端连接Ab，Pep的羧基端连接L1的氨基端。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，Ab的重链的羧基端连接Pep，且Ab的轻链的羧基端连接Pep；
优选地，Ab的重链的羧基端连接-Gly-Ala-Leu-Pro-Glu-Thr-，且Ab的轻链的羧基端连接-Gly-Ala-Leu-Pro-Glu-Thr-。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗体或抗原结合片段特异 与HER蛋白家族中至少一种蛋白特异性结合；优选地，所述抗体或抗原结合片段与如下的至少一种蛋白特异性结合：HER2、HER3。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13中至少一项所示的氨基酸序列；和/或，
所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，其中，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6中至少一项所示的氨基酸序列；
所述轻链可变区、所述重链可变区为根据Kabat的分析方法编码。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；
HCDR1包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
LCDR1包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗原或抗原结合片段的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，和/或，
所述抗原或抗原结合片段的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，L1、L2、L3如第一方面中所定义。
在一些实施方式中，本公开提供了如下式(III-1)～(III-6)任一项所示的抗体药物偶联物：
优选如下任一项所示的结构：
在本公开中，Ab可以是与任意类型的肿瘤抗原结合的抗体或抗原结合片段。示例性的，肿瘤抗原包括但不限于PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、CD103、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、AFP、CEA、PSCA、GD2、NKG2D、BCMA、EGFR、HER2、HER3、EGFRvIII、CD171、FAP、IL13Ra2、VEGFR1、VEGFR2、GPC-3、Mesothelin、claudin 18.2、EpCAM、MUC1、MUC16、EPHA2、EPHA3、CD133、PSMA。抗体或抗原结合片段通过特异性结合肿瘤表面抗原，从而将艾日布林特异性递送至肿瘤细胞，发挥高效、特异性的肿瘤细胞杀伤作用。
进一步的，抗体或抗原结合片段与HER蛋白家族中至少一种蛋白特异性结合；优选地，所述抗体或抗原结合片段与如下的至少一种蛋白特异性结合：HER2、HER3。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区，其中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13中至少一项所示的氨基酸序列；和/或，
所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，其中，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6中至少一项所示的氨基酸序列；
所述轻链可变区、所述重链可变区为根据Kabat的分析方法编码。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；
HCDR1包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
LCDR1包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据本公开所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗原或抗原结合片段的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，和/或，所述抗原或抗原结合片段的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
发明的效果
本公开提供的如式(I)所示的化合物，其由连接子与细胞毒性药物艾日布林偶联形成；式(I)所示化合物中的连接子可进一步连接抗体，得到抗体药物偶联物。利用式(I)所示化合物制备的抗体药物偶联物，能够特异性靶向肿瘤细胞；而在进入肿瘤细胞内后，抗体药物偶联物的接头部分可以发生断裂，释放细胞毒性药物艾日布林，具有高的肿瘤细胞杀伤活性，在肿瘤治疗领域具有重要的应用前景。
进一步的，如式(I)所示的化合物能够针对肿瘤的不同靶点连接不同的抗体，实现对不同类型肿瘤的高效、特异性杀伤。
在一些实施方式中，本公开提供了如式(I-1)～式(I-6)任一项所示的化合物，式(I-1)～式(I-6)所示的化合物能够通过其甘氨酸接头，以酶促偶联的方式与抗体连接得到结构稳定抗体药物偶联物，抗体药物偶联物兼具特异性地靶向作用和对肿瘤细胞的高杀伤活性，发挥优异的肿瘤治疗效果。
在一些优选的实施方式中，本公开以式(I-1)、式(I-5)所示的化合物连接HER2抗体，得到了具有如式(III-1)、式(III-5)所示结构的抗体药物偶联物。本公开发现，式(III-1)、式(III-5)所示的抗体药物偶联物能够显著降低HER2阳性(例如，HCC1954、SK-BR-3和NCI-N87)的各类肿瘤细胞的体外存活率，发挥高效的肿瘤细胞杀伤活性。与小分子药物Dxd相比，艾日布林显示出更强的抗肿瘤活性；与小分子药物艾日布林相比，本公开中式(III-1)、式(III-5)所示的抗体药物偶联物具有更低的IC50值，和更高的肿瘤细胞杀伤活性。并且，在HER2阴性细胞中，ADC药物的细胞毒性低于小分子药物艾日布林；同时，式(III-1)、式(III-5)所示的抗体药物偶联物在HER2阳性细胞的细胞毒性高于在HER2阴性细胞的细胞毒性。以上结果说明本公开中的抗体药物偶联物能够靶向结合肿瘤细胞，并且在肿瘤细胞内部释放细胞毒性药物艾日布林，发挥靶向、高效杀伤肿瘤细胞的作用。
