CN118415230A - 一种鲜切双孢蘑菇综合保鲜的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食用菌保鲜技术领域，公开了一种鲜切双孢蘑菇综合保鲜的方法和应用，步骤如下：预处理，将蘑菇进行挑选分级，选择新鲜蘑菇，将挑好的蘑菇整齐地摆放；用3％H2O2浸泡60s，切成薄片；配置p‑CA+SH混合溶液，对蘑菇切片进行浸泡；进行5μmol/L CAR熏蒸包装，扎孔散热排湿，贮藏即可。本发明方法从“抑制病变”‑“降低褐变”‑“保留营养”三个层面入手，利用p‑CA、CAR和SH的抑菌、减褐、保湿作用，从抑制病原菌侵染(病变)、降低褐变程度(褐变)和降低营养成分流失(营养)三个层面有效提高了双孢蘑菇抗病保鲜品质，是一种新型提高双孢蘑菇贮藏品质的方法，也能为食用菌的贮藏保鲜提供参考。
Description
技术领域
本发明属于食用菌保鲜技术领域，尤其是一种鲜切双孢蘑菇综合保鲜的方法和应用，特别是一种对香豆酸和香芹酚在透明质酸钠基质下联合使用提高食用菌保鲜品质的方法和应用。
背景技术
双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，因其丰富的营养成分深受国内外消费者喜欢。据报道，双孢蘑菇干粉中粗蛋白质含量接近40％，脂肪含量仅为1.5％；含有17种氨基酸，包含8种人体必须氨基酸，高达氨基酸总量的40％；双孢蘑菇中还富含多种维生素和矿物质，营养成分远超其他果蔬，因此又被称为“植物肉”。除丰富的营养物质以外，双孢蘑菇中还含有多种糖类、酚类、凝集素等活性成分，具有抗癌、抗氧化、抗肥胖、抗炎等功效。双孢蘑菇的水分在85％至95％之间，在室温下呼吸速率超过200mg/kg/h，又缺少角质层保护，体内各种代谢活动强烈，且其中酚类物质较多，采后极易出现酶促褐变、失水萎缩、细菌侵染等问题，导致贮藏品质下降。在室温(20-25℃)或冷藏(0-2℃)下储存保鲜期仅分别在1-3天和5-7天。
双孢蘑菇与其他果蔬差别较大，因其独特的生长特性，双孢蘑菇采摘后仍然会继续生长，菌柄伸长，菌帽扩张，逐渐开伞露出菌褶。此外，双孢蘑菇表面没有果皮等保护组织，而且颜色洁白，极易发生变色。目前双孢蘑菇的保鲜方法主要是冷藏，冷藏的适宜温度为0-4℃，当温度低于0℃时，双孢蘑菇会出现冻伤现象；然而，即使贮藏在0-4℃环境中，双孢蘑菇贮藏期也仅最多一周。与整菇相比，鲜切双孢蘑菇的贮藏保鲜困难更大：鲜切处理操作对双孢蘑菇造成严重机械伤，导致蘑菇细胞和组织损失，加之双孢蘑菇体内含有大量褐变相关物质，进而受到机械性损害时会快速褐变，使得蘑菇切片在短时间内发生变色；此外，鲜切双孢蘑菇含水量高，比表面积增大，失水率极速增加，加速萎蔫，同时病原微生物的污染概率增大，病变问题加重。即使冷藏也只能缓解这些问题，并不能有效延长贮藏期。化学保鲜技术虽具有高效、成本低和应用范围广等优点，但是合成化学保鲜剂因安全隐患在鲜切蔬菜上的应用受到很大限制。因此，目前还没有安全有效的方法来防止鲜切双孢蘑菇贮藏过程中产生病变、褐变、失水问题，寻找绿色、安全、环保、有效的防治保鲜手段仍然是迫在眉睫。
天然植物来源的保鲜因子，对香豆酸(p-coumaric acid，p-CA)，是植物内源物质，苯丙烷代谢途径的重要中间产物。具有抗氧化、抗褐变、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、预防心血管疾病、调节糖尿病等作用。另外，对多种病原菌也有一定的抑制作用，还可抑制黑色素形成及延缓皮肤老化等。香芹酚(carvacrol，CAR)是单萜酚类化合物，是很多挥发性精油的主要成分，有广谱抗菌性，已在多项研究中证明。此外，CAR还具有抗癌、抗氧化、调节免疫等活性，已被批准为食品添加剂。