CN118374578A - 发夹探针和锁式探针共同作用实现rna原位荧光成像的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明介绍了一种采用发夹探针对RNA进行原位荧光成像的方法。发夹探针针对靶序列专门设计，利用滚环扩增技术和荧光显微镜成像技术实现了高灵敏、高特异的RNA原位检测。发夹探针识别并结合靶序列后打开茎环结构，让一条茎与锁式探针结合开启RCA，相比于直接通过锁式探针识别靶序列后加入引物开启RCA，增加了碱基互补配对准确性的要求，提高了检测的特异性。发夹探针作为锁式探针的夹板和引物，利用高活性T4连接酶连接成环，提高了检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于RNA原位表达分析技术领域，具体涉及一种以发夹探针和锁式探针共同作用而实现RNA高特异、高灵敏的原位检测的方法。
背景技术
原位RCA技术已被用于实现细胞内高特异性单分子mRNA成像。RCA能够实现局域化的、恒温的及一对一的扩增，因此可以实现对单个目标分子空间的定位。但是，基于RCA扩增技术的方法应用在mRNA原位成像上还存在一些问题，使该方法没有被广泛应用。
第一，一般需要经过一个逆转录过程将目标mRNA转变成cDNA序列，这个过程将在mRNA定量过程中引入的更多的反应步骤和影响因素，检测效率低，同时使检测方法变得非常复杂。第二，近年发展的适用于m RNA检测的连接酶Splint R连接酶，plint R连接酶能够以RNA为模板催化连接锁式探针，因此使能够不需要经过逆转录地实现对m RNA的检测，然而由于Splint R连接酶保真度相对不尽人意，因此在单碱基识别能力上需要进一步提高，此外。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种RNA原位荧光成像的方法，提高了检测灵敏度和特异性。
本发明的另一个目的在于提供一种基于T4连接酶连接的RNA原位荧光成像的方法，提高原位成像的检测灵敏度。
本发明的又一个目的在于提供基于发夹探针打开一种RNA原位荧光成像的方法，以利于进一步实施单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)分析。
本发明的RNA原位荧光成像的方法，将发夹探针(Hairpin Probe，HP)和锁式探针(Padlock Ligation Probe，PLP)共同作用实现RNA原位检测方法是在原位杂交环节加入了HP，通过HP与PLP的双重杂交开启滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)反应，增加了碱基互补配对准确性的要求，提高了信号的特异性。
一种RNA原位荧光成像的方法，以具有更高特异性的HP和PLP共同作用实现原位荧光成像，HP和PLP系根据目标RNA上的靶序列对应设计而得，并将与靶序列互补配对的识别序列放置在HP的环部。
一种用于靠近RNA原位荧光成像的方法的HP，其具有如下结构：
与目标RNA上靶序列互补配对的识别序列放置在HP的环部，分别位于HP的5’端和3’端具有完全互补的序列而构成茎部，3’端茎部的序列和识别序列之间还有一段中间序列，该中间序列和3’端茎部的序列的一部分又组成了和PLP两端互补并辅助PLP环化的修复序列。
另一种用于靠近RNA原位荧光成像的方法的HP，其具有如下结构：
HP的5’端的第一核酸序列(CCACACG)与和靠近3’端的第二核酸序列(CGTGTGG)完全互补；在溶液中，HP首尾结合形成双链从而构成HP的茎部分，而与目标RNA上的靶序列互补的第三核酸序列(CCCCGGATTACTTGC)仍保持单链构成HP的环部分，第二核酸序列与第三核酸序列之间还有一段第四核酸序列(AGGAT)，第四核酸序列与第二核酸序列共同组成与PLP两端互补配对的第五核酸序列(AGGATCGTGTGG)，用于PLP的环化，同时还能作为PLP的引物引导RCA的启动。
具体的，本发明的方法包括如下步骤：
(1)将HP输送至含靶序列的细胞内，使其与靶序列识别并杂交，当HP的第三核酸序列与靶序列识别并形成双链的同时，已经形成的茎部在竞争性不足的情况下双链打开，形成单链结构；
(2)将PLP输送至经步骤(1)处理的细胞内，使PLP与线性的HP杂交，通过DNA连接酶将PLP的5’端和3’端连接形成环状单链DNA分子；