进一步的，在接种Capan-1、NCI-N87和HCC1954不同肿瘤细胞的三种荷瘤小鼠模型中验证式(III-1)、式(III-5)所示抗体药物偶联物的体内肿瘤治疗效果，结果显示，式(III-1)、式(III-5)所示抗体药物偶联物能够显著抑制Capan-1肿瘤、NCI-N87肿瘤和HCC1954肿瘤的生长，高效、特异性杀伤体内肿瘤细胞，并且不具有明显的药物毒性，在肿瘤临床治疗中具有广阔的应用前景。
本公开提供的如式(II)所示的连接子，连接子的L1基团和L3基团接头能够分别连接抗体与药物化合物，得到抗体药物偶联物。连接子直接影响抗体药物偶联物的稳定性和药物活性，本公开中连接子中的L3基团在进入细胞内后可发生断裂，释放细胞毒性药物；利用本公开连接子构建的抗体药物偶联物，具有高效、特异性杀伤肿瘤细胞的活性，为抗体药物偶联物的开发提供了新的选择和偶联方式。
附图说明
图1示出了不同药物浓度梯度的Ab0100-H0037、Ab0100-H0038、BQ3、艾日布林、Dxd对HCC1954细胞存活率的影响检测结果；
图2示出了不同药物浓度梯度的Ab0100-H0037、Ab0100-H0038、BQ3、艾日布林、Dxd对SK-BR-3细胞存活率的影响检测结果；
图3示出了不同药物浓度梯度的Ab0100-H0037、Ab0100-H0038、BQ3、艾日布林、Dxd对NCI-N87细胞存活率的影响检测结果；
图4示出了不同药物浓度梯度的Ab0100-H0037、Ab0100-H0038、BQ3、艾日布林、Dxd对MDA-MB-468细胞存活率的影响检测结果；
图5示出了溶媒(DPBS)、Ab0100-H0037(5mg/kg)、Ab0100-H0038(5mg/kg)，以及BQ3(5mg/kg)给药后荷瘤小鼠(Capan-1荷瘤雌性BALB/c裸鼠)的体重变化检测结果；
图6示出了溶媒(DPBS)、Ab0100-H0037(5mg/kg)、Ab0100-H0038(5mg/kg)，以及BQ3(5mg/kg)给药后荷瘤小鼠(Capan-1荷瘤雌性BALB/c裸鼠)的肿瘤生长曲线；
图7示出了溶媒(DPBS)、Ab0100-H0037(5mg/kg)、Ab0100-H0038(5mg/kg)，以及BQ3(5mg/kg) 给药后荷瘤小鼠(NCI-N87荷瘤雌性BALB/c裸鼠)的肿瘤生长曲线；
图8示出了溶媒(DPBS)、Ab0100-H0037(3mg/kg)、Ab0100-H0038(3mg/kg)，以及BQ3(5mg/kg)给药后荷瘤小鼠(HCC1954荷瘤雌性BALB/c裸鼠)的肿瘤生长曲线。
具体实施方式
定义
除非有相反陈述，否则在本公开中所使用的术语具有下述含义。
在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
在本公开中，使用“数值A-数值B的任一整数”覆盖数值A与数值B之间任意类型的自然数，其范围覆盖含端点数值A、B。示例性的，1-10的任一整数为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10中的任一整数。
在本公开中，“任意种类的氨基酸”可以是常见氨基酸(本公开中表1所示出的氨基酸)，也可以是非常见氨基酸(例如，2-氨基己二酸，2-氨基丁酸，2-氨基庚二酸，2-羧酸酰胺等等)。进一步的，任意种类的氨基酸可以是修饰的氨基酸(例如，酰基化、泛素化、糖链修饰、生物素化等等)，也可以是未修饰的氨基酸。
术语“各自独立地”是指结构中存在的取值范围相同或相近的至少两个基团(或环系)可以在特定情形下具有相同或不同的含义。例如，取代基X和取代基Y各自独立地为氢、羟基、烷基或芳基，则当取代基X为氢时，取代基Y既可以为氢，也可以为羟基、烷基或芳基；同理，当取代基Y为氢时，取代基X既可以为氢，也可以为羟基、烷基或芳基。或者，取代基X的个数为两个，每个X各自独立地为氢、羟基、烷基或芳基；则当一个X为氢时，另外一个X既可以为氢，也可以为羟基、烷基或芳基。同理，取代基X的个数为三个或以上，每个X各自独立地为氢、羟基、烷基或芳基，意味着其中任意一个X均可以选择氢、羟基、烷基或芳基。
示例性地，在-(X1)e-中，e为0-10的任一整数，若存在，每一个X1各自独立地为Gly或Ala。例如，当e为2时，沿氨基端向羧基端的方向，-(X1)e-可以是-Gly-Gly-、-Ala-Ala-，-Ala-Gly-或-Gly-Ala-。
术语“连接子”、“连接单元”、“接头单元”、“接头”或“连接片段”是指一端与配体/抗体连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。在一些实施方式中，本公开的连接子是末端为甘氨酸的氨基酸片段。末端为甘氨酸的氨基酸片段可以被Fmoc等保护基保护。作为优选的实施例，其末端的氨基酸片段可以是3-5个甘氨酸。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。
术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体(重链抗体)；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。
术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗 体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology，273，927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体，优选人源化抗体和全人源抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能用鼠制备抗体。制备时用特定抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。
