CN118401654A

CN118401654A - 多肽和应用其的氨基酸的制备方法

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Publication number: CN118401654A
Application number: CN202280083462.7A
Authority: CN
Inventors: 筱田清道; 太田淳; 椎名淳一; 松尾笃; 石野聪; 江岛大贵; 石山诗织; 中野効彦; 塚田启介
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2024-07-26

Abstract

多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐与由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

Description

多肽和应用其的氨基酸的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽和应用其的氨基酸的制备方法。

背景技术

已知N-烷基氨基酸等氨基酸存在于各种天然生理活性物质的结构的一部分中。关于为N-烷基氨基酸的一种的N-甲基氨基酸的一部分，已知氨基酸其本身是天然存在的(非专利文献1)。

作为合成N-烷基氨基酸的方法，存在各种有机化学方法。从绿色化学的观点等出发，研究/报告了通过酶合成N-烷基氨基酸的方法。

三原等以由苯基丙酮酸和甲胺合成N-甲基苯丙氨酸的活性为基础，筛选了各种微生物(专利文献1、非专利文献2,3)。其结果，从相同活性最高的P.Putida ATCC12633株发现了N-甲基氨基酸脱氢酶(N-methyl amino acid dehydrogenase；NMAADH)，同时克隆了该酶的基因(称为dpkA)并在大肠杆菌中表达，成功地获得了纯化的该酶。

此外，该纯化酶具有从各种α-酮酸(丙酮酸、苯基丙酮酸、羟基丙酮酸等)和烷基胺(甲胺、乙胺、丙胺等)合成对应的N-烷基氨基酸的活性。

上述来自P.Putida ATCC12633株的NMAADH的氨基酸序列与由P.Putida KT2440株的基因组编码的蛋白质PP3591显示出良好的一致性(专利文献2、非专利文献2,3,4)。

关于与来自P.Putida ATCC12633株的NMAADH显示71％的氨基酸序列一致性的、来自P.Syringae的NMAADH，进行了X线晶体结构分析(非专利文献3,5)。纯化的来自P.Syringae的NMAADH的α-酮酸对胺的底物特异性显示着与纯化的来自P.PutidaATCC12633株的NMAADH的那种类似，同时以晶体结构基础说明了来自P.Syringae的NMAADH催化的反应的机理。

报告了在NMAADH中导入突变的文献。来自P.Syringae的NMAADH的晶体结构(非专利文献5)中底物结合位点中所包含的残基在来自P.Putida KT2440株的NMAADH中也保守。通过对这些氨基酸残基导入突变，发现以乙醛酸与甲胺、乙醛酸与乙胺为底物时的比活性提高的、来自P.Putida KT2440株的NMAADH的突变体F117L(非专利文献6)。

来自P.Putida KT2440株的NMAADH与苯基丙酮酸相比对丙酮酸显示更高活性。在两个位点加入突变的突变体P262A、M141L对苯基丙酮酸和丙酮酸的活性大致相同(非专利文献7)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2003/072770号

专利文献2：国际公开第2002/077183号

非专利文献

非专利文献1：J.F.Hyslop et al.,J.Biotechnol.2019,293,56-65.

非专利文献2：H.Mihara et al.,FEBS Journal2005,272,1117-1123.

非专利文献3：三原久明、生化学2015,87,326-332.

非专利文献4：K.E.Nelson et al.,Environ.Microbiol.2002,4,799-808.

非专利文献5：M.Goto et al.,J.Biol.Chem.2005,280,40875-40884.

非专利文献6：M.Mindet et al.,Front.Bioeng.Biotechnol.2019,7.

非专利文献7：A.Kerbs et al.,Microorganisms 2021,9,824.

发明概述

发明要解决的问题

据本发明人所知，包括上述文献在内，仅存在3篇报告应用改变NMAADH合成N-烷基氨基酸的文献。即，关于改变NMAADH的报告极少。

关于来自P.Putida ATCC12633株的NMAADH，专利文献2,3中显示，对氨完全不显示活性，和对β位有分支的α-酮异己酸、α-酮-β-甲基吉草酸也完全不显示活性。

关于非专利文献4中记载的由P.Putida KT2440株的基因组编码的蛋白质PP3591，据本发明人所知，仅公开了序列信息，不存在关于催化活性等进行研究的信息。据本发明人所知，也不存在改变PP3591的氨基酸序列等而提高规定氨基酸的合成活性的报告。

本发明的目的是提供可作为催化还原氨基化反应的酶利用的新多肽。此外，本发明的目的是提供应用该多肽的氨基酸的制备方法。

用于解决问题的手段

本发明例如涉及以下的各发明。

[1]

多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且

在至少一个反应条件下，其对于下述由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐与下述由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或前述化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

[化学式1]

[式(1)中，

R¹和R²分别独立地表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基，这些基团任选被取代，R¹或R²的任1个以上是氢原子。]

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

[式(2)中，

X表示碳原子，

Y表示氢原子、前述由式(1')表示的基团或前述由式(3)表示的基团，

n表示0以上且2以下的整数，

R⁶表示氢原子、任选被取代的碳原子数为1以上且6以下的脂肪族烃基、任选被取代的碳原子数为5以上且12以下的芳基、任选被取代的构成环的原子数目为5以上且12以下的杂芳基、包含氮原子的基团、或包含氧原子的基团，

式(1')中，

[化学式5]

表示与X的结合点，

R^1a是从式(1)中由R¹表示的基团除去氢原子的基团，不是氢原子，

式(3)中，

[化学式6]

表示与X的结合点，

m表示0以上且6以下的整数，

p是0或1，

q是0或1，

r是0或1，

Z¹表示任选被取代的亚烷基、或碳原子数为1以上且6以下的含醚键基团，在m是2以上的情形中，多个存在的Z¹可以相同也可以不同，

Z²表示碳原子，

R³、R⁴和R⁵分别独立地表示氢原子、任选被取代的碳原子数为1以上且6以下的脂肪族烃基、任选被取代的碳原子数为5以上且12以下的芳基、任选被取代的构成环的原子数目为5以上且12以下的杂芳基、包含氮原子的基团、或包含氧原子的基团，

R³、R⁴和R⁵的任2个以上任选彼此结合与Z²共同形成环结构，这些环结构可以是环烷基、芳基、杂环基、或杂芳基，这些基团任选被取代，

R³、R⁴、和R⁵任选与Z²形成双键或三键，在R³、R⁴、和R⁵的任1个通过双键或三键与Z²结合的情形中，p、q或r的任1个以上是0，

式(1)中，在R¹和R²的一个是甲基、并且另一个是氢原子的情形中，式(2)中，Y是前述由式(3)表示的基团，m是0，R³至R⁵中的2个以上不是氢原子。]

[2]

多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中2个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且

[化学式7]

[式(1)中，

[化学式8]

[化学式9]

[化学式10]

[式(2)中，

X表示碳原子，

n表示0以上且2以下的整数，

式(1')中，

[化学式11]

表示与X的结合点，

式(3)中，

[化学式12]

表示与X的结合点，

m表示0以上且6以下的整数，

p是0或1，

q是0或1，

r是0或1，

Z²表示碳原子，

[3]

[1]中记载的多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中2个基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且

[化学式13]

[式(1)中，

[化学式14]

[化学式15]

[化学式16]

[式(2)中，

X表示碳原子，

n表示0以上且2以下的整数，

式(1')中，

[化学式17]

表示与X的结合点，

式(3)中，

[化学式18]

表示与X的结合点，

m表示0以上且6以下的整数，

p是0或1，

q是0或1，

r是0或1，

Z²表示碳原子，

[4]

多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且

[化学式19]

[式(1)中，

[化学式20]

[化学式21]

[化学式22]

[式(2)中，

X表示碳原子，

n表示0以上且2以下的整数，

式(1')中，

[化学式23]

表示与X的结合点，

式(3)中，

[化学式24]

表示与X的结合点，

m表示0以上且6以下的整数，

p是0或1，

q是0或1，

r是0或1，

Z²表示碳原子，

[5]

[1]中记载的多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且

[化学式25]

[式(1)中，

[化学式26]

[化学式27]

[化学式28]

[式(2)中，

X表示碳原子，

n表示0以上且2以下的整数，

式(1')中，

[化学式29]

表示与X的结合点，

式(3)中，

[化学式30]

表示与X的结合点，

m表示0以上且6以下的整数，

p是0或1，

q是0或1，

r是0或1，

Z²表示碳原子，

[6]

多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于烷基胺或其盐、与下述由式(2')表示的化合物的任1个以上或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号1表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高。

[化学式31]

[式中，Y’表示C₃～C₈环烷基、或C₆～C₉芳烷基，该芳烷基被C₁～C₃烷基或卤素原子任选取代。]

[7]

多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中2个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于烷基胺或其盐、与下述由式(2')表示的化合物的任1个以上或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号1表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高。

[化学式32]

[8]

[6]中记载的多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中2个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于烷基胺或其盐、与下述由式(2')表示的化合物的任1个以上或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号1表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高。

[化学式33]

[9]

多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于烷基胺或其盐、与下述由式(2')表示的化合物的任1个以上或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号1表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高。

[化学式34]

[10]

[6]中记载的多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于烷基胺或其盐、与下述由式(2')表示的化合物的任1个以上或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号1表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高。

[化学式35]

[11]

[1]～[10]的任一中记载的多肽，其包含与由序列编号17表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列。

[12]

[1]～[11]的任一中记载的多肽，其包含与由序列编号17表示的氨基酸序列中2个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列。

[13]

[1]～[12]的任一中记载的多肽，其包含与由序列编号17表示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列。

[14]

多肽，其包含由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自44位的组氨酸残基、117位的苯丙氨酸残基、141位的蛋氨酸残基、156位的苏氨酸残基、182位的组氨酸残基、186位的谷氨酰胺残基、253位的色氨酸残基、和260位的赖氨酸残基的1个以上的氨基酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列。

[15]

[1]～[13]的任一中记载的多肽，其包含由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自44位的组氨酸残基、117位的苯丙氨酸残基、141位的蛋氨酸残基、156位的苏氨酸残基、182位的组氨酸残基、186位的谷氨酰胺残基、253位的色氨酸残基、和260位的赖氨酸残基的1个以上的氨基酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列。

[16]

[1]～[15]中记载的多肽，其包含由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自141位的蛋氨酸残基、182位的组氨酸残基、253位的色氨酸残基、和260位的赖氨酸残基的1个以上的氨基酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列。

[17]

多肽，其包含下列序列：

由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自141位的蛋氨酸残基、182位的组氨酸残基、和253位的色氨酸残基的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第一改变位点被改变，

由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自182位的组氨酸残基、253位的色氨酸残基和260位的赖氨酸残基、并且与作为第一改变位点被改变的氨基酸残基不同的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第二改变位点被改变。

[18]

[1]～[16]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：

由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自141位的蛋氨酸残基、182位的组氨酸残基、和253位的色氨酸残基的1个氨基酸残基的部位的基酸残基作为第一改变位点被改变，

[19]

多肽，其包含下列序列：

由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自141位的蛋氨酸残基和182位的组氨酸残基的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第一改变位点被改变，

由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自182位的组氨酸残基和253位的色氨酸残基、并且与作为第一改变位点被改变的氨基酸残基不同的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第二改变位点被改变，

由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自253位的色氨酸残基和260位的赖氨酸残基、并且与作为第一改变位点和第二改变位点被改变的氨基酸残基不同的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第三改变位点被改变。

[20]

[1]～[16]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：

[21]

[1]、[6]、[11]、和[14]～[16]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自141位的蛋氨酸残基、253位的色氨酸残基、和260位的赖氨酸残基的1个以上的氨基酸残基的部位的氨基酸残基被改变。

[22]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]的任一中记载的多肽，其中，由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点为1个位点。

[23]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[22]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于44位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被蛋氨酸残基取代。

[24]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[23]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于117位的苯丙氨酸残基的部位的氨基酸残基被亮氨酸残基取代。

[25]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[24]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代。

[26]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[25]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、苯丙氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代。

[27]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[26]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于156位的苏氨酸残基的部位的氨基酸残基被丝氨酸残基取代。

[28]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[27]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、甘氨酸残基、苯丙氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代。

[29]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[28]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自蛋氨酸残基、亮氨酸残基和苯丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代。

[30]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[29]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于186位的谷氨酰胺残基的部位的氨基酸残基被选自蛋氨酸残基和谷氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代。

[31]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[30]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基、脯氨酸残基、天冬酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代。

[32]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[31]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自亮氨酸残基、异亮氨酸残基和组氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代。

[33]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[32]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被组氨酸残基取代。

[34]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[33]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、色氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、组氨酸残基、甘氨酸残基、苯丙氨酸残基、谷氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代。

[35]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[34]的任一中记载的多肽，其包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、谷氨酸残基和天冬酰胺残基的一个以上的氨基酸残基取代。

[36]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[35]的任一中记载的多肽，其中，前述由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列是：由序列编号6表示的、X是缬氨酸残基的氨基酸序列(M141V)，由序列编号6表示的、X是酪氨酸残基的氨基酸序列(M141Y)，由序列编号8表示的、X是亮氨酸残基的氨基酸序列(H182L)，由序列编号11表示的、X是组氨酸残基的氨基酸序列(W253H)，或由序列编号12表示的、X是谷氨酸残基的氨基酸序列(K260E)。

[37]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[36]的任一中记载的多肽，其包含与下列序列具有90％以上的序列同一性的序列：由序列编号6表示的、X是缬氨酸残基的氨基酸序列(M141V)，由序列编号6表示的、X是酪氨酸残基的氨基酸序列(M141Y)，由序列编号8表示的、X是亮氨酸残基的氨基酸序列(H182Y)，由序列编号11表示的、X是组氨酸残基的氨基酸序列(W253H)，或由序列编号12表示的、X是谷氨酸残基的氨基酸序列(K260E)。

[38]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[37]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号6表示的、X是缬氨酸残基的氨基酸序列(M141V)，由序列编号6表示的、X是酪氨酸残基的氨基酸序列(M141Y)，由序列编号8表示的、X是亮氨酸残基的氨基酸序列(H182Y)，由序列编号11表示的、X是组氨酸残基的氨基酸序列(W253H)，或由序列编号12表示的、X是谷氨酸残基的氨基酸序列(K260E)。

[39]

[1]、[6]、[11]、[14]～[16]和[21]～[38]的任一中记载的多肽，其具有由序列编号18、序列编号19、序列编号20、序列编号21、或序列编号22表示的氨基酸序列。

[40]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]和[18]的任一中记载的多肽，其中，由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点为2个位点以上。

[41]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]和[40]的任一中记载的多肽，其中，由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点为2个位点。

[42]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、[40]和[41]中记载的多肽，其包含：

由序列编号1表示的氨基酸序列中，

位于相应于141位的蛋氨酸残基和182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、

位于相应于141位的蛋氨酸残基和253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、

位于相应于141位的蛋氨酸残基和260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、

位于相应于182位的组氨酸残基和253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、

位于相应于182位的组氨酸残基和260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、或位于相应于253位的色氨酸残基和260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列。

[43]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[42]中记载的多肽，其包含：

由序列编号1表示的氨基酸序列中，

[44]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[43]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[45]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[44]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、缬氨酸残基和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[46]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[45]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、和苯丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[47]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[46]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自蛋氨酸残基和亮氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[48]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[47]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、蛋氨酸残基、组氨酸残基和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[49]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[48]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被组氨酸残基取代的序列。

[50]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[49]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自丝氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、甘氨酸残基、苯丙氨酸残基、谷氨酸残基和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[51]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[50]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自谷氨酰胺残基和谷氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[52]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[51]的任一中记载的多肽，其中，前述由序列编号1表示的氨基酸序列中2个氨基酸残基被改变的序列是：

由序列编号25表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是丙氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141A＿K260E)、

由序列编号25表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是丙氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(M141A＿K260Q)、

由序列编号25表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是酪氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141Y＿K260E)、

由序列编号25表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141V＿K260E)、

由序列编号27表示的、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(H182L＿K260E)、

由序列编号27表示的、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(H182L＿K260Q)、

由序列编号27表示的、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(H182M＿K260E)、

由序列编号27表示的、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(H182M＿K260Q)、或由序列编号28表示的、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是组氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(W253H＿K260E)。

[53]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[52]的任一中记载的多肽，其包含与下列序列具有90％以上的序列同一性的序列：

[54]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[53]的任一中记载的多肽，其包含：

[55]

[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、和[40]～[54]的任一中记载的多肽，其具有由序列编号36～44的任一表示的氨基酸序列。

[56]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]和[20]的任一中记载的多肽，其中，由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个位点以上。

[57]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]和[56]的任一中记载的多肽，其中，由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个位点。

[58]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、[56]和[57]的任一中记载的多肽，其包含：

由序列编号1表示的氨基酸序列中，

位于相应于141位的蛋氨酸残基、182位的组氨酸残基和253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、

位于相应于141位的蛋氨酸残基、182位的组氨酸残基和260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、

位于相应于141位的蛋氨酸残基、253位的色氨酸残基和260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、

位于相应于182位的组氨酸残基、253位的色氨酸残基和260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列。

[59]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[58]的任一中记载的多肽，其包含：

由序列编号1表示的氨基酸序列中，

[60]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[59]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[61]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[60]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、缬氨酸残基和异亮氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[62]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[61]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自蛋氨酸残基、亮氨酸残基和苯丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[63]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[62]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自蛋氨酸残基和亮氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[64]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[63]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且、由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基和谷氨酸的一个氨基酸残基取代的序列。

[65]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[64]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基和组氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[66]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[65]的任一中记载的多肽，其包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自谷氨酰胺残基和谷氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

[67]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[66]的任一中记载的多肽，其中，前述由序列编号1表示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被改变的序列是：

由序列编号33表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是酪氨酸残基、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141Y＿H182M＿K260E)、

由序列编号31表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141V＿W253M＿K260E)、

由序列编号32表示的、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是组氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(H182L＿W253H＿K260E)、

由序列编号33表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是酪氨酸残基、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(M141Y＿H182M＿K260Q)、

由序列编号33表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141V＿H182M＿K260E)、

由序列编号33表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(M141V＿H182L＿K260Q)、

由序列编号33表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是酪氨酸残基、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(M141Y＿H182L＿K260Q)、

由序列编号31表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141L＿W253Q＿K260E)、

由序列编号32表示的、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(H182L＿W253Q＿K260E)、

由序列编号31表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是异亮氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是组氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141I＿W253H＿K260E)、

由序列编号33表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141V＿H182L＿K260E)、

由序列编号33表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是酪氨酸残基、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(M141Y＿H182L＿K260E)

由序列编号32表示的、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列(H182L＿W253M＿K260E)、

由序列编号31表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(M141V＿W253Q＿K260Q)、

由序列编号31表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是组氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(M141V＿W253H＿K260Q)、

由序列编号31表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是亮氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(M141V＿W253L＿K260Q)、

由序列编号31表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是异亮氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是组氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(M141I＿W253H＿K260Q)、或

由序列编号31表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酰胺残基的氨基酸序列(M141V＿W253M＿K260Q)。

[68]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[67]的任一中记载的多肽，其包含与下列序列具有90％以上的序列同一性的序列：

[69]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[68]的任一中记载的多肽，其包含：

[70]

[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、和[56]～[69]的任一中记载的多肽，其具有由序列编号45～62的任一表示的氨基酸序列。

[71]

[6]～[70]的任一中记载的多肽，在至少一个反应条件下，其对于前述由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐与前述由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或前述化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

[72]

[1]～[71]的任一中记载的多肽，在至少一个反应条件下，其对于前述由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐与前述由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或前述化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号17表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

[73]

[6]～[10]的任一中记载的多肽，其中，前述烷基胺或其盐是选自甲胺、乙胺和它们的盐的1个以上。

[74]

[6]～[10]和[73]的任一中记载的多肽，其中，前述由式(2')表示的化合物或其盐是选自苯基丙酮酸、2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸、2-环戊基-2-氧代-乙酸和它们的盐的1个以上。

[75]

[1]～[74]的任一中记载的多肽，在至少一个反应条件下，其对于乙胺或其盐、与苯基丙酮酸或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号17表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高。

[76]

[1]～[75]的任一中记载的多肽，在至少一个反应条件下，其对于乙胺或其盐、与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号17表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高。

[77]

[1]～[76]的任一中记载的多肽，在至少一个反应条件下，其对于甲胺或其盐、与2-环戊基-2-氧代-乙酸或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号17表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高。

[78]

[1]～[77]的任一中记载的多肽，在至少一个反应条件下，其具有对于氨或其盐、与苯基丙酮酸或其盐的还原氨基化反应的催化活性。

[79]

[1]～[78]的任一中记载的多肽，其中，前述改变是选自取代、缺失和插入的1个以上。

[80]

[1]～[79]的任一中记载的多肽，其中，前述改变是保守的改变。

[81]

[1]～[80]的任一中记载的多肽，其中，前述改变是取代。

[82]

[1]～[81]的任一中记载的多肽，其中，前述改变是取代为与改变前的氨基酸残基不同的天然氨基酸。

[83]

[82]中记载的多肽，其中，前述天然氨基酸是选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸的1个以上。

[84]

[1]～[83]的任一中记载的多肽，其在N末端和C末端的任一个或两者包含选自链霉抗生物素蛋白结合肽标签序列和His标签序列的1个以上。

[85]

[1]～[84]的任一中记载的多肽，其在作为单体存在的情形中的氨基酸残基数是300以上且400以下。

[86]

[1]～[85]的任一中记载的多肽，其中，前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽高的温度存在于0℃以上且50℃以下的范围。

[87]

[1]～[86]的任一中记载的多肽，其中，前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽高的pH存在于7以上且11以下的范围。

[88]

[1]～[5]的任一中记载的多肽，其中，进行还原氨基化反应时的反应液总量中，在反应开始时间点的前述化合物A和其盐的浓度的总计为100mM以上且3000mM以下的范围的至少一点，前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽高。

[89]

[1]～[5]和[88]的任一中记载的多肽，其中，进行还原氨基化反应时的反应液总量中，在反应开始时间点的前述化合物B和其盐的浓度的总计为0.001mM以上1000mM以下的范围的至少一点，前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽高。

[90]

[1]～[5]和[88]和[89]的任一中记载的多肽，其中，进行还原氨基化反应时的反应液总量中，在反应开始时间点的、前述化合物A和其盐的摩尔数的总计相对于前述化合物B和其盐的摩尔数的总计的比是1以上时的至少1点，前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

[91]

[1]～[90]的任一中记载的多肽，在37℃、pH8的反应条件下，其具有比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的催化活性高的催化活性。

[92]

[1]～[91]的任一中记载的多肽，在25℃、pH9的反应条件下，其具有比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的催化活性高的前述催化活性。

[93]

[1]～[92]的任一中记载的多肽，其中前述催化活性的评价在以下的反应条件进行：

在苯基丙酮酸、2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸、或2-环戊基-2-氧代-乙酸为50mM、D(+)-葡萄糖为100mM、甲胺或乙胺为500mM、磷酸缓冲液为100mM、β-NADPH为0.89mM、GDH溶液为0.002单位/μL、评价对象的多肽为2.5μM的浓度、并且37℃、pH8的条件下开始反应，在经过19小时的时间点，求得通过还原氨基化反应生成的氨基酸的收率。

[94]

[1]～[93]的任一中记载的多肽，其为催化还原氨基化反应的酶。

[95]

[1]～[94]的任一中记载的多肽，其中，前述催化活性是前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性的1.2倍以上。

[96]

[1]～[5]和[88]～[90]的任一中记载的多肽，其中，前述式(1)中，R¹是氢原子，R²是C₁～C₆烷基。

[97]

[1]～[5]、[88]～[90]和[96]的任一中记载的多肽，其中，前述式(1)中，R¹是氢原子，R²是乙基。

[98]

[1]～[5]、[88]～[90]和[96]的任一中记载的多肽，其中，前述式(1)中，R¹是氢原子，R²是甲基。

[99]

[1]～[5]和[88]～[90]的任一中记载的多肽，其中，前述式(1)中，R¹和R²是氢原子。

[100]

[1]～[5]、[88]～[90]和[96]～[99]的任一中记载的多肽，其中，式(2)中，Y是C₃～C₈环烷基或C₆～C₉芳烷基，该芳烷基被C₁～C₃烷基或卤素原子任选取代。

[101]

[1]～[5]、[88]～[90]和[96]～[100]的任一中记载的多肽，其中，式(2)中，Y是C₃～C₈环烷基。

[102]

[1]～[5]、[88]～[90]和[96]～[100]的任一中记载的多肽，其中，式(2)中，Y是C₆～C₉芳烷基，该芳烷基被C₁～C₃的烷基或卤素原子任选取代。

[103]

[1]～[5]和[88]～[90]的任一中记载的多肽，其中，

前述式(1)中，R¹是氢原子，R²是乙基，

前述式(2)中，n和m均为0，Y是由式(3)表示的基团，R³是苯基，R⁴、R⁵和R⁶均为氢原子，p、q、r均为1。

[104]

[1]～[5]和[88]～[90]的任一中记载的多肽，其中，

前述式(1)中，R¹是氢原子，R²是乙基，

前述式(2)中，n和m均为0，Y是由式(3)表示的基团，R³是对甲苯基，R⁴、R⁵和R⁶均为氢原子，p、q、r均为1。

[105]

[1]～[5]和[88]～[90]的任一中记载的多肽，其中，

前述式(1)中，R¹是氢原子，R²是甲基，

前述式(2)中，n和m均为0，Y是由式(3)表示的基团，R³和R⁴彼此连接形成环戊烷环，R⁵和R⁶均为氢原子，p、q、r均为1。

[106]

分离的核酸，其编码[1]～[105]的任一中记载的多肽。

[107]

载体，其包含[106]中记载的核酸。

[108]

转化体，其包含[106]中记载的核酸、或[107]中记载的载体。

[109]

制备多肽的方法，其包括培养[108]中记载的转化体使得产生该多肽的步骤。

[110]

[109]中记载的方法，其进一步包括回收前述多肽的步骤。

[111]

还原性氨基化剂，其包含[1]～[105]的任一中记载的多肽。

[112]

氨基酸的制备方法，其包括下列步骤：在[1]～[105]的任一中记载的多肽和还原剂存在下，使选自胺、胺类似物和它们的盐的1个以上与选自酮酸、酮酸类似物和它们的盐的1个以上反应，或使选自酮酸、酮酸类似物和它们的盐的化合物在分子内反应。

[113]