透明质酸钠(Sodium Hyaluronate，SH)，广泛存在于人体皮肤、关节软组织中。SH的安全性已被认可，2008年被批准为新资源食品，2021年被批准为新食品原料，扩大了在食品中的应用范围。多项研究证明，SH具有补水润滑、美容养颜、促进愈合修复、抗氧化等功效。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种鲜切双孢蘑菇综合保鲜的方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种对香豆酸和香芹酚在透明质酸钠基质下联合使用提高食用菌保鲜品质的方法，包括如下步骤：
步骤一，预处理，将蘑菇进行挑选分级，选择无机械伤害、无病斑、子实体洁白、未开伞、菇体完整、直径在3-4cm的新鲜蘑菇，切除多余菌柄，放好备用；
步骤二，将挑好的蘑菇在质量浓度3％H2O2溶液中浸泡60s，放到果蔬保鲜纸上晾干，晾干后的双孢蘑菇切片处理备用；选取中间位置含有菌褶、菌肉、菌柄的2-3片备用；
步骤三，配置对香豆酸、透明质酸钠的混合溶液，该混合溶液中对香豆酸的浓度为37.5mg/L、透明质酸钠的质量浓度为1％、溶剂为水，对蘑菇切片表面进行浸泡，具体方法如下：
室温下，将蘑菇切片在对香豆酸、透明质酸钠的混合溶液中浸泡2min，捞出后置于保鲜纸上吸收20-30min；
步骤四，进行5μmol/L香芹酚熏蒸包装，具体方法如下：
将香芹酚与蒸馏水混合，剧烈摇晃，形成水油平衡液，喷洒于果蔬保鲜纸上，将保鲜纸覆于步骤三得到的双孢蘑菇切片表面，熏蒸浓度为5μmol/L，保鲜膜包装后于4±1℃贮藏。
进一步地，所述步骤一中，切除菌柄后的菌柄保留0.5±0.2cm。
进一步地，所述步骤三中，浸泡比例为48片蘑菇浸泡于300mL混合溶液。
进一步地，所述步骤四中，5μmol/L香芹酚熏蒸为体积熏蒸浓度，按照香芹酚的水油平衡液中香芹酚浓度、香芹酚密度、保鲜纸香芹酚的水油平衡液喷洒量以及包装盒体积计算。
进一步地，所述步骤四中，保鲜膜包装后，于上方扎几个小孔，疏散蘑菇呼吸热，控制湿度。
如上所述的方法在采后食用菌的细菌性褐斑病防治中的应用。
如上所述的方法在食用菌保鲜中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、食用菌采后极易出现细菌侵染问题，本发明方法从“抑制病变”入手，添加天然植物源抑菌成分p-CA和CAR，提供高效抑菌杀菌作用，避免病原菌的侵染，保证贮藏期间无病原菌感染，且使用浓度较低，仅分别为mg/L和μmol/L级别，符合发明初衷，在提高双孢蘑菇采后贮藏品质的同时控制成本。
2、护色保鲜问题是双孢蘑菇采后贮藏和生产加工中必须解决的共性关键技术问题。本发明方法从“降低褐变”层面入手，利用p-CA和CAR抗氧化、抗褐变作用，在贮藏5天后使鲜切双孢蘑菇的菌肉、菌褶、菌柄的L*值分数分别提高了7.16、11.33、6.52，褐变指数(BI)分别降低了23％、28％、28％，色差值(ΔE)分别降低了57.6％，44.6％，36％，而且有效降低了褐变相关酶(PPO)活性，提高了抗氧化相关酶(CAT、SOD、POD)的活性，最终有效降低了蘑菇的褐变程度，维持了保鲜品质，是一种新型降低鲜切双孢蘑菇褐变的方法，为鲜切双孢蘑菇护色保鲜提供新思路。
3、本发明方法从“保留营养”层面入手，利用p-CA、CAR和SH抗氧化、抗褐变、保湿的活性，使贮藏5天时失重率降低13.4％，可溶性固形物含量提高20％、可溶性蛋白含量提高12％，有效减少营养成分流失，为维持鲜切双孢蘑菇贮藏品质提供一个参考。