术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。本公开为全人源单克隆抗体。全人抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。
术语“载药量”可以表示为药物量和抗体量的比值。载药量的范围可以是每个抗体(Ab)连接1-20个，优选1-10个细胞毒性药物(D)；更优先2-4个。
在本公开中，“溶剂化”是指：一些溶剂分子被溶质分子或离子包围而成为一个集团的现象。
本发明的化合物还可以以盐的形式提供。可以利用通常进行的方法形成这些盐。或根据本发明的制造方法的条件，可以以盐的形式生成化合物(例如是源自添加剂的物质)。
本发明的化合物还可以以溶剂化物的形式提供。例如可列举出与水的溶剂化物。这样的溶剂化物可以利用通常进行的方法来形成。或根据本公开的制造方法的条件，可以以溶剂化物的形式生成化合物。进而，上述化合物的盐可以以溶剂化物的形式生成并提供。
本公开上下文中使用的术语“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本公开的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物、前药或含者有其的药物组合物(以下也称为“本公开的药物组合物”)，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。
本公开上下文中使用的术语“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触(例如给药)本公开的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物、前药或本公开的药物组合物，从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。
本公开上下文中使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不 限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，结节性黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖，脑瘤和脑癌，以及头颈癌，及相关转移。
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
术语“有效量”指本公开的化合物或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诱如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
本公开上下文中使用的术语“药学上可接受的盐”是指由本公开中的化合物与相对无毒的酸或碱制备得到的盐。当本公开中的化合物含有相对偏酸性的官能团(例如羧基或磺酸基)时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与其游离形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的非限制性实例包括但不限于钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、镁盐、有机胺盐或类似的盐。当本公开中的化合物含有相对偏碱性的官能团(例如氨基或胍基)时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与其游离形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的非限制性实例包括但不限于无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、亚磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐等)、有机酸盐(例如乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、葡糖醛酸等)以及氨基酸盐(例如精氨酸盐等)。药学上可接受的盐的具体形式还可参见Berge et al.，“Pharmaceutical Salts”，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66：1-19)。
本公开上下文中使用的术语“药物组合物”是指可供药用的组合物，其包含一种或多种化合物或其药学上可接受的形式(例如盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物、前药等)，以及其他组分(例如药学上可接受的辅料)。
本公开上下文中使用的术语“药学上可接受的辅料”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用辅料的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物，还在于提供一种方法，以便在为受试者施用药物之后，活性成分能够以所期望的速率溶出，或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的辅料可以是具有惰性的填充剂，也可以是为药用组合物提供某种功能(例如稳定组合物的整体pH值或防止组合物中活性成分的降解)的功效成分。药学上可接受的辅料的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂(或填充剂)、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。
本公开中的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋和/或冻干工艺。
