CN118344362A - 一种白背叶内生真菌中抗肿瘤活性化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白背叶内生真菌中抗肿瘤活性化合物及其制备方法，所述抗肿瘤活性化合物具有化合物1‑2所示结构：
Description
技术领域
本发明属于真菌次级代谢产物领域，具体涉及一种白背叶内生真菌中抗肿瘤活性化合物及其制备方法。
背景技术
白背叶是大戟科、野桐属的小乔木或灌木，根有小毒，有清热平肝，健脾化湿，收敛固脱的功效；叶有清热利湿，消炎解毒，止血止痛的功效；根可用于治疗急慢性肝炎，肝脾肿大，消化不良，风湿关节痛等症状，叶外用于中耳炎，病肿，湿疹，跌打损伤等症状。本发明从海南东寨港野菠萝岛红树林自然保护区采摘白背叶根，分离获得一株内生真菌BYS8，并从中分离获得2个抗肿瘤活性化合物。
发明内容
本发明提供一种白背叶来源真菌BYS8，特征在于其菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年11月16日；保藏编号：CGMCCNo.40924；分类命名：土曲霉Aspergillus terreus。
本发明的另一实施方案提供一种抗肿瘤活性化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述抗肿瘤活性化合物具有化合物1-2所示结构：
本发明的另一实施方案提供上述抗肿瘤活性化合物1-2的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制种子培养基，将白背叶来源真菌BYS8接入种子培养基种子，28℃恒温培养3天得种子培养液；
(2)将步骤(1)得到的种子培养液接入发酵培养基中，28℃恒温静置培养28-30天得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，其中发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，将梯度为80:20得到的洗脱液浓缩后，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝1:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝25:75，最终得到化合物1、2。
其中所述洗脱剂或流动相的比例均为体积比；所述种子培养基中含有葡萄糖1.5％–3.0％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；所述发酵培养基中含有葡萄糖1.6％–3.5％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；上述百分比均为重量百分比；所述种子培养基和发酵培养基均需120℃灭25–30分钟。
本发明的另一实施方案提供白背叶来源真菌BYS8在制备抗肿瘤化合物1和/或2中的应用。优选针对Hela肿瘤细胞。
本发明的另一实施方案提供上述化合物1、2或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于以上述化合物1、2或其药学上可接受的盐作为有效成分。
本发明提供的上述抗肿瘤药物组合物，还可包含其他抗肿瘤药物；也可以包含药学上可接受的辅料(优选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。上述药物组合物的剂型可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。
附图说明
图1是化合物1的1H NMR图。
图2是化合物1的13C NMR图。
图3是化合物1的135°DEPT图。
图4是化合物1的H-H COSY图。
图5是化合物1的HMBC图。
图6是化合物2的1H NMR图。
图7是化合物2的13C NMR图。
图8是化合物2的135°DEPT图。
图9是化合物2的HMBC图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)白背叶来源真菌BYS8的菌种培养
配制种子培养基：葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，粗海盐2.5g，水1.0L，平均分装于2个1000mL锥形瓶，120℃灭25分钟。
将白背叶来源真菌BYS8菌株接入配制好的种子培养基中，于28℃下恒温培养3天得种子培养液；
(2)白背叶来源真菌BYS8的发酵
配制发酵培养基：葡萄糖1.1kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g，水50L，平均分装于100个1000mL锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液(10mL/瓶)接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于28℃恒温静置培养28天得发酵物。
(3)浸膏的制备
将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏(24.3g)；
(4)化合物1、2的提取分离
步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，将梯度为80:20得到的洗脱液浓缩后，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝1:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝25:75，最终得到化合物1(11.2mg)、2(13.4mg)。
化合物1：ESI-MS m/z 389.1[M+H]+.
化合物2：ESI-MS m/z 373.1[M+H]+.