(3)将步骤(2)得到的环状DNA分子作为模板，加入DNA聚合酶进行RCA，获得滚环扩增产物(Rolling Circle Product,RCP)，每个RCP上都有多个检测探针识别的位点；
(4)向步骤(3)得到的RCP添加修饰了荧光基团的检测探针(Detection Probe，DP)，通过荧光显微镜对目标RNA进行原位荧光成像，实现RNA原位检测。
在本发明的一个优选实施方案中，所述目标RNA系在细胞内部表达的RNA，包括细胞自身具有表明其物种特性的基因，也包括通过人为转染或转导的外源性基因，还包括自然发生而转染或转导的外源性基因。
在本发明的一个优选实施方案中，所述DNA连接酶为T4连接酶。
在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞为经分离获得的游离细胞或尚作为组织一部分的细胞。
本发明的有益效果是：
1.本发明通过特殊设计的HP和PLP共同作用下实现具有更高特异性和灵敏度的荧光原位成像方法。
2.本发明将与目标RNA上靶序列互补配对的识别序列放置在HP的环部，与将识别序列直接放在PLP的两端相比，增加了HP的特异性识别过程，提高了信号的特异性。
3.本发明将与目标RNA上靶序列互补配对的识别序列放置在HP的环部，与将识别序列直接放在PLP的两端相比，HP环部的识别序列要结合靶序列，需要和互补配对的茎序列发生竞争，如果靶序列存在错配，茎环结构的HP难以被打开变为线性探针，则无法与PLP结合启动RCA，从而提高了SNP检测能力。
4、本发明发夹探针作为锁式探针的夹板和引物，利用高活性DNA连接酶，如T4连接酶连接成环，提高了检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明实施例2发夹探针RNA荧光原位杂交实验原理图。
图2为本发明实施例2发夹探针RNA荧光原位检测结果图，A:凝胶电泳分析RCA产物；B:通过发夹探针RNA荧光原位检测SK-BR-3细胞系mRNA；C:不含发夹探针，结果表明，电泳条带和信号点来自对目标mRNA的特异性扩增。
图3为本发明实施例4不同甲酰胺浓度对发夹探针检测SK-BR-3和A549细胞系HER2基因表达mRNA结果图，结果表明，发夹探针杂交buffer中甲酰胺工作浓度为0作为后续实验条件。
图4为本发明20％甲酰胺洗涤条件荧光原位检测结果图，探针杂交后，利用20％甲酰胺洗涤可以有效降低背景非特异。
图5为本发明5与经典锁式探针方法检测结果对比图，本发明具有更高的检测效率。
图6为本发明6发夹探针RNA荧光原位检测方法识别单碱基结果图，本发明的发夹探针RNA荧光原位检测方法具有单碱基识别能力。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1：发夹探针和锁式探针对靶序列的RCA效果验证。
本实施例的实验结果如图4所示，具体步骤如下：
(1)锁式探针杂交与环化
设置阴性对照(Negative control，NC)和阳性对照(Positive control，PC)两个实验组，反应体系均为25μL。在PC中含有终浓度为0.4μM发夹探针、0.4μM锁式探针、0.8μMHER2 mRNA、1×T4 DNA ligase buffer和0.1U/μL T4 DNA连接酶的反应混合液；在NC中不含HER2 mRNA，其它组分与PC完全一致。将PC和NC置于16℃下反应3h。
HP-HER2的序列为：其中，序列AGGATCGTGTGG为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与靶标杂交序列。
PLP序列为：
其中，序列GATCCT/CCACAC为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与引物杂交序列。
HER2 mRNA序列为：AGAACCUGCAAGUAAUCCGGGGACGAAUUCU G。
(2)滚环扩增
将经过步骤(1)处理的样品中加入终浓度为0.2μg/μL BSA、1mM dNTPs、1×Phi29DNA聚合酶缓冲液、1U/μL Phi29聚合酶的DEPC-H2O的杂交混合液，终体积为50μL。将样品置在37℃反应2h，进行RCA。
(3)琼脂糖凝胶电泳
将步骤(2)得到的样品取10μL后，分别加入2μL上样缓冲液，充分混匀，加入2％的琼脂糖凝胶加样孔中，在100V，80mA下电泳30-45min。最后在凝胶成像仪中进行图像采集。