4、食用菌采后极易出现酶促褐变、失水萎缩、细菌侵染等多重问题，引起食用菌采后品质下降。然而，单一处理仅能解决单一问题，本发明方法立足我国食用菌贮藏保鲜的重大需求，从“抑制病变”-“降低褐变”-“保留营养”三个层面入手，首次开发植物内源物质p-CA、CAR和保湿成分SH联合使用体系，直面食用菌采后贮藏酶促褐变、失水萎缩、细菌侵染问题，逐个突破，协同提高采后蘑菇抗病保鲜效果，并确定p-CA、CAR在SH基质下最佳联用体系为1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR，为食用菌产业提供新型全面高效的抗病保鲜方式。
5、本发明所添加活性成分来源安全，p-CA和CAR均为植物源提取成分，具备抗氧化、抗褐变、抑菌等多种活性，首次应用于鲜切食用菌贮藏保鲜。
6、本发明的适用范围更广，操作简单，更容易在工厂应用，即便普通家用也能快速实现。
附图说明
图1为本发明中利用p-CA+CAR+SH联用体系对鲜切双孢蘑菇保鲜处理的一种技术路线图；
图2为本发明方法处理后鲜切双孢蘑菇贮藏期间表观照片；
图3为本发明方法处理后鲜切双孢蘑菇贮藏期间表观评定图；
图4为本发明方法处理后鲜切双孢蘑菇贮藏期间色度图；其中，(A)L*值；(B)BI值；(C)ΔE值；
图5为本发明方法处理后鲜切双孢蘑菇贮藏期间失重率图；
图6为本发明方法处理后鲜切双孢蘑菇贮藏期间可溶性固形物含量图；
图7为本发明方法处理后鲜切双孢蘑菇贮藏期间PPO酶活性图；
图8为本发明方法处理后鲜切双孢蘑菇贮藏期间抗氧化相关酶(CAT、SOD、POD)活性图；其中，(A)CAT酶活性；(B)SOD酶活性；(C)POD酶活性；
图9为本发明中蛋白浓度标准对照曲线图；
图10为本发明方法处理后鲜切双孢蘑菇贮藏期间可溶性蛋白质含量图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
一种对香豆酸和香芹酚在透明质酸钠基质下联合使用提高食用菌保鲜品质的方法，包括如下步骤：
步骤一，预处理，将蘑菇进行挑选分级，选择无机械伤害、无病斑、子实体洁白、未开伞、菇体完整、直径在3-4cm的新鲜蘑菇，切除多余菌柄，放好备用；
步骤二，将挑好的蘑菇在质量浓度3％H2O2溶液中浸泡60s，放到果蔬保鲜纸上晾干，晾干后的双孢蘑菇切片处理备用；选取中间位置含有菌褶、菌肉、菌柄的2-3片备用；
步骤三，配制对香豆酸、透明质酸钠的混合溶液，该混合溶液中对香豆酸的浓度为37.5mg/L、透明质酸钠的质量浓度为1％、溶剂为水，对蘑菇切片表面进行浸泡，具体方法如下：
室温下，将蘑菇切片在对香豆酸、透明质酸钠的混合溶液中浸泡2min，捞出后置于保鲜纸上吸收20-30min；
步骤四，进行5μmol/L香芹酚熏蒸包装，具体方法如下：
将香芹酚与蒸馏水混合，剧烈摇晃，形成水油平衡液，喷洒于果蔬保鲜纸上，将保鲜纸覆于步骤三得到的双孢蘑菇切片表面，熏蒸浓度为5μmol/L，保鲜膜包装后于4±1℃贮藏。
较优地，所述步骤一中，切除菌柄后的菌柄保留0.5±0.2cm。
较优地，所述步骤三中，浸泡比例为48片蘑菇浸泡于300mL混合溶液。
较优地，所述步骤四中，5μmol/L香芹酚熏蒸为体积熏蒸浓度，按照香芹酚的水油平衡液中香芹酚浓度、香芹酚密度、保鲜纸香芹酚的水油平衡液喷洒量以及包装盒体积计算。
较优地，所述步骤四中，保鲜膜包装后，于上方扎几个小孔，疏散蘑菇呼吸热，控制湿度。
如上所述的方法在采后食用菌的细菌性褐斑病防治中的应用。
如上所述的方法在食用菌保鲜中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
一、一种p-CA和CAR在SH基质下联合使用对双孢蘑菇处理方法，步骤如下：
步骤一，预处理，将蘑菇进行挑选分级，选择无机械伤害、无病斑、子实体洁白、未开伞、菇体完整、直径在3-4cm的新鲜蘑菇，保留0.5±0.1cm菌柄，切除多余部分，放好备用。
步骤二，将挑好的蘑菇在质量浓度3％H2O2溶液中浸泡60s，放到果蔬保鲜纸上晾干，晾干后的双孢蘑菇切片处理备用。选取中间位置含有菌褶、菌肉、菌柄的2-3片备用。