[112]中记载的制备方法，其中，前述反应在适当的条件下进行。

[114]

[112]或[113]中记载的制备方法，其中，前述反应伴随胺、胺类似物或它们的盐与酮酸、酮酸类似物或它们的盐的还原氨基化反应。

[115]

[112]～[114]的任一中记载的制备方法，其中，前述胺或胺类似物由前述式(1)表示，并且，该式(1)中R¹和R²与[1]的式(1)中记载的R¹和R²分别同义。

[116]

[112]～[115]的任一中记载的制备方法，其中，前述酮酸或酮酸类似物由前述式(2)表示，并且，该式(2)中，式(1')、式(3)、X、Y、Z¹、Z²、R^1a、R³、R⁴、R⁵、R⁶、m、n、p、q和r与[1]的式(2)中记载的式(1')、式(3)、X、Y、Z¹、Z²、R^1a、R³、R⁴、R⁵、R⁶、m、n、p、q和r分别同义。

[117]

[112]～[116]的任一中记载的制备方法，其中，前述酮酸或酮酸类似物由式(2')表示，并且该式(2')中的Y’与[6]中记载的Y’同义。

[118]

[112]～[117]的任一中记载的制备方法，其中，前述还原剂是选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、NADP+、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和NAD+的1个以上。

[119]

[112]～[118]的任一中记载的制备方法，其中，在下述由式(4)表示的化合物C存在下进行前述反应。

[化学式36]

[式(4)中，v和w分别独立地表示0或1，v和w中任1个以上表示1，T表示碳原子、磷原子或硫原子，下述由式(4a)

[化学式37]

表示的官能团表示＝O、-ORd或羟基，

在v和w都是1的情形中，多个存在的由式(4a)表示的2个官能团可以相同也可以不同，

Ra、Rb和Rc分别独立地表示氢原子、C₁～C₃烷基、烷基氨基或-CH₂-ORd，

Ra、Rb、和Rc中任2个以上任选与T共同彼此连接形成环结构，

Rd表示C₁～C₃烷基，

d、e和f分别独立地表示0或1，

d、e和f中任一个以上表示1，

在v和w都是1的情形中，Ra、Rb和Rc的任1个以上是甲基，Ra、Rb和Rc均彼此连接不与T共同形成环结构，

在Ra、Rb和Rc的任1个以上是甲基氨基的情形中，Ra、Rb和Rc均彼此连接不与T共同形成环结构，

在由式(4a)表示的官能团是羟基、并且T是碳原子的情形中，v是1，w是0，d、e和f均为1，Ra、Rb和Rc均为氢原子。]

[120]

[119]中记载的制备方法，其中，前述式(4)中，T是磷原子或硫原子，前述由式(4a)表示的官能团是＝O，Ra、Rb和Rc均为甲基。

[121]

[119]或[120]中记载的制备方法，其中，前述化合物C是选自二甲基亚砜、二甲基砜、二甲氧基乙烷、三甲基氧化膦、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四亚甲基亚砜、二乙基亚砜、甲醇和甲基甲酰胺的1个以上的化合物。

[122]

[119]～[121]的任一中记载的制备方法，其中，前述化合物C是二甲基亚砜。

[123]

[112]～[122]的任一中记载的制备方法，其包括以下的步骤(A)和(B)：

步骤(A)；使纯化对象物与含锂物质接触的步骤，该纯化对象物是通过[112]～[122]的任一中记载的方法得到的为纯化目标物的以下(i)与为杂质的以下(ii)的混合物，

(i)在N末端具有保护基的前述氨基酸

(ii)前述纯化目标物以外的化合物；

步骤(B)；使前述纯化目标物的锂盐析出的步骤。

[124]

肽化合物的制备方法，其包括以下的步骤：

(1)通过[112]～[122]的任一中记载的方法制备氨基酸的步骤；和

(2)将前述氨基酸与选自其它氨基酸和肽的1个以上连接，制备肽化合物的步骤。

发明效果

根据本发明，可以提供可作为催化还原氨基化反应的酶利用的新的多肽。此外，根据本发明，可以提供应用该多肽的氨基酸的制备方法。

附图简述

[图1]图1是显示实施例的反应中得到的化合物(2S,3S)-2-氨基-3-苯基-丁酸(I)、购入的标准品化合物(2S,3R)-2-氨基-3-苯基-丁酸盐酸盐(II)、和(2S,3S)-2-氨基-3-苯基-丁酸盐酸盐(III)的¹H-NMR测定谱的图。

[图2]图2是显示实施例的反应中得到的化合物(2S,3S)-2-氨基-3-苯基-丁酸(I)、以及将购入的标准品化合物(III)和(IV)以(III):(IV)＝7:3的比率混合配制的混合物(V)的手性HPLC分析数据的图。

用于实施发明的方式

以下，关于用于实施本发明的方式进行详细说明。但是，本发明不限于以下的实施方式。

本说明书中的“1个或多个”意味着1个或2个以上的数目。“1个或多个”在与某基团的取代基有关的上下文中应用的情形中，该术语意味着从1个至该基团容许的取代基的最大数目的数目。作为“1个或多个”，具体地，例如，列举1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、和/或比其大的数目。

本说明书中，表示范围的“～”包含其两端的值，例如，“A～B”意味着A以上、并且B以下的范围。

本说明书中，称为“约”的术语在与数值组合使用的情形中，意味着该数值的+10％和-10％的值范围。

本说明书中，术语“和/或”的含义包括适当组合“和”与“或”的所有组合。具体地，例如，“A、B、和/或C”包括以下的7种变体：(i)A、(ii)B、(iii)C、(iv)A和B、(v)A和C、(vi)B和C、(vii)A、B和C。

本说明书中的“烷基”是从脂肪族烃除去任意一个氢原子衍生的1价基团，具有骨架中不含杂原子(指碳和氢原子以外的原子。)或不饱和碳-碳键、含有氢和碳原子的烃基或烃基团结构的子集。烷基不仅包含直链状的那种，也包含支链状的那种。作为烷基，具体地，列举碳原子数1～20(C₁～C₂₀，下文“C_p～C_q”意味着碳原子数p～q个)的烷基，优选C₁～C₁₀烷基，更优选C₁～C₆烷基。作为烷基，具体地，列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基(2-甲基丙基)基团、正戊基、仲戊基(1-甲基丁基)基团、叔戊基(1,1-二甲基丙基)基团、新戊基(2,2-二甲基丙基)基团、异戊基(3-甲基丁基)基团、3-戊基(1-乙基丙基)基团、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、正己基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2,2-四甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基等。

本说明书中的“烯基”是具有至少1个双键(2个相邻SP²碳原子)的1价基团。根据双键和取代基(存在时)的构型，双键的几何学形式可以是entgegen(E)或zusammen(Z)、顺式或反式构型。烯基不仅包含直链状的那种，也包含支链状的那种。作为烯基，优选列举C₂～C₁₀烯基，更优选列举C₂～C₆烯基，具体地，例如，列举乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基(包括顺式、反式)、3-丁烯基、戊烯基、3-甲基-2-丁烯基、己烯基等。

本说明书中的“炔基”是具有至少1个三键(2个相邻SP碳原子)的1价基团。炔基不仅包含直链状的那种，也包含支链状的那种。作为炔基，优选列举C₂～C₁₀炔基，更优选列举C₂～C₆炔基，具体地，例如，列举乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、3-丁炔基、戊炔基、己炔基、3-苯基-2-丙炔基、3-(2'-氟苯基)-2-丙炔基、2-羟基-2-丙炔基、3-(3-氟苯基)-2-丙炔基、3-甲基-(5-苯基)-4-戊炔基等。

本说明书中的“环烷基”意味着饱和或部分饱和的环状1价脂肪族烃基，包含单环、双环、螺环。作为环烷基，优选列举C₃～C₈环烷基，具体地，例如，列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.1]庚基、螺[3.3]庚基等。

本说明书中的“芳基”意味着1价芳香族烃环，优选列举C₆～C₁₀芳基。作为芳基，具体地，例如，列举苯基、萘基(例如，1-萘基、2-萘基)基团等。

本说明书中的“杂环基”意味着除碳原子外还含有1～5个杂原子的非芳香族的环状的1价基团。杂环基可以在环中具有双键和/或三键，环中的碳原子可以被氧化形成羰基，可以是单环也可以是稠环。构成环的原子数优选4～10(4～10元杂环基)，更优选4～7(4～7元杂环基)。作为杂环基，具体地，例如，列举氮杂环丁烷基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、1,2-噻嗪烷基、噻二唑烷基、噁唑烷酮、苯并二噁烷基、苯并噁唑基、二氧戊环基、二噁烷基、四氢吡咯并[1,2-c]咪唑基、硫杂环丁烷基、3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷基、2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷基、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷基、磺内酰胺、2-氧杂螺[3.3]庚基等。

本说明书中的“保护杂环基”意味着前述定义的“杂环基”中包含的1个或多个官能团例如氨基被任意的保护基保护的基团，优选列举保护4～7元杂环基。作为保护基，具体地，列举Boc、Fmoc、Cbz、Troc、Alloc等，作为保护杂环基，具体地，例如，列举Boc保护氮杂环丁烷基等。

本说明书中的“杂环亚烷基”意味着通过从前述定义的“杂环基”的1个碳原子除去2个氢原子生成的、游离原子价成为双键的一部分的二价基团。作为杂环亚烷基，优选列举4～7元杂环亚烷基，具体地，例如，列举四氢吡喃-4-亚基、氮杂环丁烷-3-亚基等。

本说明书中的“保护杂环亚烷基”意味着前述定义的“杂环亚烷基”中包含的1个或多个官能团、例如氨基被任意的保护基保护的基团，优选列举保护4～7元杂环亚烷基。作为保护基，具体地，列举Boc、Fmoc、Cbz、Troc、Alloc等，作为保护杂环亚烷基，具体地，例如，列举Boc保护氮杂环丁烷-3-亚基等。

本说明书中的“杂芳基”意味着除碳原子外还含有1～5个杂原子的芳香族性的环状1价基团。环可以是单环，可以是与其它环的稠环，可以是部分饱和的。构成环的原子数可以是5～12(5～12元杂芳基)，可以是6～10(6～10元杂芳基)，可以是6～7(6～7元杂芳基)。作为杂芳基，具体地，例如，列举呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并间二氧杂环戊烯基、中氮茚基、咪唑并吡啶基等。

本说明书中的“烷氧基”意味着前述定义的“烷基”结合的氧基，优选列举C₁～C₆烷氧基。作为烷氧基，具体地，例如，列举甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、3-甲基丁氧基等。

本说明书中的“烷基硫代基”意味着前述定义的“烷基”结合的硫醇基，优选列举C₁～C₆烷基硫代基。作为烷基硫代基，具体地，例如，列举甲基硫代基、乙基硫代基、1-丙基硫代基、2-丙基硫代基、正丁基硫代基、异丁基硫代基、仲丁基硫代基、叔丁基硫代基等。

本说明书中的“烯基氧基”意味着前述定义的“烯基”结合的氧基，优选列举C₂～C₆烯基氧基。作为烯基氧基，具体地，例如，列举乙烯基氧基、烯丙基氧基、1-丙烯基氧基、2-丙烯基氧基、1-丁烯基氧基、2-丁烯基氧基(包括顺式、反式)、3-丁烯基氧基、戊烯基氧基、己烯基氧基等。

本说明书中的“环烷氧基”意味着前述定义的“环烷基”结合的氧基，优选列举C₃～C₈环烷氧基。作为环烷氧基，具体地，例如，列举环丙氧基、环丁氧基、环戊基氧基等。

本说明书中的“芳基氧基”意味着前述定义的“芳基”结合的氧基，优选列举C₆～C₁₀芳基氧基。作为芳基氧基，具体地，例如，列举苯氧基、1-萘氧基、2-萘氧基等。

本说明书中的“氨基”狭义地意味着-NH₂，广义地意味着-NRR’，此处R和R’独立选自氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，或者R和R’与它们结合的氮原子一起形成环。作为氨基，优选列举-NH₂、单C₁～C₆烷基氨基、二C₁～C₆烷基氨基、4～8元环状氨基等。

本说明书中的“单烷基氨基”意味着前述定义的“氨基”之中R是氢原子、并且R’是前述定义的“烷基”的基团，优选列举单C₁～C₆烷基氨基。作为单烷基氨基，具体地，例如，列举甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、异丙基氨基、正丁基氨基、仲丁基氨基、叔丁基氨基等。

本说明书中的“二烷基氨基”意味着前述定义的“氨基”之中R和R’独立为前述定义的“烷基”的基团，优选列举二C₁～C₆烷基氨基。作为二烷基氨基，具体地，例如，列举二甲基氨基、二乙基氨基等。

本说明书中的“环状氨基”意味着前述定义的“氨基”之中R和R’与它们结合的氮原子一起形成环的基团，优选列举4～8元环状氨基。作为环状氨基，具体地，例如，列举1-氮杂环丁烷基、1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-哌嗪基、4-吗啉基、3-噁唑烷基、1,1-二氧硫代吗啉基-4-基、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基等。

本说明书中的“保护氨基”意味着被任意的保护基保护的氨基。作为保护氨基，具体地，例如，列举被Boc、Fmoc、Cbz、Troc、Alloc等的保护基保护的氨基。

本说明书中的“氨基羰基”意味着前述定义的“氨基”结合的羰基，优选列举-CONH₂、单C₁～C₆烷基氨基羰基、二C₁～C₆烷基氨基羰基、4～8元环状氨基羰基。作为氨基羰基，具体地，例如，列举-CONH₂、二甲基氨基羰基、1-氮杂环丁烷基羰基、1-吡咯烷基羰基、1-哌啶基羰基、1-哌嗪基羰基、4-吗啉基羰基、3-噁唑烷基羰基、1,1-二氧硫代吗啉基-4-基羰基、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基羰基等。

本说明书中的“烯基氧基羰基”意味着前述定义的“烯基氧基”结合的羰基，优选列举C₂～C₆烯基氧基羰基。作为烯基氧基羰基，具体地，例如，列举乙烯基氧基羰基、烯丙基氧基羰基、1-丙烯基氧基羰基、2-丙烯基氧基羰基、1-丁烯基氧基羰基、2-丁烯基氧基羰基(包括顺式、反式)、3-丁烯基氧基羰基、戊烯基氧基羰基、己烯基氧基羰基等。

本说明书中的“烷基磺酰基”意味着前述定义的“烷基”结合的磺酰基，优选列举C₁～C₆烷基磺酰基。作为烷基磺酰基，具体地，例如，列举甲基磺酰基等。

本说明书中的“羟基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被羟基取代的基团，优选C₁～C₆羟基烷基。作为羟基烷基，具体地，例如，列举羟基甲基、1-羟基乙基、2-羟基乙基、2-羟基-2-甲基丙基、5-羟基戊基等。

本说明书中的“卤烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被卤素原子取代的基团，优选C₁～C₆卤烷基，更优选C₁～C₆氟烷基。作为卤烷基，具体地，例如，列举二氟甲基、三氟甲基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3-二氟丙基、4,4-二氟丁基、5,5-二氟戊基等。

本说明书中的“氰基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被氰基取代的基团，优选C₁～C₆氰基烷基。作为氰基烷基，具体地，例如，列举氰基甲基、2-氰基乙基等。

本说明书中的“氨基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“氨基”取代的基团，优选C₁～C₆氨基烷基。作为氨基烷基，具体地，例如，列举1-吡啶基甲基、2-(1-哌啶基)乙基、3-(1-哌啶基)丙基、4-氨基丁基等。

本说明书中的“羧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被羧基取代的基团，优选C₂～C₆羧基烷基。作为羧基烷基，具体地，例如，列举羧基甲基等。

本说明书中的“烯基氧基羰基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“烯基氧基羰基”取代的基团，优选C₂～C₆烯基氧基羰基C₁～C₆烷基，更优选C₂～C₆烯基氧基羰基C₁～C₂烷基。作为烯基氧基羰基烷基，具体地，例如，列举烯丙基氧基羰基甲基、2-(烯丙基氧基羰基)乙基等。

本说明书中的“烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“烷氧基”取代的基团，优选C₁～C₆烷氧基C₁～C₆烷基，更优选C₁～C₆烷氧基C₁～C₂烷基。作为烷氧基烷基，具体地，例如，列举甲氧基甲基、乙氧基甲基、1-丙氧基甲基、2-丙氧基甲基、正丁氧基甲基、异丁氧基甲基、仲丁氧基甲基、叔丁氧基甲基、戊氧基甲基、3-甲基丁氧基甲基、1-甲氧基乙基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基等。

本说明书中的“烷基硫代烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“烷基硫代基”取代的基团，优选C₁～C₆烷基硫代C₁～C₆烷基，更优选C₁～C₆烷基硫代C₁～C₂烷基。作为烷基硫代烷基，具体地，例如，列举甲基硫代甲基、乙基硫代甲基、1-丙基硫代甲基、2-丙基硫代甲基、正丁基硫代甲基、异丁基硫代甲基、仲丁基硫代甲基、叔丁基硫代甲基等。

本说明书中的“烯基氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“烯基氧基”取代的基团，优选C₂～C₆烯基氧基C₁～C₆烷基，更优选C₁～C₆烯基氧基C₁～C₂烷基。作为烯基氧基烷基，具体地，例如，列举乙烯基氧基甲基、烯丙基氧基甲基等。

本说明书中的“环烷基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“环烷基”取代的基团，优选C₃～C₈环烷基C₁～C₆烷基，更优选C₃～C₆环烷基C₁～C₂烷基。作为环烷基烷基，具体地，例如，列举环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。

本说明书中的“环烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“环烷氧基”取代的基团，优选C₃～C₈环烷氧基C₁～C₆烷基，更优选C₃～C₆环烷氧基C₁～C₂烷基。作为环烷氧基烷基，具体地，例如，列举环丙氧基甲基、环丁氧基甲基等。

本说明书中的“杂环基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“杂环基”取代的基团，优选4～7元杂环基C₁～C₆烷基，更优选4～7元杂环基C₁～C₂烷基。作为杂环基烷基，具体地，例如，列举2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基、2-(氮杂环丁烷-3-基)乙基等。

本说明书中的“烷基磺酰基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“烷基磺酰基”取代的基团，优选C₁～C₆烷基磺酰基C₁～C₆烷基，更优选C₁～C₆烷基磺酰基C₁～C₂烷基。作为烷基磺酰基烷基，具体地，例如，列举甲基磺酰基甲基、2-(甲基磺酰基)乙基等。

本说明书中的“氨基羰基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“氨基羰基”取代的基团，优选氨基羰基C₁～C₆烷基，更优选氨基羰基C₁～C₄烷基。作为氨基羰基烷基，具体地，例如，列举甲基氨基羰基甲基、二甲基氨基羰基甲基、叔丁基氨基羰基甲基、1-氮杂环丁烷基羰基甲基、1-吡咯烷基羰基甲基、1-哌啶基羰基甲基、4-吗啉基羰基甲基、2-(甲基氨基羰基)乙基、2-(二甲基氨基羰基)乙基、2-(1-氮杂环丁烷基羰基)乙基、2-(1-吡咯烷基羰基)乙基、2-(4-吗啉基羰基)乙基、3-(二甲基氨基羰基)丙基、4-(二甲基氨基羰基)丁基等。

本说明书中的“芳基氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“芳基氧基”取代的基团，优选C₆～C₁₀芳基氧基C₁～C₆烷基，更优选C₆～C₁₀芳基氧基C₁～C₂烷基。作为芳基氧基烷基，具体地，例如，列举苯氧基甲基、2-苯氧基乙基等。

本说明书中的“芳烷基(芳基烷基)基团”意味着前述定义的“烷基”的至少一个氢原子被前述定义的“芳基”取代的基团，优选C₇～C₁₄芳烷基，更优选C₇～C₁₀芳烷基。作为芳烷基，具体地，例如，列举苄基、苯乙基、3-苯基丙基等。

本说明书中的“芳烷氧基”意味着前述定义的“芳烷基”结合的氧基，优选C₇～C₁₄芳烷氧基，更优选C₇～C₁₀芳烷氧基。作为芳烷氧基，具体地，例如，列举苄氧基、苯乙氧基、3-苯基丙氧基等。

本说明书中的“芳烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“芳烷氧基”取代的基团，优选C₇～C₁₄芳烷氧基C₁～C₆烷基，更优选C₇～C₁₄芳烷氧基C₁～C₂烷基。作为芳烷氧基烷基，具体地，例如，列举苄氧基甲基、1-(苄氧基)乙基等。

本说明书中的“杂芳基烷基”意味着前述定义的“烷基”的至少一个氢原子被前述定义的“杂芳基”取代的基团，优选5～10元杂芳基C₁～C₆烷基，更优选5～10元杂芳基C₁～C₂烷基。作为杂芳基烷基，具体地，例如，列举3-噻吩基甲基、4-噻唑基甲基、2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基、2-(2-吡啶基)乙基、2-(3-吡啶基)乙基、2-(4-吡啶基)乙基、2-(6-喹啉基)乙基、2-(7-喹啉基)乙基、2-(6-吲哚基)乙基、2-(5-吲哚基)乙基、2-(5-苯并呋喃基)乙基等。

本说明书中的“杂芳基烷氧基”意味着前述定义的“杂芳基烷基”结合的氧基，优选5～10元杂芳基C₁～C₆烷氧基，更优选5～10元杂芳基C₁～C₂烷氧基。作为杂芳基烷氧基，具体地，例如，列举3-噻吩基甲氧基、3-吡啶基甲氧基。

本说明书中的“杂芳基烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“杂芳基烷氧基”取代的基团，优选5～10元杂芳基C₁～C₆烷氧基C₁～C₆烷基，更优选5～10元杂芳基C₁～C₂烷氧基C₁～C₂烷基。作为杂芳基烷氧基烷基，具体地，例如，列举3-吡啶基甲氧基甲基等。

本说明书中的“杂环亚烷基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢原子被前述定义的“杂环亚烷基”取代的基团，优选4～7元杂环亚烷基C₁～C₆烷基，更优选4～7元杂环亚烷基C₁～C₂烷基。作为杂环亚烷基烷基，具体地，例如，列举四氢-4H-吡喃-4-亚基甲基、氮杂环丁烷-3-亚基甲基等。

本说明书中的“烷氧基烯基”意味着前述定义的“烯基”的1个或多个氢原子被前述定义的“烷氧基”取代的基团，优选C₁～C₆烷氧基C₂～C₆烯基。作为烷氧基烯基，具体地，例如，列举(E)-4-甲氧基丁-2-烯-1-基等。

本说明书中的“氨基羰基烯基”意味着前述定义的“烯基”的1个或多个氢原子被前述定义的“氨基羰基”取代的基团，优选氨基羰基C₂～C₆烯基。作为氨基羰基烯基，具体地，例如，列举(E)-3-(二甲基氨基羰基羰基)-丙-2-烯-1-基等。

本说明书中的“卤烷氧基”意味着前述定义的“烷氧基”的1个或多个氢原子被卤素原子取代的基团，优选C₁～C₆卤烷氧基。作为卤烷氧基，具体地，例如，列举二氟甲氧基、三氟甲氧基、2,2-二氟乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基等。

本说明书中的“亚烷基”意味着从前述“烷基”进一步除去任意一个氢原子而衍生的二价基团，优选C₄～C₈亚烷基。作为亚烷基，具体地，列举-CH₂-、-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-CH(CH₃)CH₂-、-C(CH₃)₂-、-(CH₂)₄-、-CH(CH₃)CH₂CH₂-、-C(CH₃)₂CH₂-、-CH₂CH(CH₃)CH₂-、-CH₂C(CH₃)₂-、-CH₂CH₂CH(CH₃)-、-(CH₂)₅-、-(CH₂)₆-、-(CH₂)₇-、-(CH₂)₈-等。

本说明书中的“环亚烷基”意味着从前述“环烷基”进一步除去任意一个氢原子而衍生的二价基团，优选C₃～C₈环亚烷基。作为环亚烷基，具体地，列举环丙烷-1,2-二基、环丁烷-1,2-二基、环戊烷-1,2-二基、环己烷-1,2-二基等。

本说明书中的“亚烯基”意味着从前述“烯基”进一步除去任意一个氢原子而衍生的二价基团。根据双键和取代基(存在时)的构型，双键的几何学形式可以是entgegen(E)或zusammen(Z)、顺式或反式构型。亚烯基包含直链状或支链状的那种，优选C₂～C₁₀亚烯基，更优选C₂～C₆亚烯基。

本说明书中的“亚炔基”意味着从前述“炔基”进一步除去任意一个氢原子而衍生的二价基团。亚炔基包含直链状或分枝链状的那种，优选C₂～C₁₀亚炔基，更优选C₂～C₆亚炔基。

本说明书中的“亚芳基”意味着从前述“芳基”进一步除去任意一个氢原子而衍生的二价基团。亚芳基可为单环也可为稠环。构成环的原子数目没有特别限定，优选6～10(C₆～C₁₀亚芳基)。作为亚芳基，具体地，例如，列举1,2-亚苯基、1,3-亚苯基、1,4-亚苯基、1,2-亚萘基、1,3-亚萘基、1,4-亚萘基等。

本说明书中的“螺环烷基”意味着构成环烷烃环的1个碳原子与结合对象的基团中的碳原子共有形成的基团。作为螺环烷基，优选列举C₃～C₈螺环烷基，具体地，列举螺环丙基、螺环丁基、螺环戊基、螺环己基、螺环庚基、螺环辛基等。

本说明书中的“螺杂环基”意味着前述“螺环烷基”中的1个或多个碳原子被杂原子取代的基团。作为螺杂环基，优选列举4～10元螺杂环基。

本说明书中的“脂环”意味着非芳香族烃环。脂环可以在环中具有不饱和键，也可以是具有2个以上环的多环。此外，构成环的碳原子可以被氧化形成羰基。作为脂环，优选列举3～8元脂环，具体地，例如，列举环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环、环庚烷环、环辛烷环、双环[2.2.1]庚烷环等。

本说明书中的“杂环”意味着构成环的原子中优选含有1～5个、更优选1～3个杂原子的、非芳香族的杂环。杂环可以在环中具有双键和/或三键，环中的碳原子可以被氧化形成羰基，可以是单环、稠环、螺环。构成环的原子数优选3～12(3～12元杂环)，更优选4～8(4～8元杂环)。作为杂环，具体地，例如，列举氮杂环丁烷环、氧杂环丁烷环、四氢呋喃环、四氢吡喃环、吗啉环、硫代吗啉环、吡咯烷环、4-氧代吡咯烷环、哌啶环、4-氧代哌啶环、哌嗪环、吡唑烷环、咪唑烷环、噁唑烷环、异噁唑烷环、噻唑烷环、异噻唑烷环、噻二唑烷环、噁唑烷酮环、二氧戊环、二噁烷环、硫杂环丁烷环、八氢吲哚环、或氮杂环辛烷环、或者这些饱和杂环中的1个或多个单键被双键或三键取代的环等。