在实施例1中，发夹探针与锁式探针具备对靶序列RCA的能力，具体如图2A所示。
实施例2：SK-BR3细胞(国家实验室细胞资源共享平台)和A549细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)为试验样品对HER2基因的表达水平进行原位检测。
本实施例的实验原理如图1所示，具体步骤如下：
(一)细胞爬片与固定：
人乳腺癌细胞系SK-BR-3经RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％双抗SP)及人非小细胞肺癌细胞系A549经DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS、1％双抗SP)培养24-48h后，用胰蛋白酶处理成悬浮细胞，并种板于表面带多聚赖氨酸的无菌载玻片上，重新培养12-24h。然后弃去制作细胞爬片的培养皿中的培养基，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)-PBS浸没过载玻片，将培养皿平铺放置在超净工作台上，轻微晃动皿身，清洗3次，每次3min后弃去废液。向培养皿中加入4％多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)，在室温下固定30min后弃去废液。向培养皿中加入DEPC-PBS，清洗3次，每次3min以终止PFA的固定作用。在培养皿中相继加换70％、85％和100％乙醇，在每种溶液中放置5min以进行脱水。放置使玻片完全干燥，记录信息和编号进行原位检测实验或放置玻片盒中，-80℃保存以备用。
(二)细胞的预处理
(1)细胞透化
细胞样品首先用含有0.1％ Tween 20的DEPC-PBS(DEPC-PBST)冲洗，然后用含有0.1M HCl室温孵育5min。
(2)发夹探针原位杂交
在载玻片上滴加50μL含有终浓度为2×SSC缓冲液(2xSSC 300mM氯化钠、30mM柠檬酸钠(pH7.0)增加1.5mM镁离子)和0.2μM发夹探针的DEPC-H2O杂交混合液，37℃下孵育2h，使发夹探针对与靶标序列充分杂交。用DEPC PBST洗3次后，每次洗涤2min，再用2×SSC缓冲液，20％甲酰胺37℃洗3次，每次10min，以去除多余的未杂交发夹探针，空气晾干。
HP-HER2的序列为： 其中，序列AGGATCGTGTGG为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与靶标杂交序列。
(3)锁式探针杂交与环化
在样本中加入50μL含有终浓度为0.2μM锁式探针、1U/μL RiboLock RNaseInhibitor、1×T4 DNA ligase buffer和0.1U/μL T4 DNA连接酶的DEPC-H2O反应混合液，于37℃下反应30min。然后再用DEPC-PBST冲洗3次，每次洗涤2min。
PLP序列为:
其中，序列GATCCT/CCACAC为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与引物杂交序列。
(4)滚环扩增
在样品中加入含有5％甘油、0.2μg/μL BSA、1mM dNTPs、1×Phi29 DNA聚合酶缓冲液、1U/μL Phi29聚合酶的DEPC-H2O的杂交混合液，在37℃反应3h，进行RCA。反应后使用DEPC-PBST进行三次洗涤，每次洗涤2min。
(5)荧光检测探针杂交和图像获取
将上述RCP与检测探针DP杂交。在经过步骤(4)处理后的样品中加入含有0.2μMDP、20％甲酰胺和2×SSC的反应混合液，37℃下孵育30min后用DEPC PBST洗3次。空气晾干。最后加入含有0.5μg/mL DAPI的Gold Anti fade Mountan封片剂(Fermantas)室温下孵育10min后进行荧光显微镜检测并拍照。
DP序列：5’端修饰Cy3荧光基团。
在实施例2中，SK-BR3细胞(国家实验室细胞资源共享平台)和A549细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)为试验样品对HER2基因的表达水平进行原位检测结果与预期结果一致，具体如图2B和图2C所示。
实施例3：A549细胞为试验样品对EGFP基因的表达水平进行原位检测。