步骤三，配置p-CA、HA混合溶液(0.5％SH、1％SH、37.5mg/L p-CA+0.5％SH、75mg/Lp-CA+0.5％SH、37.5mg/L p-CA+1％SH、75mg/L p-CA+1％SH，以上百分数均为质量浓度，溶剂均为水)，对蘑菇切片表面进行浸泡，具体方法如下：
室温下，将蘑菇切片在p-CA+SH溶液中浸泡2min，浸泡比例为48片蘑菇浸泡于300mL混合溶液，捞出后置于保鲜纸上吸收20-30min；
步骤四，进行5μmol/L CAR熏蒸包装，具体方法如下：
将CAR与蒸馏水混合，剧烈摇晃，形成水油平衡液，喷洒于果蔬保鲜纸上，将保鲜纸覆于双孢蘑菇切片表面；熏蒸浓度为5μmol/L，5μmol/L CAR熏蒸为体积熏蒸浓度，按照CAR的水油平衡液中CAR浓度、CAR密度、保鲜纸CAR的水油平衡液喷洒量以及包装盒体积计算；保鲜膜包装后，在上方保鲜膜中扎几个小孔，疏散蘑菇呼吸热，控制湿度，于4±1℃贮藏，如图1所示。
二、本发明方法处理后的蘑菇感官品质测定，具体实验如下：
对储存期内的蘑菇切片拍照并按照下面评分标准进行感官评定。
表1采后鲜切双孢蘑菇贮藏感官评分标准
对联用体系浸泡后的鲜切双孢蘑菇的菌肉、菌褶、菌柄进行了监测，从图2可以看出，在仅贮藏1d时，Control组的蘑菇切片就出现褐变的现象，表现为菌肉颜色开始轻微变黄，菌褶颜色加深逐渐转为褐色，菌柄有轻微黄斑出现，而其他用不同比例SH+p-CA+CAR联用体系处理组未出现此现象。随贮藏时间的延长，各组均出现褐变萎蔫现象，其中，Control组褐变萎蔫程度最为严重，1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组的鲜切双孢蘑菇菌肉和菌柄颜色洁白，菌褶也呈粉褐色，保鲜效果最佳。为了能更直观的观察各组蘑菇的储存品质，对贮藏期间双孢蘑菇进行了感官品质进行量化评分。如图3所示，随贮藏时间的延长，各组蘑菇的菌肉、菌褶、菌柄颜色，气味和质地的状态均呈逐渐下降的趋势，菌肉、菌褶、菌柄的颜色评分下降更为明显，气味和质地只有轻微下降。在所有处理组中，Control组的评分一直最低，质量浓度1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR一直最高，可见p-CA和CAR在SH基质下的联用可以有效维持双孢蘑菇的感官品质。尤其在贮藏第五天时，Control组菌褶颜色变为黑褐色，感官评定分数仅为2.25，而1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR的菌褶颜色还是粉褐色，感官分数为3.75，菌褶分数高达Control组的1.6倍。可以看出1％SH+37.5mg/Lp-CA+5μmol/L CAR联用体系有效保持鲜切双孢蘑菇的感官品质，尤其对于保持菌褶颜色效果最佳。
同时，也可以看出，本发明方法中1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR这三者之间具有协同作用，能够协同提高食用菌的保鲜品质。
三、本发明方法处理后的蘑菇中色度测定，具体实验如下：
每组随机选取5片鲜切双孢蘑菇，利用WR-18色差仪，测量双孢蘑菇的菌褶、菌肉和菌柄的L*、a*、b*值，每个组织部位复测3次。按照下面公式计算褐变度(BI)和ΔE。
BI＝[100×(X-0.31)]/0.172
式中：X＝(a*+1.75L*)/(5.645L*+a*-3.012b*)
ΔL*、Δa*、Δb*分别为各样品与Control组的L*、a*、b*的差值