本说明书中的“饱和杂环”意味着除碳原子外还包含1～5个杂原子、环中不含双键和/或三键的非芳香族的杂环。饱和杂环可以是单环，也可以与其它环、例如苯环等芳香环形成稠环。在饱和杂环形成稠环的情形中，作为饱和杂环，优选列举4～7元饱和杂环，具体地，例如，列举氮杂环丁烷环、氧杂环丁烷环、四氢呋喃环、四氢吡喃环、吗啉环、硫代吗啉环、吡咯烷环、4-氧代吡咯烷环、哌啶环、4-氧代哌啶环、哌嗪环、吡唑烷环、咪唑烷环、噁唑烷环、异噁唑烷环、噻唑烷环、异噻唑烷环、噻二唑烷环、噁唑烷酮环、二氧戊环、二噁烷环、硫杂环丁烷环、八氢吲哚环、二氢吲哚环、氮杂环庚烷环等。

本说明书中的“氨基酸”包含天然氨基酸、和非天然氨基酸。本说明书中的“天然氨基酸”指Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys、Met、Lys、Arg、Pro。非天然氨基酸没有特别限定，示例β-氨基酸、γ-氨基酸、D型氨基酸、N取代氨基酸、α,α-二取代氨基酸、侧链与天然不同的氨基酸、羟基羧酸等。在本说明书中，非天然N取代氨基酸意味着Pro以外的N取代氨基酸。作为本说明书中的氨基酸，容许任意的立体构型。氨基酸的侧链的选择不设特别限制，除氢原子外也自由选自例如烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基，这些基团中不相邻的1或2个亚甲基可以被氧原子、羰基(-CO-)、或磺酰基(-SO₂-)取代。可以分别赋予取代基，这些取代基也没有限制，例如，可以从包含卤素原子、O原子、S原子、N原子、B原子、Si原子、或P原子的任意的取代基中独立地自由选择1个或2个以上。即，示例任选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基等。在非限定的一个方式中，本说明书中的氨基酸可以是同一分子内具有羧基与氨基的化合物(即使该情形中，如脯氨酸、羟脯氨酸的亚氨基酸也包含在氨基酸中)。

氨基酸的主链氨基可以非取代(NH₂基)，也可以被取代(即，-NHR基：R表示任选具有取代基的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基，这些基团中不相邻的1或2个亚甲基可以被氧原子、羰基(-CO-)、或磺酰基(-SO₂-)取代，此外，如脯氨酸，与N原子结合的碳链和α位的碳原子可以形成环。)。前述R的取代基与上述的氨基酸侧链中的取代基同样地选择。主链氨基被取代的情形中的前述R包含在本说明书中的“氨基酸的侧链”中。这样的主链氨基被取代的氨基酸在本说明书中称为“N取代氨基酸”。作为本说明书中的“N取代氨基酸”，优选示例N-烷基氨基酸、N-C₁～C₆烷基氨基酸、N-C₁～C₄烷基氨基酸、N-甲基氨基酸，但不限于这些。

本说明书中的“氨基酸”包含分别对应的所有同位素。“氨基酸”的同位素是至少1个原子被原子编号(质子数)相同、质量数(质子和中子数之和)不同的原子取代的那种。作为本说明书中的“氨基酸”中包含的同位素的实例，有氢原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，分别含有²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl等。

作为本说明书中包含卤素原子的取代基，示例取代基中有卤素的烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等，更具体地，示例氟烷基、二氟烷基、三氟烷基等。

作为本说明书中包含氧原子的取代基，列举羟基(-OH)、氧基(-OR)、羰基(-C(＝O)-R)、羧基(-CO₂H)、氧基羰基(-C(＝O)-OR)、羰基氧基(-O-C(＝O)-R)、硫代羰基(-C(＝O)-SR)、羰基硫代基(-S-C(＝O)-R)、氨基羰基(-C(＝O)-NHR)、羰基氨基(-NH-C(＝O)-R)、氧基羰基氨基(-NH-C(＝O)-OR)、磺酰基氨基(-NH-SO₂-R)、氨基磺酰基(-SO₂-NHR)、氨磺酰氨基(-NH-SO₂-NHR)、硫代羧基(-C(＝O)-SH)、羧基羰基(-C(＝O)-CO₂H)等基团。

作为氧基(-OR)的实例，列举烷氧基、环烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基等。作为烷氧基，优选C₁～C₄烷氧基、C₁～C₂烷氧基，特别优选甲氧基、或乙氧基。

作为羰基(-C(＝O)-R)的实例，列举甲酰基(-C(＝O)-H)、烷基羰基、环烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、芳烷基羰基等。

作为氧基羰基(-C(＝O)-OR)的实例，列举烷基氧基羰基、环烷基氧基羰基、烯基氧基羰基、炔基氧基羰基、芳基氧基羰基、杂芳基氧基羰基、芳烷基氧基羰基等。

作为羰基氧基(-O-C(＝O)-R)的实例，列举烷基羰基氧基、环烷基羰基氧基、烯基羰基氧基、炔基羰基氧基、芳基羰基氧基、杂芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基等。

作为硫代羰基(-C(＝O)-SR)的实例，列举烷基硫代羰基、环烷基硫代羰基、烯基硫代羰基、炔基硫代羰基、芳基硫代羰基、杂芳基硫代羰基、芳烷基硫代羰基等。

作为羰基硫代基(-S-C(＝O)-R)的实例，列举烷基羰基硫代基、环烷基羰基硫代基、烯基羰基硫代基、炔基羰基硫代基、芳基羰基硫代基、杂芳基羰基硫代基、芳烷基羰基硫代基等。

作为氨基羰基(-C(＝O)-NHR)的实例，列举烷基氨基羰基(例如，C₁～C₆或C₁～C₄烷基氨基羰基，特别示例乙基氨基羰基、甲基氨基羰基等。)、环烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、炔基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基、芳烷基氨基羰基等。除这些外，还列举与-C(＝O)-NHR中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。

作为羰基氨基(-NH-C(＝O)-R)的实例，列举烷基羰基氨基、环烷基羰基氨基、烯基羰基氨基、炔基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基等。除这些外，还列举与-NH-C(＝O)-R中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。

作为氧基羰基氨基(-NH-C(＝O)-OR)的实例，列举烷氧基羰基氨基、环烷氧基羰基氨基、烯基氧基羰基氨基、炔基氧基羰基氨基、芳基氧基羰基氨基、杂芳基氧基羰基氨基、芳烷基氧基羰基氨基等。除这些外，还列举与-NH-C(＝O)-OR中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。

作为磺酰基氨基(-NH-SO₂-R)的实例，列举烷基磺酰基氨基、环烷基磺酰基氨基、烯基磺酰基氨基、炔基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、芳烷基磺酰基氨基等。除这些外，还列举与-NH-SO₂-R中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。

作为氨基磺酰基(-SO₂-NHR)的实例，列举烷基氨基磺酰基、环烷基氨基磺酰基、烯基氨基磺酰基、炔基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、杂芳基氨基磺酰基、芳烷基氨基磺酰基等。除这些外，还列举与-SO₂-NHR中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的化合物。

作为氨磺酰氨基(-NH-SO₂-NHR)的实例，列举烷基氨磺酰氨基、环烷基氨磺酰氨基、烯基氨磺酰氨基、炔基氨磺酰氨基、芳基氨磺酰氨基、杂芳基氨磺酰氨基、芳烷基氨磺酰氨基等。进一步，与-NH-SO₂-NHR中的N原子结合的2个H原子可以被独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、和芳烷基的取代基取代，此外，这2个取代基可以形成环。

作为包含S原子的取代基，列举硫醇基(-SH)、硫代基(-S-R)、亚磺酰基(-S(＝O)-R)、磺酰基(-SO₂-R)、磺基(-SO₃H)等基团。

作为硫代基(-S-R)的实例，选自烷基硫代基、环烷基硫代基、烯基硫代基、炔基硫代基、芳基硫代基、杂芳基硫代基、芳烷基硫代基等。

作为磺酰基(-SO₂-R)的实例，列举烷基磺酰基、环烷基磺酰基、烯基磺酰基、炔基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、芳烷基磺酰基等。

作为本说明书包含氮原子的取代基，列举叠氮基(-N₃)、氰基(-CN)、伯氨基(-NH₂)、仲氨基(-NH-R；也称为单取代氨基。)、叔氨基(-NR(R')；也称为二取代氨基。)、脒基(-C(＝NH)-NH₂)、取代脒基(-C(＝NR)-NR'R")、胍基(-NH-C(＝NH)-NH₂)、取代胍基(-NR-C(＝NR”')-NR'R")、氨基羰基氨基(-NR-CO-NR'R")、吡啶基、哌啶子基、吗啉代基、氮杂环丁烷基等基团。

作为仲氨基(-NH-R；单取代氨基)的实例，列举烷基氨基、环烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、芳烷基氨基等。

作为叔氨基(-NR(R')；二取代氨基)的实例，例如，列举烷基(芳烷基)氨基等具有分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等的任意2个取代基的氨基，这些任意2个取代基可以形成环。具体地，示例二烷基氨基，特别是C₁-C₆二烷基氨基、C₁-C₄二烷基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基等。本说明书中的“C_p-C_q二烷基氨基”指氨基中取代有2个C_p-C_q烷基的基团，两个C_p-C_q烷基可以相同也可以不同。

作为取代脒基(-C(＝NR)-NR'R")的实例，列举N原子上的3个取代基R、R'、和R"分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，例如烷基(芳烷基)(芳基)脒基等。

作为取代胍基(-NR-C(＝NR”')-NR'R")的实例，列举R、R'、R"、和R”'分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，或它们形成环的基团等。

作为氨基羰基氨基(-NR-CO-NR'R")的实例，列举R、R'、和R"分别独立地选自氢原子、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，或它们形成环的基团等。

本说明书中的“肽残基”、“氨基酸残基”有时分别简单称为“肽”、“氨基酸”。

本说明书中的“相应于......的部位”可用于通过参考由序列编号1表示的氨基酸序列来表征本实施方式涉及的多肽中的氨基酸序列中的氨基酸残基。用于确定相应部位的比对可以通过使用本技术领域中技术范围内的各种方法例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)软件、或GENETYX(注册商标)(株式会社Genetex)等可公开得到的计算机软件实现。本领域技术人员可以确定用于取得序列的比对的适当的参数，包括用于在被比较序列全长实现最大比对的必要的任意算法。

一个实施方式涉及的多肽包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于后述的由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐、和后述的由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或前述化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

一个实施方式涉及的多肽包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中2个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于后述的由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐、和后述的由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或前述化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

一个实施方式涉及的多肽包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于后述的由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐、和后述的由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或前述化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

一个实施方式涉及的多肽可以是催化还原氨基化反应的酶。本实施方式涉及的多肽在至少一个反应条件下对于化合物A或其盐与化合物B或其盐的还原氨基化反应、或化合物B或其盐的分子内还原氨基化反应可以具有催化活性。

另外，本说明书中，有时将化合物A或其盐统称为化合物A，有时将化合物B或其盐统称为化合物B。

由于一个实施方式涉及的多肽对于还原氨基化反应具有催化活性，其适于氨基酸的制备。

一个实施方式涉及的多肽在用以往的催化还原氨基化反应的酶合成活性低的氨基酸的制备中也具有高合成活性。具体地，非专利文献4中记载的P.Putida KT2440株的基因组所编码的蛋白质PP3591(以下，称为野生型酶)中，碳原子数比甲基大的烷基(例如，乙基)与氮原子结合的氨基酸(以下也称为“N-Et以上的N取代氨基酸”。)、和相对于氨基β位具有支链结构的氨基酸(以下也称为“β-支链型氨基酸”。)的合成活性低。一个实施方式涉及的多肽与野生型酶相比对于N-Et以上的N取代氨基酸和/或β-支链型氨基酸具有高活性。进一步，根据本实施方式涉及的多肽，能够以高立体选择性制备目标氨基酸。

由序列编号1表示的氨基酸序列是非专利文献4中记载的公知的氨基酸序列。

上述多肽与由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列的序列同一性可以是90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％。

上述多肽与由序列编号1表示的氨基酸序列中2个氨基酸残基被改变的序列的序列同一性可以是90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％。

上述多肽的与序列编号1表示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被改变的序列的序列同一性可以是90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上或100％。

氨基酸序列的序列同一性被定义为，在将序列排列成得到最大的百分数序列同一性并且如果需要在导入空隙后、并且不认为任何保守取代也是序列同一性的一部分时，与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分率比。用于确定氨基酸序列的序列同一性的目标比对可以通过使用本技术领域中的技术范围内的各种方法、例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)软件、或GENETYX(注册商标)(株式会社Genetex)等可公开得到的计算机软件实现。本领域技术人员可以确定用于取得序列的比对的适当的参数，包括用于在被比较序列全长实现最大比对的必要的任意算法。

氨基酸序列的序列同一性可以通过Karlin and Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：5873-7)确定。基于该算法，开发了称为BLASTN或BLASTX的程序(Altschul et al.，J.Mol.Biol.(1990)215：403-10)。在基于BLAST通过BLASTX分析氨基酸序列的情形中，参数为例如score＝50、Wordlength＝3。在应用BLAST和Gapped BLAST程序的情形中，应用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法可以参考公知的NCBI(National Center for Biotechnology Information)的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)的网站的信息。

ALIGN-2序列比较计算机程序是Genentech公司的著作，其源代码与使用者用文件一起提交给美国版权局(U.S.Copyright Office,Wasington D.C.,20559)，作为美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可以从Genentech公司(Genentech,Inc.,South SanFrancisco,California)公开得到，也可以从源代码编译。编译ALIGN-2程序用于在包含Digital UNIX V4.0D的UNIX操作系统上使用。所有序列比较参数通过ALIGN-2程序设定，不变动。

在氨基酸序列比较中应用ALIGN-2的情况下，给定氨基酸序列A对于给定氨基酸序列B、或与给定氨基酸序列B、或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者，也可以称为，对于给定氨基酸序列B、或与给定氨基酸序列B、或相对于给定氨基酸序列B具有或包含某％氨基酸序列同一性的给定的氨基酸序列A)如下计算：百分率X/Y的100倍。此处，X是通过序列比对程序ALIGN-2、在该程序的A和B的比对中相同被评分为一致的氨基酸残基数目，Y是B中的氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情形中，A对于B的％氨基酸序列同一性不等于B对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，本说明书中应用的所有％氨基酸序列同一性值为如前一段所述应用ALIGN-2计算机程序得到的那种。

在本说明书中，“催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高”意味着在至少一个反应条件下，催化活性比前述多肽的前述催化活性高。“催化活性比由序列编号17表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高”意味着在至少一个反应条件，催化活性比前述多肽的前述催化活性高。在一个方式中，可以使用实施例中记载的反应条件评价多肽的催化活性。例如，反应开始时的各化合物的浓度可为，化合物B和其盐的浓度的总计为50mM、D(+)-葡萄糖的浓度为100mM、化合物A和其盐的浓度的总计为500mM、磷酸缓冲液的浓度为100mM、β-NADPH的浓度为0.89mM、GDH溶液的浓度为0.002单位/μL、评价对象的多肽的浓度为2.5μM。该反应可以在后述的预混物中添加成为催化活性的评价对象的多肽而进行。预混物可以如下配制，将化合物B和/或其盐、D(+)-葡萄糖溶解于用盐酸调整为pH7.5～8.5的化合物A和/或其盐的水溶液、以及磷酸缓冲液的混合溶剂，应用氢氧化钠水溶液将pH调整为8.0后通过超纯水定容，对该溶液添加β-NADPH水溶液(在超纯水中溶解成为89mM)、和GDH溶液(在1xTNG中溶解)。

在一个实施方式中，前述催化活性的评价可以通过下列评价，在苯基丙酮酸、2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸、或2-环戊基-2-氧代-乙酸为50mM、D(+)-葡萄糖为100mM、甲胺或乙胺为500mM、磷酸缓冲液为100mM、β-NADPH为0.89mM、GDH溶液为0.002单位/μL、评价对象的多肽为2.5μM的浓度、并且37℃、pH8的条件下开始反应，在经过19小时的时间点，求得通过还原氨基化反应生成的氨基酸的收率。

催化活性基于通过还原氨基化反应生成的氨基酸(以下有时称为“目标产物”。)的生成量计算。目标产物的生成量可以应用液相色谱质谱仪(LCMS)测定。具体地，可以在后述的实施例中记载的条件测定。

本实施方式涉及的多肽的催化活性可以是具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性的1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上或8倍以上。本实施方式涉及的多肽的前述催化活性是具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性的多少倍可以通过下列求得，计算在从反应开始时间点经过19小时的时间点应用两个肽的情形中目标产物的收率的比。具体地，可以通过应用本实施方式涉及的多肽的情形的收率除以应用具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的情形的收率求得。在本说明书中，反应开始时间点意味着系统中由式(1)表示的化合物A或其盐和由式(2)表示的化合物B或其盐、本说明书公开的酶、和还原剂被添加的时间点中任一较晚的那个。

在从反应开始时间点经过19小时的时间点的收率通过下面所示方法计算。首先，将反应溶液和另外配制的标准曲线样品(具有与目标产物相同的结构或显示相同的UV吸收波长的结构的化合物)供给LCMS分析，关于各自，取得UV图或萃取离子色谱图。根据从反应溶液得到的UV图或萃取离子色谱图，分别取得来自目标产物的UV峰面积或MS峰面积。根据标准曲线样品，也同样取得标准品的UV峰面积或MS峰面积。基于标准曲线样品中包含的标准品的浓度与UV峰面积或MS峰面积的对应关系，根据UV峰面积或MS峰面积计算反应溶液中包含的目标产物的浓度。在反应溶液中的化合物B和其盐全部转化为目标产物的情形中，认为反应溶液中的目标产物浓度等于反应开始时间点反应溶液中的化合物B和其盐的浓度的总计。通过实际反应溶液中包含的目标产物的浓度除以反应开始时间点反应溶液中的化合物B和其盐的浓度的总计，计算收率。

化合物A是下述由式(1)表示的化合物。

[化学式38]

式(1)中，R¹和R²分别独立地表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基，这些基团任选被取代，R¹或R²的任1个以上是氢原子。此外，式(1)中R¹可以是氢原子，R²可以是C¹～C⁶烷基。化合物A可以是胺或胺类似物。

对于化合物A，式(1)中，R¹和R²的一个可为烷基，另一个可为氢原子，可为烷基胺。烷基胺或其盐可以是选自甲胺、乙胺和它们的盐的1个以上。化合物A可以是氨。化合物A可以是选自氨、甲胺、乙胺和它们的盐的1个以上。

化合物B是下述由式(2)表示的化合物。

[化学式39]

[化学式40]

[化学式41]

式(2)中，X表示碳原子，Y表示氢原子、前述由式(1')表示的基团或前述由式(3)表示的基团。式(2)中，Y表示C₃～C₈的环烷基、或C₆～C₉的芳烷基，该芳烷基可以被C₁～C₃的烷基或卤素原子取代。

n表示0以上且2以下的整数。n可以是0或1，可以是0。

R⁶表示氢原子、任选被取代的碳原子数为1以上且6以下的脂肪族烃基、任选被取代的碳原子数为5以上且12以下的芳基、任选被取代的构成环的原子数目为5以上且12以下的杂芳基、包含氮原子的基团、或包含氧原子的基团。由R⁶表示的基团的具体实例如上述。

式(1')中，

[化学式42]

表示与X的结合点。

R^1a是从式(1)中由R¹表示的基团除去氢原子的基团，不是氢原子。

式(3)中，

[化学式43]

表示与X的结合点。

m表示0以上且6以下的整数。m的下限是0以上，可以是1以上、2以上、3以上、4以上、或5以上。m的上限是6以下，可以是5以下、4以下、3以下、2以下、或1以下。p是0或1，q是0或1，r是0或1。

Z¹表示任选被取代的亚烷基、或碳原子数为1以上且6以下的含醚键基团。在m是2以上的情形中，多个存在的Z¹可以相同也可以不同。作为“含醚键基团”，例如，示例被烷氧基、烯丙基氧基等取代的烷基。作为碳原子数为1以上且6以下的含醚键基团的具体实例，列举甲氧基甲基、乙氧基甲基和烯丙基氧基甲基、烯丙基氧基乙基、烯丙基氧基丙基。

Z²表示碳原子。

R³、R⁴和R⁵分别独立地表示氢原子、任选被取代的碳原子数为1以上且6以下的脂肪族烃基、任选被取代的碳原子数为5以上且12以下的芳基、任选被取代的构成环的原子数目为5以上且12以下的杂芳基、包含氮原子的基团、或包含氧原子的基团。

R³、R⁴和R⁵的任2个以上任选彼此结合与Z²共同形成环，这些环结构可以是环烷基、芳基、杂环基、或杂芳基，这些基团可以被取代。

R³、R⁴、和R⁵可以与Z²形成双键或三键，在R³、R⁴、和R⁵的任1个通过双键或三键与Z²结合的情形中，p、q或r的任1个以上是0。

式(1)中，在R¹和R²的一个是甲基、并且另一个是氢原子的情形中，式(2)中，Y是前述由式(3)表示的基团，m是0，R³至R⁵中的2个以上不是氢原子。

在R³至R⁵的任2个是氢原子的情形中，氢原子以外的基团可以是任选被取代的碳原子数为1以上且6以下的脂肪族烃基、任选被取代的碳原子数为5以上且12以下的芳基、或任选被取代的构成环的原子数目为5以上且12以下的杂芳基，可以是任选被取代的碳原子数为5以上且12以下的芳基，可以是苯基或对甲苯基。

前述式(1)中，R¹可以是氢原子、R²可以是乙基。

前述式(1)中，R¹可以是氢原子、R²可以是甲基。

前述式(1)中，R¹和R²可以是氢原子。

化合物B可以是酮酸或酮酸类似物。

化合物B可以是下述由式(2')表示的化合物。

[化学式44]

式(2')中，Y’表示C₃～C₈环烷基、或C₆～C₉芳烷基，该芳烷基可以被C₁～C₃烷基或卤素原子取代。

由式(2')表示的化合物或其盐可以是选自苯基丙酮酸、2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸、2-环戊基-2-氧代-乙酸和它们的盐的1个以上。

化合物A与化合物B的组合可以是式(1)中R¹是氢原子、R²是乙基的化合物A(乙胺)与式(2)中n和m均为0、Y是由式(3)表示的基团、R³是苯基、R⁴、R⁵和R⁶均为氢原子、p、q和r均为1的化合物B(苯基丙酮酸)的组合，可以是式(1)中R¹是氢原子、R²是乙基的化合物A(乙胺)与式(2)中n和m均为0、Y是由式(3)表示的基团、R³是对甲苯基、R⁴、R⁵和R⁶均为氢原子、p、q和r均为1的化合物B(2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸)的组合，可以是式(1)中R¹是氢原子、R²是甲基的化合物A(甲胺)与式(2)中n和m均为0、Y是由式(3)表示的基团、R³和R⁴彼此连接形成环戊烷环、R⁵和R⁶均为氢原子、p、q和r均为1的化合物B(2-环戊基-2-氧代-乙酸)的组合。

测定催化活性时，可以应用化合物A是乙胺、化合物B是苯基丙酮酸钠盐的组合，该情形中，可以以H-EtPhe-OH合成活性为指标评价多肽的催化活性。在其它方式中测定催化活性时，可以应用化合物A是乙胺、化合物B是2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸钠盐的组合，该情形中，可以以H-EtPhe(4-Me)-OH合成活性为指标评价多肽的催化活性。在其它方式中测定催化活性时，可以应用化合物A是甲胺、化合物B是2-环戊基-2-氧代-乙酸的组合，该情形中，可以以H-MeGly(cPent)-OH合成活性为指标评价多肽的催化活性。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是由序列编号1表示的氨基酸序列中1个以上的氨基酸残基被改变的多肽，1～20个、1～15个、1～10个、1～7个或1～5个的氨基酸残基可以被改变。被改变的氨基酸残基可以是3个以内，可以是2个以内，可以是1个。

关于本发明的一个实施方式涉及的多肽，由序列编号1表示的氨基酸序列中被改变的氨基酸残基数目示例1～5个，优选1个，更优选2个以上，最优选2个或3个。

改变可以是选自取代、缺失和插入的1个以上，可以是取代。改变可以是保守的改变。保守的改变意味着，与改变前的多肽比较不减少目标催化活性的氨基酸残基改变。

此外，前述改变可以是取代为与改变前的氨基酸残基不同的天然氨基酸。进一步，前述取代中应用的天然氨基酸可以是选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸和脯氨酸的1个以上。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于选自44位的组氨酸残基、117位的苯丙氨酸残基、141位的蛋氨酸残基、156位的苏氨酸残基、182位的组氨酸残基、186位的谷氨酰胺残基、253位的色氨酸残基、和260位的赖氨酸残基的1个以上的氨基酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列的多肽，由于对于还原氨基化反应的催化活性进一步提高，可以是包含位于相应于选自141位的蛋氨酸残基、182位的组氨酸残基、253位的色氨酸残基、和260位的赖氨酸残基的1个以上的氨基酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列的多肽，进一步，可以是包含位于相应于选自141位的蛋氨酸残基、253位的色氨酸残基、和260位的赖氨酸残基的1个以上的氨基酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列的多肽。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于44位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被组氨酸以外的氨基酸残基取代的序列的多肽。该多肽可以是包含由序列编号2表示的氨基酸序列的多肽。序列编号2中由X表示的氨基酸残基是丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基。

由于对于还原氨基化反应的催化活性进一步提高，可以包含位于相应于44位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被蛋氨酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于44位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被蛋氨酸残基取代的氨基酸序列(H44M)。该情形中，对于乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于117位的苯丙氨酸残基的部位的氨基酸残基被苯丙氨酸残基以外的氨基酸残基取代的序列的多肽。该多肽可以是包含由序列编号4表示的氨基酸序列的多肽。序列编号4中由X表示的氨基酸残基是丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基。