(一)细胞爬片与固定：
人非小细胞肺癌细胞系A549经DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS、1％双抗SP)培养24-48h后，用胰蛋白酶处理成悬浮细胞，并种板于表面带多聚赖氨酸的无菌载玻片上，重新培养12-24h。然后弃去制作细胞爬片的培养皿中的培养基，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)-PBS浸没过载玻片，将培养皿平铺放置在超净工作台上，轻微晃动皿身，清洗3次，每次3min后弃去废液。向培养皿中加入4％多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)，在室温下固定530min后弃去废液。向培养皿中加入DEPC-PBS，清洗3次，每次3min以终止PFA的固定作用。在培养皿中相继加换70％、85％和100％乙醇，在每种溶液中放置5min以进行脱水。放置使玻片完全干燥，记录信息和编号进行原位检测实验或放置玻片盒中，-80℃保存以备用。
(二)细胞的预处理
(1)细胞透化
细胞样品首先用含有0.1％ Tween 20的DEPC-PBS(DEPC-PBST)冲洗，然后用含有0.1M HCl室温孵育5min。
(2)发夹探针原位杂交
在载玻片上滴加50μL含有终浓度为2×SSC缓冲液(2xSSC 300mM氯化钠、30mM柠檬酸钠(pH7.0)增加1.5mM镁离子)和0.2μM发夹探针的DEPC-H2O杂交混合液，37℃下孵育2h，使发夹探针对与靶标序列充分杂交。用DEPC PBST洗3次后，每次洗涤2min，再用2×SSC缓冲液，20％甲酰胺37℃洗3次，每次10min，以去除多余的未杂交发夹探针，空气晾干。
HP-EGFP的序列为： 其中，序列AGGATCGTGTGG为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与靶标杂交序列。
(3)锁式探针杂交与环化
在样本中加入50μL含有终浓度为0.2μM锁式探针、1U/μL RiboLock RNaseInhibitor、1×T4 DNA ligase buffer和0.1U/μL T4 DNA连接酶的DEPC-H2O反应混合液，于37℃下反应30min。然后再用DEPC-PBST冲洗3次，每次洗涤2min。
PLP序列为:
其中，序列GATCCT/CCACAC为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与引物杂交序列。
(4)滚环扩增
在样品中加入含有5％甘油、0.2μg/μL BSA、1mM dNTPs、1×Phi29 DNA聚合酶缓冲液、1U/μL Phi29聚合酶的DEPC-H2O的杂交混合液，在37℃反应3h，进行RCA。反应后使用DEPC-PBST进行三次洗涤，每次洗涤2min。
(5)荧光检测探针杂交和图像获取
将上述RCP与检测探针DP杂交。在经过步骤(4)处理后的样品中加入含有0.2μMDP、20％甲酰胺和2×SSC的反应混合液，37℃下孵育30min后用DEPC PBST洗3次。空气晾干。最后加入含有0.5μg/mL DAPI的Gold Anti fade Mountan封片剂(Fermantas)室温下孵育10min后进行荧光显微镜检测并拍照。
DP序列：5’端修饰Cy3荧光基团。
在实施例3中，A549细胞为试验样品对EGFP基因的表达水平进行原位检测结果与预期结果一致，具体如图4所示。
实施例4：SK-BR-3细胞和A549细胞为试验样品对甲酰胺工作浓度进行优化。
(一)细胞爬片与固定：
人乳腺癌细胞系SK-BR-3经RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％双抗SP)及人非小细胞肺癌细胞系A549经DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS、1％双抗SP)培养24-48h后，用胰蛋白酶处理成悬浮细胞，并种板于表面带多聚赖氨酸的无菌载玻片上，重新培养12-24h。然后弃去制作细胞爬片的培养皿中的培养基，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)-PBS浸没过载玻片，将培养皿平铺放置在超净工作台上，轻微晃动皿身，清洗3次，每次3min后弃去废液。向培养皿中加入4％多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)，在室温下固定30min后弃去废液。向培养皿中加入DEPC-PBS，清洗3次，每次3min以终止PFA的固定作用。在培养皿中相继加换70％、85％和100％乙醇，在每种溶液中放置5min以进行脱水。放置使玻片完全干燥，记录信息和编号进行原位检测实验或放置玻片盒中，-80℃保存以备用。
