CN118339183A

CN118339183A - 组合中针对pd-l1和cd137的多特异性结合剂

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Publication number: CN118339183A
Application number: CN202280073882.7A
Authority: CN
Inventors: A·穆克; K·纽尔姆伯格; N·彭彻瓦; M·N·朱尔-昆克尔; U·萨新; S·费勒莫尔-科普夫; P·加里多卡斯特罗; J·布卢姆; F·吉泽克; E·C·W·布雷伊; L·盖伦; J·奈杰森; K·贝克曼; C·保尔曼; B-J·德克鲁克; R·希伯特; J·舒尔曼; A·拉布里金; I·库兹曼诺夫
Original assignee: Debiotech SA; Jian Mabao
Current assignee: Debiotech SA; Jian Mabao
Priority date: 2021-10-06
Filing date: 2022-10-05
Publication date: 2024-07-12

Abstract

本发明提供了使用与人CD137和人PD‑L1结合的结合剂与PD‑1抑制剂组合的组合疗法，以减少或预防肿瘤进展或治疗癌症。

Description

组合中针对PD-L1和CD137的多特异性结合剂

技术领域

本发明涉及使用与人CD137和人PD-L1结合的结合剂与PD-1抑制剂组合的组合疗法，以减少或预防肿瘤进展或治疗癌症。

发明背景

CD137(4-1BB)是TNFR家族的成员，并且是CD8⁺和CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤T细胞(NK(T)细胞)、B细胞和中性粒细胞上的共刺激分子。在T细胞上，CD137不是组成型表达，而是在T细胞受体(TCR)活化后被诱导(例如，在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上表达)(Gros等人,J.Clin Invest 2014；124(5):2246-59))。经由其天然配体4-1BBL或激动剂抗体的刺激导致使用TRAF-2和TRAF-1作为衔接物的信号传导。CD137的早期信号传导涉及K-63多聚泛素化反应，最终导致核因子(NF)-κB和丝裂原活化蛋白(MAP)激酶途径的活化。信号传导导致增加的T细胞共刺激、增殖、细胞因子产生、成熟和延长的CD8+T细胞生存。针对CD137的激动性抗体已经显示在各种临床前模型中促进T细胞的抗肿瘤控制(Murillo等人,Clin Cancer Res 2008；14(21):6895-906)。刺激CD137的抗体可以诱导T细胞的生存和增殖，从而增强抗肿瘤免疫应答。刺激CD137的抗体已在现有技术中公开，并且包括人IgG4抗体乌瑞芦单抗(urelumab)(AU 2004279877)和人IgG2抗体乌托鲁单抗(utomilumab)(Fisher等人,2012,Cancer Immunol.Immunother.61:1721-1733)。

程序性死亡配体1(PD-L1、PDL1、CD274、B7H1)是33kDa、I型单次跨膜蛋白。已经描述了基于选择性剪接的PD-L1的三种同工型。PD-L1属于免疫球蛋白(Ig)超家族，并且含有一个Ig样C2型域和一个Ig样V型域。新鲜分离的T细胞和B细胞表达可忽略量的PD-L1，并且一小部分(约16％)的CD14⁺单核细胞组成型表达PD-L1。然而，已知干扰素-γ(IFNγ)上调肿瘤细胞上的PD-L1。

PD-L1通过如下方式阻碍抗肿瘤免疫：1)通过与其在活化T细胞上的受体程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)(CD279)的结合来耐受肿瘤反应性T细胞；2)通过经由肿瘤细胞表达的PD-L1的PD-1信号传导使得肿瘤细胞对CD8⁺T细胞和Fas配体介导的裂解具有抗性；3)通过经由T细胞表达的CD80(B7.1)的反向信号传导来耐受T细胞；和4)促进诱导性调节性T细胞的发育和维持。PD-L1在许多人癌症中表达，包括黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和结肠癌(Latchman等人,2004Proc Natl Acad Sci USA 101,10691-6)。

PD-L1阻断抗体已在多种已知过表达PD-L1的癌症(包括黑色素瘤、NSCLC)中显示出临床活性。例如，阿替利珠单抗(atezolizumab)是针对PD-L1的人源化IgG1单克隆抗体。目前，它作为用于若干适应症(包括各种类型的实体瘤)的免疫疗法正处于临床试验中(参见例如Rittmeyer等人,2017Lancet389:255-265)，并被批准用于非小细胞肺癌和膀胱癌适应症。PD-L1抗体阿维鲁单抗(avelumab)(Kaufman等人Lancet Oncol.2016；17(10):1374-1385)已经被FDA批准用于治疗患有转移性梅克尔细胞癌的成人和12岁及以上的儿科患者，并且目前正处于若干癌症适应症，包括膀胱癌、胃癌、头颈癌、间皮瘤、NSCLC、卵巢癌和肾癌的临床试验中。PD-L1抗体德瓦鲁单抗(durvalumab)，已经被批准用于局部晚期或转移性尿路上皮癌适应症，并且处于多种实体瘤和血癌的临床开发中(参见例如Massard等人,2016JClin Oncol.34(26):3119-25)。进一步的抗PD-L1抗体已经描述于例如WO2004004771中。

Horton等人(J Immunother Cancer.2015；3(Suppl 2):O10)公开了激动性4-1BB抗体与中和性PD-L1抗体的组合。WO 2019/025545提供了结合剂，诸如结合人PD-L1并结合人CD137的双特异性抗体。

然而，尽管本领域中取得这些进展，仍然相当需要改进的疗法以预防肿瘤进展或治疗癌症。

发明内容

本发明人出人意料地发现，(i)用结合人CD137和结合人PD-L1的结合剂进行的刺激和(ii)PD-1抑制剂(特别是PD-1抗体)的组合增强免疫应答。

因此，在第一方面，本公开提供了结合剂，其用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法中，所述方法包括在施用PD-1抑制剂之前、同时或之后将结合剂施用至所述受试者，其中结合剂包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区；并且