由于对于还原氨基化反应的催化活性进一步提高，可以包含位于相应于117位的苯丙氨酸残基的部位的氨基酸残基被亮氨酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于117位的苯丙氨酸残基的部位的氨基酸残基被亮氨酸残基取代的氨基酸序列(F117L)。该情形中，对于甲胺与2-环戊基-2-氧代-乙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被蛋氨酸以外的氨基酸残基取代的序列的多肽。该多肽可以是包含由序列编号6表示的氨基酸序列的多肽。序列编号6中由X表示的氨基酸残基是丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基。

由于对于还原氨基化反应的催化活性进一步提高，可以包含位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被酪氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基、或丙氨酸残基取代的氨基酸序列(M141Y、M141W、M141V、M141T、M141S、M141R、M141L、M141K、M141I、M141H、M141F、M141A)。进一步，可以包含位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、苯丙氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被酪氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基、或丙氨酸残基取代的氨基酸序列(M141Y、M141W、M141V、M141K、M141I、M141H、M141F、M141A)。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被丙氨酸残基、赖氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于甲胺与2-环戊基-2-氧代-乙酸的还原氨基化反应、和乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应、乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被精氨酸残基、亮氨酸残基或丝氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于甲胺与2-环戊基-2-氧代-乙酸的还原氨基化反应、和乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被异亮氨酸残基或苏氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应、和乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被苯丙氨酸残基、或组氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于156位的苏氨酸残基的部位的氨基酸残基被苏氨酸以外的氨基酸残基取代的序列的多肽。该多肽可以是包含由序列编号7表示的氨基酸序列的多肽。序列编号7中由X表示的氨基酸残基是丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基。

由于对于还原氨基化反应的催化活性进一步提高，可以包含位于相应于156位的苏氨酸残基的部位的氨基酸残基被丝氨酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于156位的苏氨酸残基的部位的氨基酸残基被丝氨酸残基取代的氨基酸序列(T156S)。该情形中，对于乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被组氨酸以外的氨基酸残基取代的序列的多肽。该多肽可以是包含由序列编号8表示的氨基酸序列的多肽。序列编号8中由X表示的氨基酸残基是丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基。

由于对于还原氨基化反应的催化活性进一步提高，可以包含位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、甘氨酸残基、苯丙氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被酪氨酸残基、谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、甘氨酸残基、苯丙氨酸残基、或丙氨酸残基取代的氨基酸序列(H182Y、H182Q、H182M、H182L、H182G、H182F、H182A)。进一步，可以包含位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自蛋氨酸残基、亮氨酸残基、和苯丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被蛋氨酸残基、亮氨酸残基、或苯丙氨酸残基取代的氨基酸序列(H182M、H182L、H182F)。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被丙氨酸残基、苯丙氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基或酪氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应和乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被谷氨酰胺残基取代的氨基酸序列的多肽，对于甲胺与2-环戊基-2-氧代-乙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被甘氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于186位的谷氨酰胺残基的部位的氨基酸残基被谷氨酰胺残基以外的氨基酸残基取代的序列的多肽。该多肽可以是包含由序列编号10表示的氨基酸序列的多肽。序列编号10中由X表示的氨基酸残基是丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基。

由于对于还原氨基化反应的催化活性进一步提高，可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于186位的谷氨酰胺残基的部位的氨基酸残基被选自蛋氨酸残基和谷氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于186位的谷氨酰胺残基的部位的氨基酸残基被蛋氨酸残基或谷氨酸残基取代的氨基酸序列(Q186M、Q186E)。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于186位的谷氨酰胺残基的部位的氨基酸残基被蛋氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于186位的谷氨酰胺残基的部位的氨基酸残基被谷氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应、和乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被色氨酸残基以外的氨基酸残基取代的序列的多肽。该多肽可以是包含由序列编号11表示的氨基酸序列的多肽。序列编号11中由X表示的氨基酸残基是丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、赖氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、或酪氨酸残基。

由于对于还原氨基化反应的催化活性进一步提高，可以包含位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基、脯氨酸残基、天冬酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被酪氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基、脯氨酸残基、天冬酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基、或丙氨酸残基取代的氨基酸序列(W253Y、W253V、W253T、W253S、W253R、W253Q、W253P、W253N、W253M、W253L、W253K、W253I、W253H、W253F、W253A)。进一步，可以包含位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自亮氨酸残基、异亮氨酸残基和组氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列，优选包含被组氨酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被亮氨酸残基、异亮氨酸残基或组氨酸残基取代的氨基酸序列(W253L、W253I、W253H)，优选包含被组氨酸残基取代的氨基酸序列(W253H)。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被组氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于甲胺与2-环戊基-2-氧代-乙酸的还原氨基化反应、乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应、和乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被丙氨酸残基、苯丙氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、或酪氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于甲胺与2-环戊基-2-氧代-乙酸的还原氨基化反应、和乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被赖氨酸残基、精氨酸残基、或丝氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于甲胺与2-环戊基-2-氧代-乙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被天冬酰胺残基取代的氨基酸序列的多肽，对于乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

本发明的一个实施方式涉及的多肽可以是包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被赖氨酸残基以外的氨基酸残基取代的序列的多肽。该多肽可以是包含由序列编号12表示的氨基酸序列的多肽。序列编号12中由X表示的氨基酸残基是丙氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、天冬酰胺残基、脯氨酸残基、谷氨酰胺残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基。

由于对于还原氨基化反应的催化活性进一步提高，可以包含位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、色氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、组氨酸残基、甘氨酸残基、苯丙氨酸残基、谷氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以具有由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被酪氨酸残基、色氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、组氨酸残基、甘氨酸残基、苯丙氨酸残基、谷氨酸残基或丙氨酸残基取代的氨基酸序列(K260Y、K260W、K260T、K260S、K260R、K260Q、K260N、K260M、K260L、K260H、K260G、K260F、K260E、K260A)。进一步，可以包含位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、谷氨酸残基和天冬酰胺残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列。即，本实施方式涉及的多肽可以具有由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、谷氨酸残基或天冬酰胺残基取代的氨基酸序列(K260Q、K260M、K260E、K260N)。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被谷氨酸残基或丝氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于甲胺与2-环戊基-2-氧代-乙酸的还原氨基化反应、乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应、和乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被苯丙氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、谷氨酰胺残基、苏氨酸残基、或酪氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应、和乙胺与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

对于包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、天冬酰胺残基、精氨酸残基、或色氨酸残基取代的氨基酸序列的多肽，对于乙胺与苯基丙酮酸的还原氨基化反应的催化活性更提高。

本实施方式涉及的多肽可以包含由序列编号6表示的、由X表示的氨基酸残基是缬氨酸残基的氨基酸序列a1(突变：M141V)，由序列编号6表示的、由X表示的氨基酸残基是酪氨酸残基的氨基酸序列a2(突变：M141Y)，由序列编号8表示的、由X表示的氨基酸残基是亮氨酸残基的氨基酸序列a3(突变：H182L)，由序列编号11表示的、由X表示的氨基酸残基是组氨酸残基的氨基酸序列a4(突变：W253H)，或由序列编号12表示的、由X表示的氨基酸残基是谷氨酸残基的氨基酸序列a5(突变：K260E)。

本实施方式涉及的多肽可以包含与氨基酸序列a1、a2、a3、a4或a5具有90％以上的序列同一性的序列。前述序列同一性可以是91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上，可以是100％。

本实施方式涉及的多肽可以是包含氨基酸序列a1、a2、a3、a4或a5中1个以上的氨基酸残基被改变的序列的多肽，1～20个、1～15个、1～10个、1～7个或1～5个的氨基酸残基可以被改变。被改变的氨基酸残基可以是3个以内，可以是2个以内，可以是1个。

对于本实施方式涉及的多肽，由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点可以是2个位点以上，可以是2个位点。以下，关于改变位点为2个位点以上的该多肽的优选方式进行说明。

该多肽优选包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于选自141位的蛋氨酸残基、182位的组氨酸残基、和253位的色氨酸残基的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第一改变位点被改变，由序列编号1表示的氨基酸序列中选自182位的组氨酸残基、253位的色氨酸残基和260位的赖氨酸残基、并且位于相应于与作为第一改变位点被改变的氨基酸残基不同的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第二改变位点被改变。

该多肽优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中、位于相应于141位的蛋氨酸残基和182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、

位于相应于182位的组氨酸残基和260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、或位于相应于253位的色氨酸残基和260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列，

更优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中、

该多肽优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列，更优选包含被选自酪氨酸残基、缬氨酸残基和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

该多肽优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、和苯丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列，更优选包含被选自蛋氨酸残基和亮氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

该多肽优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、蛋氨酸残基、组氨酸残基和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列，更优选包含被组氨酸残基取代的序列。

该多肽优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自丝氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、甘氨酸残基、苯丙氨酸残基、谷氨酸残基和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列，更优选包含被选自谷氨酰胺残基和谷氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

以下，由序列编号1表示的氨基酸序列中、位于相应于m¹位的氨基酸残基X¹的部位的氨基酸残基被X¹以外的其它氨基酸残基x¹取代并且位于相应于m²位的氨基酸残基X²的部位的氨基酸残基被X²以外的其它氨基酸残基x²取代的序列标记为X¹m¹x¹＿X²m²x²。例如，由于由序列编号23表示的氨基酸序列是位于相应于141位和182位的氨基酸残基的部位的氨基酸残基分别被其它氨基酸残基X取代的那种，标记为M141X＿H182X。具体地，由序列编号23表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是酪氨酸残基、位于相应于182位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基的氨基酸序列标记为M141Y＿H182M。由序列编号24～30表示的氨基酸序列中也同样标记。

由序列编号1表示的氨基酸序列中2个氨基酸残基被改变的序列例如可以是选自由如下所示氨基酸序列组成的组a1～组a4的氨基酸序列，优选选自组a1～组a3的氨基酸序列，更优选选自组a1和组a2的氨基酸序列，最优选选自组a1的氨基酸序列。

组a1：

M141Y＿K260E、H182L＿K260Q、M141A＿K260E、H182M＿K260Q、M141A＿K260Q、H182M＿K260E、M141V＿K260E、W253H＿K260E、和H182L_K260E。

组a2：

M141V＿K260Q、W253H＿K260Q、W253M＿K260E、M141Y＿H182M、M141Y＿K260Q、H182F＿K260Q、M141V＿K260F、M141V＿H182L、M141V_K260L、M141Y_K260G、H182L_W253H、H182F_K260E、和M141T＿K260Q

组a3：

M141Y＿H182L、W253M＿K260Q、M141V＿W253M、M141V＿K260S、M141V_K260A、M141A_K260F、M141A_K260H、W253A_K260E、M141V_W253A、M141V_W253H、M141K_K260L、M141V_K260G、和M141A_K260L。

组a4：

M141W_K260A、M141V_W253Y、M141K_K260G、M141A_K260G、M141A_K260S、M141A_K260N、M141Y_W253H、M141A_K260A、M141K＿K260S、W253A＿K260Q、M141V＿H182M、M141A＿K260I、M141T_K260G、W253M_K260L、M141I_W253A、W253T_K260L、M141R_K260G、W253A_K260L、M141K_W253S、M141A_H182L、W253N_K260L、M141K_K260A、M141K_W253M、H182Y_W253A、H182M_W253H、M141R_K260A、H182M_W253A和M141K_W253A。

该多肽例如可以包含与选自组a1～组a4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的序列，优选包含与选自组a1～组a3的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的序列，更优选包含与选自组a1和组a2的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的序列，最优选包含与选自组a1的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的序列。

该多肽可以包含选自组a1～组a4的氨基酸序列，优选包含选自组a1～组a3的氨基酸序列，更优选包含选自组a1和组a2的氨基酸序列，最优选包含选自组a1的氨基酸序列。

对于本实施方式涉及的多肽，例如，由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点可以是3个位点以上，可以是3个位点。以下，关于改变位点是3个位点以上的该多肽的优选方式进行说明。

该多肽优选包含下列序列：由序列编号1表示的氨基酸序列中、位于相应于选自141位的蛋氨酸残基和182位的组氨酸残基的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第一改变位点被改变，

由序列编号1表示的氨基酸序列中、选自182位的组氨酸残基和253位的色氨酸残基、并且位于相应于与作为第一改变位点被改变的氨基酸残基不同的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第二改变位点被改变，

由序列编号1表示的氨基酸序列中、选自253位的色氨酸残基和260位的赖氨酸残基、并且位于相应于与作为第一改变位点和第二改变位点被改变的氨基酸残基不同的1个氨基酸残基的部位的氨基酸残基作为第三改变位点被改变。

该多肽优选包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中、位于相应于141位的蛋氨酸残基、182位的组氨酸残基和253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列、

位于相应于182位的组氨酸残基、253位的色氨酸残基和260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列，

更优选包含：由序列编号1表示的氨基酸序列中、

该多肽优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、和丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列，更优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于141位的蛋氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、缬氨酸残基和异亮氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

该多肽优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自蛋氨酸残基、亮氨酸残基和苯丙氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列，更优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于182位的组氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自蛋氨酸残基和亮氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

该多肽优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基和谷氨酸的一个氨基酸残基取代的序列，更优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自谷氨酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基和组氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

该多肽优选包含由序列编号1表示的氨基酸序列中的改变位点是3个、并且由序列编号1表示的氨基酸序列中位于相应于260位的赖氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自谷氨酰胺残基和谷氨酸残基的一个氨基酸残基取代的序列。

以下，由序列编号1表示的氨基酸序列中、位于相应于m¹位的氨基酸残基X¹的部位的氨基酸残基被X¹以外的其它氨基酸残基x¹取代、位于相应于m²位的氨基酸残基X²的部位的氨基酸残基被X²以外的其它氨基酸残基x²取代、并且位于相应于m³位的氨基酸残基X³的部位的氨基酸残基被X³以外的其它氨基酸残基x³取代的序列标记为X¹m¹x¹＿X²m²x²＿X³m³x³。例如，由于由序列编号31表示的氨基酸序列是位于相应于141位、253位和260位的氨基酸残基的部位的氨基酸残基分别被其它氨基酸残基X取代的那种，标记为M141X＿W253X＿K260X。具体地，由序列编号31表示的、位于相应于141位的氨基酸残基的部位的X是缬氨酸残基、位于相应于253位的氨基酸残基的部位的X是蛋氨酸残基、位于相应于260位的氨基酸残基的部位的X是谷氨酸残基的氨基酸序列标记为M141V＿W253M＿K260E。由序列编号32～35表示的氨基酸序列中也同样标记。

由序列编号1表示的氨基酸序列中3个氨基酸残基被改变的序列例如可以是选自由如下所示氨基酸序列组成的组b1～组b4的氨基酸序列，优选选自组b1～组b3的氨基酸序列，更优选选自组b1和组b2的氨基酸序列，最优选选自组b1的氨基酸序列。

组b1：

M141Y_H182M_K260E、M141V_W253M_K260E、H182L_W253H＿K260E、M141Y＿H182M＿K260Q、M141V＿H182M＿K260E、M141V＿H182L＿K260Q、M141Y＿H182L＿K260Q、M141V＿W253Q＿K260E、H182L＿W253Q＿K260E、M141I＿W253H＿K260E、M141V＿H182L＿K260E、M141Y_H182L_K260E、H182L_W253M_K260E、M141VW253Q＿K260Q、M141V＿W253H＿K260Q、M141V＿W253L＿K260Q、M141I＿W253H＿K260Q、和M141V＿W253M＿K260Q。

组b2：

H182M＿W253H＿K260E、M141V＿W253V＿K260Q、H182L＿W253H＿K260Q、M141V＿W253H＿K260E、H182L＿W253Q＿K260Q、M141L＿W253H＿K260E、H182M＿W253Q＿K260E、M141V＿W253F＿K260Q、M141V＿W253L＿K260E、M141V＿W253T＿K260Q、M141Y＿H182F＿K260E、H182M＿W253M＿K260E、H182L＿W253M＿K260Q、M141Y＿W253H＿K260E、M141Y＿W253Q＿K260E、M141V＿H182M＿K260Q、H182M_W253L_K260E、H182F_W253H_K260E、M141A_H182FK260Q、M141Y＿W253M＿K260E、H182M＿W253Q＿K260Q、和H182M＿W253M＿K260Q。

组b3：

H182L＿W253T＿K260Q、M141Y＿W253S＿K260E、M141V＿H182F＿K260E、M141A＿H182M＿K260E、M141T＿H182L＿K260Q、M141Y＿W253T＿K260E、H182M＿W253L＿K260Q、M141V＿H182F＿K260Q、M141S_W253H_K260E、M141T_W253H_K260E、H182M_W253H＿K260Q、M141A＿H182L＿K260Q、H182M＿W253F＿K260Q、M141A＿H182M＿K260Q、M141A＿W253Q＿K260E、M141A＿H182L＿K260E、M141A＿W253H＿K260E、M141V＿W253E＿K260Q、M141A＿W253M＿K260E、M141A＿W253H＿K260Q、M141K＿H182L＿W253H、和M141T＿H182M＿K260Q。

组b4：

M141A＿W253M＿K260Q、和M141A＿H182F＿K260E

该多肽例如可以包含与选自组b1～组b4的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的序列，优选包含与选自组b1～组b3的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的序列，更优选包含与选自组b1和组b2的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的序列，最优选包含与选自组b1的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的序列。

该多肽可以包含选自组b1～组b4的氨基酸序列，优选包含选自组b1～组b3的氨基酸序列，更优选包含选自组b1和组b2的氨基酸序列，最优选包含选自组b1的氨基酸序列。

在至少一个反应条件下，本实施方式涉及的多肽对于前述由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐与前述由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或上述化合物B的任1个以上或其盐的分子内的还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。在一个方式中，在至少一个反应条件下，本实施方式涉及的多肽的前述催化活性比由序列编号17表示的氨基酸序列组成的多肽的前述催化活性高。

在一个方式中，在至少一个反应条件下，本实施方式涉及的多肽对于乙胺或其盐与苯基丙酮酸或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号17表示的氨基酸序列组成的多肽高。

在一个方式中，在至少一个反应条件下，本实施方式涉及的多肽对于乙胺或其盐与2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号17表示的氨基酸序列组成的多肽高。

在一个方式中，在至少一个反应条件下，本实施方式涉及的多肽对于甲胺或其盐与2-环戊基-2-氧代-乙酸或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号17表示的氨基酸序列组成的多肽高。

在一个方式中，在至少一个反应条件下，本实施方式涉及的多肽具有对于氨或其盐与苯基丙酮酸或其盐的还原氨基化反应的催化活性。

本实施方式涉及的多肽可以与其它多肽或蛋白质融合。即，本实施方式涉及的多肽在N末端和C末端的任一或两者可以具有，与由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列以外的氨基酸序列(其它氨基酸序列)。该其它氨基酸序列例如可以是标签序列。

作为具有该其它氨基酸序列的多肽或蛋白质，例如，列举由数个(例如6个、10个等)His(组氨酸)残基组成的标签His标签(6XHis、10XHis等)、包含具有链霉抗生物素蛋白对生物素的结合部位的结合能力的氨基酸序列的链霉抗生物素蛋白结合肽标签(SBP标签)、GST(谷胱甘肽S转移酶)、HA(流感凝集素)、免疫球蛋白恒定区、B-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)、FLAG(Hopp，T.P.et al.，BioTechnology(1988)6，1204-1210)、人c-myc的片段、VSV-GP的片段、p18HIV的片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原的片段、Ick标签、α-微管蛋白的片段、B-标签、ProteinC的片段、S标签、StrepTag、HaloTag等。His标签例如可以是由序列编号14表示的氨基酸序列。SBP标签例如可以是由序列编号15表示的氨基酸序列。

本实施方式涉及的多肽在N末端和C末端的任一或两者可以包含选自链霉抗生物素蛋白结合肽标签序列和His标签序列的1个以上，在C末端可以包含链霉抗生物素蛋白结合肽标签序列和His标签序列。接头序列例如可以具有由GGSS或GGS表示的氨基酸序列。作为包含链霉抗生物素蛋白结合肽标签序列、接头序列和His标签序列的氨基酸序列的一个实例，例如，列举由序列编号16表示的氨基酸序列。

本实施方式涉及的多肽可以具有上述氨基酸序列a1、a2、a3、a4或a5与标签序列。本实施方式涉及的多肽除氨基酸序列a1、a2、a3、a4或a5与标签序列还可以具有连接氨基酸序列a1、a2、a3、a4或a5与标签序列的接头序列。

一个实施方式涉及的多肽可以具有：

具有由序列编号6表示的、由X表示的氨基酸残基是缬氨酸残基的氨基酸序列a1(突变：M141V)、和在该氨基酸序列a1的C末端连接的由序列编号16表示的氨基酸序列的由序列编号18表示的氨基酸序列，

具有由序列编号6表示的、由X表示的氨基酸残基是酪氨酸残基的氨基酸序列a2(突变：M141Y)、和在该氨基酸序列a2的C末端连接的由序列编号16表示的氨基酸序列的由序列编号19表示的氨基酸序列，

具有由序列编号8表示的、由X表示的氨基酸残基是亮氨酸残基的氨基酸序列a3(突变：H182L)、和在该氨基酸序列a3的C末端连接的由序列编号16表示的氨基酸序列的由序列编号20表示的氨基酸序列，

具有由序列编号11表示的、由X表示的氨基酸残基是组氨酸残基的氨基酸序列a4(突变：W253H)、和在该氨基酸序列a4的C末端连接的由序列编号16表示的氨基酸序列的由序列编号21表示的氨基酸序列，或

具有由序列编号12表示的、由X表示的氨基酸残基是谷氨酸残基的氨基酸序列a5(突变：K260E)、和在该氨基酸序列a5的C末端连接的由序列编号16表示的氨基酸序列的由序列编号22表示的氨基酸序列。

由序列编号18、序列编号19、序列编号20、序列编号21、或序列编号22表示的氨基酸序列中1个以上的氨基酸残基可以被改变，1～20个、1～15个、1～10个、1～7个或1～5个的氨基酸残基可以被改变。在由序列编号18、序列编号19、序列编号20、序列编号21、或序列编号22表示的氨基酸序列中，被改变的氨基酸残基可以是3个以内，可以是2个以内，可以是1个。

一个实施方式涉及的多肽优选具有由序列编号36～44的任一表示的氨基酸序列。

一个实施方式涉及的多肽优选具有由序列编号45～62的任一表示的氨基酸序列。

本实施方式涉及的多肽可以作为与其它多肽的混合物应用，可以以分离/纯化的状态应用。在作为与其它多肽的混合物应用的情形中，可以经过分离/生成目标产物的步骤得到目标氨基酸。

在本实施方式涉及的多肽作为单体存在的情形中，氨基酸残基数可以是300以上、310以上、320以上、或325以上，可以是330。此外，在本实施方式涉及的多肽作为单体存在的情形中，氨基酸残基数可以是400以下、390以下、380以下、或375以下。

此外，在前述其它氨基酸序列不附加于N末端和C末端的任一的情形中，本实施方式涉及的多肽的氨基酸残基数可以是300以上、310以上、320以上、或325以上，可以是330。此外，在前述其它氨基酸序列不附加于N末端和C末端的任一的情形中，本实施方式涉及的多肽的氨基酸残基数可以是360以下、350以下、340以下、或335以下。

进一步，在前述其它氨基酸序列附加于N末端和C末端的任一或两者的情形中，本实施方式涉及的多肽的氨基酸残基数可以是340以上、350以上、360以上、或370以上，可以是374。此外，在前述其它氨基酸序列附加于N末端和C末端的任一或两者的情形中，本实施方式涉及的多肽的氨基酸残基数可以是400以下、390以下、380以下、或375以下。

另外，本实施方式涉及的多肽可以作为单体应用，可以以2个以上的单体彼此缔合的方式应用。进一步，本实施方式涉及的多肽可以是均二聚体。

在本实施方式涉及的多肽是均二聚体的情形中，氨基酸残基数是作为单体存在的情形的2倍。

在一个方式中，至少一个反应条件下，本实施方式涉及的多肽的前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

在一个方式中，本实施方式涉及的多肽的前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽高的温度存在于0℃以上且50℃以下的范围。

此外，本实施方式涉及的多肽在0℃以上且50℃以下的反应条件下的至少一点，可以具有对于化合物A的任1个以上或其盐与化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或前述化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性。前述温度的下限可以是0℃以上、10℃以上、20℃以上、或30℃以上。反应温度的上限可以是50℃以下、40℃以下、或30℃以下。反应温度例如可以是0℃以上且50℃以下、10℃以上且40℃以下、或20℃以上且30℃以下。此外，在一个方式中，前述温度可以是25℃，可以是37℃。反应温度可以逐步或连续变化。

在一个方式中，本实施方式涉及的多肽的前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽高的pH存在于7以上且11以下的范围。此外，本实施方式涉及的多肽在pH7以上且11以下的反应条件下的至少一点可以具有催化活性。前述pH的下限可以是7以上、7.5以上、8以上、或8.5以上。pH的上限可以是11以下、10以下、9.5以下、或9以下。pH例如可以是pH7以上且11以下、8以上且10以下、或8.5以上且9.5以下。此外，在一个方式中，pH可以是8，可以是9。另外，此处所述pH指反应开始时间点的pH，反应中容许pH变动。反应中的pH变动可以是2以内，可以是1.5以内，可以是1以内。

在一个方式中，本实施方式涉及的多肽在进行还原氨基化反应时的反应液总量中、反应开始时间点的前述化合物A和其盐的浓度的总计为100mM以上且3000mM以下的范围的至少一点，前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽高。在一个方式中，本实施方式涉及的多肽在37℃、pH8的反应条件下，具有比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高的前述催化活性。

在一个方式中，本实施方式涉及的多肽在25℃、pH9的反应条件下，具有比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高的前述催化活性。

此外，本实施方式涉及的多肽在化合物A和其盐的浓度的总计为100mM以上且3000mM以下的反应条件下可以具有催化活性。

前述化合物A和其盐的浓度的总计的下限可以是100mM以上、300mM以上、500mM以上、700mM以上、900mM以上、1100mM以上、1300mM以上、1500mM以上、或1700mM以上。化合物A和其盐的浓度的总计的上限可以是3000mM以下、2500mM以下、或2000mM以下。化合物A和其盐的浓度的总计可以是100mM以上且3000mM以下、或500mM以上且2000mM以下。此外，在一个方式中，化合物A和其盐的浓度的总计可以是500mM，可以是1750mM。上述化合物A和其盐的浓度的总计是进行还原氨基化反应时的反应液总量中、反应开始时间点的化合物A和其盐的浓度的总计。