为了更清晰的对比各组双孢蘑菇的菌肉、菌褶、菌柄的褐变程度，监测了菌肉、菌褶、菌柄颜色变化，详细数据见表2、3、4。可以看出菌肉、菌褶、菌柄的变化趋势一致，随储存时间延长，各组菌肉、菌褶、菌柄的L*值逐渐降低，BI值和ΔE逐渐升高，这代表着双孢蘑菇的褐变程度逐渐加重。其中，联用体系处理组的L*一直处于较高水平，BI值和ΔE值也一直低于Control组。尤其1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组保鲜效果最好，贮藏到第五天时，Control组菌肉、菌褶、菌柄的L*值仅为81.04±0.6、37.39±0.64、76.86±1.34，而1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组菌肉、菌褶、菌柄的L*值为88.20±0.89、48.72±0.87、83.38±0.57，菌肉、菌褶、菌柄的L*值分别高出Control组7.16、11.33、6.52。如图4所示，1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组双孢蘑菇菌肉、菌褶、菌柄的L*、BI值和ΔE值的水平一直显著优于Control组，且与单独的1％SH处理相比，联用体系中加入37.5mg/Lp-CA+5μmol/L CAR，抗褐变作用增大，且在菌褶抗褐变中效果更明显，使菌褶L*值最高可达到Control组的1.3倍，BI值和ΔE值低至Control组的72％、55.3％。由此可见，1％SH、37.5mg/L p-CA和5μmol/L CAR这三种条件的共同使用，三者之间具有协同作用，能够协同提高抗氧化作用，保持鲜切双孢蘑菇的贮藏品质。依此结果，1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR为最佳联用体系，可有效缓解双孢蘑菇储存期间褐变问题，保持感官品质。
四、本发明方法处理后的蘑菇失重率测定，测定方法如下：
每天对储存期的蘑菇切片称重，按照下面公式计算失重率。
失重率(％)＝(G1-G2)/G1×100
式中：G1为贮藏前双孢蘑菇质量，g；G2为贮藏后双孢蘑菇质量，g。
各处理组双孢蘑菇储存期间失重率见表5，各处理组失重率随贮藏时间延长不断增加，Control组失重率一直显著高于其他添加SH的8组，且随SH添加量的增加，失重率逐渐减小，在1％SH基质联用体系处理的四组双孢蘑菇(1％SH，1％SH+5μmol/L CAR，1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR，1％SH+75mg/L p-CA+5μmol/L CAR)与Control组差异更显著，其中1％SH+75mg/L p-CA+5μmol/L CAR失重率最低。如图5所示，在贮藏3天时，1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组失重率仅为Control组的76％，在贮藏5天时，Control组失重率高达7.7％，而1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组仅为6.6％，降低了13.4％。以上结果说明SH在双孢蘑菇采后贮藏期间发挥了显著保湿锁水的作用，有效降低了鲜切双孢蘑菇失重率，提高了贮藏品质。即质量浓度1％SH、37.5mg/L p-CA和5μmol/LCAR这三种条件的共同使用，三者之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的食用菌的相关保鲜品质。
五、本发明方法处理后的蘑菇可溶性固形物含量测定，测定方法如下：
称取1g蘑菇样品，加入2mL蒸馏水，用研钵充分研磨，4000rpm，离心10min，取滤液利用手持式折光仪测定。