其中当

a)与CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:2、3和4中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ IDNO:6、7和8中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；并且

b)与PD-L1结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:12、13和14中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ IDNO:16、17和18中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，

则PD-1抑制剂不是如下抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:59、60和61中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ ID NO:62、63和64中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在第二方面，本公开提供了试剂盒，其包含(i)包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区的结合剂，以及(ii)PD-1抑制剂；其中当

在第三方面，本公开提供了第二方面的试剂盒，其用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法中。

在第四方面，本公开提供了用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法，所述方法包括在施用PD-1抑制剂之前、同时或之后将结合剂施用至所述受试者，其中结合剂包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区，并且

其中当

附图简述

图1显示了CD137xPD-L1双特异性抗体的预期作用模式的示意图。(A)PD-L1在抗原呈递细胞(APC)以及肿瘤细胞上表达。PD-L1与表达负调控分子PD-1的T细胞的结合，有效地覆盖(override)T细胞活化信号，最终导致T细胞抑制。(B)添加CD137xPD-L1双特异性抗体后，抑制性PD-1:PD-L1相互作用经由PD-L1特异性臂被阻断，并且同时双特异性抗体通过细胞-细胞相互作用提供表达于T细胞上的CD137的激动信号传导导致强烈的T细胞共刺激。

图2显示了通过将1×10⁶个MC38细胞皮下接种到C57BL/6小鼠中建立的MC38同基因肿瘤模型。当肿瘤达到64mm³的平均体积达时，将小鼠随机化，并用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB(5mg/kg)、抗小鼠PD-1抗体(抗mPD-1；10mg/kg)(单独或者组合)，或PBS(均为2QW×3)进行治疗。A.显示的数据是每个治疗组(n＝10只)的中位肿瘤体积，其中达到终止标准的动物的数据向前沿用(carry forward)。当治疗组之内<50％的动物仍生存时(PBS、mbsIgG2a-PD-L1x4-1BB、抗mPD-1)或直至第35天(mbsIgG2a-PD-L1x4-1BB与抗mPD-1组合)，生长曲线停止。箭头表示治疗的天数。B.无进展生存，定义为具有小于500mm³的肿瘤体积的小鼠的百分比，显示为Kaplan Meier曲线。Mantel Cox分析用于比较在第45天的治疗组之间的生存(表8)。

图3显示了对GEN1046和抗PD-1抗体纳武单抗在具有活性的PD1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞测定中的增殖剂量-响应的分析。在存在(A)GEN1046(1至0.00015μg/mL的3倍连续稀释)或(B)纳武单抗(0.8至0.00005μg/mL的4倍连续稀释)的情况下，将用密蛋白6特异性TCR-IVT-RNA和PD-1-IVT-RNA电穿孔的CFSE标记的T细胞与密蛋白6-IVT-RNA电穿孔的未成熟树突状细胞温育5天。通过流式细胞术测量CD8⁺T细胞增殖。显示的数据是作为抗体浓度函数的扩增指数。误差线(SD)表示实验内的变化((A)中n＝3个重复；(B)中n＝2个重复，使用来自一位代表性供体的细胞)。通过4参数对数拟合来拟合曲线，并使用GraphPadPrism软件v9.0确定EC50值和Hill-Slopes(如表9和10中所示)。

图4显示了在不存在或存在抗PD-1抗体纳武单抗的情况下，通过GEN1046的PD-1/PD-L1介导的T细胞抑制的释放(release)和CD8+T细胞增殖的额外共刺激。在存在0.2μg/mL、0.0067μg/mL或0.0022μg/mL GEN1046与固定浓度的1.6μg/mL纳武单抗或0.8μg/mL非结合对照抗体IgG1-ctrl组合的情况下，将用密蛋白6特异性TCR-和PD-1体外翻译(IVT)-RNA电穿孔的CFSE标记的T细胞与密蛋白6-IVT-RNA电穿孔的未成熟树突细胞培养五天(每个条件n＝2个技术重复，使用来自n＝3个个体供体的细胞)。使用仅培养基、仅0.8μg/mL IgG1-ctrl和仅1.6μg/mL纳武单抗以确定在不存在GEN1046的情况下的基线增殖。通过流式细胞术测量CD8⁺T细胞增殖。条形图代表使用FlowJo软件v10.7.1计算的每个指定条件的扩增指数的平均数±SD。虚线代表在存在抗PD-1抗体纳武单抗的情况下的基线增殖。

图5是具有扩展队列的首次人体、开放标签、剂量递增试验的示意图，以评价GEN1046在患有恶性实体瘤的受试者中的安全性。

图6是瀑布图，其显示在已经接受用检查点抑制剂的既往疗法的受试者(灰线)和未接受检查点抑制剂治疗的患者(黑线)中的无进展生存。

图7比较了与具有稳定疾病(SD)或进行性疾病(PD)的受试者相比，具有临床响应(PR)的经历CPI的扩展队列(GEN1046单一疗法)中的受试者中自末次既往抗PD-(L)1以来的时间。使用Wilcoxon检验比较响应组。PR与PD：p＝0.0017；PR与SD：p＝0.034。