(二)细胞的预处理
(1)细胞透化
细胞样品首先用含有0.1％ Tween 20的DEPC-PBS(DEPC-PBST)冲洗，然后用含有0.1M HCl室温孵育5min。
(2)发夹探针原位杂交
设置了三个样，其中甲酰胺浓度分别为0％、5％、10％，在载玻片上滴加50μL含有终浓度为2×SSC缓冲液(2xSSC 300mM氯化钠、30mM柠檬酸钠(pH7.0)增加1.5mM镁离子)、和0.2μM发夹探针的DEPC-H2O杂交混合液，37℃下孵育2h，使发夹探针对与靶标序列充分杂交。用DEPC PBST洗3次后，每次洗涤2min，再用2×SSC缓冲液，20％甲酰胺37℃洗3次，每次10min，以去除多余的未杂交发夹探针，空气晾干。
HP-HER2的序列为： 其中，序列AGGATCGTGTGG为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与靶标杂交序列。
(3)锁式探针杂交与环化
在样本中加入50μL含有终浓度为0.2μM锁式探针、1U/μL RiboLock RNaseInhibitor、1×T4 DNA ligase buffer和0.1U/μL T4 DNA连接酶的DEPC-H2O反应混合液，于37℃下反应30min。然后再用DEPC-PBST冲洗3次，每次洗涤2min。
PLP序列为:
其中，序列GATCCT/CCACAC为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与引物杂交序列。
(4)滚环扩增
在样品中加入含有5％甘油、0.2μg/μL BSA、1mM dNTPs、1×Phi29 DNA聚合酶缓冲液、1U/μL Phi29聚合酶的DEPC-H2O的杂交混合液，在37℃反应3h，进行RCA。反应后使用DEPC-PBST进行三次洗涤，每次洗涤2min。
(5)荧光检测探针杂交和图像获取
将上述RCP与检测探针DP杂交。在经过步骤(4)处理后的样品中加入含有0.2μMDP、20％甲酰胺和2×SSC的反应混合液，37℃下孵育30min后用DEPC PBST洗3次。空气晾干。最后加入含有0.5μg/mL DAPI的Gold Anti fade Mountan封片剂(Fermantas)室温下孵育10min后进行荧光显微镜检测并拍照。
DP序列：5’端修饰Cy3荧光基团。
在实施例4中，SK-BR-3细胞和A549细胞为试验样品对甲酰胺工作浓度进行优化，甲酰胺浓度为0％效果最佳，具体如图3所示。
实施例5：经典锁式探针方法。
本实施例的具体步骤如下：
(一)细胞爬片与固定：
人乳腺腺癌细胞系SK-BR-3经RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％双抗SP)及人非小细胞肺癌细胞系A549经DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS、1％双抗SP)培养24-48h后，用胰蛋白酶处理成悬浮细胞，并种板于表面带多聚赖氨酸的无菌载玻片上，重新培养12-24h。然后弃去制作细胞爬片的培养皿中的培养基，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)-PBS浸没过载玻片，将培养皿平铺放置在超净工作台上，轻微晃动皿身，清洗3次，每次3min后弃去废液。向培养皿中加入4％多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)，在室温下固定530min后弃去废液。向培养皿中加入DEPC-PBS，清洗3次，每次3min以终止PFA的固定作用。在培养皿中相继加换70％、85％和100％乙醇，在每种溶液中放置5min以进行脱水。放置使玻片完全干燥，记录信息和编号进行原位检测实验或放置玻片盒中，-80℃保存以备用。
(二)细胞的预处理
(1)细胞透化