如表6所示，随贮藏时间的延长，各处理组的可溶性固形物含量逐渐下降，其中Control组下降最为严重，而各SH+p-CA+CAR处理组的下降问题均有所缓解，一直高于Control组。在相同p-CA和CAR浓度下相比，1％SH联用体系组比0.5％SH更高。其中1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组效果最好。如图6所示，贮藏到第5天时，1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组的可溶性固形物含量最高，为1.8％，而Control组为1.5％，提高了20％，有效降低了双孢蘑菇贮藏期间可溶性固形物损失，保障了贮藏品质。即质量浓度1％SH、37.5mg/L p-CA和5μmol/L CAR这三种条件的共同使用，三者之间具有协同作用，能够协同提高鲜切双孢蘑菇的贮藏品质。六、本发明方法处理后的蘑菇中褐变相关酶活(PPO)以及抗氧化相关酶活(POD、CAT、SOD)测定，测定方法如下：
称取1g样品加入9mL 50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0，含1％PVP，1mmol/LDTT)，冰浴研磨，在4℃条件下8500rpm/min离心5min。取上清液备用，四种酶测定均采用南京建成生物工程研究所所研发的相应酶试剂盒。
如图7所示，PPO活性逐渐上升，Control组PPO酶活性在5d上升至最高值54.34U/mgprot。在贮藏1-3天时，1％SH处理组的PPO酶活性相较于Control组无明显差异，而1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/LCAR处理组的PPO活性一直显著低于Control组，尤其在2d时，Control组PPO活性高达1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组的1.4倍。以上结果表明，SH对于降低PPO活性作用微弱，而37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR对PPO活性升高有显著阻止作用。1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/LCAR联用体系阻止PPO酶活上升，抑制了褐变，保持鲜切双孢蘑菇的贮藏品质。
如图8所示，CAT、SOD和POD的活性整理均呈现不断上升趋势，1％SH处理组的CAT、SOD和POD酶活性相较于Control组显著上升，添加37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR后上升幅度更大，1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组CAT、SOD和POD酶活性分别在5d、5d、3d达到峰值，分别为164.37U/mgprot、390.71U/mgprot和83.72U/mg prot相同贮藏时间下，分别为Control组的2.2、1.2、1.4倍。以上结果表明，1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR联用体系提高子实体内抗氧化能力，降低氧化损伤。即质量浓度1％SH、37.5mg/L p-CA和5μmol/LCAR这三种条件的共同使用，三者之间具有协同作用，能够协同提高鲜切双孢蘑菇的抗氧化能力，提高贮藏品质。
七、本发明方法处理后的双孢蘑菇中可溶性蛋白含量测定方法，包括以下具体步骤：
步骤一，取约1g组织样品，加入6mL 0.05mol/L pH 7.0磷酸缓冲液(含1％PVP，1mmol/LDTT)冰浴研磨匀浆，8000rpm，4℃离心15min，将上清液转移至干净无菌的2mL离心管中，置于冰盒中保存待测；