图8显示了IgG1-PD1与不同物种的PD-1的结合。将用不同物种的PD-1瞬时转染的CHO-S细胞与IgG1-PD1、派姆单抗或非结合性对照抗体IgG1-ctrl-FERR和IgG4-ctrl一起温育，并使用流式细胞术分析结合。包括与IgG1-PD1温育的未转染CHO-S细胞作为阴性对照。A-B.显示的数据是来自四个实验中的一个代表性实验的重复孔的几何平均荧光强度(gMFI)±SD。C-D.显示的数据是来自两个实验中的一个代表性实验的重复孔的gMFI±SD。E.显示的数据是来自四个实验中的一个代表性实验的重复孔的几何平均荧光强度(gMFI)±SD。缩写：gMFI＝几何平均荧光强度；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PE＝R-藻红蛋白。

图9显示了IgG1-PD1与PD-L1和PD-L2对人PD-1的竞争性结合。在存在IgG1-PD1或派姆单抗的情况下，将用人PD-1瞬时转染的CHO-S细胞与1μg/mL生物素化重组人PD-L1(A)或PD-L2(B)温育。包括IgG1-ctrl-FERR作为阴性对照。用链霉亲和素-别藻蓝蛋白对细胞进行染色，并通过使用流式细胞术测量链霉亲和素-别藻蓝蛋白⁺细胞的百分比来确定结合生物素化PD-L1或PD-L2的细胞的百分比。无抗体对照和未转染样品中链霉亲和素-别藻蓝蛋白⁺细胞的百分比用虚线表示。显示的数据来自三个独立实验中的一个代表性实验的单次重复。缩写：Ab＝抗体；CHO-S＝中国仓鼠卵巢，悬浮；ctrl＝对照；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；PD-L2＝程序性细胞死亡1配体2。

图10显示了IgG1-PD1对PD-1/PD-L1检查点的功能性抑制。使用基于细胞的生物发光PD-1/PD-L1阻断报告物测定来测试PD-1/PD-L1轴的阻断。显示的数据是五次(派姆单抗和IgG1-PD1)、三次(IgG1-ctrl-FERR)或两次(纳武单抗)实验中的一次代表性实验中重复孔的平均发光±SD。缩写：FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；RLU＝相对光单位；SD＝标准偏差。

图11显示了在抗原特异性T细胞增殖测定中IgG1-PD1对CD8⁺T细胞增殖的增强。人CD8⁺T细胞用编码CLDN6特异性TCR的RNA和编码PD-1的RNA进行电穿孔，并用CFSE进行标记。然后，在存在IgG1-PD1、派姆单抗、纳武单抗或IgG1-ctrl-FERR的情况下，将T细胞与用CLDN6编码RNA电穿孔的iDC共培养。4d后通过流式细胞术分析T细胞中的CFSE稀释物并将其用于计算扩增指数。显示了在三个独立实验中评价的来自四个供体中的一个代表性供体(26268_B)的数据。误差线代表重复孔的SD。使用GraphPad Prism通过4参数对数拟合来拟合曲线。缩写：CFSE＝羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；SD＝标准偏差。

图12显示了同种异体MLR测定中IgG1-PD1诱导的IFNγ分泌。将同种异体人mDC和CD8⁺T细胞的三个独特供体对在IgG1-PD1或派姆单抗的存在下共培养5天。包括IgG1-ctrl-FERR和IgG4同种型对照作为阴性对照。使用IFNγ特异性免疫测定来分析上清液中的IFNγ分泌。显示的数据是三个独特的同种异体供体对的平均浓度的平均数±平均数标准误差(SEM)。缩写：FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；IFN＝干扰素；IgG＝免疫球蛋白G；mDC＝成熟树突状细胞；MLR＝混合淋巴细胞反应；SEM＝平均数标准误差。

图13显示了同种异体MLR测定中IgG1-PD1诱导的细胞因子分泌。将同种异体人mDC和CD8⁺T细胞的三个独特供体对在1μg/mL IgG1-PD1或派姆单抗的存在下共培养5天。包括IgG1-ctrl-FERR作为阴性对照。使用Luminex分析上清液中的细胞因子分泌。(A)细胞因子水平表示为在未治疗的共培养物中测量到的细胞因子水平的平均倍数变化。(B)显示了三个独特的同种异体供体对的细胞因子产生水平，其中水平线表示平均、上限和下限。缩写：FC＝倍数变化；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；GM-CSF＝粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；IgG＝免疫球蛋白G；IL＝白细胞介素；MCP-1＝单核细胞趋化蛋白1；mDC＝成熟树突状细胞；MLR＝混合淋巴细胞反应；TNF＝肿瘤坏死因子。

图14显示了C1q与膜结合的IgG1-PD1的结合。使用刺激的人CD8⁺T细胞分析C1q与IgG1-PD1的结合。与IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR、IgG1-ctrl或阳性对照抗体IgG1-CD52-E430G(不具有惰性突变并且具有六聚化增强突变)进行温育后，将细胞与作为C1q来源的人血清进行温育。使用FITC缀合的兔抗C1q抗体检测C1q的结合。显示的数据是来自三个相当的实验中的七个供体中的一个代表性供体的重复孔的几何平均荧光强度(gMFI)±标准偏差(SD)。缩写：FITC＝异硫氰酸荧光素；gMFI＝几何平均荧光强度；PE＝R-藻红蓝蛋白。

图15显示了IgG1-PD1的FcγR结合。在有资格的测定中通过SPR分析IgG1-PD1与固定化人重组FcγR构建体的结合(n＝1)。IgG1-PD1的FcγRIa(A)、FcγRIIa-H131(B)、FcγRIIa-R131(C)、FcγRIIb(D)、FcγRIIIa-F158(E)和FcγRIIIa-V158(F)结合。包括抗体IgG1-ctrl(不具有FER惰性突变)作为结合的阳性对照。缩写：ctrl＝对照；FcγR＝Fcγ受体；IgG＝免疫球蛋白G；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；RU＝共振单位。