在本公开中，使用药物组合物的目的在于促进针对生物体的给药，有利于活性成分的吸收，进而发挥生物活性。本公开的药物组合物可以通过任何形式给药，包括注射(动脉内、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下)、粘膜、口服(口服固体制剂、口服液体制剂)、直肠、吸入、植入、局部(例如眼部)给药等。口服固体制剂的非限制性实例包括但不限于散剂、胶囊剂、锭剂、颗粒剂、片剂等。口服或粘膜给药的液体制剂的非限制性实例包括但不限于混悬剂、酊剂、酏剂、溶液剂等。局部给药制剂的非限制性实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药制剂的非限制性实例包括但不限于注射用溶液剂、注射用干粉剂、注射用悬浮液、注射用乳剂等。本公开的药物组合物还可以制成控制释放或延迟释放剂型(例如脂质体或微球)。
在本公开中，施用途经能够以任何适用的方式进行变化或调整，以满足药物的性质、患者和医务人员的便利以及其它相关因素的需求。
本公开上下文中使用的术语“Dxd”又称Exatecan derivative，是一种DNA拓扑异构酶I抑制剂，其具有如下所示结构：
在本公开中，当L1位于式(I)所示的化合物，或位于式(II)所示的连接子中，L1为(Gly)p-(Z1)a-，并且，L1中位于氨基末端的甘氨酸残基为NH2-CH2-C(＝O)-。
在本公开中，当L1位于式(III)所示的抗体药物偶联物中，L1为-(Gly)p-(Z1)a-，并且，L1中位于氨基末端的甘氨酸残基为-NH-CH2-C(＝O)-。
抗体药物偶联物的制备方法：
本公开的抗体药物偶联物可以用本领域已知的任何方法制备。在一些实施方式中，偶联物是通过酶催化的抗体或抗原结合片段和式(I)所示的化合物特异性结合制备的，其中，抗体或抗原结合片段中包含连接酶的识别序列。示例性的，连接酶为转肽酶，其包括但不限于各种天然Sortase酶(包括A，B，C，D，L.plantarum的Sortase等)及经过优选改造的各种新型转肽酶。反应通过生物酶催化手段实现(参照WO2015165413A1，其通过引用并入本文)，反应条件温和，降低了偶联过程对抗体的物理、化学损伤，制备工艺与流程更为优化，易于产业化升级，有利于ADC产品的质量控制。
该方法包括步骤A和步骤B。
步骤A：制备式(I)所示的化合物
在一些优选的实施方式中，优选实施例中，式(I)所示化合物由连接子与艾日布林共价连接形成。
式(I)所示的化合物具有明确的结构、确定的组成和高纯度，因此在与抗体进行偶联反应时，引入的杂质较少或不引入其他杂质。在连接酶催化下，当式(I)所示的化合物被用于和带有连接酶识别序列的抗体或抗原结合片段在特定位点发生偶联反应时，可获得质量高度可控的同质ADC。
步骤B：将靶分子与式(I)所示化合物连接
本公开中的靶分子可以通过本技术已知的任何方法与式(I)所示化合物结合，得到式(III)所示的抗体药物偶联物。
靶分子和式(I)所示化合物通过底物的连接酶特异性识别序列相互连接。识别序列取决于所使用的特定连接酶。在一些实施方式中，靶分子是一种抗体或抗原结合片段，在轻链和/或重链的c端(羧基端)引入基于识别序列的末端修饰，在野生型或优化的工程连接酶或其任何组合的催化下，靶分子 与式(I)所示化合物结合。
在一些具体的实施方式中，连接酶为Sortase酶。更具体的，连接酶为Sortase A酶。
示例性的，结合反应可以用以下方案表示：
三角形代表抗体的一部分，抗体的羧基端连接Sortase A酶的识别序列LPXT(G)r；其中，L为亮氨酸，P为脯氨酸，X为任意类型的氨基酸，T为苏氨酸，(G)r是数量为r的甘氨酸，r为1-2的任一整数。五边形表示式(II)化合物的一部分，(G)p是数量为p的甘氨酸，p为1-10的任一整数，示例性的，p为1、2、3、4、5等等。
Sortase A酶亲核攻击中LPXT(G)r序列中苏氨酸(T)与甘氨酸(G)之间的肽键，形成共价硫代中间体。该中间体可捕获中的甘氨酸接头(G)p，并在苏氨酸(T)和甘氨酸(G)之间重新形成酰胺键，释放出Sortase A酶，得到靶分子与式(I)所示化合物结合的抗体药物偶联物
在下面将对本公开进行详细描述。然而，本公开可能具体体现为许多不同的形式，而且它不应该被局限于此处所描述的实施例中，提供这些实施例中的目的是使所披露内容更完整与全面。所用试剂和原料，除了提供制备方法的除外，其余均为市售。除非另有定义，否则本文中所有科技术语具有的含义与权利要求主题所属技术领域人员通常理解的含义相同。
本公开中氨基酸及缩写和英文简称如下表所示：
表1
本发明所用的实验室试剂均来自于商业化购买，纯度均为分析纯。合成过程中所用的试剂缩写及中文全名如下表所示：
表2
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
除非有特别说明，否则本公开中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。
实施例1 BP182a的合成
化合物BP182a具有如下式(I-5)所示的结构：
化合物BP182a的合成步骤如下所示：
步骤1，1186k的合成：1186k以Fmoc固相合成方法合成，以Rink Amide MBHA Resin为固相载体，用20％哌啶/DMF(v/v)溶液脱除Fmoc保护，再以HOBT/DIC为缩合体系，DMF为反应溶剂，依次偶 联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-NH-PEG4-PA、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH，其中Fmoc-NH-PEG4-PA采用HBTU/DIEA体系缩合，然后经TFA∶TIS∶H2O＝95∶2.5∶2.5裂解，甲基叔丁基醚沉淀，过滤、干燥，得1186k粗品，最后经高效液相色谱纯化、脱盐，然后浓缩、冻干、甲基叔丁基醚打浆、干燥，得1186k纯品。
步骤2，BP102c05、BP102c的合成：BP102c05、BP102c的合成参考EP0624377A2的合成方法，EP0624377A2通过引用并入本申请；
