CN118406734A - 一种铁螯合肽制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁螯合肽制剂的制备方法，属于牡蛎功能活性肽制备领域。本发明公开了一种以牡蛎酶解物为原料，制备铁螯合肽制剂，该铁螯合肽制剂由牡蛎酶解物，硫酸亚铁组成，其制备方法包括以下步骤：将牡蛎干粉与水混合，加入碱性蛋白酶进行酶解，将酶解后的溶液加入乙醇进行醇沉，醇沉24h的酶解物旋蒸后经过真空冷冻干燥得到干粉；将制备得到的酶解物干粉溶解在去离子水中，再与硫酸亚铁溶液混合，加入抗坏血酸钠，筛选制备条件(酶解物浓度、螯合温度、螯合时间)。本发明以牡蛎酶解物为原料，与对于维持人体身体健康的铁元素进行结合，制备过程简单温和，一定程度上开拓了海洋食品价值化利用的产业思路。
Description
技术领域
本发明涉及牡蛎功能活性肽制备领域，具体涉及一种铁螯合肽制剂的制备方法。
背景技术
矿物质元素铁在维持人们的身体健康起着十分重要的作用。铁元素，是血红蛋白、肌红蛋白以及细胞呼吸酶的组成成分，参与体内氧气的运输，缺铁则会影响儿童的生长发育，最常见的便是缺铁性贫血，会造成人体乏累、心悸等症状。所以维持体内的铁平衡状态是保证健康的重要基础。
相较于市面流通的硫酸亚铁口服液等，由食品来源制备的肽-铁复合物会避免游离的金属离子对胃肠道的刺激作用和金属味道等，具有市场研究开发前景。例如，CN110731512 A披露了一种南极磷虾铁螯合肽及其铁螯合物的制备方法，以南极磷虾粉为原料，经过脱脂、酶解和膜分离，取分子量<3000Da的组分，经过真空冷冻干燥获得南极磷虾铁螯合肽，南极磷虾铁螯合肽与Fe2+结合，形成南极磷虾肽铁螯合物。但是，南极磷虾肽铁螯合物还存在以下不足：南极磷虾氟含量高，食品制品中氟含量难以以物理形式脱出；此外，铁在生物体起主要作用的是二价态，但二价铁在肽铁制剂的生产和贮藏过程中易被氧化。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种铁螯合肽制剂的制备方法，利用牡蛎酶解物，将其作为一种铁离子的负载体系制备铁螯合肽制剂。
本发明提供了一种铁螯合肽制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、将新鲜牡蛎冷冻后，再进行真空冷冻干燥，将干燥后的牡蛎磨成粉，得到牡蛎干粉；将牡蛎干粉加入到纯净水中，用盐酸和氢氧化钠调节pH；
S2、取碱性蛋白酶，酶活力为200000U/g，加入到S1调完pH的溶液中，进行酶解；其中牡蛎干粉与碱性蛋白酶的质量比为10：0.6；
S3、向S2所得溶液加入无水乙醇进行避光醇沉；醇沉后，过滤，将沉淀去除，后经蒸发浓缩将乙醇去除；将经蒸发浓缩后的溶液冷冻，真空冷冻干燥，即得牡蛎酶解物干粉；
S4、将牡蛎酶解物干粉溶于去离子水，得到牡蛎酶解物溶液，牡蛎酶解物的浓度为4～6mg/mL；
S5、将S4的牡蛎酶解物溶液与硫酸亚铁溶液按照体积比1：1混合，再添加抗坏血酸钠，进行反应，反应的温度为40℃～70℃，时间为30～150min，得到铁螯合肽制剂。
在本发明的一种实施方式中，S1中冷冻是在-80～-30℃下冷冻；真空冷冻干燥的真空度为0.01MPa。
在本发明的一种实施方式中，S1中牡蛎干粉和纯净水的质量比为1:100；盐酸和氢氧化钠的浓度均为1M。
在本发明的一种实施方式中，S1中调节pH至8～10。
在本发明的一种实施方式中，S3中所述避光醇沉是在4℃避光醇沉24h；S3中无水乙醇为S2所得溶液和无水乙醇总体积的75～80％。
在本发明的一种实施方式中，S3中蒸发浓缩的温度为45～50℃，相对真空度为-0.06～0.01MPa。
在本发明的一种实施方式中，S3中冷冻是在-20～-80℃下冷冻2-12h；真空冷冻干燥的真空度为0.01MPa。