图16显示了IgG1-PD1和若干其他抗PD-1抗体的FcγR结合。通过SPR分析IgG1-PD1、纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗(dostarlimab)和西米普利单抗(cemiplimab)与固定化人重组FcγR构建体的结合(n＝3)。测试抗体的FcγRIa(A)、FcγRIIa-H131(B)、FcγRIIa-R131(C)、FcγRIIb(D)、FcγRIIIa-F158(E)和FcγRIIIa-V158(F)结合。包括IgG1-ctrl和IgG4-ctrl抗体作为具有野生型Fc区的IgG1和IgG4分子的FcγR结合的阳性对照。显示的是三个单独的实验的结合响应±SD。缩写：ctrl＝对照；FcγR＝Fcγ受体；IgG＝免疫球蛋白G；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；RU＝共振单位。

图17显示了IgG1-PD1和若干其他抗PD-1抗体的FcγRIa结合。通过流式细胞术分析IgG1-PD1、纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗与瞬时表达人FcγRIa的CHO-S细胞的结合。包括IgG1-ctrl和IgG1-ctrl-FERR分别作为阳性对照和阴性对照。缩写：ctrl＝对照；FcγR＝Fcγ受体；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；huIgG＝人免疫球蛋白G；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PE＝R-藻红蛋白。

图18显示了小鼠血浆样品中的总人IgG。在t＝0时用1或10mg/kg IgG1-PD1静脉内注射小鼠，并在注射后10min、4h、1d、2d、8d、14d和21d时采集连续血浆样品。通过ECLIA确定每只小鼠的血浆样品中的总huIgG。数据表示为三只个体小鼠的平均huIgG浓度±SD。虚线表示通过基于人中IgG清除的两室模型(Bleeker等人,2001,Blood.98(10):3136-42)预测的野生型(wt)huIgG的血浆浓度。虚线表示LLOQ和ULOQ。缩写：huIgG＝人IgG；IgG＝免疫球蛋白G；LLOQ＝定量下限；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；SD＝标准偏差；ULOQ＝定量上限。

图19显示了IgG1-PD1在人PD-1敲入小鼠中的抗肿瘤活性。通过hPD-1KI小鼠SC移植建立MC38结肠癌同基因肿瘤模型。向小鼠施用0.5、2或10mg/kg IgG1-PD1或派姆单抗或10mg/kg IgG1-ctrl-FERR 2QW×3(每组9只小鼠)。(A)每组中的平均肿瘤体积±SEM，直到该组完成的最后一个时间点。(B)所有组均完成的最后一天(第11天)时不同组的肿瘤体积。显示的数据是每个治疗组中个体小鼠中的肿瘤体积，以及每个治疗组的平均肿瘤体积±SEM。使用Mann-Whitney分析比较治疗组与IgG1-ctrl-FERR治疗组的肿瘤体积，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。C.无进展生存，定义为具有小于500mm³的肿瘤体积的小鼠的百分比，显示为Kaplan-Meier曲线。分析排除了来自2mg/kg IgG1-PD1组的一只小鼠，该小鼠被发现在第16天、肿瘤体积超过500mm³之前由于不明原因死亡。缩写：2QW×3＝每周两次，持续三周；ctrl＝对照；FERR＝L234F/L235E/G236R/K409R突变；IgG＝免疫球蛋白G；KI＝敲入；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；SC＝皮下；SEM＝平均数标准误差。

图20显示了在同种异体MLR测定中由IgG1-PD1与GEN1046组合诱导的IL-2分泌。将同种异体人mDC和CD8+T细胞的两个独特供体对在IgG1-PD1(1μg/mL)、派姆单抗(研究级，1μg/mL)、GEN1046(0.001至30μg/mL)或者派姆单抗或IgG1-PD1和GEN1046的组合的存在下共培养5天。包括IgG1-ctrl-FERR(100μg/mL)、IgG4(100μg/mL)、bsIgG1-PD-L1x对照(30μg/mL)、bsIgG1-ctrlx4-1BB(30μg/mL)和IgG1-ctrl-FEAL(30μg/mL)作为对照抗体。通过Luminex在上清液中分析IL-2分泌。显示的数据是2个独特的同种异体供体对的平均IL-2水平±SEM。缩写：bsIgG1＝双特异性免疫球蛋白G1；ctrl＝对照；FERR＝突变L234F/L235E/G236R,K409R；FEAL＝突变L234F/L235E/D265A,F405L；IL＝白细胞介素；IgG＝免疫球蛋白G；mDC＝成熟树突状细胞；MLR＝混合淋巴细胞反应；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；SEM＝平均数标准误差。

图21显示了在抗原特异性T细胞刺激测定中IgG1-PD1与GEN1046组合对CD8⁺T细胞增殖的增强。人CD8⁺T细胞用编码CLDN6特异性TCR的RNA和编码PD1的RNA进行电穿孔，并用CFSE进行标记。然后在单独或与指定浓度的GEN1046组合的0.8μg/mL IgG1-PD1、派姆单抗或IgG1-ctrl-FERR的存在下，将T细胞与用CLDN6电穿孔的iDC共培养。4天后通过流式细胞术分析T细胞中的CFSE稀释物并将其用于计算扩增指数。显示了在两个独立实验中评价的来自四个供体中的一个代表性供体的数据。误差线代表重复孔的SD。虚线表示与模拟品电穿孔(即不表达CLDN6)的iDC共培养的CD8⁺T细胞的扩增指数。缩写：CFSE＝羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；CLDN6＝密蛋白6；ctrl＝对照；FERR＝突变L234F/L235E/G236R,K409R；iDC＝未成熟树突状细胞；IgG1＝免疫球蛋白G1；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；RNA＝核糖核酸；SD＝标准偏差；TCR＝T细胞受体。