在一个方式中，本实施方式涉及的多肽在进行还原氨基化反应时的反应液总量中、反应开始时间点的前述化合物B和其盐的浓度的总计为0.001mM以上且1000mM以下的范围的至少一点，前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽高。

此外，本实施方式涉及的多肽在化合物B和其盐的浓度的总计为10mM以上且500mM以下的反应条件下可以具有催化活性。前述化合物B和其盐的浓度的总计的下限可以是10mM以上、30mM以上、50mM以上、100mM以上、150mM以上、200mM以上、250mM以上、300mM以上、或330mM以上。化合物B和其盐的浓度的总计的上限可以是500mM以下、450mM以下、400mM以下、或380mM以下。化合物B和其盐的浓度的总计可以是10mM以上且500mM以下、或300mM以上且400mM以下。在一个方式中，化合物B和其盐的浓度的总计可以是50mM，可以是350mM。上述化合物B和其盐的浓度的总计是进行还原氨基化反应时的反应液总量中、反应开始时间点的化合物B和其盐的浓度的总计。

在一个方式中，本实施方式涉及的多肽在进行还原氨基化反应时的反应液总量中、反应开始时间点的、前述化合物A和其盐的摩尔数的总计相对于前述化合物B和其盐的摩尔数的总计的比是1以上时的至少1点，前述催化活性比前述具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的前述催化活性高。

此外，本实施方式涉及的多肽在化合物A和其盐的摩尔数的总计相对于化合物B和其盐的摩尔数的总计的比(化合物A和其盐的摩尔数的总计/化合物B和其盐的摩尔数的总计)是1以上的反应条件下可以具有催化活性。

化合物A和其盐的摩尔数的总计相对于前述化合物B和其盐的摩尔数的总计的比(化合物A和其盐的摩尔数的总计/化合物B和其盐的摩尔数的总计)可以是1以上、3以上、5以上、8以上、或9以上，可以是50以下、30以下、20以下、或15以下，可以是5或10。化合物A和其盐的摩尔数的总计相对于上述化合物B和其盐的摩尔数的总计的比是进行还原氨基化反应时的反应液总量中、反应开始时间点的化合物A和其盐的摩尔数的总计相对于化合物B和其盐的摩尔数的总计的比。

本实施方式涉及的多肽可以在氨基酸的制备方法中利用。该氨基酸的制备方法包括下列步骤：在上述多肽和还原剂的存在下使选自胺、胺类似物和它们的盐的1个以上、与选自酮酸、酮酸类似物和它们的盐的1个以上反应，或使选自酮酸、酮酸类似物和它们的盐的化合物在分子内反应。在分子内反应的情形中，酮酸和酮酸类似物可以具有伯氨基、或仲氨基。

此外，该氨基酸的制备方法中，可以在适当的条件下进行前述反应。此处，适当的条件指，在前述段落[0231]～[0241]中记载的温度、pH、反应开始时间点，反应溶液中的化合物A和其盐的浓度的总计、化合物B和其盐的浓度的总计、以及化合物A和其盐的摩尔数的总计相对于化合物B和其盐的摩尔数的总计的比等被适当设定的条件。

前述反应可以在包含胺或胺类似物、酮酸或酮酸类似物、上述多肽、和还原剂的反应液中进行。在一个方式中，可以使用化合物A作为胺或胺类似物。作为胺或胺类似物，可以是烷基胺或氨，烷基胺可以是C₁～C₆烷基胺或C₁～C₄烷基胺。更具体地，示例甲胺、乙胺、丙胺、和氨。在一个方式中，可以使用化合物B作为酮酸或酮酸类似物。作为酮酸或酮酸类似物，可以是式(2)中Y为C₃～C₈环烷基或C₆～C₉芳烷基。更具体地，示例2-环戊基-2-氧代-乙酸、苯基丙酮酸、和2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸。胺或胺类似物、和酮酸或酮酸类似物可以以盐的方式加入反应液。反应中使用的物质可以以任意顺序同时或分别混合。此外，该盐优选可以是化学或药学上容许的盐。该盐包含例如：盐酸盐；氢溴酸盐；氢碘酸盐；磷酸盐；膦酸盐；硫酸盐；甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等磺酸盐；乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、水杨酸盐等羧酸盐；或锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐；镁盐、钙盐等碱土金属盐；铵盐、烷基铵盐、二烷基铵盐、三烷基铵盐、四烷基铵盐等铵盐等。

作为还原剂，例如，列举还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。在一个实施方式中，还原剂可以是β-NADPH。

进一步，可以共同添加例如葡萄糖脱氢酶(GDH)和葡萄糖等、使NADP+和NAD+分别还原为NADPH和NADH的添加剂。

例如，由于在应用NADPH作为还原剂的情形中，可以抑制NADPH的使用量，在反应的步骤中，可以应用将反应液中生成得到的NADP⁺(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)还原为NADPH的反应剂。作为该反应剂，例如，列举葡萄糖与GDH(葡萄糖脱氢酶)的组合。在连同NADPH应用葡萄糖和GDH的情形中，可以将NADPH的使用量抑制为催化量。

反应开始时间点反应溶液中的还原剂的浓度例如可以是0.001mM～100mM、或0.01～10mM。

前述反应中，温度、pH、和各化合物的浓度等反应条件可以是上述条件。

氨基酸的制备方法可以在下述由式(4)表示的化合物C存在下进行还原氨基化反应。

[化学式45]

式(4)中，v和w分别独立地表示0或1，v和w中任1个以上表示1，T表示碳原子、磷原子或硫原子。

式(4)中，下述由式(4a)

[化学式46]

表示的官能团表示＝O、-ORd或羟基。此处，由式(4a)表示的官能团是＝O意味着T以双键与氧原子结合。即，由式(4a)表示的官能团是＝O，化合物C具有由T＝O表示的结构。由式(4a)表示的官能团是-ORd意味着T以单键与ORd结合。即，由式(4a)表示的官能团是-ORd，化合物C具有由T-ORd表示的结构。由式(4a)表示的官能团是羟基表示T与羟基直接结合。即，由式(4a)表示的官能团是-OH，化合物C具有由T-OH表示的结构。

式(4)中，在v和w都是1的情形中，多个存在的由式(4a)表示的2个官能团可以相同也可以不同。Ra、Rb和Rc分别独立地表示氢原子、C₁～C₃烷基、烷基氨基或-CH₂-ORd，Ra、Rb、和Rc中任2个以上可以与T共同彼此连接形成环结构。Rd表示C₁～C₃烷基。d、e和f分别独立地表示0或1，d、e和f中任一个以上表示1。

式(4)中，在v和w都是1的情形中，Ra、Rb和Rc的任1个以上是甲基，Ra、Rb和Rc均彼此连接不与T共同形成环结构。例如，在v和w都是1的情形中，T是硫原子，由式(4a)表示的官能团均为＝O，f是0，Ra和Rb的至少一个可以是甲基。

在Ra、Rb和Rc的任1个以上是甲基氨基的情形中，Ra、Rb和Rc均彼此连接不与T共同形成环结构。在由式(4a)表示的官能团是羟基、并且T是碳原子的情形中，v是1，w是0，d、e和f均为1，Ra、Rb和Rc均为氢原子。

化合物C可以是式(1)中T为碳原子、下述由式(4-1)表示的化合物。

[化学式47]

由式(4-1)表示的化合物可以是v为1、w为0的下述由式(4-1a)表示的化合物。

[化学式48]

式(4-1a)中，在由式(4a)表示的官能团是＝O的情形中，d、e和f中的2个是1，其它是0。在由式(4a)表示的官能团是＝O的情形中，由式(4-1a)表示的化合物可以是d和e为1、并且f为0、下述由式(4-1b)表示的化合物。

[化学式49]

由式(4-1b)表示的化合物可以是Ra和Rb的一个为氢原子或C₁～C₃烷基、并且另一个为烷基氨基的化合物。此外，烷基氨基可以是单甲基氨基或二甲基氨基。例如，由式(4-1b)表示的化合物可以是N,N二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、或N-甲基甲酰胺。

式(4-1a)中，在由式(4a)表示的官能团是羟基的情形中，d、e和f均为1。在由式(4a)表示的官能团是羟基的情形中，由式(4-1a)表示的化合物可以是d、e和f均为1、下述由式(4-1c)表示的化合物。

[化学式50]

Ra、Rb和Rc可以分别独立地是氢原子、或C₁～C₃烷基。由式(4-1c)表示的化合物可以是Ra、Rb和Rc均为氢原子的甲醇。

式(4-1a)中，在由式(4a)表示的官能团是-ORd的情形中，可为d、e和f均为1、Rb和Rd均为氢原子。在由式(4a)表示的官能团是-ORd的情形中，由式(4-1a)表示的化合物可以是d、e和f均为1、Rb和Rd均为氢原子、下述由式(4-1d)表示的化合物。下述由式(4-1d)表示的化合物中，Ra可以是-CH₂-ORd。下述由式(4-1d)表示的化合物可以是Ra为-CH₂-ORd、Rd均为-CH₃的二甲氧基乙烷。

[化学式51]

化合物C可以是式(4)中的T为磷原子、下述由式(4-2)表示的化合物。

[化学式52]

由式(4-2)表示的化合物可以是v是1、w是0、由式(4a)表示的官能团是＝O、下述由式(4-2a)表示的化合物。

[化学式53]

式(4-2a)中，Ra、Rb和Rc可以均为C₁～C₃烷基。由式(4-2a)表示的化合物可以是Ra、Rb和Rc均为甲基的三甲基氧化膦。

化合物C可以是式(4)中的T是硫原子、下述由式(4-3)表示的化合物。

[化学式54]

由式(4-3)表示的化合物可以是v为1、w为0、由式(4a)表示的官能团为＝O、d和e均为1、f为0、下述由式(4-3a)表示的化合物。

[化学式55]

式(4-3a)中，Ra和Rb可以均为C₁～C₃烷基，Ra和Rb任选彼此连接与硫原子(S)共同形成环结构。

由式(4-3a)表示的化合物可以是Ra和Rb分别独立地为甲基或乙基。由式(4-3a)表示的化合物可以是Ra和Rb均为甲基的二甲基亚砜、或Ra和Rb均为乙基的二乙基亚砜。由式(4-3a)表示的化合物可以是Ra和Rb均为C₁～C₃烷基、该烷基相互彼此连接与S共同形成环结构的四亚甲基亚砜。

由式(4-3)表示的化合物可以是v和w均为1、由式(4a)表示的官能团为＝O、d和e均为1、f为0、下述由式(4-3b)表示的化合物。

[化学式56]

由式(4-3b)表示的化合物的Ra和Rb的任1个以上是甲基。由式(4-3b)表示的化合物可以是Ra和Rb均为甲基的二甲基砜。

由于化合物C可以收率更好地制备氨基酸，可以是选自二甲基亚砜、二甲基砜、三甲基氧化膦、二甲氧基乙烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四亚甲基亚砜、二乙基亚砜、甲醇和甲基甲酰胺的1个以上的化合物。由于化合物C可以收率更好地制备氨基酸，可以是选自二甲基亚砜、二甲基砜和三甲基氧化膦的1个以上，可以是二甲基亚砜。

化合物C在25℃和1个大气压的条件下可以是液体或固体，由于氨基酸的制备效率更提高，在25℃和1个大气压的条件下可以是液体。作为在25℃和1个大气压的条件下是液体的化合物，列举二甲基亚砜、二甲氧基乙烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、甲醇和N-甲基甲酰胺。

氨基酸的制备方法可以包括以下的步骤(A)和(B)。

步骤(A)；使纯化对象物接触含锂物质的步骤，该纯化对象物是通过上述方法得到的为纯化目标物的以下(i)与为杂质的以下(ii)的混合物，

(i)在N末端具有保护基的前述氨基酸

(ii)前述纯化目标物以外的化合物，

步骤(B)；使前述纯化目标物的锂盐析出的步骤。

本发明的另一实施方式是从纯化对象物除去杂质的方法，其包括上述步骤(A)和(B)。

本发明的又另一实施方式是氨基酸的锂盐或它们的溶剂化物，上述氨基酸的锂盐是以纯度99摩尔％以上或表观纯度99％以上含有下述由通式(5)表示的氨基酸的锂盐的氨基酸的锂或它们的溶剂化物。

[化学式57]

前述通式(5)中，n5表示1以上且3以下的数目，R^5a存在多个时，R^5a任选彼此相同也可以不同，R^5a和R^5b分别独立地表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基或选自这些取代基的2个以上结合的取代基，这些基团可以具有取代基，这些基团可以是饱和烃基或不饱和烃基，A表示碳原子，B表示氢原子或与氨基酸或肽化合物的结合点，Z⁵表示芴基甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙基氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基，R^5a和R^5b可以与N和A共同结合形成环，该情形中，R^5a和R^5b是无关环形成的情形中从取代基的结构除去1个氢原子的结构的取代基，在n5是2的情形中，R^5b和2个存在的R^5a中任1个以上不是氢原子。

以往，在纯化上述纯化目标物的情形中，以高纯度纯化它们是困难的。通常，纯化目标物可以用作肽化合物和蛋白质合成等的原料。得到高纯度的肽化合物和蛋白质在它们是药品的情形中由于抑制杂质引起的副作用而重要。即，以高纯度纯化构成它们的原料是重要的。本发明人深入研究，结果令人惊讶地新发现，通过将纯化目标物转化为锂盐，可以高纯度地纯化，使纯化目标物的有用性、应用它们的肽化合物和蛋白质合成中的有用性进一步提高。

本发明中氨基酸的盐或它们的溶剂化物、更优选氨基酸的盐、更进一步优选氨基酸的锂盐通过经步骤(A)和步骤(B)处理纯化对象物得到。本说明书中的纯化对象物是前述纯化目标物与前述杂质的混合物。本说明书中的纯化目标物指N末端具有保护基的前述氨基酸。作为前述纯化目标物，示例前述由通式(5)表示的氨基酸。此外，本说明书中的前述杂质指前述纯化对象物中包含的、前述纯化目标物以外的化合物。作为前述杂质，列举准特定杂质(纯化目标物以外的、N末端具有保护基的氨基酸)。更具体地，示例β-丙氨酸或其衍生物。本说明书中的衍生物指将某有机化合物作为母体考虑时、进行官能团的导入、氧化、还原、原子的置换等不大幅改变母体结构或性质程度的改变的化合物，作为β-丙氨酸的衍生物，示例特定杂质(N末端具有保护基的β-丙氨酸)。

步骤(A)是使纯化对象物接触含锂物质的步骤。此外，通过步骤(A)可以形成前述纯化目标物的锂盐，可以形成前述杂质的锂盐。步骤(B)是使纯化目标物的锂盐析出的步骤。此外，步骤(A)的一部分和步骤(B)的一部分也可以在时间上重复进行。另外，步骤(A)之前，可以用本发明以外的方法纯化前述纯化对象物。例如，也可以不形成纯化目标物的锂盐、通过将纯化目标物以游离状态析出而纯化。步骤(A)和步骤(B)的至少一个可以在溶剂存在下进行，本说明书中从溶剂中生成固体称为“析出”。

纯化目标物的保护基可以是氨基甲酸酯基。氨基甲酸酯基指芴基甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙基氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基，可以是芴基甲氧基羰基、叔丁氧基羰基或苄氧基羰基，可以是芴基甲氧基羰基或苄氧基羰基，可以是芴基甲氧基羰基，可以是苄氧基羰基。

杂质的保护基可以是氨基甲酸酯基。氨基甲酸酯基指芴基甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙基氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基，可以是芴基甲氧基羰基、叔丁氧基羰基或苄氧基羰基，可以是芴基甲氧基羰基或苄氧基羰基，可以是芴基甲氧基羰基，可以是苄氧基羰基。这些保护基可以是保护杂质的N末端的保护基。

纯化目标物的保护基与杂质的保护基可以不同也可以相同。纯化目标物的保护基与前述杂质的保护基优选相同。

步骤(A)可以在第一有机溶剂存在下进行。从有效进行纯化目标物与含锂物质的接触的观点出发，第一有机溶剂是可以溶解纯化目标物的溶剂。前述纯化目标物对于第一有机溶剂的溶解度优选20g/L以上。前述纯化目标物的锂盐对于第一有机溶剂的溶解度优选20g/L以下。前述杂质对于第一有机溶剂的溶解度优选20g/L以上。

作为第一有机溶剂，示例选自下列的至少1种：乙腈等腈类，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-2-丙醇、乙二醇等醇类，四氢呋喃、1,4-二噁烷、2-甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚、二异丙基醚、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷等醚类，丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮等酮类，二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮等酰胺类，1,3-二甲基-2-咪唑啉酮等脲类，二甲基亚砜等亚砜类，环丁砜等砜类，庚烷、甲基环己烷、己烷、环己烷、戊烷等烷烃类，苯、甲苯、1,2-二甲基苯、1,3-二甲基苯、1,4-二甲基苯等芳香族化合物类，乙酸乙酯、乙酸异丙酯等酯类，二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等卤代烷基类。第一溶剂的种类可以是多个，但从步骤(A)的简化的观点出发，优选1种。

步骤(A)可以在水的存在下进行。

步骤(B)可以在第二有机溶剂存在下进行。第二有机溶剂是纯化目标物的锂盐的溶解度小的溶剂、即作为纯化目标物的锂盐的不良溶剂起作用的溶剂。前述纯化目标物的锂盐对于第二有机溶剂的溶解度优选10g/L以下。

作为第二有机溶剂，示例选自下列的至少1种：乙腈等腈类，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-2-丙醇、乙二醇等醇类，四氢呋喃、1,4-二噁烷、2-甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚、二异丙基醚、二乙基醚、1,2-二甲氧基乙烷等醚类，丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮等酮类，二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮等酰胺类，1,3-二甲基-2-咪唑啉酮等脲类，二甲基亚砜等亚砜类，环丁砜等砜类，庚烷、甲基环己烷、己烷、环己烷、戊烷等烷烃类，苯、甲苯、1,2-二甲基苯、1,3-二甲基苯、1,4-二甲基苯等芳香族化合物类，乙酸乙酯、乙酸异丙酯等酯类，二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等卤代烷基类。第二溶剂的种类可以是多个，但从步骤(B)的简化的观点出发，优选1种。

步骤(B)可以在水的存在下进行，从使杂质的锂盐溶解的观点出发，优选在水的存在下进行。杂质的锂盐对于水的溶解度优选10g/L以上。

第二有机溶剂在步骤(A)中可以与第一有机溶剂共同应用。

在步骤(B)中，使前述纯化目标物的锂盐析出。析出时，通过添加前述第二有机溶剂、使其比例增加，可以促进前述纯化目标物的锂盐的析出。在增加前述第二有机溶剂的比例的情形中，在步骤(A)中应用的前述第一有机溶剂中添加前述第二有机溶剂即可。

此外，前述第一有机溶剂的比例或第二有机溶剂的比例意味着，通过前述第一有机溶剂或第二有机溶剂的体积除以纯化目标物的质量计算的体积/质量比(ml/g，以下也称为v/w)。

此外，在前述纯化目标物的锂盐对于步骤(A)中应用的前述第一有机溶剂的溶解度非常小的情形中，前述第一有机溶剂和前述第二有机溶剂可以是相同溶剂。该情形中，不必在步骤(B)中添加前述第二有机溶剂。该情形中，步骤(A)中使前述纯化目标物接触前述含锂物质时迅速开始步骤(B)，纯化目标物的锂盐析出。

纯化目标物的锂盐优选作为固体析出。此处所述固体包含晶体或非晶体。此外，更优选作为晶体析出(晶析)。该情形中，步骤(B)也可以称为使纯化目标物的锂盐晶析的步骤。

前述第一有机溶剂相对于前述纯化对象物1g的容量通过步骤(A)和步骤(B)可以是1ml以上、2ml以上或3ml以上，可以是100ml以下、80ml以下、60ml以下或40ml以下。前述第一有机溶剂相对于前述纯化对象物1g的容量通过步骤(A)和步骤(B)可以是1ml以上且100ml以下、1ml以上且80ml以下、2ml以上且60ml以下或3ml以上且40ml以下。

在步骤(A)结束时，前述第一有机溶剂相对于前述纯化对象物1g的容量(第一有机溶剂的初始浓度)在步骤(B)中增加第二有机溶剂的比例的情形中可以是1ml以上、2ml以上或3ml以上，可以是50ml以下、40ml以下、30ml以下或20ml以下。第一有机溶剂的初始浓度可以是1ml以上且50ml以下、1ml以上且40ml以下、2ml以上且30ml以下或3ml以上且20ml以下。

步骤(A)结束时，前述第一有机溶剂相对于前述纯化对象物1g的容量(第一有机溶剂的初始浓度)在步骤(B)中不增加第二有机溶剂的比例的情形中可以是1ml以上、10ml以上、20ml以上或30ml以上、35ml以上，可以是100ml以下、75ml以下或50ml以下或37ml以下。第一有机溶剂的初始浓度可以是1ml以上且100ml以下、10ml以上且75ml以下、20ml以上且50ml以下、30ml以上且37ml以下或35ml以上且37ml以下。

第二有机溶剂相对于纯化对象物1g的容量通过步骤(A)和(B)可以是0ml以上，可以是40ml以下、60ml以下、80ml以下或100ml以下。第二有机溶剂相对于纯化对象物1g的容量通过步骤(A)和(B)可以是0ml以上且100ml以下、0ml以上且80ml以下、1ml以上且60ml以下或1ml以上且40ml以下。

步骤(B)结束时，第二有机溶剂相对于纯化对象物1g的容量可以是0ml以上，可以是40ml以下、60ml以下、80ml以下、或100ml以下。步骤(B)结束时，第二有机溶剂相对于纯化对象物1g的容量可以是0ml以上且100ml以下、0ml以上且80ml以下、0ml以上且60ml以下或0ml以上且40ml以下。

前述水相对于前述纯化对象物1g的容量通过步骤(A)和(B)可以是0.1ml以上、0.3ml以上或0.5ml以上，可以是50ml以下、30ml以下、10ml以下或5ml以下。溶剂中的水的容量通过步骤(A)和(B)可以是0.1ml以上且50ml以下、0.1ml以上且30ml以下、0.3ml以上且10ml以下或0.5ml以上且5ml以下。

步骤(A)结束时，前述水相对于前述纯化对象物1g的容量(水的初始浓度)可以是0.1ml以上、0.3ml以上或0.5ml以上，可以是50ml以下、30ml以下、10ml以下或4ml以下。水的初始浓度可以是0.1ml以上且50ml以下、0.1ml以上且30ml以下、0.3ml以上且10ml以下或0.5ml以上且4ml以下。

在步骤(B)结束时，前述水相对于前述纯化对象物1g的容量(水的初始浓度)可以是0.1ml以上、0.3ml以上或0.5ml以上，可以是50ml以下、30ml以下、10ml以下或4ml以下。水的初始浓度可以是0.1ml以上且50ml以下、0.1ml以上且30ml以下、0.3ml以上且10ml以下或0.5ml以上且4ml以下。

步骤(A)和步骤(B)可以在第一有机溶剂和第二有机溶剂以外的其它溶剂的存在下进行。作为其它溶剂，示例磷酸缓冲液、CHES(N-环己基-2-氨基乙烷磺酸)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、Bicine(N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸)等缓冲液。

进行步骤(A)的温度可以是-20℃以上，可以是0℃以上，可以是10℃以上，可以是20℃以上。进行步骤(A)的温度可以是100℃以下，可以是80℃以下，可以是60℃以下，可以是40℃以下，可以是30℃以下。进行步骤(A)的温度可以是-20～100℃，可以是0～80℃，可以是10～60℃，可以是10～40℃，可以是20～30℃。

进行步骤(B)的温度可以是-20℃以上，可以是0℃以上，可以是10℃以上，可以是20℃以上，可以是30℃以上，可以是35℃以上。进行步骤(B)的温度可以是100℃以下，可以是80℃以下，可以是60℃以下，可以是40℃以下，可以是30℃以下。进行步骤(A)的温度可以是-20～100℃，可以是0～80℃，可以是10～60℃，可以是10～40℃，可以是20～30℃。

在步骤(A)和步骤(B)中，温度、各种溶液中包含的物质的浓度等各条件可以相同也可以不同。在两者中这些各条件不同的情形中，可以组合选自上述步骤(A)的各种条件的条件。此外，前述步骤(A)结束时间点的前述含锂物质的物质量以纯化目标物的物质量为基准可以是0.5当量以上、0.8当量以上或1.0当量以上，可以是2.0当量以下、1.5当量以下或1.1当量以下。以前述纯化目标物的物质量为基准的含锂物质的物质量可以是0.5当量以上且2.0当量以下、0.8当量以上且1.5当量以下或1.0当量以上且1.1当量以下。

另外，本说明书中的前述含锂物质指步骤(A)中用于与前述纯化目标物接触的、含有锂的物质。作为步骤(A)中应用的含锂物质，例如，列举选自氢氧化锂、叔丁醇锂、氢氧化锂、碳酸锂、氢化锂、磷酸3锂、甲醇锂、乙醇锂、异丙醇锂、叔丁醇锂、甲基锂、正丁基锂、仲丁基锂、叔丁基锂、氨基锂、二异丙基氨基锂、六甲基二硅基氨基锂、四甲基哌啶锂的至少1种。

使纯化对象物接触含锂物质的方法没有限制，可以使纯化对象物和含锂物质在第一有机溶剂存在下接触。该情形中，纯化对象物、含锂物质和第一有机溶剂可以从开始在同一容器中混合，可以将纯化对象物与第一有机溶剂混合、在得到的混合液中添加含锂物质，可以将含锂物质与第一有机溶剂混合、在得到的混合液中添加纯化对象物。

另外，为确定第一有机溶剂、第二有机溶剂和含锂物质的量时的基准的、纯化对象物中的纯化目标物的含量可以是实测值、推定值或计算值，优选实测值或计算值，最优选实测值。

作为纯化目标物中包含的、在N末端具有保护基的氨基酸或构成在N末端具有保护基的肽化合物的氨基酸，列举前述由通式(5)表示的氨基酸(也称为氨基酸(1)。)、疏水性氨基酸、脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸等。

n5表示1以上且3以下的数目，可以是1以上且3以下的整数。n5可以是1、2或3。在n5是2的情形中，R^5b和2个存在的R^5a中任1个以上不是氢原子，R^5b和2个存在的R^5a中2个以上可以不是氢原子，R^5b和2个存在的R^5a的3个都可以不是氢原子。