细胞样品首先用含有0.1％Tween 20的DEPC-PBS(DEPC-PBST)冲洗，然后用含有0.1M HCl室温孵育5min。
(2)锁式探针杂交
在载玻片上滴加50μL含有终浓度为6×SSC缓冲液(Sigma)、10％甲酰胺和0.2μM锁式探针的DEPC-H2O杂交混合液，37℃下孵育2h，使锁式探针对与靶标序列充分杂交。用DEPC-PBST清洗3次后，每次洗涤2min，以去除多余的未杂交锁式探针，空气晾干。
PLP-HER2的序列为：
其中，序列ATTACTTGCAGGTTCT/CAGAATTCGTCCCCGG为用于与待测RNA互补配对序列，加框突出显示部分为用于引物扩增的序列。
(3)锁式探针环化
在样本中加入50μL含有终浓度为1×Splint R连接酶反应缓冲液(NEB)、50％甘油、0.5U/μL SplintR连接酶(NEB)、1U/μL RiboLock RNase Inhibitor(ThermoScientificPromega)、0.2μg/μL BSA(NEB)的DEPC-H2O的杂交混合液，在37℃下孵育30min，然后再用DEPC-PBST冲洗3次，以去除未连接的锁式探针和酶。
(4)引物杂交
在样品中加入50μL含有终浓度为6×SSC缓冲液、2010％甲酰胺和0.2μM RCA引物的DEPC-H2O杂交混合液，在37℃孵育30min，用DEPC-PBST洗涤3次，每次洗涤2min，去除未杂交的RCA引物。
RCA引物的序列为：ACAGCAGCAGCATTGAGGTC。
(5)滚环扩增
在样品中加入50μL含有终浓度为5％甘油、0.2μg/μL BSA(Sigma)、1mM dNTPs(天根)、1×Phi29 DNA聚合酶缓冲液(NEB)、1U/μL Phi29聚合酶(NEB)的DEPC-H2O的杂交混合液，在37℃反应3h，进行RCA。反应后使用DEPC-PBST进行3次洗涤，每次洗涤2min。
(6)检测探针杂交和图像获取
将上述RCP与检测探针DP杂交。在经过步骤(5)处理后的样品中加入含有0.2μMDP、20％甲酰胺和2×SSC的反应混合液，37℃下孵育30min后用DEPC PBST洗3次。空气晾干。最后加入含有0.5μg/mL DAPI的Gold Anti fade Mountan封片剂(Fermantas)室温下孵育10min后进行荧光显微镜检测并拍照。
DP序列：5’端修饰Cy3荧光基团。
在实施例5中，与经典荧光原位检测方法对比，具有相同的检测效率，具体如图5所示。
实施例6：SNP实验。
(一)细胞爬片与固定：
人乳腺癌细胞系SK-BR-3经RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％双抗SP)及人非小细胞肺癌细胞系A549经DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS、1％双抗SP)培养24-48h后，用胰蛋白酶处理成悬浮细胞，并种板于表面带多聚赖氨酸的无菌载玻片上，重新培养12-24h。然后弃去制作细胞爬片的培养皿中的培养基，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)-PBS浸没过载玻片，将培养皿平铺放置在超净工作台上，轻微晃动皿身，清洗3次，每次3min后弃去废液。向培养皿中加入4％多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)，在室温下固定30min后弃去废液。向培养皿中加入DEPC-PBS，清洗3次，每次3min以终止PFA的固定作用。在培养皿中相继加换70％、85％和100％乙醇，在每种溶液中放置5min以进行脱水。放置使玻片完全干燥，记录信息和编号进行原位检测实验或放置玻片盒中，-80℃保存以备用。
(二)细胞的预处理
(1)细胞透化
细胞样品首先用含有0.1％ Tween 20的DEPC-PBS(DEPC-PBST)冲洗，然后用含有0.1M HCl室温孵育5min。
(2)发夹探针原位杂交
在载玻片上滴加50μL含有终浓度为2×SSC缓冲液(2xSSC 300mM氯化钠、30mM柠檬酸钠(pH7.0)增加1.5mM镁离子)、和0.2μM发夹探针(MIS0、MIS1)的DEPC-H2O杂交混合液，37℃下孵育2h，使发夹探针对与靶标序列充分杂交。用DEPC PBST洗3次后，每次洗涤2min，再用2×SSC缓冲液，20％甲酰胺37℃洗3次，每次10min，以去除多余的未杂交发夹探针，空气晾干。