在本发明的一种实施方式中，S5中硫酸亚铁溶液浓度为2mM。
本发明提供上述方法制备得到的铁螯合肽制剂。
本发明还提供上述所述的铁螯合肽制剂在制备富铁食品或铁补充剂药物中的应用。
[有益效果]
1、牡蛎酶解物是将牡蛎蛋白经蛋白酶水解后得到含有分子量不同的肽的混合物，通过将牡蛎酶解物与铁离子螯合，通过调整牡蛎酶解物的浓度、螯合的温度、螯合的时间，得到了具有高的铁结合能力的铁螯合肽制剂，铁结合能力高达93.04％，进一步提高铁元素的金属离子利用度，为铁补充剂的研发方向提供良好方案；
2、牡蛎产量较大，营养价值丰富，无显著天然毒性物质，以牡蛎为原料制备的铁螯合肽具有更好的安全性；
3、本发明制备肽铁制剂的过程中，加入抗坏血酸钠，显著提升了肽铁制剂在溶液及粉末状态的铁稳定性，改善了由于氧化而造成的肽铁制剂在补铁功能的损失。
附图说明
图1A、B、C分别为实施例1和对比例1的牡蛎酶解物浓度、实施例2和对比例2的螯合温度、实施例3的螯合时间对铁结合能力的影响；
图2为Fe2+、Fe2+和VcNa、对比例3制备的铁螯合肽制剂(未加VcNa)、实施例1中牡蛎酶解物的浓度6mg/mL制备的铁螯合肽制剂溶于水中(依次从左往右)。
具体实施方式
以下将结合具体实例对本专利技术方案做进一步说明，下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
碱性蛋白酶购买于南宁庞博生物工程有限公司，酶活力为200000U/g。
牡蛎酶解物的铁结合能力测定：加入1mL牡蛎酶解物，500μL硫酸亚铁溶液(2mM)，1mL去离子水，100μL 1,10-菲罗啉。562nm处OD值采用酶标仪计数。铁结合能力(％)由下式计算：
铁结合能力(％)＝[(OD空白-OD样品)/OD空白]×100
其中，OD空白指的是样品不包含牡蛎肽，OD样品指的是样品包含牡蛎肽。
实施例1
一种铁螯合肽制剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：将新鲜牡蛎放入-30℃冰箱冷冻24h，取出后进行真空冷冻干燥，真空度为0.01MPa，干燥后的牡蛎放入磨粉机中，得到牡蛎干粉；
S2：取牡蛎干粉，按质量比1:100加入纯净水，使用1M盐酸和1M氢氧化钠将体系pH调整到8；
S3：取碱性蛋白酶，酶活力为200000U/g，加入S2所得溶液中，牡蛎干粉与碱性蛋白酶的质量比为10：0.6，将溶液置于磁力搅拌水浴锅中，50℃下酶解5h；
S4：向S3所得溶液加入无水乙醇进行醇沉，控制无水乙醇为S3所得溶液和无水乙醇总体积的80％，将溶液在4℃避光醇沉24h；
S5：将S4醇沉后所得溶液先经过滤，将沉淀去除，后经蒸发浓缩将乙醇去除，控制蒸发浓缩的温度为50℃，相对真空度为-0.06MPa；
S6：将S5经蒸发浓缩后的溶液置于-80℃冰箱冷冻2h，取出后进行真空冷冻干燥，真空度为0.01MPa，干燥后即得牡蛎酶解物干粉；
S7、将制备的牡蛎酶解物干粉溶于去离子水，得到牡蛎酶解物溶液，牡蛎酶解物的浓度分别4mg/mL，5mg/mL，6mg/mL；
S8、将S7的牡蛎酶解物溶液与2mM的硫酸亚铁溶液按照体积比1：1混合，添加0.1％的抗坏血酸钠，进行反应，反应的温度为60℃，时间为90min，得到铁螯合肽制剂。
对比例1
与实施例1铁螯合肽制剂的制备方法的制备方法一致，区别仅在于：S7中牡蛎酶解物的浓度为2mg/mL，3mg/mL。
实施例2
一种铁螯合肽制剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：将新鲜牡蛎放入-30℃冰箱冷冻24h，取出后进行真空冷冻干燥，真空度为0.01MPa，干燥后的牡蛎放入磨粉机中，得到牡蛎干粉；