R^5a和R^5b表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基或选自这些取代基的2个以上结合的取代基(例如苄基等)，这些基团可以具有取代基，这些基团可以饱和或不饱和。

A表示碳原子，B表示氢原子或与氨基酸或肽化合物的结合点。

Z⁵表示芴基甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙基氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基。

R^5a和R^5b可以与N和A共同结合形成环。该情形中，R^5a和R^5b是无关环形成的情形中从取代基的结构除去1个氢原子的结构的取代基。

在步骤(B)中，纯化结果物可以析出使得步骤(B)中得到的析出物(纯化结果物)中包含的准特定杂质的含量减少。在步骤(B)中，纯化结果物可以析出使得纯化结果物的纯度是95摩尔％以上。前述纯度更优选96摩尔％以上，进一步优选97摩尔％以上，更进一步优选98摩尔％以上，特别优选99摩尔％以上，最优选100摩尔％。本说明书中的“纯度”广义地意味着为测定纯度的对象的物质中包含的、目标物质的存在比例，狭义地意味着纯化结果物中包含的、以纯化目标物的锂盐和特定杂质的锂盐的物质量的总计为基准的、纯化目标物的锂盐的物质量的比例。

在步骤(B)中，纯化结果物可以析出使得纯化结果物中的杂质含有率为5摩尔％以下。前述杂质含有率优选4摩尔％以下，更优选3摩尔％以内，进一步优选2摩尔％以内，特别优选1摩尔％以内，最优选0摩尔％。本说明书中的“杂质含有率”意味着纯化结果物中包含的、以纯化目标物的锂盐和特定杂质的锂盐的物质量的总计为基准的、特定杂质的锂盐的物质量。

纯度或杂质含有率例如可以通过核磁共振装置、气相色谱、或高效液相色谱测定。在应用高效液相色谱的情形中，可以通过UV吸收峰的面积比计算。下述式1a显示求得纯度的式，下述式2a显示求得杂质含有率的式。

[数学式1]

[数学式2]

此处，每单位UV吸收峰面积的物质量是物质量除以纯化目标物或特定杂质的UV吸收峰面积的值。

在步骤(B)中，纯化结果物可以析出使得纯化结果物的表观纯度是95％以上。表观纯度更优选96％以上，进一步优选97％以上，更进一步优选98％以上，特别优选99％以上，最优选100％。本说明书中的“表观纯度”意味着，以将纯化结果物用高效液相色谱分离为纯化目标物和特定杂质后测定的两者的特定波长中UV吸收峰面积的总计为基准的、纯化目标物的前述特定波长的UV吸收峰面积的比例。

在步骤(B)中，纯化结果物可以析出使得纯化结果物的表观杂质含有率是5％以下。表观杂质含有率优选4％以下，更优选3％以内，进一步优选2％以内，特别优选1％以内，最优选0％。本说明书中的“表观杂质含有率”意味着，以将纯化结果物用高效液相色谱分离为纯化目标物和特定杂质后测定的两者的特定波长中UV吸收峰面积的总计为基准的、特定杂质在特定波长的UV吸收峰面积的比例。

下述式1b显示求得表观纯度的式，下述式2b显示求得表观杂质含有率的式。

[数学式3]

[数学式4]

本说明书中的特定波长是自纯化目标物具有的保护基显示的极大吸收波长前后10％以内的波长。此外，在存在多个极大吸收波长的情形中，以其中的最大吸收波长的吸收强度为基准，只要是显示30％以上的吸收强度的极大吸收波长，则可以选择任一个作为极大吸收波长。此外，通过在多个存在的极大吸收波长内选择长波长侧，可以减轻噪声的影响。此外，可以相应于选择的极大吸收波长的吸收强度调整样本浓度。测定时，从样本浓度的调整的容易性和噪声减轻的观点出发，可以选择认为最优选的极大吸收波长。

例如，若为Fmoc基则可将254nm、若为Boc基则可将197nm、若为Cbz基则可将210nm的UV光作为特定波长的UV光。

在一个实施方式涉及的制备方法中，通过得到锂盐，可以减少纯化对象物中β-丙氨酸或其衍生物的含有率。换言之，本实施方式涉及的制备方法可以具备减少β-丙氨酸或其衍生物的含有率的步骤。

本实施方式涉及的制备方法可以进一步具备成为锂盐以外的盐的步骤。具体地，例如，可以将通过一个实施方式涉及的制备方法得到的锂盐脱盐，得到游离体的氨基酸或游离体的肽化合物。脱盐可以通过已知的方法进行。进一步，可以从得到的游离体的氨基酸或肽化合物制备锂盐以外的盐。作为锂盐以外的盐，可以示例：与盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐；与乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、硬脂酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸等有机酸的盐；与碱金属(钠或钾)的盐；与钙、镁等碱土金属的盐；铵盐等。

本实施方式涉及的多肽可以在肽化合物的制备方法中利用。

在一个方式中，该肽化合物的制备方法可以包括以下的步骤。

(1)通过上述方法制备氨基酸或氨基酸衍生物的步骤；和

(2)将前述氨基酸与选自其它氨基酸和肽的1个以上连接的步骤。

前述步骤(2)可以在“SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS”(https://www.bachem.com/wpfd_file/solid-phase-peptide-synthesis/,2002363published byGlobal Marketing,Bachem AG,December 2019)中记载的条件下实施。

前述反应可以在水性介质中或水性介质与有机溶剂的混合液中进行。水性介质可以是水或缓冲液。作为缓冲液，列举磷酸缓冲液、CHES(N-环己基-2-氨基乙烷磺酸)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、Bicine(N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸)。作为有机溶剂，例如，列举二甲基亚砜。

通过本实施方式涉及的肽化合物的制备方法得到的肽化合物例如可以是具有环状部分的肽化合物(环状肽化合物)。

本实施方式涉及的环状肽化合物的氨基酸残基数可以是30以下、25以下、20以下、15以下、14以下、13以下、12以下、11以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下或2以下。此外，本实施方式涉及的环状肽化合物可以是由2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、11个以上、12个以上、13个以上、14个以上、或15个以上的氨基酸组成的肽化合物。此外，本实施方式涉及的环状肽化合物的氨基酸残基数可以是2以上且10以下、2以上且8以下、2以上且6以下、或2以上且4以下。此外，本实施方式涉及的环状肽化合物的氨基酸残基数可以是5以上且30以下、7以上且25以下、8以上且15以下、9以上且14以下、10以上且13以下、或11。

环状肽化合物的“环状部分”意味着2个以上的氨基酸残基连接形成的环状的部分。构成环状肽化合物的环状部分的氨基酸残基数可以是5以上且14以下、6以上且14以下、7以上且14以下、8以上且14以下、9以上且14以下、10以上且14以下、5以上且13以下、6以上且13以下、7以上且13以下、8以上且13以下、9以上且13以下、10以上且13以下、5以上且12以下、6以上且12以下、7以上且12以下、8以上且12以下、9以上且12以下、10以上且12以下、5以上且11以下、6以上且11以下、7以上且11以下、8以上且11以下、9以上且11以下、10以上且11以下、或11。环状部分优选经由酰胺键、碳-碳键、S-S键、硫醚键、三唑键等共价键形成，可以使氨基酸残基连接的直链状的肽化合物的N末端侧的基团与C末端侧的基团结合而形成。具体地，例如，可以使氨基酸残基连接的直链状的肽化合物的N末端侧的氨基与C末端侧的羧基结合而形成。环化可以是如酰胺键的通过碳-氮键环化、如酯键和醚键的通过碳-氧键环化、如硫醚键的通过碳-硫键环化、通过碳-碳键环化、通过硫-硫键环化、或通过杂环构建环化等任何形式。它们之中，优选经由酰胺键和碳-碳键等共价键环化，更优选经由通过侧链的羧基和主链的氨基的酰胺键环化。环化中应用的羧基和氨基等的位置可以是主链上的那种，也可以是侧链上的那种，只要是可环化的位置，则没有特别限制。

本实施方式涉及的环状肽化合物的环原子数可以是15以上且46以下。本说明书中的“环原子数”意味着包含环的最内侧部分的环式化合物的原子(环原子)的数目，在化合物具有多个环的情形中定义为该原子的数目最多的环的该原子的数目。另外，在2个环共有一部分原子而存在的情形中，使用共有的原子的数目小的那个，计算各个环的环原子数。关于“环原子数”用具体实例进一步说明时，例如，应用该方法时，四氢呋喃(THF)的环原子数是5，他克莫司(FK506)的环原子数是21。

本实施方式涉及的环状肽化合物的环原子数例如可以是34以上且46以下、34以上且43以下、34以上且40以下、34以上且37以下、34以上且36以下、或34。环原子数的计算中使用的环原子可以选自碳原子、氢原子、氮原子、氧原子、硫原子、磷原子、和硅原子，也可以选自碳原子、氢原子、氮原子、和氧原子。

本实施方式涉及的环状肽化合物除环状部分还可以具有直链部分。环状肽化合物的氨基酸残基数的具体的方式与上述肽化合物的氨基酸残基数的具体的方式同样。在环状肽化合物具有直链部分的情形中，合并环状部分与直链部分的氨基酸残基数优选在相同范围内。此外，在环状肽化合物具有直链部分的情形中，构成环状部分的氨基酸残基数优选5以上且15以下、6以上且15以下、6以上且14以下、7以上且14以下、8以上且14以下、7以上且13以下，更优选7以上且12以下、8以上且11以下，进一步优选9以上且11以下，特别优选10或11，构成直链部分的氨基酸残基数优选1以上且8以下、1以上且7以下、1以上且6以下、1以上且5以下、1以上且4以下，更优选1以上且3以下。

本实施方式涉及的环状肽化合物的分子量没有特别限定，例如，可以是500以上、550以上、600以上、650以上、700以上、750以上、800以上、850以上、900以上、950以上，优选1000以上、1100以上、1200以上、1300以上、或1400以上。作为本实施方式涉及的肽化合物的分子量的上限，没有特别限定，优选5000以下、4000以下、3000以下、2500以下、2000以下。本说明书中的分子量意味着构成化合物分子的原子的原子量的总和(单位：“g/mol”)，通过计算分子结构式中包含的原子的原子量的总和得到(单位“g/mol”)。本说明书中有时省略分子量的单位。另外，肽化合物的分子量可以通过实施例中记载的液相色谱质谱分析(LC/MS)测定。

本实施方式涉及的环状肽化合物可以包含1个或多个N取代氨基酸残基，优选包含至少3个N取代氨基酸残基，更优选包含至少4个N取代氨基酸残基，进一步优选包含至少5个N取代氨基酸残基。N取代氨基酸残基可以在N取代环状肽化合物中连续存在，也可以不连续存在。

本发明的一个实施方式是编码上述多肽的DNA。该DNA包含例如基因组DNA、cDNA和基于它们人为产生的DNA的任一种。基因组DNA包含外显子和内含子。即，基因组DNA可以包含也可以不包含内含子，此外，可以包含也可以不包含非翻译区(5’UTR和/或3’UTR)、转录调节区等。此外，cDNA可以包含来源于内含子序列的一部分的核酸序列，其为编码氨基酸序列的核酸序列。此外，该DNA还包含由只要编码相同氨基酸的密码子则为任何密码子构成的缩聚多核苷酸。本实施方式涉及的DNA可以是来自希望的生物的DNA。

本实施方式涉及的DNA可以通过任何方法得到。例如，由mRNA制备的互补(cDNA)、由基因组DNA制备的DNA、通过化学合成得到的DNA、以RNA或DNA为模板用PCR法扩增得到的DNA和将这些方法适当组合构建的DNA全部包含在内。本实施方式涉及的DNA可以根据常规方法，通过从编码上述多肽的基因组DNA或RNA克隆该DNA、导入突变等制备。

例如，作为从编码本实施方式涉及的DNA所编码的上述多肽的mRNA克隆cDNA的方法，首先，根据常规方法，从表达和产生上述多肽的任意组织或细胞制备编码该多肽的mRNA。例如，可以将应用硫氰酸胍法、热酚法或AGPC(Acid guanidium-Phenol-Chloroform)法等方法配制的总RNA通过经寡聚(dT)纤维素或聚U-sepharose等进行亲和色谱来进行。

然后，以得到的mRNA为模板，通过例如应用逆转录酶等公知的方法(Mil.Cell.Biol.，Vol.2,p.161,1982；Mol.Cell.Biol.，Vol.3,p.280，1983；gene，Vol.25，p.263,1983)等合成cDNA链，将cDNA转换为双链cDNA，将该cDNA整合到质粒载体、噬菌体载体或粘粒载体等，转化大肠杆菌，或者体外包装后，通过转染(转染)大肠杆菌，制备cDNA文库。

通过应用制备的cDNA文库，将本实施方式涉及的DNA或其一部分作为探针进行筛选，可以取得目标基因。或者，也可以应用本实施方式涉及的DNA或其一部分作为引物，通过PCR直接扩增。探针和引物的部位和长度可以适当确定。

本发明的一个实施方式是具有上述DNA的重组载体。作为该重组载体，只要在原核细胞和/或真核细胞的任一宿主内可保持复制或自身增殖的那种则没有特别限制，包括质粒载体、噬菌体载体、和病毒载体等。

作为克隆用载体，例如，示例pUC19、λgt10、λgt11等。另外，在分离可在宿主细胞内表达本实施方式涉及的多肽的细胞的情形中，优选可表达本实施方式涉及的DNA的具有启动子的载体。

作为重组载体，可以简单地通过将编码本实施方式涉及的多肽的DNA通过常规方法与本行业可获得的重组用载体(质粒DNA和噬菌体DNA)连接而配制。

作为应用的重组用载体，例如，示例来自大肠杆菌的质粒(pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19等)、来自酵母的质粒(pSH19、pSH15等)、来自枯草芽孢杆菌的质粒(pUBl10、pTP5、pC194等)。

此外，作为噬菌体，示例λ噬菌体等噬菌体，进一步示例逆转录病毒、牛痘病毒、核多角体病毒、慢病毒等动物或昆虫的病毒(pVL1393、Invitrogen制)。

在表达编码本实施方式涉及的多肽的DNA、生产上述多肽的目的中，表达载体是有用的。作为表达载体，只要具有在原核细胞和/或真核细胞的任一宿主细胞中表达编码上述多肽的DNA、生产这些多肽的功能，则没有特别限制。

例如，可以列举pMAL C2、pEF-BOS(NucleicAcid Research，Vol.18，1990，p.5322等)或者pME18S(实验医学別册“基因工程手册”、1992年等)等。

在应用细菌、特别大肠杆菌作为宿主细胞的情形中，重组载体优选至少包含启动子-操纵子区、起始密码子、编码上述多肽的DNA、终止密码子、终止子区和可复制单元。

在应用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主的情形中，重组载体优选至少包含启动子、起始密码子、编码上述多肽的DNA、和终止密码子。

重组载体可以包含编码信号肽的DNA、增强子序列、编码上述多肽的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、剪接接合部位、多腺苷酸化部位、选择标记物区或可复制单元等。

重组载体按需要可以包含可选择基因扩增和转化的宿主的标记物基因(基因扩增基因、耐药基因等)。

作为标记物基因，例如，可以示例二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、胸苷激酶基因、新霉素抗性基因、谷氨酸合成酶基因、腺苷脱氨酶基因、鸟氨酸脱羧酶基因、潮霉素-B-磷酸转移酶基因、天冬氨酸转氨甲酰酶基因等。

用于在细菌中表达上述多肽的启动子-操纵子区可以包含启动子、操纵子和Shine-Dal garno(SD)序列(例如，AAGG等)。

在宿主是埃希氏菌属菌的情形中，作为启动子，例如，列举Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lPP启动子、tac启动子等。

作为用于在酵母中表达上述多肽的启动子，列举PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子。在宿主是芽孢杆菌属菌的情形中，列举SLO1启动子、SP02启动子、penP启动子等。

在宿主是哺乳动物细胞等真核细胞的情形中，作为启动子，列举来自SV40的启动子、来自逆转录病毒的启动子、热休克启动子等。优选SV40、逆转录病毒。但是，启动子不特别限于这些。此外，表达中利用增强子也是有效的方法。

作为合适的起始密码子，示例蛋氨酸密码子(ATG)。作为终止密码子，示例常用的终止密码子(例如，TAG-TGA、TM)。作为终止子区，可以应用通常应用的天然或合成的终止子。

可复制单元指具有能够在宿主细胞中复制其全部DNA序列的能力的DNA，包括天然质粒、人工修饰的质粒(由天然质粒制备的DNA片段)和合成质粒等。作为合适的质粒，列举大肠杆菌中质粒pBR322、或其人工修饰物(将pBR322用适当限制酶处理得到的DNA片段)，酵母中酵母2μ质粒、或酵母染色体DNA，此外哺乳动物细胞中质粒pRSVneo(ATCC 37198)、质粒pSV2dhfr(ATCC 37145)、质粒pdBPV-MMTneo(ATCC 37224)、质粒pSV2neo(ATCC 37149)等。

关于增强子序列、多腺苷酸化部位和剪接接合部位，例如，可以分别应用来自SV40的那种等、本领域技术人员通常使用的那种。

表达载体可以通过将至少上述的启动子、起始密码子、编码上述多肽的DNA、终止密码子和终止子区连续且环状地连接到适当的可复制单元而配制。此外，此时，按期望可以通过用限制酶消化、应用T4 DNA连接酶连接等常规方法，应用适当的DNA片段(例如，接头、其它限制酶切断部位等)。

本发明的一个实施方式是具有编码上述多肽的DNA的转化体。该转化体例如可以通过将上述的表达载体导入宿主细胞、作为转化的重组细胞得到。

作为宿主细胞，只要是适合上述表达载体、可转化的那种则没有特别限定，示例本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或者人工建立的重组细胞等各种细胞，例如，细菌(埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)、动物细胞或昆虫细胞等。

宿主细胞优选大肠杆菌或动物细胞。作为大肠杆菌或动物细胞，例如，示例大肠杆菌(DH5a、TB1、HB101等)、小鼠来源的细胞(Cop、L、C127、Sp2/0、NS-1或NIH3T3等)、大鼠来源的细胞(PC12,PC12h)、仓鼠来源的细胞(BHK和CHO等)、猴来源的细胞(COS1、COS3、COS7、CV1和Velo等)和人来源的细胞(Hela、2倍体成纤维细胞来源的细胞、骨髓瘤细胞和HepG2等)等。

表达载体向宿主细胞的导入(转化(转染))可以按照常规方法进行([大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等情形中]：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Vol.69，p.2110，1972；Mil.Gen.Genet.、Vol.168，p.111,1979；J.Mol.Biol.，Vol.56，p.209，1971；[酿酒酵母的情形中]：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Vol.75，p.1927，1978；J.Bacteriol.，Vol.153,p.163,1983)；[动物细胞的情形中]：Virology，Vol.52,p.456，1973；[昆虫细胞的情形中]：Mol.Cell.Biol.，Vol.3,p.2156-2165，1983)。

本实施方式涉及的多肽例如可以通过下列方法制备，该方法包括按照常规方法培养为转化体的重组细胞、和从通过培养得到的培养物得到目标多肽。

作为从培养物得到目标多肽的方法，可以应用通常应用的分离、纯化方法。作为分离、纯化方法，例如，列举盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法，透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差的方法，离子交换色谱或羟基磷灰石色谱等利用电荷的方法，亲和色谱等利用特异亲和性的方法，反相高效液相色谱等利用疏水性差的方法，等电点电泳等利用等电点差的方法等。

在目标多肽存在于培养的重组细胞(大肠杆菌等)的周质或细胞质内的情形中，将培养物交付过滤或离心分离等常规方法收集菌体或细胞，悬浮于适当的缓冲液，例如通过超声波、溶菌酶和冻融等方法破坏细胞等的细胞壁和/或细胞膜后，用离心分离或过滤等方法得到含有目标多肽的级分。将该级分应用Triton^TM-X100等表面活性剂溶解，得到粗溶液。然后，通过将该粗溶液应用如之前示例的常规方法，可以分离、纯化目标多肽。

本实施方式涉及的多肽可以应用如上述公知的基因重组技术制备，通常可以如下配制。首先，将包含野生型多肽基因的质粒作为模板，通过应用该引物的PCR在特定的位置和特定的氨基酸导入位点特异性突变，用限制酶消化模板质粒后在大肠杆菌等中转化，克隆目标的突变导入质粒。

在导入第2氨基酸的氨基酸突变的情形中，然后，将在特定位置导入突变的质粒作为模板，与上述同样地重复应用引物的位点特异性突变导入，构建编码二氨基酸取代体的质粒DNA。进一步导入氨基酸突变的情形中也同样进行即可。

将制备的DNA与编码乳糖阻遏子(Lac repressor)(Laci)的质粒pREP4等同时转化入大肠杆菌BL21株等，分离培养得到的转化株后，用IPTG进行表达诱导。然后粉碎得到的菌株，将上清通过利用His标签的亲和柱等，从而纯化目标多肽。

或者也可以通过以下方法配制。即，将编码目标多肽的碱基序列基因合成，载置于表达载体后，通过蛋白表达、利用各种纯化标签的亲和柱纯化目标多肽。

作为本实施方式涉及的多肽的制备方法，不限于上述方法，可以使用公知的点突变技术或基因合成技术、通过限制酶导入改变片段的方法等各种基因操作技术，表达也不限于大肠杆菌，也可以使用动物细胞或无细胞翻译系统。此外，纯化方法也不限于利用聚组氨酸的亲和柱，可以应用各种肽标签或纯化柱。

实施例

本发明通过以下的实施例进一步示例，但不限于此。实施例中使用以下的缩写。

[表1]

缩写	正式名称
		FA	甲酸
β-NADPH	还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
		IIEPES	4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
1 x TNG	50mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)、150mM氯化钠、10％(v/v)甘油、pH8.0
		GDH	葡萄糖脱氢酶
PVDF	聚偏二氟乙烯
		PTFE	四氟乙烯

[表2]

LCMS的分析条件如下述。

[表3]

关于购入方没有特别记载的试剂从Sigma Aldrich Japan United公司、富士胶片和光纯药株式会社、东京化成工业株式会社、Nakarai Tesk株式会社、和渡边化学工业株式会社的任一购入。

比较例1：野生型酶的表达/纯化

对于野生型酶序列(序列编号1)，合成在C末端附加链霉抗生物素蛋白结合肽标签序列(GTDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQ)、和His标签序列(HHHHHH)的基因，在大肠杆菌表达用载体中克隆。将该表达载体导入BL21(DE3)大肠杆菌株(Novagen)，通过应用Overnight Express Instant TB Medium(Novagen)在18℃培养2天表达目标蛋白。

通过离心回收得到的菌体，将菌体超声波破碎。通过离心分级分离裂解物，通过应用Ni Sepharose 6Fast Flow(Cytiva)的亲和色谱纯化上清级分。回收包含目标蛋白的级分，作为最终配制品(#02-001(序列编号17))。

实施例1：改性酶的表达/纯化

对于各种改性酶序列(序列编号2～13和23～35)，合成在C末端附加链霉抗生物素蛋白结合肽标签序列(GTDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQ)、接头序列(GGS)、和His标签序列(HHHHHH)的基因，在大肠杆菌表达用载体中克隆。将该表达载体导入BL21(DE3)大肠杆菌株(Novagen)，通过应用Overnight Express Instant TB Medium(Novagen)在18℃培养2天表达目标蛋白。

通过离心回收得到的菌体，将菌体超声波破碎。通过离心分级分离裂解物，通过应用Ni Sepharose 6Fast Flow(Cytiva)的亲和色谱纯化上清级分。回收包含目标蛋白的级分，作为最终配制品(#02-002～217和#03-001～130和#04-001～0072)。

实施例2：改性酶的表达/纯化

除下列方面以外，用与实施例1同样的方法实施(#02-169)：不应用Ni Sepharose6Fast Flow(Cytiva)、通过应用cOmplete^TM His-Tag Purification Resin(Roche)的亲和色谱纯化上清级分，和回收包含目标蛋白的级分后、在50mM Tris-盐酸(pH 8.0)/150mM氯化钠/10％甘油中透析样品作为最终配制品。

合成例1：H-MeGly(cPent)-OH的合成

[化学式58]

在Fmoc-MeGly(cPent)-OH(CASNo 187475-29-2)(250mg、0.659mmol)的二氯甲烷(KANTO、目录号11338-25)(1.0ml)悬浮液中加入4-(3-苯基丙基)哌啶(TCI、目录号P0760)(0.419ml、1.977mmol)，在室温搅拌1分钟，其后，加入水(1.0ml)后，在室温搅拌过夜。取得反应溶液中的水层，用反相硅胶柱色谱(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液＝100/0→95/5)纯化，得到H-MeGly(cPent)-OH(88.2mg、85％)。

LCMS(ESI)m/z＝158.1(M+H)⁺

保留时间：0.25分钟(分析条件FA05-1)

¹H-NMR(JNM-ECZ400S，400MHz，D₂O)δppm3.28(1H，d，7.6Hz)，2.53(3H，s)，2.07(1H，m)，1.69(1H，m)，1.60-1.38(5H，m)，1.22(2H，m)

评价例1：以H-MeGly(cPent)-OH合成活性为指标的改性酶筛选的实施

为了以H-MeGly(cPent)-OH合成活性为指标实施实施例1中配制的改性酶(#02-002～217)的筛选，配制包含底物的溶液(以下称为预混物1)。具体地，将2-环戊基-2-氧代-乙酸(购自Enamine Ltd)、D(+)-葡萄糖(购自富士胶片和光纯药株式会社)的2个化合物溶解于甲胺水溶液(将购自富士胶片和光纯药株式会社的水溶液用盐酸调整为pH8.5)、磷酸缓冲液(400mM、pH7.4)的混合溶剂。应用氢氧化钠水溶液将pH调整为8.0后，用超纯水定容。对该溶液，添加β-NADPH水溶液(将购自Oriental酵母工业株式会社的粉末以89mM溶解于超纯水)、和GDH溶液(将购自富士胶片和光纯药株式会社的粉末溶解于1xTNG)，得到预混物1。另外，在预混物1的时间点的各化合物的浓度是，2-环戊基-2-氧代-乙酸为55.6mM、D(+)-葡萄糖为111mM、甲胺为556mM、磷酸缓冲液为111mM、β-NADPH为0.99mM、GDH溶液为0.0022单位/μL。