HP-HER2(MIS0)的序列为：
HP-HER2(MIS1)的序列为：
其中，序列AGGATCGTGTGG/AGGATCGTGTGG为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与靶标杂交序列。
(3)锁式探针杂交与环化
在样本中加入50μL含有终浓度为0.2μM锁式探针、1U/μL RiboLock RNaseInhibitor、1×T4 DNA ligase buffer和0.1U/μL T4 DNA连接酶的DEPC-H2O反应混合液，于37℃下反应30min。然后再用DEPC-PBST冲洗3次，每次洗涤2min。
PLP序列为:
其中，序列GATCCT/CCACAC为与锁式探针杂交序列，加框突出显示部分为与引物杂交序列。
(4)滚环扩增
在样品中加入含有5％甘油、0.2μg/μL BSA、1mM dNTPs、1×Phi29 DNA聚合酶缓冲液、1U/μL Phi29聚合酶的DEPC-H2O的杂交混合液，在37℃反应3h，进行RCA。反应后使用DEPC-PBST进行三次洗涤，每次洗涤2min。
(5)荧光检测探针杂交和图像获取
将上述RCP与检测探针DP杂交。在经过步骤(4)处理后的样品中加入含有0.2μMDP、20％甲酰胺和2×SSC的反应混合液，37℃下孵育30min后用DEPC PBST洗3次。空气晾干。最后加入含有0.5μg/mL DAPI的Gold Anti fade Mountan封片剂(Fermantas)室温下孵育10min后进行荧光显微镜检测并拍照。
DP序列：5’端修饰Cy3荧光基团。
在实施例6中，发夹探针RNA荧光原位检测方法具有单碱基识别能力，具体如图6所示。
Claims (6)
1.一种RNA原位荧光成像方法，其特征在于：将发夹探针和锁式探针共同作用实现RNA原位检测，在原位杂交环节加入了发夹探针，通过发夹探针与锁式探针的双重杂交开启滚环扩增反应，实现RNA原位荧光成像；
所述的发夹探针和所述的锁式探针系根据目标RNA上的靶序列对应设计而得，并将与靶序列互补配对的识别序列放置在发夹探针的环部；
所述发夹探针的5’端和3’端具有完全互补的序列而构成茎部；
3’端茎部的序列和识别序列之间还有一段中间序列，该中间序列和3’端茎部序列的一部分又组成了和锁式探针两端互补并辅助锁式探针环化的修复序列。
2.根据权利要求1所述的RNA原位荧光成像方法，其特征在于：所述发夹探针的5’端的第一核酸序列与和靠近3’端的第二核酸序列完全互补；在溶液中，发夹探针首尾结合形成双链从而构成发夹探针的茎部分，而与目标RNA上的靶序列互补的第三核酸序列仍保持单链构成发夹探针的环部分，第二核酸序列与第三核酸序列之间还有一段第四核酸序列，第四核酸序列与第二核酸序列共同组成与锁式探针两端互补配对的第五核酸序列，用于锁式探针的环化，同时还能作为锁式探针的引物引导滚环扩增反应的启动。
3.根据权利要求1所述的RNA原位荧光成像方法，其特征在于：还包括以下步骤：
1)将发夹探针输送至含目标RNA靶序列的细胞内，使其与靶序列识别并杂交，当发夹探针的环序列与靶序列识别并形成双链的同时，所述发夹探针的茎部在竞争性不足的情况下双链打开，形成单链结构；
2)将锁式探针输送至经步骤1)处理的细胞内，锁式探针和线性的发夹探针杂交，通过DNA连接酶将锁式探针的5’端和3’端连接形成环状单链DNA分子；
3)将步骤2)得到的环状DNA分子作为模板，加入DNA聚合酶进行滚环扩增反应，获得滚环扩增产物，每个滚环扩增产物上都有多个检测探针识别的位点；
4)向步骤3)所得滚环扩增产物添加修饰了荧光基团的检测探针，通过荧光显微镜对目标RNA进行原位荧光成像，实现RNA原位检测。
4.根据权利要求3所述的RNA原位荧光成像方法，其特征在于：所述DNA连接酶为T4连接酶。
5.根据权利要求1或3所述的RNA原位荧光成像方法，其特征在于：目标RNA系在细胞内部表达的RNA，包括细胞自身具有表明其物种特性的基因，也包括通过人为转染或转导的外源性基因，还包括自然发生而转染或转导的外源性基因。
6.根据权利要求1或3所述的RNA原位荧光成像方法，其特征在于：所述细胞为经分离获得的游离细胞或尚作为组织一部分的细胞。
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