步骤二，完全溶解蛋白标准品，取10μL，用0.05M pH 7.0磷酸缓冲液(含1％PVP，1mmol/LDTT)稀释至250μL，使终浓度为0.2g/L；
步骤三，5×G250染色液(北京索莱宝)使用前颠倒3-5次混匀，取1mL 5×G250染色液，加入4mL 0.05mol/L pH 7.0磷酸缓冲液，混匀成1×G250染色液；
步骤四，将标准品按0，2，4，6，8，12，16，20μL分别加到96孔板中，加0.05mol/LpH7.0磷酸缓冲液(含1％PVP，1mmol/LDTT)补足到20μL，用酶标仪测定595nm的吸光度，得到标准曲线，回归方程为：Y＝0.002X+0.0149；
步骤五，加20μL样品到96孔板的样品孔中，各孔中加入200μL稀释后的1×G250染色液，室温放置3-5分钟，用酶标仪测定595nm处的吸光度；
步骤六，根据回归方程计算出样品中的蛋白浓度。
如图9所示，随贮藏时间的延长，各处理组的可溶性蛋白含量逐渐下降，其中Control组下降最为严重，而1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR的下降问题有所缓解，一直高于Control组。贮藏到第5d时，1％SH+37.5mg/L p-CA+5μmol/L CAR处理组的可溶性蛋白含量最高，是Control组的1.2倍，有效降低了双孢蘑菇贮藏期间可溶性蛋白损失，保障了贮藏品质。即质量浓度1％SH、37.5mg/L p-CA和5μmol/L CAR这三种条件的共同使用，三者之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的食用菌的相关保鲜品质。
上述提到的Control组即对照例，具体处理如下：
采用常规贮藏保鲜技术，即将挑好的蘑菇在质量浓度3％H2O2溶液中浸泡60s，放到果蔬保鲜纸上晾干，晾干后的双孢蘑菇切片处理备用，在自来水中浸泡2min，置于吸水纸中晾干，放入保鲜盒包裹保鲜膜，4±1℃贮藏。进行贮藏双孢蘑菇。
在贮藏期间进行定期抽检，抽样检测的项目主要包括色差、失重率、形态等感官指标以及PPO和抗氧化相关酶(POD、CAT、SOD)活性变化，可溶性固形物、可溶性蛋白含量等营养指标。
表2双孢蘑菇不同组织部位L*值
注：数据表示平均值±标准误差(n＝3)。同一行中不同的大写字母代表不同联用体系之间的显著性(P<0.05)；同一列中不同的小写字母在不同时间点之间具有显著性(P<0.05)。
表3双孢蘑菇不同组织部位BI值
注：数据表示平均值±标准误差(n＝3)。同一行中不同的大写字母代表不同联用体系之间的显著性(P<0.05)；同一列中不同的小写字母在不同时间点之间具有显著性(P<0.05)。
表4双孢蘑菇不同组织部位ΔE值
注：数据表示平均值±标准误差(n＝3)。同一行中不同的大写字母代表不同联用体系之间的显著性(P<0.05)；同一列中不同的小写字母在不同时间点之间具有显著性(P<0.05)。
表5联用体系对双孢蘑菇贮藏期间失重率的影响
注：数据表示平均值±标准误差(n＝3)。同一行中不同的大写字母代表不同联用体系之间的显著性(P<0.05)；同一列中不同的小写字母在不同时间点之间具有显著性(P<0.05)。
表6联用对双孢蘑菇贮藏期间可溶性固形物含量的影响
注：数据表示平均值±标准误差(n＝3)。同一行中不同的大写字母代表不同联用体系之间的显著性(P<0.05)；同一列中不同的小写字母在不同时间点之间具有显著性(P<0.05)。