对于配制的预混物1，添加#02-001～217的任1个，实施H-MeGly(cPent)-OH合成反应。具体地，对于预混物1，分别添加#02-001～217的任1个溶液。在为阴性对照的酶(-)中，添加含咪唑缓冲液(250mM咪唑、50mM HEPES(pH7.5)、150mM氯化钠)。将其充分混合后，在37℃进行19小时温育。另外，反应开始时的各化合物的浓度是，2-环戊基-2-氧代-乙酸为50mM、D(+)-葡萄糖为100mM、甲胺为500mM、磷酸缓冲液为100mM、β-NADPH为0.89mM、GDH溶液为0.002单位/μL、#02-001～217的任1个为2.5μM。

关于温育后的反应溶液，实施后处理并进行LCMS分析用样品配制。具体地，添加反应溶液的9倍量的盐酸使得氯化氢的添加后终浓度为30mM(以下，将该溶液称为后处理过的反应溶液1)。

以用LCMS定量后处理过的反应溶液1中溶解的H-MeGly(cPent)-OH的浓度为目的，制备合成例1中合成的H-MeGly(cPent)-OH的稀释系列。具体地，在1M氢氧化钠水溶液中溶解H-MeGly(cPent)-OH使得成为1000mM后，用超纯水重复2倍的稀释操作。

应用该稀释系列的浓度定量由于后处理过的反应溶液1中溶解的各种化合物引起的离子抑制而困难，因此将该稀释系列添加于模拟后处理过的反应溶液1的组成的溶液。首先，将2-环戊基-2-氧代-乙酸、D(+)-葡萄糖的2个化合物溶解于甲胺水溶液、磷酸缓冲液的混合溶剂，应用氢氧化钠水溶液和盐酸将pH调整为8.0后，用超纯水定容(以下，将本溶液称为预混物2)。随后，对于预混物2，添加β-NADPH水溶液、1xTNG、含咪唑缓冲液、稀释系列，充分混和。另外，该时间点的各化合物的浓度是，2-环戊基-2-氧代-乙酸为25mM、D(+)-葡萄糖为75mM、甲胺为475mM、磷酸缓冲液为100mM、β-NADPH为0.89mM，1xTNG和含咪唑缓冲液分别为体积比10％。最后，添加反应溶液的9倍量的盐酸使得氯化氢的添加后终浓度为30mM，得到LCMS分析用标准曲线样品(以下，将该溶液称为后处理过的标准曲线样品1)。

考虑后处理过的反应溶液1中溶解超过后处理过的标准曲线样品1中标准曲线范围水平的H-MeGly(cPent)-OH的可能性，进行稀释操作。首先，作为前述离子抑制的预备，配制模拟后处理过的反应溶液1中溶解的各种化合物的组成的稀释用溶液。具体地，混合预混物2、1xTNG、含咪唑缓冲液、β-NADPH水溶液、盐酸，用超纯水定容。另外，定容后的β-NADPH、氯化氢的浓度分别是0.089mM、30mM，预混物2、1xTNG、含咪唑缓冲液的最终体积比分别是6％、1％、1％。应用该稀释用溶液，通过将后处理过的反应溶液1稀释32倍，得到后处理过的反应溶液2。

将后处理过的反应溶液1、后处理过的反应溶液2、后处理过的标准曲线样品1全部通过0.2μm的PVDF膜滤器(购自Corning，Inc)后，供给LCMS测定。测定中使用的液体量是1μL。应用搭载于MassLynx的、检测萃取离子色谱图的峰面积的功能(TargetLynx)，评价#02-001～217各自的H-MeGly(cPent)-OH的合成活性。结果如下表，可以发现多个与野生型酶(#02-001)相比H-MeGly(cPent)-OH的合成活性高的改性酶。

LCMS(ESI)m/z＝158.10(M+H)⁺

保留时间：0.23分钟(分析条件FA05-1)

关于合成活性，通过应用#02-001～217的情形中的目标产物的收率除以应用野生型酶(#02-001)的情形中的目标产物的收率求得。计算的合成活性的比示于表4和表5。另外，使用野生型酶时的收率是21％。

[表4]

[表5]

评价例2：以H-EtPhe-OH合成活性为指标的改性酶筛选的实施(单突变体筛选)

为了以H-EtPhe-OH合成活性为指标实施实施例1中配制的改性酶(#02-002～217)的筛选，配制包含底物的溶液(以下，称为预混物3)。具体地，将苯基丙酮酸钠盐(购自SigmaAldrich Japan United公司)、D(+)-葡萄糖的2个化合物溶解于乙胺水溶液(将购自东京化成株式会社的水溶液用盐酸调整为pH7.7)、磷酸缓冲液的混合溶剂。应用氢氧化钠水溶液和盐酸将pH调整为8.0后，用超纯水定容。对于该溶液，添加β-NADPH水溶液、和GDH溶液，得到预混物3。另外，预混物3的时间点的各化合物的浓度是，苯基丙酮酸钠盐为55.6mM、D(+)-葡萄糖为111mM、乙胺为556mM、磷酸缓冲液为111mM、β-NADPH为0.99mM、GDH溶液为0.0022单位/μL。

对于配制的预混物3，添加#02-001～217的任1个，实施H-EtPhe-OH合成反应。具体地，对于预混物3，分别添加#02-001～217的任1个的溶液。在为阴性对照的酶(-)中，添加含咪唑缓冲液。将其充分混合后，在37℃进行19小时温育。另外，反应开始时的各化合物的浓度是，苯基丙酮酸钠盐为50mM、D(+)-葡萄糖为100mM、乙胺为500mM、磷酸缓冲液为100mM、β-NADPH为0.89mM、GDH溶液为0.002单位/μL、#02-001～217的任1个为2.5μM。

关于温育后的反应溶液，实施后处理并进行LCMS分析用样品配制。具体地，添加反应溶液的9倍量的盐酸使得氯化氢的添加后终浓度为30mM(以下，将该溶液称为后处理过的反应溶液3)。

以用LCMS定量后处理过的反应溶液3中溶解的H-EtPhe-OH的浓度为目的，制备摩尔吸光系数推定为与H-EtPhe-OH相同的H-MePhe-OH的稀释系列。具体地，在1M氢氧化钾水溶液中溶解H-MePhe-OH(购自渡边化学工业株式会社)使得为500mM后，用超纯水重复2倍的稀释操作。通过将该稀释系列添加于包含磷酸缓冲液、1xTNG、含咪唑缓冲液的混合溶剂，作为标准曲线样品。另外，该时间点的磷酸缓冲液的浓度是100mM(pH7.4)，1xTNG、含咪唑缓冲液、H-MePhe-OH稀释系列的体积比分别是10％、10％、20％，剩余的的体积部分是超纯水。最后，添加反应溶液的9倍量的盐酸使得氯化氢的添加后终浓度为30mM，得到LCMS分析用标准曲线样品(以下，将该溶液称为后处理过的标准曲线样品2)。

将后处理过的反应溶液3、后处理过的标准曲线样品2全部通过0.2μm的PVDF膜滤器(购自Corning，Inc)后，供给LCMS测定。测定中使用的液体量是1μL。应用TargetLynx，通过检测UV图(254nm)上的来自H-EtPhe-OH的峰的面积，评价#02-001～217各自的H-EtPhe-OH的合成活性。结果如下表，可以发现多个与野生型酶(#02-001)相比H-EtPhe-OH的合成活性高的改性酶。

LCMS(ESI)m/z＝194.18(M+H)⁺

保留时间：0.37分钟(分析条件FA05-2、UV图(254nm)中的保留时间)关于合成活性，通过应用#02-001～217的情形中的目标产物的收率除以应用野生型酶(#02-001)的情形中的目标产物的收率求得。计算的合成活性的比示于表6和表7。另外，野生型酶的收率对应于#02-193～200为22％，其它为28％。

[表6]

[表7]

合成例2：2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的钠盐化

实施H-EtPhe(4-Me)-OH的原料酮酸的2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸的钠盐化。具体地，将2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸(购自ChemSpace公司)悬浮于乙腈-超纯水(1:1)的混合溶剂后，相对于上述酮酸添加1当量的1M氢氧化钠水溶液，充分搅拌。确认完全溶解后，通过0.5μm的PTFE膜滤器(购自东曹株式会社)，冷冻干燥。

评价例3：以H-EtPhe(4-Me)-OH合成活性为指标的改性酶筛选的实施

为了以H-EtPhe(4-Me)-OH合成活性为指标实施实施例1中配制的改性酶(#02-002～217)的筛选，配制包含底物的溶液(以下，称为预混物4)。具体地，将合成例2中配制的酮酸的钠盐、D(+)-葡萄糖的2个化合物溶解于乙胺水溶液、磷酸缓冲液的混合溶剂。应用氢氧化钠水溶液将pH调整为8.0后，用超纯水定容。对于该溶液，添加β-NADPH水溶液、和GDH溶液，得到预混物4。另外，预混物4的时间点的各化合物的浓度是，合成例2中配制的酮酸的钠盐为55.6mM、D(+)-葡萄糖为111mM、乙胺为556mM、磷酸缓冲液为111mM、β-NADPH为0.99mM、GDH溶液为0.0022单位/μL。

对于配制的预混物4，添加#02-001～217的任1个，实施H-EtPhe(4-Me)-OH合成反应。具体地，对于预混物4，分别添加#02-001～217的任1个溶液。在为阴性对照的酶(-)中，添加含咪唑缓冲液。将其充分混合后，在37℃进行19小时温育。另外，反应开始时的各化合物的浓度是，合成例2中配制的酮酸的钠盐为50mM、D(+)-葡萄糖为100mM、乙胺为500mM、磷酸缓冲液为100mM、β-NADPH为0.89mM、GDH溶液为0.002单位/μL、#02-001～217的任1个为2.5μM。

关于温育后的反应溶液，实施后处理并进行LCMS分析用样品配制。具体地，添加反应溶液的9倍量的含盐酸DMSO溶液(盐酸与DMSO的体积比是3:87)使得氯化氢的添加后终浓度为30mM(以下，将该溶液称为后处理过的反应溶液4)。

用LCMS定量后处理过的反应溶液4中溶解的H-EtPhe(4-Me)-OH的浓度时，与H-EtPhe-OH时同样，制备H-MePhe-OH的稀释系列(后处理过的标准曲线样品2)。另外，在最后的稀释过程中，使用盐酸或含盐酸DMSO溶液(含盐酸DMSO溶液的组成与后处理过的反应溶液4中应用的那种相同)。

将后处理过的反应溶液4、后处理过的标准曲线样品2全部通过0.2μm的PVDF膜滤器(购自Corning，Inc)后，供给LCMS测定。测定中使用的液体量是1μL。应用TargetLynx，通过检测UV图(254nm)上的来自H-EtPhe(4-Me)-OH的峰的面积，评价#02-001～217各自的H-EtPhe(4-Me)-OH的合成活性。结果如下表，可以发现多个与野生型酶(#02-001)相比H-EtPhe(4-Me)-OH的合成活性高的改性酶。

LCMS(ESI)m/z＝208.21(M+H)⁺

保留时间：0.59分钟(分析条件FA05-2、UV图(254nm)中的保留时间)关于合成活性，通过应用#02-001～217的情形中的目标产物的收率除以应用野生型酶(#02-001)的情形中的目标产物的收率求得。计算的合成活性的比示于表8和表9。另外，野生型酶的收率关于#02-002～073、#02-092～109、#02-128～145、#02-200～217是10％，其它是6％。

[表8]

[表9]

评价例4：以H-EtPhe-OH合成活性为指标的改性酶筛选的实施(双突变体筛选)

以H-EtPhe-OH合成活性为指标实施实施例1中配制的改性酶(#03-001～130)的筛选。除了代替#02-002～217应用#03-001～130作为改性酶以外，与评价例2同样地实施方案。另外，#02-021、117在评价例2中活性评价过，均作为与WT不同的实验系统的对照应用。

结果如下表，可以发现多个与野生型酶(#02-001)相比H-EtPhe-OH的合成活性高的改性酶。

LCMS(ESI)m/z＝194.11(M+H)⁺

保留时间：0.38分钟(分析条件FA05-2、UV图(254nm)中的保留时间)关于合成活性，通过应用#02-001和#03-001～130各自的情形中的目标产物的收率除以应用野生型酶(#02-001)的情形中的目标产物的收率求得。计算的合成活性的比示于表10和表11。另外，野生型酶的收率是32％。

[表10]

[表11]

评价例5：以H-EtPhe-OH合成活性为指标的改性酶筛选的实施(三突变体筛选)

以H-EtPhe-OH合成活性为指标实施实施例1中配制的改性酶(#04-001～072)的筛选。除了代替#02-002～217应用#04-001～072作为改性酶以外，与评价例2同样实施方案。另外，#02-021,117、#03-006，020在评价例2、3中活性评价过，均作为与WT不同的实验系统的对照应用。

LCMS(ESI)m/z＝194.07(M+H)⁺

保留时间：0.37分钟(分析条件FA05-2、UV图(254nm)中的保留时间)关于合成活性，通过应用#02-001、#04-001～072的情形中的目标产物的收率除以应用野生型酶(#02-001)的情形中的目标产物的收率求得。计算的合成活性的比示于表12。另外，野生型酶的收率是16％。

[表12]

合成例3：H-MeVal-OH的合成

为了试验通过实施例1中配制的改性酶(#02-169)的H-MeVal-OH合成，配制包含底物的溶液(以下，称为预混物5)。具体地，将3-甲基-2-氧代丁酸钠(购自Sigma AldrichJapan United公司)、D(+)-葡萄糖的2个化合物溶解于甲胺水溶液、磷酸缓冲液(400mM、pH7.4)的混合溶剂。应用氢氧化钠水溶液将pH调整为8.0后，用超纯水定容。对于该溶液，添加β-NADPH水溶液、和GDH溶液，得到预混物5。另外，预混物5的时间点的各化合物的浓度是，3-甲基-2-氧代丁酸钠为55.6mM、D(+)-葡萄糖为111mM、甲胺为556mM、磷酸缓冲液为111mM、β-NADPH为0.99mM、GDH溶液为0.0022单位/μL。

对于配制的预混物5，添加#02-169，实施H-MeVal-OH合成反应。具体地，对于预混物5，添加#02-169的溶液。将其充分混合后，在37℃进行19小时温育。另外，反应开始时的各化合物的浓度是，3-甲基-2-氧代丁酸钠为50mM、D(+)-葡萄糖为100mM、甲胺为500mM、磷酸缓冲液为100mM、β-NADPH为0.89mM、GDH溶液为0.002单位/μL、#02-169为2.5μM。

关于温育后的反应溶液，实施后处理并进行LCMS分析用样品配制。具体地，添加反应溶液的9倍量的盐酸使得氯化氢的添加后终浓度为30mM(以下，将该溶液称为后处理过的反应溶液5)。

以用LCMS定量后处理过的反应溶液5中溶解的H-MeVal-OH的浓度为目的，制备H-MeVal-OH的稀释系列。具体地，在超纯水中溶解H-MeVal-OH使得为1000mM后，用超纯水重复2倍的稀释操作。

应用该稀释系列的浓度定量由于后处理过的反应溶液5中溶解的各种化合物引起的离子抑制而困难，因此将该稀释系列添加于模拟后处理过的反应溶液5的组成的溶液。首先，将3-甲基-2-氧代丁酸钠、D(+)-葡萄糖的2个化合物溶解于甲胺水溶液、磷酸缓冲液的混合溶剂，应用氢氧化钠水溶液将pH调整为8.0后，用超纯水定容(以下，将本溶液称为预混物6)。随后，对于预混物6，添加β-NADPH水溶液、1xTNG、含咪唑缓冲液、稀释系列，充分混和。另外，该时间点的各化合物的浓度是，3-甲基-2-氧代丁酸钠为25mM、D(+)-葡萄糖为75mM、甲胺为475mM、磷酸缓冲液为100mM、β-NADPH为0.89mM、1xTNG和含咪唑缓冲液分别为体积比10％。最后，添加反应溶液的9倍量的盐酸使得氯化氢的添加后终浓度为30mM，得到LCMS分析用标准曲线样品(以下，将该溶液称为后处理过的标准曲线样品3)。

考虑后处理过的反应溶液5中溶解超过后处理过的标准曲线样品3中标准曲线范围水平的H-MeVal-OH的可能性，进行稀释操作。首先，作为前述离子抑制的预备，配制模拟后处理过的反应溶液5中溶解的各种化合物的组成的稀释用溶液。具体地，混合预混物6、1×TNG、含咪唑缓冲液、β-NADPH水溶液、盐酸，用超纯水定容。另外，定容后的β-NADPH、氯化氢的浓度分别是0.089mM、30mM，预混物6、1×TNG、含咪唑缓冲液的最终体积比分别是6％、1％、1％。应用该稀释用溶液，通过将后处理过的反应溶液5稀释32倍，得到后处理过的反应溶液6。

将后处理过的反应溶液5、后处理过的反应溶液6、后处理过的标准曲线样品3全部通过0.2μm的PVDF膜滤器后，供给LCMS测定。测定中使用的液体量是1μL。应用搭载于MassLynx的、检测萃取离子色谱图的峰面积的功能(TargetLynx)，评价#02-169的H-MeVal-OH的合成活性时，显示#02-169具有H-MeVal-OH的合成活性。

LCMS(ESI)m/z＝132.02(M+H)⁺

保留时间：2.85分钟(分析条件HILIC)

收率：26％

合成例4：H-MeGly(cPent)-OH的合成

LC/MS在以下的分析条件实施。

HPLC方法

装置：Waters AQUITY UPLC H-Class/QDa

柱：ACQUITY UPLC HSS T3 2.1×50mm、1.8μm

溶剂：A)0.05％TFA-H₂O、B)0.05％TFA-CH₃CN

梯度：0％B(0min)→98％B(5.0min)→98％B(6.0min)→0％B(6.01min)→0％B(8.0min)

流量：0.5mL/min

注入量：1.0μl

温度：30℃

波长：197nm

本实施例中使用以下的试剂。

[表13]

[化学式59]

将2-环戊基-2-氧代-乙酸钠盐(5.3g、32.5mmol)，甲胺盐酸盐(11.0g、162.7mmol)、D-葡萄糖(11.7g、65.1mmol)、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(10.6g、65.1mmol)溶解于蒸馏水(69.4mL)，将外温设定为25℃。加入50w/v％氢氧化钠水溶液(4.8mL)，调整为pH9.2。加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(249.0mg、0.3mmol)、D-葡萄糖脱氢酶(26.0mg、0.5wt％、1300U)、改性酶溶液(2.0mL、作为酶53mg、相当于1.0wt％)，在内温25℃搅拌21小时(反应转化率99％以上)。加入浓盐酸(7.5mL)调整为pH1.9，搅拌1小时。将不溶物用硅藻土过滤滤出，将硅藻土用蒸馏水(10.7mL)洗涤，将H-MeGly(cPent)-OH溶液作为滤液得到。保留时间：1.41min、MS(ESI)：m/z＝158.10(M+H)⁺

合成例4-2：(S)-3,3-二甲基-2-(甲基氨基)丁酸的合成

LC/MS在以下的分析条件实施。

HPLC方法

装置：Waters AQUITY UPLC H-Class/QDa

柱：ACQUITY UPLC HSS T3 2.1x50mm、1.8μm

溶剂：A)0.05％TFA-H₂O、B)0.05％TFA-CH₃CN

流量：0.5mL/min

注入量：0.5μl

温度：30℃

波长：197nm

本实施例中使用下表中记载的试剂。未记载的试剂使用表13的试剂。

[表14]

试剂名称	CAS登录号	供应商
			3，3-二甲基-2-氧代丁酸	815-17-8	东京化成工业
(S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酸	20859-02-3	东京化成工业

[化学式60]

将氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(50mg)溶解于0.4mol/LN，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸溶液(1.0mL、pH9.0)，配制氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(A液)。

将D-葡萄糖脱氢酶(50mg)溶解于0.4mol/LN，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸溶液(1.0mL、pH9.0)，配制D-葡萄糖脱氢酶溶液(B液)。

将3，3-二甲基-2-氧代丁酸(50mg、0.38mmol)、N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(130mg、0.77mmol)、甲胺盐酸盐(130mg、1.9mmol)、D-葡萄糖(140mg、0.77mmol)溶解于蒸馏水(0.80mL)、二甲基亚砜(0.20mL)。加入50w/v％氢氧化钠水溶液(88μL)，调整为pH9.0作为底物溶液(C液)。

在C液中加入A液(59μL、3.8μmol)、B液(10μL、1.0wt％)，加入实施例2中配制的改性酶溶液(作为1.0～100wt％、73.3mg/ml的溶液分别添加)，在外温25℃搅拌17小时后，在外温37℃振荡24小时。

反应液中的(S)-3，3-二甲基-2-(甲基氨基)丁酸的收率以(S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酸为标准品，根据LC/MS中197nm的UV吸收峰面积计算。结果示于表15。

[表15]

评价例6：应用改性酶W253H-SBP-His和添加剂(二甲基亚砜)的MeHph(2-Cl)的合成

缩写MeHph(2-Cl)表示具有以下的结构式的化合物。

[表16]

LCMS的分析条件如下述。

LCMS方法

条件名：FA05

装置：Waters Acquity UPLC/SQD

柱(I.D.×长度(mm)、粒径(μm))：Aldrich Ascentis Express C18(2.1×50、2.7)

流动相：A)0.1％FA H₂O、B)0.1％FA MeCN

梯度(A/B)：

流速(ml/分钟)：1

柱温：35℃

波长：210-400nm PDA total

条件名：TFA00

装置：Waters H class

柱：(I.D.×长度(mm)、粒径(μm))：ACQUITYUPLCHSST3(2.1×50、1.8)流动相：A)0.05％TFA H₂O、B)0.05％TFA MeCN

梯度(A/B)：

流速(ml/分钟)：0.5

柱温：30℃

波长：197nm

条件名：TFA00-QDa

装置：Waters H class/QDa

梯度(A/B)：

流速(ml/分钟)：0.5

柱温：30℃

波长：197nm

本实施例中使用以下的试剂。

[表17]

以下的试剂如下实施事前配制并使用。

[表18]

原料中间体(E)-4-(2-氯苯基)-2-氧代丁-3-烯酸的合成

[化学式61]

在0度下在1N氢氧化钠水溶液(60ml)和乙醇(3ml)的混合溶液中加入丙酮酸钠(2.42g、0.022mol)后，经20分钟以上滴加2-氯苯甲醛(2.25ml、0.02mol)，在0度搅拌反应液2小时。其后，在反应液中加入水(160ml)，用甲苯(100ml)洗涤。在0度下在得到的水层中滴加5N盐酸直至pH为1，将该溶液搅拌30分钟。过滤回收溶液中生成的析出物，将该析出物用冷水进行洗涤。使得到的湿式固体加热减压干燥，得到(E)-4-(2-氯苯基)-2-氧代丁-3-烯酸(2.7g、0.013mol、64％收率)。

LCMS(ESI)m/z＝209.0(M-H)^-

保留时间：0.52分钟(分析条件FA05)

原料4-(2-氯苯基)-2-氧代丁酸钠的合成

[化学式62]

将(E)-4-(2-氯苯基)-2-氧代丁-3-烯酸(1.00g、4.75mol)和钯/碳(0.20g、1.88mol)的甲醇(20ml)和二苯硫醚(7.97μl、0.047mmol)的悬浮液在氢气氛下在室温搅拌1小时。过滤反应液后，将得到的滤液在减压条件下浓缩。在得到的残渣中加入1N氢氧化钠水溶液(15ml)，用甲苯(15ml)洗涤(2次)。将水层在0度下搅拌30分钟后，过滤回收溶液中生成的析出物，将该析出物用冷水进行洗涤。使得到的湿式固体加热减压干燥，得到4-(2-氯苯基)-2-氧代丁酸钠(847mg、3.61mmol、75％收率)。

LCMS(ESI)m/z＝211.0(M-H)^-

保留时间：0.59分钟(分析条件FA05)

应用改性酶W253H-SBP-His和添加剂的MeHph(2-Cl)的合成

配制4-(2-氯苯基)-2-氧代丁酸钠(终浓度50mM)、D(+)-葡萄糖(终浓度100mM)、甲胺溶液(终浓度500mM)、磷酸缓冲液(终浓度0.1M)、NADPH溶液(终浓度1mM)、GDH溶液(终浓度0.002单位/μL)、二甲基亚砜(DMSO)(相对于反应溶液20v/v％)、实施例2中配制的改性酶W253H-SBP-His(终浓度2.5μM)、超纯水的混合溶液(pH8-9)，在25℃或者在37℃进行3小时温育。

在温育后的反应溶液中添加反应溶液的19倍量的含盐酸DMSO溶液，使得氯化氢的添加终浓度为300mM。将得到的溶液通过0.45μm的PTFE膜滤器(Cosmospin滤器H、NakaraiTesk)，作为LCMS分析用样品，实施LCMS测定(分析条件：FA05)。计算目标物MeHph(2-Cl)的254nm的UV峰面积，求得反应收率。结果示于表19。

LCMS(ESI)m/z＝228.1(M+H)⁺

保留时间：0.38分钟(分析条件FA05)

[表19]

本实施例中使用以下的试剂。

[表20]

以下的试剂如下实施事前配制并使用。

[表21]

LCMS的分析条件如下述。

LCMS方法

条件名：FA05

装置：Waters Acquity UPLC/SQD

柱(I.D.×长度(mm)、粒径(μm))：Aldrich Ascent is Express C18(2.1×50、2.7)

流动相：A)0.1％FA H₂O、B)0.1％FA MeCN

梯度(A/B)：

流速(ml/分钟)：1

柱温：35℃

波长：210-400nm PDA total

¹H-NMR分析应用以下的机器、重溶剂测定。

机器：AVANCE III HD 400SMART-BBFO probe(400MHz，Bruker)

重溶剂：三氟乙酸-d₁

本实施例中使用以下的缩写。

[表22]

缩写	化合物
		(I)	反应中得到的化合物：(2S，3S)-2-氨基-3-苯基-丁酸
(II)	标准品化合物：(2S，3R)-2-氨基-3-苯基-丁酸盐酸盐
		(III)	标准品化合物：(2S，3S)-2-氨基-3-苯基-丁酸盐酸盐
(IV)	标准品化合物：(2R，3R)-2-氨基-3-苯基-丁酸盐酸盐

评价例7：应用改性酶W253H-SBP-His和添加剂(二甲基亚砜)的(2S，3S)-2-氨基- 3-苯基-丁酸的合成

[化学式63]