S2：取牡蛎干粉，按质量比1:100加入纯净水，使用1M盐酸和1M氢氧化钠将体系pH调整到8；
S3：取碱性蛋白酶，酶活力为200000U/g，加入S2所得溶液中，牡蛎干粉与碱性蛋白酶的质量比为10：0.6，将溶液置于磁力搅拌水浴锅中，50℃下酶解5h；
S4：向S3所得溶液加入无水乙醇进行醇沉，控制无水乙醇为S3所得溶液和无水乙醇总体积的80％，将溶液在4℃避光醇沉24h；
S5：将S4醇沉后所得溶液先经过滤，将沉淀去除，后经蒸发浓缩将乙醇去除，控制蒸发浓缩的温度为50℃，相对真空度为-0.06MPa；
S6：将S5经蒸发浓缩后的溶液置于-80℃冰箱冷冻2h，取出后进行真空冷冻干燥，真空度为0.01MPa，干燥后即得牡蛎酶解物干粉；
S7、将制备的牡蛎酶解物干粉溶于去离子水，得到牡蛎酶解物溶液，牡蛎酶解物的浓度为6mg/mL；
S8、将S7的牡蛎酶解物溶液与2mM的硫酸亚铁溶液按照体积比1：1混合，添加0.1％的抗坏血酸钠，进行反应，温度分别为40℃，50℃，60℃，70℃，时间为90min，得到铁螯合肽制剂。
对比例2
与实施例1铁螯合肽制剂的制备方法的制备方法一致，区别仅在于：S8中反应的温度为30℃。
实施例3
本发明提供了一种铁螯合肽制剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：将新鲜牡蛎放入-30℃冰箱冷冻24h，取出后进行真空冷冻干燥，真空度为0.01MPa，干燥后的牡蛎放入磨粉机中，得到牡蛎干粉；
S2：取牡蛎干粉，按质量比1:100加入纯净水，使用1M盐酸和1M氢氧化钠将体系pH调整到8；
S3：取碱性蛋白酶，酶活力为200000U/g，加入S2所得溶液中，牡蛎干粉与碱性蛋白酶的质量比为10：0.6，将溶液置于磁力搅拌水浴锅中，50℃下酶解5h；
S4：向S3所得溶液加入无水乙醇进行醇沉，控制无水乙醇为S3所得溶液和无水乙醇总体积的80％，将溶液在4℃避光醇沉24h；
S5：将S4醇沉后所得溶液先经过滤，将沉淀去除，后经蒸发浓缩将乙醇去除，控制蒸发浓缩的温度为50℃，相对真空度为-0.06MPa；
S6：将S5经蒸发浓缩后的溶液置于-80℃冰箱冷冻2h，取出后进行真空冷冻干燥，真空度为0.01MPa，干燥后即得牡蛎酶解物干粉；
S7、将制备的牡蛎酶解物干粉溶于去离子水，牡蛎酶解物的浓度为6mg/mL；
S8、将S7的牡蛎酶解物溶液与2mM的硫酸亚铁溶液按照体积比1：1混合，添加0.1％的抗坏血酸钠，进行反应，温度为40℃，反应时间分别为30min，60min，90min，120min，150min，得到铁螯合肽制剂。
用碱性蛋白酶对牡蛎进行酶解，得到牡蛎酶解物。研究了牡蛎酶解物的浓度、螯合温度和螯合时间对铁结合能力的影响。如图1A所示，牡蛎酶解物的铁结合能力值呈剂量依赖性增加，铁结合能力在浓度为6mg/mL时达到最大值93.04％，而在牡蛎酶解物浓度达到4mg/mL后，铁结合能力保持稳定，这可能是由于牡蛎酶解物与金属离子的接触面积逐渐减小，导致金属离子与结合位点的结合概率。此外，还考察了温度对铁结合能力的影响。从图1B的结果可以看出，铁结合能力在30℃时较低，而在其他温度(40℃、50℃、60℃、70℃)下较高。当温度较低时，铁离子的反应活性会减慢，而当温度较高时，肽的结构会被破坏，铁离子会被氧化，导致铁结合能力降低。同样，如图1C所示，铁结合能力值随时间显著下降，90min后保持稳定，说明铁离子与牡蛎酶解物的结合可能是一个快速反应。
对比例3
本发明提供了一种铁螯合肽制剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：将新鲜牡蛎放入-30℃冰箱冷冻24h，取出后进行真空冷冻干燥，真空度为0.01MPa，干燥后的牡蛎放入磨粉机中，得到牡蛎干粉；