步骤3，化合物BP182a11的合成：向烧瓶中加入687mg(1.2eq)BP102c，565mg(1.0eq)艾日布林，6ml DMF，搅拌溶解，加入162ul(1.2eq)DIEA，TLC监控反应完毕后将反应液倒入至TBME中，固体析出，搅拌打浆后过滤、滤饼用TBME洗涤，收集滤饼，真空干燥得类白色固体1021mg即BP182a11，样品不经纯化，直接进行下一步反应。
步骤4，化合物BP182a的合成：向烧瓶中加入402mg(1.0eq)BP182a11，16ml甲醇，搅拌溶清；称取236mg(1.2eq)1186k，用1ml纯化水溶解，并用碳酸氢钠溶液调节pH至5-6，然后加入至BP182a11的反应瓶中，30min后HPLC监控反应完毕，反应液不处理，经反向高效液相制备纯化，收集纯品，冻干得166mg白色固体，即BP182a。LC/MS(m/z)：calcd for C89H135N13O28S 1865.93；found 1867.00[M+H]+、934.10[M+2H]2+、623.30[M+3H]3+。
实施例2 BP182d的合成
化合物BP182d具有如下式(I-1)所示的结构：
化合物BP182d的合成步骤如下所示：
步骤1，BP182d01的合成：以Fmoc固相合成方法合成，以2ClTrt Resin为固相载体，用20％哌啶/DMF(v/v)溶液脱除Fmoc保护，再以HOBT/DIC为缩合体系，DMF为反应溶剂，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH，然后经2％TFA/DCM溶液切割，甲基叔丁基醚沉淀，离心、干燥，得BP182d01，不经纯化，直接进行下一步反应。
步骤2，BP182d02的合成：向烧瓶中加入501mg(1.0eq)BP182d01，415mg(1.0eq)艾日布林，10mlDCM、4ml DMF，搅拌溶清后降温至5±5℃，加入237ul(2.5eq)DIEA，加入140ul(1.5eq)DEPC，升至室温反应，TLC监控反应完毕后将反应液真空浓缩除去DCM，然后加入TBME，搅拌打浆，过滤、滤饼用TBME洗涤，收集滤饼，真空干燥得类白色固体1.023g，不经纯化，直接进行下一步反应。
步骤3，BP182d的合成：向烧瓶中加入1000mg BP182d02，7ml甲醇，7ml THF，搅拌溶清；称取300mg LiOH.H2O，用10ml纯化水溶解后滴加至反应瓶中，调节pH至12，TLC监控反应完毕后加入醋酸淬灭反应，将反应液真空浓缩除去有机溶剂，得BP182d粗品，粗品经正向高效液相制备纯化，收集纯品，浓缩至干得195mg类白色固体，即BP182d。LC/MS(m/z)：calcd for C67H97N9O21 1363.68；found 1364.70[M+H]+、682.85[M+2H]2+、1362.75[M-H]-。
实施例3 式I-7化合物、式I-8化合物的制备
在BP182a11与1186k偶联完成后，在反应液中加入LiOH水溶液，发生开环反应，制得式I-7化合物、式I-8化合物的混合物，经HPLC制备纯化后冻干得式I-7化合物、式I-8化合物的混合物。
实施例4 式I-9化合物、式I-10化合物的制备
Linker Gly-Gly-Gly-PEG4-PA-Cys的合成采用2Cl-Trt树脂，合成及纯化方法见1186k的制备方法。偶联及开环反应使用式I-7化合物、式I-8化合物的制备方法制得I-9化合物、式I-10化合物混合物。
实施例5：抗体药物偶联物的制备
1、抗人ErbB2/Her2抗体的生产、纯化及鉴定：
抗体Ab0100重链的羧基端连接有GALPETGG(以下称为Ab0100-HCCTL)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示；抗体Ab0100轻链的羧基端连接有GALPETGG(以下称为Ab0100-LCCTL)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。因此，在抗体Ab0100中共引入有4个连接酶的识别序列。抗体Ab0100的合成可参考WO1989006692A1，WO1989006692通过引用并入本公开。
表3 抗体Ab0100轻链的序列信息
表4 抗体Ab0100重链的序列信息
2、偶联抗体与式(I-1)或式(I-5)所示的化合物，偶联反应的方法可已参考WO2015165413A1中的方法，具体如下：
(1)以BP182a所示的化合物为中间体，以上述抗人ErbB2/Her2为抗体，通过Sortase A酶促连接的方法制备得到的ADC，命名为Ab0100-H0037。Ab0100-H0037的具体结构如下式(III-5)所示为：
(2)以BP182d所示的化合物为中间体，以上述抗人ErbB2/Her2为抗体，通过Sortase a酶促连接的方法制备得到的ADC，命名为Ab0100-H0038。Ab0100-H0038的具体结构如下式(III-1)所示为：
实施例6：LB302-2-4的合成
本实施例制备如下述结构所示的化合物LB302-2-4：
化合物LB302-2-4的制备步骤如下所示：
步骤1，连接剂HX20111的制备：
用Rink-amide-MBHA-树脂采用传统固相多肽合成方法合成HX20111。用Fmoc保护连接单元中的氨基酸。偶联试剂从HOBT、HOAt/DIC、DCC、EDCI或HATU中选择。合成后，用三氟乙酸裂解树脂。产品经高效液相色谱纯化，冻干后保存。理论质量：1383.70，测量：[M-H]-＝1382.6。
步骤2，化合物LB302-2-4的制备：
称取HX20111和中间物MC-GGFG-Dxd(摩尔比～1∶2)分别溶于水和DMF中，充分混合得到混合物，在0-40℃下反应0.5-30h。反应完成后，直接加入适量的Tris Base溶液或其他促进开环反应的溶 液，在0-40℃下再进行0.2-20h的反应。反应完成后，用半制备/制备型HPLC对产物进行纯化，并冻干得到连接剂-有效载荷中间体LB302-2-4。理论质量：3486.52，实测：[(M+3H)/3]+＝1163.3。
实施例7：抗体药物偶联物BQ3的制备