图22显示了抗原特异性CD8⁺T细胞刺激后IgG1-PD1与GEN1046组合的对细胞因子分泌的增强。在单独或与指定浓度的GEN1046组合的0.8μg/mL IgG1-PD1、派姆单抗或IgG1-ctrl-FERR的存在下，将表达CLDN6特异性TCR和PD1的人CD8⁺T细胞与表达CLDN6的iDC共培养，如图21中所示。4天后通过多重电化学发光免疫测定来确定培养物上清液中的细胞因子浓度。显示了在两个独立实验中评价的来自四个供体中的一个代表性供体的数据。误差线代表重复孔的SD。缩写：CLDN6＝密蛋白6；ctrl＝对照；FERR＝突变L234F/L235E/G236R、K409R；GM-CSF＝粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子；iDC＝未成熟树突状细胞；IgG1＝免疫球蛋白G1；IFN＝干扰素；IL＝白细胞介素；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；RNA＝核糖核酸；SD＝标准偏差；TCR＝T细胞受体。

图23显示了通过将1×10⁶个MC38细胞SC接种到C57BL/6小鼠中建立的MC38结肠癌模型。当肿瘤达到60mm³的平均体积时，将小鼠随机化并用指定的抗体或其组合进行治疗(均为2QW×3)。A.显示的数据是每个治疗组(n＝10只)的中位肿瘤体积，以及达到终止标准的动物的延续(carry forward)的数据。当治疗组内<50％的动物保持存活时(mIgG2a-ctrl-AAKR、mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB、抗小鼠PD-1抗体[抗mPD-1])或直到第69天(mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1的组合)，生长曲线停止。朝下的三角形表示治疗的天数。B.无进展生存，定义为具有小于500mm³的肿瘤体积的小鼠的百分比，显示为Kaplan Meier曲线。

图24显示了治疗后具有完全肿瘤消退的小鼠和未接触肿瘤的小鼠的对照组的(再)攻击。在用抗体的治疗起始后第121天，用SC注射的1×10⁶个MC38肿瘤细胞(再)攻击小鼠。显示的数据为平均肿瘤体积±SEM。

图25显示了用作为单一药剂或组合的mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB、抗mPD-1抗体，或非结合性对照抗体IgG2a-ctrl-AAKR治疗的荷有MC38肿瘤的C57BL/6小鼠的外周血中的细胞因子水平。在基线(治疗前一天[第-1天]，虚线)处和每次治疗后两天(第2天和第5天)采集外周血样品。通过ECLIA进行细胞因子分析。

图26显示了来自MC38结肠癌模型的切除肿瘤组织中表达的细胞免疫和肿瘤标志物的定量IHC和ISH数据。用1×10⁶个MC38细胞接种C57BL/6小鼠。当肿瘤达到50-70mm³的平均体积时，将小鼠随机化并用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB、抗mPD-1或其组合进行治疗。在治疗起始后第7天(每个治疗组n＝5只)或第14天(每个治疗组n＝5只)切除肿瘤。一些切除肿瘤样本太小，无法进行IHC分析，导致每个治疗组分析4-5个肿瘤。通过免疫组织化学(IHC)使用抗CD3、抗CD4、抗CD8或抗PD-L1抗体对切除肿瘤的切片(4μm)进行染色，或通过原位杂交(ISH)针对4-1BB或PD-L2进行染色。来自IHC的数据描绘为玻片中计数的总细胞的标志物阳性细胞％以及每个治疗组的值±SEM。来自ISH的数据描绘为每张玻片的RNAscope H得分以及每个治疗组的平均值±SEM。

图27显示了来自MC38结肠癌模型的游离肿瘤组织的CD8 T细胞亚群中的GzmB和Ki67表达。用1×10⁶个MC38细胞接种C57BL/6小鼠。当肿瘤达到50-70mm³的平均体积时，将小鼠随机化并用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB、抗mPD-1或其组合进行治疗。将肿瘤在治疗起始后第7天切除(每个治疗组n＝5只)，游离成单细胞悬浮液并通过流式细胞术进行分析。显示的数据是个体小鼠的CD8+T细胞群中GzmB⁺细胞(A)或Ki67⁺细胞(B)的百分比以及每个治疗组的平均值±SEM。进行Mann-Whitney统计分析以比较治疗组之间CD8⁺T细胞群中GzmB⁺细胞或Ki67⁺细胞的百分比，*p<0.05和**p<0.01。

表1–序列：在下文中给出了尤其在序列表中显示的序列和SEQ ID NO的参考。此外，还给出了本文所述的本发明抗体的具体实例的参考，但不将本发明限制于此。本发明的这些示例性但非限制性的抗体在本文中通过参考抗体的名称来指定。粗体并下划线的是F；E；G；A；L；R和G，分别对应于位置234；235；236；265；405；409和430，所述位置根据EU编号。在SEQ ID NO:83和84中，粗体氨基酸代表受控Fab臂交换所需的–AAKR或–AALT突变。在可变区中，根据IMGT定义注释的所述CDR区(除非另有说明或与上下文矛盾)加下划线。

发明详述

尽管下面进一步更详细地描述了本公开，但是应当理解，本公开不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解，本文所使用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的，而不是旨在限制本公开的范围，本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在下文中，将更详细地描述本公开的要素。这些要素与具体实施方案一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式并且以任何数量组合以创建额外的实施方案。各种描述的实例和优选实施方案不应解释为将本公开仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的公开的和/或优选的要素相结合的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应被视为由本申请的说明书公开。例如，如果本文所用的结合剂的优选实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO:23或29中所示的氨基酸序列[IgG1-Fc_FEAR]或基本上由其组成或由其组成，并且在本文所用结合剂的另一个优选实施方案中，第二重链包含SEQ ID NO:24或30中所示的氨基酸序列[IgG1-Fc_FEAL]或基本上由其组成或由其组成，则在本文所用的结合剂的进一步的优选实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO:23或29中所示的氨基酸序列[IgG1-Fc_FEAR]或基本上由其组成或由其组成，并且第二重链包含SEQ ID NO:24或30中所示的氨基酸序列[IgG1-Fc_FEAL]或基本上由其组成或由其组成。