S2：取牡蛎干粉，按质量比1:100加入纯净水，使用1M盐酸和1M氢氧化钠将体系pH调整到8；
S3：取碱性蛋白酶，酶活力为200000U/g，加入S2所得溶液中，牡蛎干粉与碱性蛋白酶的质量比为10：0.6，将溶液置于磁力搅拌水浴锅中，50℃下酶解5h；
S4：向S3所得溶液加入无水乙醇进行醇沉，控制无水乙醇为S3所得溶液和无水乙醇总体积的80％，将溶液在4℃避光醇沉24h；
S5：将S4醇沉后所得溶液先经过滤，将沉淀去除，后经蒸发浓缩将乙醇去除，控制蒸发浓缩的温度为50℃，相对真空度为-0.06MPa；
S6：将S5经蒸发浓缩后的溶液置于-80℃冰箱冷冻2h，取出后进行真空冷冻干燥，真空度为0.01MPa，干燥后即得牡蛎酶解物干粉；
S7、将制备的牡蛎酶解物干粉溶于去离子水，得到牡蛎酶解物溶液，牡蛎酶解物的浓度为6mg/mL；
S8、将S7的牡蛎酶解物溶液与2mM的硫酸亚铁溶液按照体积比1：1混合，进行反应，反应的温度为60℃，时间为90min，得到铁螯合肽制剂。
为了探究抗坏血酸钠(VcNa)在牡蛎肽铁复合物的制备过程当中，对二价铁氧化的抑制作用，如图2所示，图中的4种样品，从左往右，依次为Fe2+，Fe2+和VcNa，对比例3制备的铁螯合肽制剂(未加VcNa)、实施例1中牡蛎酶解物的浓度6mg/mL制备的铁螯合肽制剂溶于水中。从图2中可以看出，实施例1中添加VcNa可明显减少肽铁复合物的红色色度，说明在肽铁复合物的制备过程中，二价铁的氧化被明显抑制，进而能够有效保持肽铁粉制剂在溶液或粉末状态下的二价铁含量，稳固了肽铁粉制剂的高效补铁作用。
以上所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明权利要求书所界定的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种铁螯合肽制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将新鲜牡蛎冷冻、干燥，再磨成粉，得到牡蛎干粉；将牡蛎干粉加入到纯净水中，调节溶液pH为8～10；
S2、取碱性蛋白酶，加入到S1调完pH的溶液中，进行酶解；
S3、向S2所得溶液加入无水乙醇进行醇沉；醇沉后，过滤，将沉淀去除，后经蒸发浓缩将乙醇去除；将经蒸发浓缩后的溶液冷冻，干燥，即得牡蛎酶解物干粉；
S4、将牡蛎酶解物干粉溶于去离子水，使牡蛎酶解物的浓度为4～6mg/mL；
S5、将S4的牡蛎酶解物溶液与硫酸亚铁溶液混合，再添加抗坏血酸钠进行反应，即得到铁螯合肽制剂。
2.根据权利要求1所述的一种铁螯合肽制剂的制备方法，其特征在于，S1中冷冻是在-80～-30℃下冷冻。
3.根据权利要求1所述的一种铁螯合肽制剂的制备方法，其特征在于，S1中牡蛎干粉和纯净水的质量比例为1:100。
4.根据权利要求1所述的一种铁螯合肽制剂的制备方法，其特征在于，S2中碱性蛋白酶的酶活力为200000U/g。
5.根据权利要求1所述的一种铁螯合肽制剂的制备方法，其特征在于，S3中所述醇沉是在4℃避光醇沉24h。
6.根据权利要求1所述的一种铁螯合肽制剂的制备方法，其特征在于，S3中无水乙醇添加量为S2所得溶液和无水乙醇总体积的75～80％。
7.根据权利要求1所述的一种铁螯合肽制剂的制备方法，其特征在于，S3中蒸发浓缩的温度为45～50℃。
8.根据权利要求1所述的一种铁螯合肽制剂的制备方法，其特征在于，S5中反应的温度为40℃～70℃；时间为30～150min；硫酸亚铁溶液浓度为2mM。
9.权利要求1～8任一所述方法制备得到的一种铁螯合肽制剂。
10.权利要求9所述的铁螯合肽制剂在制备富铁食品或铁补充剂药物中的应用。
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