采用实施例4中所示的方法，向抗人ErbB2/Her2抗体Ab0001上偶联化合物LB302-2-4，得到的ADC信息如下表所示。其中，抗体Ab0001的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，抗体Ab0001的轻链的羧基端连接有GALPETGG(以下简称为Ab0001-LCCTL)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
表5
表6 抗体Ab0001的重链和轻链的氨基酸信息
实施例8：体外实验验证ADC的细胞毒性
1.1材料与设备
本实验例采用的材料与设备如下表所示。
表7
1.2实验步骤
1.2.1细胞铺板
(1)细胞镜检；
(2)清洗；
(3)消化；
(3)离心；
(4)细胞计数；
(5)细胞铺板；其中NCI-N87和SK-BR-3是5000个细胞/孔，HCC1954和MDA-MB-468是4000/孔。
1.2.2细胞给药
(1)镜检
(2)药物配制：
a.样品配置缓冲液配置：将给药细胞所用培养基(10％FBS)配置所需量的样品配置缓冲液；
b.样品配置：按照第一个浓度所需浓度的倍比稀释样品，24孔板或96孔板中按照下表进行配置；
表8
(3)加药：从低浓度到高浓度依次加入不同浓度药物，每个浓度设3个复孔，100μl/well，其中puro组为3个复孔，100μl/well。
(4)药物加完后，将细胞移至培养箱内继续培养120h。培养条件：37度，CO2培养箱中。
1.2.3细胞活力检测
(1)检测试剂准备：提前将CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay检测试剂避光平衡至室温。
(2)细胞准备：将待测细胞从培养箱内取出，25℃平衡30min。
(3)ATP检测：弃掉培养基，加入100μl/孔DMEM，50μl/孔CTG加入96孔板中，铝箔纸避光保存，涡旋振荡仪200rpm室温震荡15min(注意：此时可以进行酶标仪程序设置)。
(4)检测程序：增益值为135，设置好程序后，将黑壁底透板去盖，按照仪器指定方式放置。
(5)数据保存
1.3实验结果
图1示出了Ab0100-H0038、Ab0100-H0037、BQ3，与小分子药物艾日布林、Dxd对人乳腺癌细胞HCC1954的细胞毒性检测结果。其中，各药物分子的IC50值如下表所示：
表9
图2示出了Ab0100-H0038、Ab0100-H0037、BQ3，与小分子药物艾日布林、Dxd对人乳腺癌细胞SK-BR-3的细胞毒性检测结果。其中，各药物分子的IC50值如下表所示：
表10
图3示出了Ab0100-H0038、Ab0100-H0037、BQ3，与小分子药物艾日布林、Dxd对人胃癌细胞NCI-N87的细胞毒性检测结果。其中，各药物分子的IC50值如下表所示：
表11
图4示出了Ab0100-H0038、Ab0100-H0037、BQ3，与小分子药物艾日布林、Dxd对人乳腺癌细胞MDA-MB-468的细胞毒性检测结果。其中，各药物分子的IC50值如下表所示：
表12
如图1-3所示，Ab0100-H0037和Ab0100-H0038能够显著降低HER2阳性(例如，HCC1954、SK-BR-3和NCI-N87)的各类肿瘤细胞的体外存活率，发挥高效的肿瘤细胞杀伤活性，说明本公开中制备抗体药物偶联物对HER2阳性的肿瘤细胞具有有效的杀伤作用。如图4所示，在HER2阴性细胞中，Ab0100-H0037和Ab0100-H0038的细胞毒性低于小分子药物艾日布林。
Ab0100-H0037和Ab0100-H0038对HER2阳性细胞HCC1954、SK-BR-3、NCI-N87的细胞毒性优于艾日布林，显著优于Dxd，说明本公开中的通过特殊结构的连接子偶联抗体与细胞毒性药物艾日布林得到的ADC药物，具有提高的肿瘤细胞的杀伤效果。进一步的，Ab0100-H0037和Ab0100-H0038 在HER2阳性细胞中的细胞毒性，明显优于在HER2阴性细胞中的细胞毒性，说明Ab0100-H0037和Ab0100-H0038能够靶向结合HER2阳性表达的细胞并进入细胞内部，通过在细胞内释放细胞毒性药物艾日布林，实现对HER2阳性细胞的特异性、高效杀伤，具有较好的靶向性和安全性。
实施例9：体内实验验证ADC的活性和毒性
2.1实验动物：
商业购买的BALB/c裸鼠，于恒温恒湿条件下饲养。
2.2实验方法和步骤
2.2.1细胞培养
于37℃下和含5％CO2的空气中，在补充有20％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的IMDM培养基中体外保存Capan-1肿瘤细胞(ATCC，目录号HTB-79)。通过胰蛋白酶-EDTA处理，每周两次对肿瘤细胞进行常规传代培养。收获处于指数生长期的细胞，并计数用于肿瘤接种。
2.2.2肿瘤接种和动物分组
对每只小鼠的右侧皮下接种在0.2mL PBS和Matrigel(PBS∶Matrigel＝1∶1)混合物中的Capan-1肿瘤细胞(5×106)，用于肿瘤发育。在肿瘤接种后第5天，当平均肿瘤体积达到187mm3时，开始治疗。使用基于动物的肿瘤体积对其进行分层随机化的基于Excel的随机化软件将动物分配至各组中。每组由6只荷瘤小鼠组成，对小鼠给予供试品。
2.2.3供试品制备
供试品制备方法如下表所示：
表13
注：在给药前现制现配。
2.2.4肿瘤测量和终点
主要终点是确定肿瘤生长是否可被延迟或小鼠是否可被治愈。使用游标卡尺在两个维度上进行肿瘤体积测量，每周两次，并使用如下公式以mm3表示所述体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。
2.3实验结果与讨论
2.3.1死亡率、患病率和体重增加或减轻
作为毒性的间接测量指标，定期监测动物体重。
图5示出了溶媒(DPBS)、Ab0100-H0037(5mg/kg)、Ab0100-H0038(5mg/kg)，以及BQ3(5mg/kg)给药后荷瘤小鼠(Capan-1荷瘤雌性BALB/c裸鼠)的体重变化检测结果。其中，图5中基于给药第一天的动物体重计算变化，以体重百分比变化(％)显示；数据点代表BW的百分比组均值变化。误差线表示均值的标准误(SEM)。图5示出了在实验过程中，该模型的所有组中均未见显著体重减轻，未发生死亡和发病，Ab0100-H0037和Ab0100-H0038在动物体内实验中未显示明显药物毒性。