优选地，本文所用的术语如"A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,和H.编,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中所描述定义。

除非另有指示，本公开的实践将采用在本领域的文献中解释的常规的化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术(参见，例如，Organikum,Deutscher Verlag derWissenschaften,Berlin 1990；Streitwieser/Heathcook,"Organische Chemie",VCH,1990；Beyer/Walter,"Lehrbuch der Organischen Chemie",S.Hirzel VerlagStuttgart,1988；Carey/Sundberg,"Organische Chemie",VCH,1995；March,"AdvancedOrganic Chemistry",John Wiley&Sons,1985；Chemie Lexikon,Falbe/Regitz(Hrsg.),Georg Thieme Verlag Stuttgart,New York,1989；Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,J.Sambrook等人编,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989。

本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非本文另有指示或与上下文另有明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，并且不对其他所要求保护的本公开的范围造成限制。说明书中的任何语言均不应解释为指示对于本公开的实践而言必要的任何未要求保护的要素。

本文中数值范围的叙述仅旨在充当单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另有指示，否则每个单独的值均被并入说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。

本说明书全文中引用了若干文档。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等)，无论上文还是下文，均通过引用以其整体并入本文。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类公开。

定义

在下文中，将提供应用于本公开的所有方面的定义。除非另有指示，以下术语具有以下含义。任何未定义的术语都有其领域公认的含义。

在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变体将理解为意指包括所陈述的成员、整数或步骤，或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤，或者成员、整数或步骤的组。术语“基本上由...组成(consisting essentially of)”意指排除任何重要意义的其他成员、整数或步骤。术语“包含”涵盖术语“基本上由...组成”，其进而涵盖术语“由...组成(consisting of)”。因此，在本申请中每次出现时，术语“包含”可以用术语“基本上由...组成”或“由...组成”替换。同样，在本申请中每次出现时，术语“基本上由...组成”可以用术语“由...组成”替换。

除非本文另有指示，或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一(a)”、“一种(an)”和“该(the)”以及类似的引用应当解释为覆盖单数和复数两者。

在本文所用之处，“和/或”视为两个指定特征或组分中的每一个与另一个或不与另一个的具体公开。例如，“X和/或Y”视为(i)X、(ii)Y和(iii)X和Y中每一个的具体公开，就像各自在本文中单独列出一样。

在本公开的上下文中，术语“约”表示本领域普通技术人员将理解的仍然确保所讨论的特征的技术效果的准确度区间。该术语通常指示与指示的数值的偏差了±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％，和例如±0.01％。如本领域普通技术人员将理解的，对于给定技术效果的数值的具体此类偏差将取决于技术效果的性质。例如，天然或生物技术效果通常可以具有比人造效果或工程技术效果的此类偏差更大的此类偏差。

在本公开的上下文中，术语“结合剂”是指能够与期望的抗原结合的任何剂。在本公开的某些实施方案中，结合剂是抗体、抗体片段或其构建体。结合剂还可以包含合成的、经修饰的或非天然存在的部分，特别是非肽部分。此类部分可以例如连接期望的抗原结合功能或区，诸如抗体或抗体片段。在一个实施方案中，结合剂是包含抗原结合CDR或可变区的合成构建体。

如本文所用，“免疫检查点”是指免疫系统的调节因子，并且特别是，调节T细胞受体识别抗原的幅度(amplitude)和质量的共刺激和抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点是抑制性信号。在某些实施方案中，抑制性信号是PD-1与PD-L1和/或PD-L2之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用以代替CD28结合。在某些实施方案中，抑制性信号是LAG-3与MHC II类分子之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是TIM-3与其配体(诸如半乳糖凝集素9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1中的一种或多种之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是一个或多个KIR与其配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是TIGIT与其配体PVR、PVRL2和PVRL3中的一种或多种之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是CD94/NKG2A与HLA-E之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是VISTA与其结合配偶体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是一个或多个Siglec与其配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是GARP与其配体中的一种或多种之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是CD47与SIRPα之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是PVRIG与PVRL2之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是CSF1R与CSF1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是BTLA与HVEM之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是腺苷能途径的一部分，例如由CD39和CD73产生的A2AR和/或A2BR与腺苷之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是B7-H3与其受体和/或B7-H4与其受体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号由IDO、CD20、NOX或TDO介导。