调整2-氧代-3-苯基丁酸钠(终浓度50mM)、D(+)-葡萄糖(终浓度100mM)、氨溶液(终浓度500mM)、N，N-二(2-羟基乙基)甘氨酸缓冲液(终浓度0.1M)、NADPH溶液(终浓度1mM)、GDH溶液(终浓度0.002单位/μL)、添加剂DMSO(20vol％)、实施例2中配制的改性酶W253H-SBP-His(终浓度20μM)、超纯水的混合溶液，在37℃进行47小时温育。

在温育后的反应溶液中添加5mol/L盐酸600μL，将得到的溶液用反相硅胶柱色谱(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液＝100/0→95/5)纯化，得到(2S，3S)-2-氨基-3-苯基-丁酸(I)(16.5mg、18％)。

LCMS(ESI)m/z＝180.1(M+H)⁺

保留时间：0.31分钟(分析条件FA05)

¹H-NMR(400MHz，Trifluoroacid-d₁，298K)δ7.32-7.21(3H，m)，7.18-7.16(2H，m)，4.94(1H，d，J＝5.6Hz)，3.55-3.48(1H，m)，1.45(1H，d，J＝6.8Hz)

比较本反应中得到的化合物(2S,3S)-2-氨基-3-苯基-丁酸(I)与购入的标准品化合物(2S,3R)-2-氨基-3-苯基-丁酸盐酸盐(II)、(2S,3S)-2-氨基-3-苯基-丁酸盐酸盐(III)、和(2R，3R)-2-氨基-3-苯基-丁酸盐酸盐(IV)的¹H-NMR、手性HPLC分析数据，鉴定得到的化合物的立体结构。

根据¹H-NMR分析中特征性的2位和3位的质子峰的比较结果(图1)和手性HPLC分析的比较结果(图2、和表23)，本反应中得到的化合物(I)的结构鉴定为(2S,3S)-2-氨基-3-苯基-丁酸。

手性HPLC分析条件如下述。

装置：SHIMADZU Nexera X3

柱(I.D.×长度(mm)、粒径(μm))：DAICEL公司CHIRALPAK ZWIX(+)(3.0×150、3.0)

流动相：含有50mM甲酸和25mM二乙胺，MeOH:MeCN:H₂O(49:49:2,v/v)溶液

溶离法：等度

分析时间：10分钟

流速(ml/分钟)：0.5

柱温：25℃

波长：254nm

图2、表23中的(V)是将购入的标准品化合物(III)、(IV)以(III):(IV)＝7:3的比率混合配制的。

[表23]

评价例8：应用改性酶W253H-SBP-His和添加剂(DMSO)的MeGly(cPent)

合成中添加剂的评价

将2-环戊基-2-氧代乙酸钠(终浓度100mM)、D(+)-葡萄糖(终浓度200mM)、甲胺盐酸盐(终浓度500mM)、NADPH(终浓度2.0mM)、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(终浓度100mM)溶解于蒸馏水，添加添加剂DMSO(0～40v/v％)后，用5M氢氧化钠水溶液调整为pH8.8～8.9。加入GDH溶液(0.10单位/μL、1xTNG溶液、终浓度0.0040单位/μL)、实施例2中配制的改性酶W253H-SBP-His(0.67mM、终浓度5.0μM)，在25℃进行24小时温育。

采样温育中的反应溶液50μL，添加甲醇750μL、1M盐酸200μL。将得到的溶液用0.5μm的PTFE膜滤器(DISMIC、ADVANTEC)过滤作为LC分析用样品，实施LC测定(分析条件：TFA00)。测定LC的197nm的UV峰面积，基于下述式X修正各化合物的吸光系数的比并计算反应收率。反应收率的推移示于表24。

保留时间：1.1分钟(分析条件：TFA00)

此外，将得到的溶液进行LCMS测定(分析条件TFA00-QDa)，确认MeGly(cPent)的MS峰。

保留时间：1.5分钟(分析条件：TFA00-QDa)

LCMS(ESI)m/z＝158.1(M+H)⁺

式X：反应收率(％)＝S_1a/((S_2a/8.0)+S_1a)x100

式X中，S_1a表示MeGly(cPent)的UV峰面积。S_2a表示2-环戊基-2-氧代乙酸钠的UV峰面积。

[表24]

评价例9：应用改性酶W253H-SBP-His的Phe合成中添加剂的评价

配制苯基丙酮酸(终浓度50mM)、D(+)-葡萄糖(终浓度100mM)、氨溶液(终浓度500mM)、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸缓冲液(终浓度0.1M)、NADPH溶液(终浓度1mM)、GDH溶液(终浓度0.002单位/μL)、添加剂DMSO(相对于反应溶液20v/v％)、实施例2中配制的改性酶W253H-SBP-His(终浓度2.5μM)、超纯水的混合溶液(pH8-9)，在25℃进行温育，实施反应的评价。作为比较条件，在无添加剂(0v/v％)条件代替添加剂添加超纯水。在温育后的反应溶液中，添加反应溶液的19倍量的含盐酸DMSO溶液使得氯化氢的添加终浓度为300mM。将得到的溶液通过0.45μm的PTFE膜滤器(Cosmospin滤器H、Nakarai Tesk)，作为LCMS分析用样品，实施LCMS测定(分析条件：FA05-1)。计算目标物Phe的254nm的UV峰面积，求得反应收率。此时，在反应温度25℃求得3小时后和5小时后的反应收率。结果示于表25。

LCMS(ESI)m/z＝166.1(M+H)⁺

保留时间：0.27分钟(分析条件FA05-1)

[表25]

高效液相色谱的条件如下。

高效液相色谱的条件1

装置：Waters AQUITY H-class/QDa

梯度(A/B)：

流速(ml/分钟)：0.5

柱温：30℃

高效液相色谱的条件2

装置：Waters AQUITY H-class

柱：(I.D.×长度(mm)、粒径(μm))：Ascentis Express RP-Amide(2.1×50、2.7)

流动相：A)0.05％TFA H₂O、B)0.05％TFA MeCN

梯度(A/B)：

流速(ml/分钟)：0.5

柱温：35℃

高效液相色谱的条件3

装置：Waters AQUITY H-class/QDa

柱：(I.D.×长度(mm)、粒径(μm))：Ascentis Express C18(3.0×50、2.7)流动相：A)0.05％TFA H₂O、B)0.05％TFA MeCN

梯度(A/B)：

流速(ml/分钟)：0.5

柱温：30℃

高效液相色谱的条件4

装置：Waters AQUITY H-class/QDa

柱(I.D.×长度(mm)、粒径(μm))：DAICEL CHIRALPAKIC-3(4.6×150、3)

流动相：A)0.05％TFA H₂O、B)0.05％TFA MeCN

梯度(A/B)：

流速(ml/分钟)：1.0

柱温：30℃

合成例5：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸粗纯化物的合成

[化学式64]

将2-环戊基-2-氧代-乙酸钠盐(3.9g、24mmol)、甲胺盐酸盐(8.1g、120mmol)、D-葡萄糖(8.7g、48mmol)和N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(7.8g、48mmol)溶解于蒸馏水(50mL)，将反应容器的外温设定为25℃。加入5M氢氧化钠水溶液(6.0mL)，调整为pH8.8。加入NADP+(0.18g、0.24mmol)、D-葡萄糖脱氢酶(3.8mg、960U、250U/mg)和实施例2中配制的改性酶W253H-SBP-His(1.6mL、作为酶相当于43mg、1.1质量％)，在反应容器的外温25℃搅拌24小时。加入浓盐酸(3.0mL)调整为pH1.9，搅拌1小时。将不溶物用硅藻土垫过滤，将硅藻土垫用蒸馏水(20mL)洗涤，得到(S)-2-环戊基-2-(甲基氨基)乙酸溶液(120g)。

应用高效液相色谱的条件1，进行质谱分析(MS(ESI))。在保留时间1.5分钟，确认m/z＝158.1(M+H)⁺的峰，确认得到作为目标的(S)-2-环戊基-2-(甲基氨基)乙酸溶液。

在(S)-2-环戊基-2-(甲基氨基)乙酸溶液(60g、相当于12mmol)中加入10M氢氧化钠水溶液(10mL)，将pH调整为12.0。将得到的溶液在反应容器的外温40℃减压下浓缩干固。加入蒸馏水(30mL)，加入浓盐酸(0.75mL)调整为pH9.7。加入乙腈(10mL)、N-苄氧羰基氧基琥珀酰亚胺(4.2g、17mmol)、甲基叔丁基醚(10mL)并搅拌1小时。加入50w/v％氢氧化钠水溶液(1.5mL)并搅拌3小时。加入N-苄氧羰基氧基琥珀酰亚胺(1.2g、4.8mmol)并搅拌90分钟。加入50w/v％氢氧化钠水溶液(0.5mL)并搅拌18小时。加入浓盐酸(8.0mL)，萃取有机层中的目标物，将得到的有机层在反应容器的外温40℃减压下浓缩干固。加入甲基叔丁基醚(15mL)，将有机层用5％磷酸氢二钠水溶液洗涤2次(10mL×2)，用2M氢氧化钠水溶液洗涤1次(10mL)，将目标物萃取于水层。合并得到的水层，通过加入甲基叔丁基醚(20mL)、浓盐酸(1.5mL)，将目标物再萃取于有机层。将得到的有机层在反应容器的外温40℃减压下浓缩干固。加入甲基叔丁基醚(30mL)、1M氢氧化钠水溶液(30mL)将目标物萃取于水层。将得到的水层用甲基叔丁基醚(30mL)洗涤。加入甲苯(30mL)、浓盐酸(3.0mL)将目标物再萃取于有机层。将得到的有机层在反应容器的外温40℃减压下浓缩干固，得到(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸粗纯化物(2.8g)。

合成例6：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸粗纯化物的合成

[化学式65]

将2-环戊基-2-氧代-乙酸钠盐(5.3g、33mmol)，甲胺盐酸盐(11g、160mmol)、D-葡萄糖(12g、65mmol)、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(11g、65mmol)溶解于蒸馏水(69mL)，将反应容器的外温设定为25℃。加入50w/v％氢氧化钠水溶液(4.8mL)，调整为pH9.2。加入NADP+(0.25g、0.33mmol)、D-葡萄糖脱氢酶(26mg、1300U、50U/mg)、实施例2中配制的改性酶W253H-SBP-His(2.0mL、作为酶相应于53mg、1.0质量％)，在反应容器的外温25℃搅拌21小时(反应转化率99％以上)。加入浓盐酸(7.5mL)调整为pH1.9，搅拌1小时。将不溶物用硅藻土垫过滤，将硅藻土垫用蒸馏水(11mL)洗涤，得到(S)-2-环戊基-2-(甲基氨基)乙酸溶液(130g)。

应用高效液相色谱的条件1，进行质谱分析(MS(ESI))。在保留时间1.4分钟，确认m/z＝158.1(M+H)⁺的峰，确认得到作为目标的(S)-2-环戊基-2-(甲基氨基)乙酸溶液。

在(S)-2-环戊基-2-(甲基氨基)乙酸溶液(27g、相当于6.5mmol)中加入50w/v％氢氧化钠水溶液(3.2mL)，将pH调整为12.3。将得到的溶液在反应容器的外温40℃浓缩干固。在反应容器的外温25℃加入蒸馏水(24mL)、浓盐酸(0.53mL)将pH配制为9.2。加入甲基叔丁基醚(5.3mL)、乙腈(2.7mL)、N-苄氧羰基氧基琥珀酰亚胺(1.8g、7.2mmol)并搅拌105分钟。加入乙腈(1.6mL)进一步搅拌30分钟。加入50w/v％氢氧化钠水溶液(0.8mL)调整为pH9.3，搅拌105分钟。加入N-苄氧羰基氧基琥珀酰亚胺(1.0g、3.9mmol)并搅拌105分钟。加入50w/v％氢氧化钠水溶液(0.5mL)调整为pH9.2后，加入N-苄氧羰基氧基琥珀酰亚胺(1.1g、4.6mmol)并搅拌13小时。加入浓盐酸(4.3mL)调整为pH0.4后，加入甲基叔丁基醚(3.0mL)，将目标物萃取于有机层。在得到的水层中加入甲基叔丁基醚(5.3mL)，将目标物萃取于有机层。合并得到的有机层，通过加入2M氢氧化钠水溶液(11mL)成为碱性，加入甲基叔丁基醚(5.3mL)将目标物萃取于水层。在水层中加入甲基叔丁基醚(11mL)并洗涤。在水层中加入甲基叔丁基醚(11mL)、浓盐酸(2.1mL)，调整为pH0.0，将目标物萃取于有机层，得到(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸粗纯化物溶液(14g)。

应用高效液相色谱的条件1，进行质谱分析(MS(ESI))。在保留时间3.9分钟，确认m/z＝292.1(M+H)⁺的峰。确认得到作为目标的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸粗纯化物。

合成例7：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸锂盐晶种的合成法

将(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸(1.0g、3.4mmol、市售品)溶解于四氢呋喃(5.0ml、5.0v/w)，在反应容器的外温25℃搅拌。加入叔丁醇锂(0.30g、3.8mmol)，确认晶体的析出。加入四氢呋喃(20ml、20v/w)并搅拌1小时。过滤晶体，将得到的晶体用四氢呋喃(5.0ml、5.0v/w)洗涤。通过在反应容器的外温40℃减压下干燥3小时，得到(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸锂盐(0.90g、收率88％)。

比较例2和实施例1-1：氨基酸衍生物以游离体的纯化和以锂盐的纯化

比较基酸衍生物以游离体(羧酸)的纯化和以锂盐的纯化。将包含杂质的氨基酸衍生物分别作为游离体或锂盐分离，比较表观纯度。表观纯度或表观杂质含有率通过高效液相色谱的UV吸收峰面积比计算。表观纯度通过式1b计算，表观杂质含有率通过式2b计算。

比较例2：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸(游离体)的纯化

将合成例5中得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸粗纯化物(1.4g、作为(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸理论收量1.8g、相当于6.0mmol)溶解于甲苯(3.0mL、1.7v/w)，在反应容器的外温25℃应用搅拌翼搅拌。加入庚烷(1.0mL、0.6v/w)、晶种((S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸(游离体)的晶体、市售品、5.0mg)并搅拌15分钟，确认晶体的析出。经1小时滴加庚烷(5.5mL、3.1v/w)，进一步搅拌30分钟。在反应容器的外温0℃进一步搅拌1小时。过滤晶体，将得到的晶体用庚烷/甲苯(v/v)＝4/1(4.0mL、2.3v/w)洗涤。通过在反应容器的外温40℃减压下干燥1小时，得到(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸(1.3g、收率73％(以合成例5的2-环戊基-2-氧代-乙酸钠盐为基准计算))。

应用高效液相色谱的条件3，通过质谱分析(MS(ESI))进行结构确认。在保留时间2.6分钟，确认杂质之一Cbz-β-Ala-OH具有的m/z＝224.1(M+H)⁺的峰。在保留时间3.9分钟，确认Cbz-MeGly(cPent)-OH具有的m/z＝292.1(M+H)⁺的峰。在210nm的测定波长，测定Cbz-MeGly(cPent)-OH和Cbz-β-Ala-OH的UV吸收峰面积，应用前述式1b和2b计算表观纯度和表观杂质含有率。表观纯度和表观杂质含有率的计算对于合成例5中得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸粗纯化物(纯化前)、和通过比较例2得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸(纯化后)的两者进行。结果示于表26。

[表26]

实施例1-1：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸以锂盐的纯化

[化学式66]

将比较例2中得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸(500mg、1.7mmol)溶解于乙腈(2.5ml、5.0v/w)，在反应容器的外温25℃应用搅拌翼搅拌。加入4M氢氧化锂水溶液(0.47ml、1.9mmol)、蒸馏水(0.50ml、1.0v/w)并在反应容器的外温40℃搅拌20分钟。经10分钟加入乙腈(5.0ml、10v/w)，加入晶种(通过合成例7合成、5.0mg)并搅拌40分钟，确认晶体的析出。将反应容器的外温设定为25℃，搅拌3小时。将反应容器的外温设定为0℃并搅拌30分钟，经5分钟加入乙腈(2.5ml、5.0v/w)，进一步搅拌30分钟。经5分钟加入乙腈(5.0ml、10v/w)，搅拌30分钟。过滤晶体，将得到的晶体用蒸馏水/乙腈(v/v)＝5/95(2.0mL、4.0v/w)洗涤。通过在反应容器的外温40℃减压下干燥3小时，得到(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸锂盐(360mg、收率71％、以比较例2中得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸为基准计算)。

应用高效液相色谱的条件3，进行质谱分析(MS(ESI))和基于其的表观纯度分析。在保留时间2.6分钟，确认杂质之一Cbz-β-Ala-OH的峰。在保留时间3.9分钟，确认Cbz-MeGly(cPent)-OH具有的m/z＝292.1(M+H)⁺的峰。在210nm的测定波长，测定Cbz-MeGly(cPent)-OH和Cbz-β-Ala-OH的UV吸收峰面积，应用前述式1b和式2b计算表观纯度和表观杂质含有率。表观纯度和表观杂质含有率的计算对于通过比较例2得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸(纯化前)、和通过实施例1-1得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸锂盐(纯化后)的两者进行。结果示于表27。

[表27]

N.D.:未未检出

实施例1-2：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸以锂盐的纯化

[化学式67]

将合成例6中得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸粗纯化物溶液(7.0g、作为(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸理论收量0.95g、相当于3.3mmol)在反应容器的外温40℃浓缩干固。加入乙腈(3.2mL、3.4v/w)，在反应容器的外温25℃应用搅拌翼搅拌。添加蒸馏水(0.53mL、0.6v/w)、4M氢氧化锂水溶液(0.90mL、3.6mmol)并搅拌20分钟。经10分钟加入乙腈(2.7mL、2.8v/w)，加入晶种(通过合成例7合成、5.0mg)并搅拌15分钟。经20分钟加入乙腈(5.3mL、5.6v/w)并搅拌17小时。经30分钟加入乙腈(5.3mL、5.6v/w)，搅拌1小时。经30分钟加入乙腈(5.3mL、5.6v/w)，搅拌1小时。过滤晶体，将得到的晶体用蒸馏水/乙腈(v/v)＝5/95(3.2mL、3.4v/w)洗涤，通过在反应容器的外温40℃减压下干燥2.5小时，得到(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸锂盐(收量：620mg、收率：64％、以合成例6的2-环戊基-2-氧代-乙酸钠盐为基准计算)。

应用高效液相色谱的条件1，进行质谱分析(MS(ESI))和基于其的表观纯度分析。在保留时间2.8分钟，确认杂质之一Cbz-β-Ala-OH的峰。在保留时间3.9分钟，确认Cbz-MeGly(cPent)-OH具有的m/z＝292.1(M+H)⁺的峰。在210nm的测定波长，测定Cbz-MeGly(cPent)-OH和Cbz-β-Ala-OH的UV吸收峰面积，应用前述式1b和式2b计算表观纯度和表观杂质含有率。表观纯度和表观杂质含有率的计算对于合成例6中得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸粗纯化物溶液(纯化前)、和通过实施例1-2得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸锂盐(纯化后)的两者进行。结果示于表28。

[表28]

N.D.:未检出

应用高效液相色谱4的条件，实施手性分析。测定波长使用210nm。(S)体和(R)体的保留时间通过标准品(购自Amatek公司)的分析，确认(S)体为16.7分钟，(R)体为17.3分钟。手性分析的结果是，通过实施例1-2得到的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)氨基)-2-环戊基-乙酸锂盐(纯化后)中未检测到(R)体，确认99.9％ee以上的光学纯度。

Claims

1.多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，

在至少一个反应条件下，其对于下述由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐与下述由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或所述化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的所述催化活性高，

[化学式1]

式(1)中，

R¹和R²分别独立地表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基，这些基团任选被取代，R¹或R²的任1个以上是氢原子，

[化学式2]

[化学式3]

[化学式4]

式(2)中，

X表示碳原子，

Y表示氢原子、所述由式(1')表示的基团或所述由式(3)表示的基团，

n表示0以上且2以下的整数，

式(1')中，

[化学式5]

表示与X的结合点，

式(3)中，

[化学式6]

表示与X的结合点，

m表示0以上且6以下的整数，

p是0或1，

q是0或1，

r是0或1，

Z²表示碳原子，

R³、R⁴、和R⁵任选与Z²形成双键或三键，在R³、R⁴、和R⁵的任1个通过双键或三键与Z²结合的情形中，p、q或r的任1个以上是0，式(1)中，在R¹和R²的一个是甲基、并且另一个是氢原子的情形中，式(2)中，Y是所述由式(3)表示的基团，m是0，R³至R⁵中的2个以上不是氢原子。

2.权利要求1中所述的多肽，其中，所述式(1)中，R¹是氢原子，R²是C₁～C₆烷基。

3.权利要求1或2中所述的多肽，其中，式(2)中，Y是C₃～C₈环烷基或C₆～C₉芳烷基，所述芳烷基被C₁～C₃烷基或卤素原子任选取代。

4.多肽，其包含与由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列具有90％以上的序列同一性的序列，并且，在至少一个反应条件下，其对于烷基胺或其盐与下述由式(2')表示的化合物的任1个以上或其盐的还原氨基化反应的催化活性比由序列编号17表示的氨基酸序列组成的多肽的所述催化活性高，

[化学式7]

式中，Y’表示C₃～C₈环烷基、或C₆～C₉芳烷基，所述芳烷基被C₁～C₃烷基或卤素原子任选取代。

5.权利要求4中所述的多肽，其中，所述烷基胺或其盐是选自甲胺、乙胺和它们的盐的1个以上。

6.权利要求4或5中所述的多肽，其中，所述由式(2')表示的化合物或其盐是选自苯基丙酮酸、2-氧代-3-(对甲苯基)丙酸、2-环戊基-2-氧代-乙酸和它们的盐的1个以上。

7.权利要求1～6的任一项中所述的多肽，其中，所述由序列编号1表示的氨基酸序列中1个氨基酸残基被改变的序列是：由序列编号6表示的、X是缬氨酸残基的氨基酸序列，由序列编号6表示的、X是酪氨酸残基的氨基酸序列，由序列编号8表示的、X是亮氨酸残基的氨基酸序列，由序列编号11表示的、X是组氨酸残基的氨基酸序列，或由序列编号12表示的、X是谷氨酸残基的氨基酸序列。

8.多肽，其包含由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于选自44位的组氨酸残基、117位的苯丙氨酸残基、141位的蛋氨酸残基、156位的苏氨酸残基、182位的组氨酸残基、186位的谷氨酰胺残基、253位的色氨酸残基、和260位的赖氨酸残基的1个以上氨基酸残基的部位的氨基酸残基被改变的序列。

9.权利要求8中所述的多肽，在至少一个反应条件下，其对于所述由式(1)表示的化合物A的任1个以上或其盐与所述由式(2)表示的化合物B的任1个以上或其盐的还原氨基化反应、或所述化合物B的任1个以上或其盐的分子内还原氨基化反应的催化活性比具有由序列编号1表示的氨基酸序列的多肽的所述催化活性高。

10.权利要求1～9的任一项中所述的多肽，其包含由序列编号1表示的氨基酸序列中，位于相应于253位的色氨酸残基的部位的氨基酸残基被选自酪氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基、脯氨酸残基、天冬酰胺残基、蛋氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、组氨酸残基、苯丙氨酸残基和丙氨酸残基的一个以上的氨基酸残基取代的序列。

11.权利要求1～10的任一项中所述的多肽，其包含：由序列编号6表示的、X是缬氨酸残基的氨基酸序列，由序列编号6表示的、X是酪氨酸残基的氨基酸序列，由序列编号8表示的、X是亮氨酸残基的氨基酸序列，由序列编号11表示的、X是组氨酸残基的氨基酸序列，或由序列编号12表示的、X是谷氨酸残基的氨基酸序列。

12.氨基酸的制备方法，其包括下列步骤：在权利要求1～11的任一项中所述的多肽和还原剂存在下，

使选自胺、胺类似物和它们的盐的1个以上、与选自酮酸、酮酸类似物和它们的盐的1个以上反应，或

使选自酮酸、酮酸类似物和它们的盐的化合物在分子内反应。

13.权利要求12中所述的制备方法，其中，所述胺或胺类似物由式(1)表示，并且，所述式(1)中R¹和R²与权利要求1的式(1)中所述的R¹和R²分别同义。

14.权利要求12或13中所述的制备方法，其中，所述酮酸或酮酸类似物由式(2)表示，并且，所述式(2)中，式(1')、式(3)、X、Y、Z¹、Z²、R^1a、R³、R⁴、R⁵、R⁶、m、n、p、q和r与权利要求1的式(2)中所述的式(1')、式(3)、X、Y、Z¹、Z²、R^1a、R³、R⁴、R⁵、R⁶、m、n、p、q和r分别同义。

15.权利要求12～14的任一项中所述的制备方法，其中，在下述由式(4)表示的化合物C存在下进行所述反应。

[化学式8]

式(4)中，

v和w分别独立地表示0或1，

v和w中任1个以上表示1，

T表示碳原子、磷原子或硫原子，

下述由式(4a)

[化学式9]

表示的官能团表示＝O、-ORd或羟基，

Ra、Rb和Rc分别独立地表示氢原子、C₁～C₃烷基、烷基氨基或-CH₂-ORd，Ra、Rb、和Rc中任2个以上任选与T共同彼此连接形成环结构，

Rd表示C₁～C₃烷基，

d、e和f分别独立地表示0或1，

d、e和f中任一个以上表示1，

在由式(4a)表示的官能团是羟基、并且T是碳原子的情形中，v是1，w是0，d、e和f均为1，Ra、Rb和Rc均为氢原子。

16.权利要求12～15的任一项中所述的制备方法，其包括以下的步骤(A)和(B)：

步骤(A)；使纯化对象物与含锂物质接触的步骤，所述纯化对象物是通过权利要求12～15的任一项中所述的方法得到的为纯化目标物的以下(i)与为杂质的以下(ii)的混合物，

(i)在N末端具有保护基的所述氨基酸

(ii)所述纯化目标物以外的化合物；

步骤(B)；使所述纯化目标物的锂盐析出的步骤。

17.肽化合物的制备方法，其包括以下的步骤：

(1)通过权利要求12～16的任一项中所述的方法制备氨基酸的步骤；和

(2)将所述氨基酸与选自其它氨基酸和肽的1个以上连接，制备肽化合物的步骤。