2.3.2肿瘤体积
接受Ab0100-H0037、Ab0100-H0038和BQ3给药的Capan-1异种移植物荷瘤雌性BALB/c裸鼠中平均肿瘤体积随时间的变化显示在图6中。溶媒组的平均肿瘤体积达到1,420mm3时，在试验条件下第42天终止整个研究。
2.3.3肿瘤生长抑制分析
基于第42天的肿瘤体积测量值，计算Ab0100-H0037、Ab0100-H0038和BQ3对接种Capan-1荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制，结果如下表14所示：
表14
注：
1.平均值±SEM；
2.使用以下公式计算每组的相对T/C：T/C％＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV；CRTV：同一天的对照组RTV)。RTV＝V42/V0，其中V0为治疗第一天的平均肿瘤体积，V42为治疗开始后第42天的平均肿瘤体积；
3.TGI(％)＝[1-(T42-T0)/(V42-V0)]×100％；
4.基于肿瘤体积计算p值。
由表14结果可知，Ab0100-H0037、Ab0100-H0038和BQ3能够对荷瘤小鼠的肿瘤生长产生明显抑制效果，实现对体内肿瘤细胞的高效特异性杀伤。
2.3.4肿瘤生长曲线
图6示出了溶媒(DPBS)、Ab0100-H0037(5mg/kg)、Ab0100-H0038(5mg/kg)，以及BQ3(5mg/kg)给药后荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线。
在本实验例中，在皮下接种人胰腺癌细胞Capan-1的荷瘤小鼠模型中评价了Ab0100-H0037、Ab0100-H0038和BQ3的药物毒性及肿瘤治疗效果。结果显示：溶媒对照组的平均肿瘤体积在治疗开始后第42天达到1,420mm3。5mg/kg Ab0100-H0037、Ab0100-H0038和BQ3的所有治疗均显著抑制Capan-1肿瘤生长。在第42天，Ab0100-H0037 5mg/kg(T/C＝10.59％，TGI＝102.98％，p＝0.025)、Ab0100-H00385mg/kg(T/C＝0.75％，TGI＝114.29％，p＝0.018)和BQ35mg/kg(T/C＝2.19％，TGI＝112.62％，p＝0.019)组的平均肿瘤体积分别为150、11和31mm3。Capan-1荷瘤BALB/c裸鼠中，所有供试品，包括Ab0100-H0037、Ab0100-H0038和BQ3均耐受良好。在所有治疗组中均未观察到显著的平均体重减轻。
实验例10：体内实验验证ADC的活性和毒性
3.1实验方法与步骤：
采用和实验例2相同的实验条件，研究在雌性BALB/c裸鼠皮下NCI-N87人胃癌异种移植模型中Ab0100-H0037、Ab0100-H0038和BQ3抗肿瘤疗效。
雌性BALB/c裸鼠皮下NCI-N87人胃癌异种移植模型建立方法如下：在37℃下含有5％CO2的空气中，在补充有10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的RPMI-1640培养基中，将NCI-N87肿瘤细胞(ATCC，Manassas，VA，目录号CRL-5822)作为单层培养物体外保存。通过胰蛋白酶-EDTA处理，每周两次对肿瘤细胞进行常规传代培养。收获处于指数生长期的细胞，并计数用于肿瘤接种。
肿瘤接种和动物分组：
对每只小鼠的右侧皮下接种补充有Matrigel(1∶1)的0.2mL PBS中的NCI-N87肿瘤细胞(10×106)，用于肿瘤发育。在肿瘤接种后第8天，平均肿瘤体积达到大约188mm3时，开始治疗。使用基于动物的肿瘤体积对其进行分层随机化的基于Excel的随机化软件将动物分配至各组中。每组由6 只荷瘤小鼠组成。参照实验例2向荷瘤小鼠给予供试品。
3.2实验结果：
3.2.1肿瘤生长曲线
图7示出了溶媒(DPBS)、Ab0100-H0037(5mg/kg)、Ab0100-H0038(5mg/kg)，以及BQ3(5mg/kg)给药后荷瘤小鼠(NCI-N87荷瘤雌性BALB/c裸鼠)的肿瘤生长曲线。
结果显示：在5mg/kg Ab0100-H0037、5mg/kg Ab0100-H0038和5mg/kg BQ3给药的荷瘤小鼠中，NCI-N87肿瘤生长均受到明显抑制；并且，Ab0100-H0038给药的NCI-N87荷瘤BALB/c裸鼠最终具有最小的肿瘤体积。
实验例11：体内实验验证ADC的活性和毒性
4.1实验方法与步骤：
采用和试验例2相同的实验条件，研究雌性BALB/c裸鼠皮下HCC1954人乳腺癌异种移植模型中Ab0100-H0037、Ab0100-H0038和BQ3抗肿瘤疗效。
雌性BALB/c裸鼠皮下HCC1954人乳腺癌异种移植模型建立方法如下：于37℃和5％CO2的空气中，在补充有10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的RPMI 1640培养基中体外保存HCC1954肿瘤细胞(ATCC，Manassas，VA，目录号CRL-2338)。通过胰蛋白酶-EDTA处理，每周两次对肿瘤细胞进行常规传代培养。收获处于指数生长期的细胞，并计数用于肿瘤接种。
肿瘤接种和动物分组：对每只小鼠的右侧皮下接种0.2mLPBS和基质胶(Matrigel)(PBS：基质胶＝1∶1)混合物中的HCC1954肿瘤细胞(5 x 106)，用于肿瘤发育。在肿瘤接种后第13天，平均肿瘤体积达到177mm3时，开始治疗。使用基于动物的肿瘤体积对其进行分层随机化的基于Excel的随机化软件将动物分配至各组中。每组由6只荷瘤小鼠组成。参照实验例2向荷瘤小鼠给予供试品。
4.2实验结果：
图8示出了溶媒(DPBS)、Ab0100-H0037(3mg/kg)、Ab0100-H0038(3mg/kg)，以及BQ3(5mg/kg)给药后荷瘤小鼠(HCC1954荷瘤雌性BALB/c裸鼠)的肿瘤生长曲线。