现有双孢蘑菇保鲜技术多集中于整菇贮藏，方法主要集中于施用保鲜剂、涂膜和气调保鲜，主要解决双孢蘑菇保鲜期短的问题，致力于延长保鲜期。然而针对于鲜切双孢蘑菇的保鲜技术鲜少，且主要集中于解决鲜切双孢蘑菇的护色、褐变问题。本发明检测指标涵盖了鲜切双孢蘑菇颜色相关(L*值、ΔE值)、褐变相关(BI值、PPO酶活性)、抗氧化相关(CAT、SOD、POD酶活性)和营养含量相关(失重率、可溶性固形物、可溶性蛋白)多方面保鲜指标，多角度证明该发明方法的高效保鲜效果。目前，有精氨酸应用于鲜切双孢蘑菇保鲜的实例，然而，0.4mmol/L精氨酸处理后，鲜切双孢蘑菇的L*值仅提高了约3，ΔE值降低了约11％，而本发明将鲜切双孢蘑菇菌褶的L*值提高了11.33，ΔE值降低了55.4％，达到了更优的护色效果。与其他类似果蔬保鲜技术相比，82mg/L p-CA应用于番茄保鲜，使可溶性固形物含量提高4.5％，而本联用体系中，p-CA浓度降低至37.5mg/L，同时使鲜切双孢蘑菇可溶性固形物含量提高20％，达到了更好的保鲜效果。此外，CAR在果蔬保鲜中应用极少，且为克服其易挥发的局限性，多制成乳液或微胶囊来延长保鲜作用。现有技术中，环糊精香芹酚微胶囊应用于水蜜桃保鲜中，使失重率降低约0.5％，可溶性固形物含量升高约1.8％，而本发明中直接利用CAR的挥发性与p-CA、SH联用，使鲜切双孢蘑菇失重率降低1.06％，可溶性固形物升高20％，保鲜效果更好，且操作简单，成本降低。本发明证明p-CA、CAR和SH联用提高了p-CA和CAR的保鲜效果，具有协同保鲜作用。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (7)
1.一种对香豆酸和香芹酚在透明质酸钠基质下联合使用提高食用菌保鲜品质的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一，预处理，将蘑菇进行挑选分级，选择无机械伤害、无病斑、子实体洁白、未开伞、菇体完整、直径在3-4cm的新鲜蘑菇，切除多余菌柄，放好备用；
步骤二，将挑好的蘑菇在质量浓度3％H2O2溶液中浸泡60s，放到果蔬保鲜纸上晾干，晾干后的双孢蘑菇切片处理备用；选取中间位置含有菌褶、菌肉、菌柄的2-3片备用；
步骤三，配置对香豆酸、透明质酸钠的混合溶液，该混合溶液中对香豆酸的浓度为37.5mg/L、透明质酸钠的质量浓度为1％、溶剂为水，对蘑菇切片表面进行浸泡，具体方法如下：
室温下，将蘑菇切片在对香豆酸、透明质酸钠的混合溶液中浸泡2min，捞出后置于保鲜纸上吸收20-30min；
步骤四，进行5μmol/L香芹酚熏蒸包装，具体方法如下：
将香芹酚与蒸馏水混合，剧烈摇晃，形成水油平衡液，喷洒于果蔬保鲜纸上，将保鲜纸覆于步骤三得到的双孢蘑菇切片表面，熏蒸浓度为5μmol/L，保鲜膜包装后于4±1℃贮藏。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一中，切除菌柄后的菌柄保留0.5±0.2cm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤三中，浸泡比例为48片蘑菇浸泡于300mL混合溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤四中，5μmol/L香芹酚熏蒸为体积熏蒸浓度，按照香芹酚的水油平衡液中香芹酚浓度、香芹酚密度、保鲜纸香芹酚的水油平衡液喷洒量以及包装盒体积计算。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤四中，保鲜膜包装后，于上方扎几个小孔，疏散蘑菇呼吸热，控制湿度。
6.如权利要求1至4任一项所述的方法在采后食用菌的细菌性褐斑病防治中的应用。
7.如权利要求1至4任一项所述的方法在食用菌保鲜中的应用。
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