化合物1和2的1H NMR(600M Hz)和13C NMR(150M Hz)
实施例2
(1)白背叶来源真菌BYS8的菌种培养
配制种子培养基(10.0L)：葡萄糖1.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于16个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将角果木真菌Colletotrichum gloeosporioides接入配制好的种子培养基中，于28℃恒温培养3天得种子培养液；
(2)白背叶来源真菌BYS8的发酵
配制发酵培养基(100L)：葡萄糖1.6％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于200个1000mL锥形瓶，120℃灭30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于28℃静置培养30天得发酵物。
(3)浸膏的制备
将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)化合物1-2的提取分离
步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，将梯度为80:20得到的洗脱液浓缩后，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝1:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝25:75，最终得到化合物1、2。
实施例3
(1)白背叶来源真菌BYS8的菌种培养
配制种子培养基(1.0L)：葡萄糖3.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于3个500mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将白背叶来源真菌BYS8菌株接入配制好的种子培养基中，于28℃恒温培养3天得种子培养液；
(2)白背叶来源真菌BYS8的发酵
配制发酵培养基(10L)：葡萄糖3.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于20个1000mL锥形瓶，120℃灭25分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于28℃恒温静置培养29天得发酵物。
(3)浸膏的制备
将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)化合物1-2的提取分离
步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，将梯度为80:20得到的洗脱液浓缩后，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝1:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝25:75，最终得到化合物1、2。
实施例4抗肿瘤活性测试
使用MTT法，测试了化合物1-2对肿瘤细胞株Hela细胞毒活性。取处于指数生长期的肿瘤细胞，加入0.02％Trypsin-EDTA使贴壁细胞脱落，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，计数并调整细胞数后接种于96孔板，置于37℃二氧化碳培养箱内培养24h。将待测化合物分设成2.00,5.00,10.00,20.00μg/mL，每组3个平行。待测样品用DMSO助溶，RPMI1640稀释后加入96孔板，37℃二氧化碳培养箱内培养72h。MTT用无血清RPMI1640溶解，每孔加50μL。置于37℃二氧化碳培养箱内培养4h，取出，吸出上清液，每孔加入DMSO150μL溶解生成的甲臜，用酶标仪630nm处测定吸光值并计算相应抑制率和IC50值。盐酸阿霉素adriamycin hydrochloride为阳性对照。使用以下公式计算每个样品的抑制率：
抑制率＝[(ODcompound-ODDMSO)/ODDMSO]×100％。使用GraphPad Prism软件测定IC50值。
| 测试化合物 | IC50(μM) |
| 化合物1 | 55.6±0.51 |
| 化合物2 | 24.2±0.16 |
| 盐酸阿霉素 | 3.16±0.04 |
Claims (10)
1.一种抗肿瘤活性化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述抗肿瘤活性化合物具有化合物1-2所示结构：
2.一种制备权利要求1所述抗肿瘤活性化合物1-2的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制种子培养基，将白背叶来源真菌BYS8接入种子培养基种子，28℃恒温培养3天得种子培养液；
(2)将步骤(1)得到的种子培养液接入发酵培养基中，28℃恒温静置培养28-30天得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，其中发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
(4)步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，将梯度为80:20得到的洗脱液浓缩后，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿:甲醇＝1:1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝25:75，最终得到化合物1、2。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述白背叶来源真菌BYS8的菌种保藏信息如下：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年11月16日；保藏编号：CGMCC No.40924；分类命名：土曲霉Aspergillus terreus。
4.权利要求3所述的白背叶来源真菌BYS8。
5.权利要求4所述的白背叶来源真菌BYS8在制备权利要求1所述抗肿瘤活性化合物1-2中的应用。
6.权利要求1所述的化合物1、2或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。优选针对Hela肿瘤细胞。
7.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于以权利要求1所述的化合物1、2或其药学上可接受的盐作为有效成分。
8.权利要求7所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于还可包含其他抗肿瘤药物。
9.权利要求7-8任一项所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于也可以包含药学上可接受的辅料(优选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。
10.权利要求7-9任一项所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于该药物组合物的剂型可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410064027.0A CN118344362A (zh) | 2024-01-16 | 2024-01-16 | 一种白背叶内生真菌中抗肿瘤活性化合物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| CN118344362A true CN118344362A (zh) | 2024-07-16 |
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2024
- 2024-01-16 CN CN202410064027.0A patent/CN118344362A/zh active Pending
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