结果显示：在3mg/kg Ab0100-H0037、3mg/kg Ab0100-H0038和5mg/kg BQ3给药的荷瘤小鼠中，HCC1954肿瘤生长均受到明显抑制；并且，3mg/kg Ab0100-H0038和5mg/kg BQ3给药的NCI-N87荷瘤BALB/c裸鼠，最终显示完全抑制的肿瘤生长。
本说明书发明的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所发明的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所发明的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

Claims (12)

  1. 如式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药：
    其中，L1为(Gly)p-(Z1)a-，p为1-10的任一整数；a为0-20的任一整数，若存在，每一个Z1各自独立地为任意种类的氨基酸残基；
    L2为-NH-R1-(CH2)c-C(＝O)-，其中R1为-(CH2-CH2-X)b-，b为1-10的任一整数，每一个X各自独立地为-CH2-、-NH-、-O-或-S-，c为1-5的任一整数；
    L3为
    L3优选为
    其中m为1-5的任一整数，优选为2；R2为-(CH2-CH2-Y)d-，d为1-10的任一整数，每一个Y各自独立地为-CH2-、-NH-、-O-或-S-；
    L1的羧基端连接L2的氨基端，L2的羧基端连接L3的氨基端。
  2. 根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其特征在于，
    L1为(Gly)p-，p为1-10的任一整数，优选为3-5的任一整数；
    L2、L3如权利要求1中所定义。
  3. 根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其特征在于，L3选自如下的任意一种：
    L3优选自如下的任意一种：
    L1、L2如权利要求1中所定义。
  4. 根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其特征在于，
    L2为-NH-R1-(CH2)c-C(＝O)-；
    其中R1为-(CH2-CH2-X)b-，b为1-10的任一整数，优选为1-5的任一整数；每一个X各自独立地为-CH2-或-O-；c为1-5的任一整数，优选为1-2的任一整数；
    L1、L3如权利要求1中所定义。
  5. 根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其特征在于，
    L1-L2-为
    其中，w为0-9的任一整数，优选为2-4的任一整数；c为1-5的任一整数，优选为1-2的任一整数；
    b为1-5的任一整数，优选为2-4的任一整数，每一个X各自独立地为-CH2-或-O-；并且， 的结构为：
  6. 根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药，其特征在于，
    L1-L2-为
    其中，w为0-9的任一整数，优选为2-4的任一整数；c为1-5的任一整数，优选为1-2的任一整数；
    b为1-5的任一整数，优选为2-4的任一整数，每一个X各自独立地为-CH2-或-O-；并且， 的结构为：
  7. 如下式(I-1)～(I-10)任一项所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药：
    优选如下任一项所示的结构：
  8. 一种用于偶联抗体与药物化合物的连接子，其特征在于，所述连接子具有如下式(II)所示的结构：
    L1-L2-L3-R3 (II)；
    其中，R3选自-NH2或-OH；
    L1、L2、L3如权利要求1-4中任一项所定义。
  9. 根据权利要求8所述的连接子，其特征在于，所述连接子具有如下式(II-1)或(II-2)所示的结构：
    其中，R3选自-NH2或-OH；
    w为0-9的任一整数，优选为2-4的任一整数；c为1-5的任一整数，优选1-2的任一整数，
    b为1-5的任一整数，优选为2-4的任一整数，每一个X各自独立地为-CH2-、-NH-、-O-或-S-。
  10. 根据权利要求8或9所述的连接子，其特征在于，所述连接子具有如下任一项所示的结构：
  11. 根据权利要求1-7任一项所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药在制备抗体药物偶联物中的用途；
    其中，所述抗体药物偶联物中，根据权利要求1-7任一项所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、光学异构体、互变异构体、同位素标记物或前药通过L1与抗体或抗原结合片段相偶联；
    可选地，所述抗体药物偶联物用于预防和/或治疗肿瘤；可选地，所述肿瘤为与HER蛋白家族中的一种或两种以上的蛋白异常表达相关的肿瘤；优选地，所述异常表达的蛋白选自HER2、HER3中的至少一种；
    可选地，所述肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌或淋巴瘤。
  12. 根据权利要求8-10任一项所示的连接子在制备抗体药物偶联物中的用途；
    其中，所述抗体药物偶联物中，所述连接子的L1基团连接抗体或抗原结合片段，所述连接子的L3基团连接药物化合物；
    可选地，所述抗体药物偶联物用于预防和/或治疗肿瘤；可选地，所述肿瘤为与HER蛋白家族中的一种或两种以上的蛋白异常表达相关的肿瘤；优选地，所述异常表达的蛋白选自HER2、HER3中的至少一种；
    可选地，所述肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌或淋巴瘤。
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