术语“检查点抑制剂”(CPI)和“免疫检查点(ICP)抑制剂”在本文中同义使用。该术语是指完全或部分减少、抑制、干扰或负向调节一种或多种检查点蛋白或者完全或部分减少、抑制、干扰或负向调节一种或多种检查点蛋白的表达的分子(诸如结合剂)，如抑制免疫检查点特别是抑制免疫检查点的抑制性信号的分子(诸如结合剂)。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂与一种或多种检查点蛋白结合。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂与一种或多种调节检查点蛋白的分子。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂与一种或多种检查点蛋白的前体结合，例如在DNA水平或RNA水平上。可以使用根据本公开作为检查点抑制剂发挥功能的任何药剂。如本文所用，术语“部分地”意指在水平上的，例如在检查点蛋白的抑制的水平上的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一个实施方案中，检查点抑制剂可以是抑制免疫检查点的抑制性信号的任何化合物，例如任何结合剂，其中抑制性信号选自由以下组成的组：PD-1与PD-L1和/或PD-L2之间的相互作用；CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用以代替CD28结合；LAG-3和MHC II类分子之间的相互作用；TIM-3与其配体(诸如半乳糖凝集素9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1)中的一种或多种之间的相互作用；一个或多个KIR与其配体之间的相互作用；TIGIT与其配体PVR、PVRL2和PVRL3中的一种或多种之间的相互作用；CD94/NKG2A与HLA-E之间的相互作用；VISTA与其结合配偶体之间的相互作用；一个或多个Siglecs与其配体之间的相互作用；GARP与其配体中的一种或多种之间的相互作用；CD47与SIRPα之间的相互作用；PVRIG与PVRL2之间的相互作用；CSF1R与CSF1之间的相互作用；BTLA与HVEM之间的相互作用；腺苷能途径的一部分，例如由CD39和CD73产生的A2AR和/或A2BR与腺苷之间的相互作用；B7-H3与其受体和/或B7-H4与其受体之间的相互作用；由IDO、CD20、NOX或TDO介导的抑制性信号。在一个实施方案中，检查点抑制剂选自由以下组成的组：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM-3抑制剂、KIR抑制剂、LAG-3抑制剂中的至少一种，TIGIT抑制剂、VISTA抑制剂和GARP抑制剂。在一个实施方案中，检查点抑制剂可以是阻断性抗体，诸如PD-1阻断性抗体、CTLA4阻断性抗体、PD-L1阻断性抗体、PD-L2阻断性抗体、TIM-3阻断性抗体、KIR阻断性抗体、LAG-3阻断性抗体、TIGIT阻断性抗体、VISTA阻断性抗体或GARP阻断性抗体。PD-1阻断性抗体的实例包括派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)和斯巴达珠单抗(spartalizumab)。CTLA4阻断性抗体的实例包括伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)。PD-L1阻断性抗体的实例包括阿替利珠单抗(atezolizumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)和阿维鲁单抗(avelumab)。

在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:43的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL包含SEQ ID NO:44的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含：

(i)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H1；

(ii)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-H2；和

(iii)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-H3；并且

其中轻链可变区包含：

(i)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L1；

(ii)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L2；和

(iii)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3。

在本文所述的抗PD-1抗体的一个实施方案中，重链可变域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列并且轻链可变域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白质，优选涉及抗原受体，诸如抗体或B细胞受体(BCR)。免疫球蛋白的特征在于具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的结构域，即免疫球蛋白域。该术语涵盖膜结合的免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也称为表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，它们通常是BCR的一部分。可溶性免疫球蛋白通常称为抗体。

免疫球蛋白的结构已得到很好表征。参见，例如，Fundamental Immunology第7章(Paul,W.,编,第2版.Raven Press,N.Y.(1989))。简而言之，免疫球蛋白通常包含数条链，通常是经由二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白域或区构成，诸如V_L或VL(可变轻链)域/区、C_L或CL(恒定轻链)域/区、V_H或VH(可变重链)域/区，以及C_H或CH(恒定重链)域/区C_H1(CH1)、C_H2(CH2)、C_H3(CH3)和C_H4(CH4)。重链恒定区通常包含三个域：CH1、CH2和CH3。铰链区是重链的CH1和CH2域之间的区，并且是高度柔性的。铰链区的二硫键是IgG分子中两条重链之间的相互作用的一部分。每条轻链通常包含VL和CL。轻链恒定区通常包含一个域：CL。VH和VL区可以进一步细分成高变性的区(或高变区，其在序列和/或结构限定环的形式上可以是高变的)，也称为互补决定区(CDR)，其中散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL通常由从氨基末端至羧基末端按如下次序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还参见Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196,901-917(1987))。除非另有说明或与上下文矛盾，否则本文的CDR序列使用DomainGapAlign根据IMGT规则进行定义(Lefranc MP.,Nucleic Acids Research 1999；27:209-212和Ehrenmann F.,Kaas Q.和Lefranc M.-P.Nucleic Acids Res.,38,D301-307(2010)；还参见互联网http地址www.imgt.org)。除非另有说明或与上下文矛盾，否则本公开中对恒定区中氨基酸位置的引用是根据EU编号(Edelman等人,Proc Natl Acad SciUSA.1969May；63(1):78-85；Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版.1991NIH Publication No.91-3242))。

哺乳动物免疫球蛋白重链有五种类型，即α、δ、ε、γ和μ，它们说明不同类别的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链包含跨膜域和在其羧基末端的短胞质域。哺乳动物中存在两种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型之内基本上是保守的，其中可变部分高度多样化并负责抗原识别。

术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在本文中可互换地使用，并且不应理解为限制性的。氨基酸是含有胺(-NH₂)和羧基(-COOH)官能团以及对每种氨基酸特异的侧链(R基团)的有机化合物。在本公开的上下文中，氨基酸可以基于结构和化学特征进行分类。因此，氨基酸的类别可以反映在下表中的一者或两者中：

表2：基于R基团的结构和一般化学表征的主要分类

类别	氨基酸
		酸性残基	D和E
碱性残基	K、R和H
		亲水性不带电荷的残基	S、T、N和Q
脂肪族不带电荷的残基	G、A、V、L和I
		非极性不带电荷的残基	C、M和P
芳香族残基	F、Y和W

表3：氨基酸残基的替代物理和功能分类

类别	氨基酸
		含羟基的残基	S和T
脂肪族残基	I、L、V和M
		环烯基相关残基	F、H、W和Y
疏水性残基	A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y
		带负电荷的残基	D和E
极性残基	C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T
		带正电荷的残基	H、K和R
小残基	A、C、D、G、N、P、S、T和V
		极小残基	A、G和S
参与转角形成的残基	A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和T
		柔性残基	Q、T、K、S、G、P、D、E和R

出于本公开的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰变体、构象、同工型、等位基因变体、物种变体和物种同系物，特别是天然存在的那些。术语“变体”特别包括氨基酸序列的片段。

氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中插入单一或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或多个氨基酸残基插入到氨基酸序列中的特定位点中，尽管具有对所得产物的适当筛选的随机插入也是可能的。

氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸(诸如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸)的氨基末端和/或羧基末端融合物。

氨基酸缺失变体的特征在于从序列中除去一个或多个氨基酸，诸如除去1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置。包含在蛋白质的N末端和/或C末端处的缺失的氨基酸缺失变体也称为N末端和/或C末端截短变体。

氨基酸取代变体的特征在于序列中的至少一个残基被除去并且另一个残基被插入其位置。一种氨基酸取代另一种氨基酸可以分类为保守性取代或非保守性取代。优选的是在位于氨基酸序列中同源蛋白质或肽之间不保守的位置中进行的修饰，和/或用具有类似性质的其他氨基酸替换氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即类似地带电荷的或不带电荷的氨基酸的取代。保守氨基酸变化涉及其侧链中相关的氨基酸家族中的一个的取代。在本公开的上下文中，“保守取代”是一个氨基酸用具有类似结构和/或化学特征的另一种氨基酸的取代，诸如一个氨基酸残基用如以上两个表中任一者中所定义的相同类别的另一种氨基酸残基的取代：例如，亮氨酸可以用异亮氨酸取代，因为它们都是脂肪族支链疏水物。类似地，天冬氨酸可以用谷氨酸取代，因为它们是小的、带负电荷的残基。天然存在的氨基酸通常还可以分成四个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、和不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸取代包括以下组内的取代：

-甘氨酸、丙氨酸；

-缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；

-天冬氨酸、谷氨酸；

-天冬酰胺、谷氨酰胺；

-丝氨酸、苏氨酸；

-赖氨酸、精氨酸；和

苯丙氨酸、酪氨酸。

如本文所用，术语“对应于位置...的氨基酸”和类似表达是指人IgG1重链中的氨基酸位置编号。其他免疫球蛋白中相应的氨基酸位置可以通过与人IgG1比对来找到。因此，一个序列中“对应于”另一个序列中的氨基酸或区段的氨基酸或区段是使用标准序列比对程序诸如ALIGN、ClustalW或类似程序通常在默认设置下与另一个氨基酸或区段比对的氨基酸或区段，并且与人IgG1重链具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％同一性。如何比对序列或序列中的区段并从而确定序列中与根据本公开的氨基酸位置相对应的位置被认为是本领域众所周知的。

在本公开的上下文中，术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者的衍生物，其具有在典型的生理条件下与抗原(特别是抗原上的表位)特异性结合的能力，优选具有显著时间段的半衰期，诸如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约一小时、至少约两小时、至少约四小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更长、约48小时或更长、约3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相关的功能定义的时段(诸如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体结合抗原相关联的生理应答的时间和/或足以使抗体募集效应物活性的时间)。特别地，术语“抗体”是指包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体以及任何前述抗体的组合。每条重链均包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。每条轻链均包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。可变区和恒定区在本文中也分别称为可变域和恒定域。VH和VL区可以进一步细分成高变性的区，称为互补决定区(CDR)，其中散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基末端至羧基末端按如下次序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VH的CDR称为HCDR1、HCDR2和HCDR3(或CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，VL的CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3(或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)，其中CH可y进一步细分为恒定域CH1、铰链区以及恒定域CH2和CH3(从氨基末端到羧基末端按如下次序排列：CH1、CH2、CH3)。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和补体系统的组分(例如C1q))的结合。抗体可以是衍生自天然来源或衍生自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂以及单链抗体和人源化抗体。

免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。术语“结合区”和“抗原结合区”在本文中可互换地使用，并且是指与抗原相互作用且包含VH区和VL区两者的区域。如本文所用，抗体不仅包括单特异性抗体，而且包括多特异性抗体，其包含多个，诸如两种或更多种，例如三种或更多种不同的抗原结合区。

如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文中的术语抗体包括作为抗原结合片段的抗体的片段，即保留与抗原特异性结合的能力。已经显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。涵盖在术语“抗体”内的抗原结合片段的实例包括(i)Fab‘或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段，或如WO 2007/059782(Genmab)中所述的单价抗体；(ii)F(ab‘)₂片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341,544-546(1989))，其基本上由VH域组成，并且也称为域抗体((Holt等人；Trends Biotechnol.2003Nov；21(11):484-90)；(vi)骆驼或纳米抗体分子(Revets等人；Expert Opin Biol Ther.2005Jan；5(1):111-24)；以及(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，该接头使它们能够制成单条蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Bird等人,Science 242,423-426(1988)和Huston等人,PNAS USA 85,5879-5883(1988)。除非另有说明或上下文明确指出，此类单链抗体涵盖在术语抗体之内。尽管此类片段通常包括在抗体的含义之内，但它们共同地且各自独立地是本公开的独特特征，展示出不同的生物学特性和效用。本文进一步讨论了本公开上下文中的这些和其他有用的抗体片段以及此类片段的双特异性形式。还应当理解，术语抗体，除非另有说明，还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽，诸如嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任何已知技术，诸如酶促切割、肽合成和重组技术提供的保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段(抗原结合片段)。

所生成的抗体可以具有任何同种型。如本文所用，术语“同种型”是指免疫球蛋白类别(例如IgG(诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgD、IgA(诸如IgA1、IgA2)、IgE、IgM或IgY)，其为由重链恒定区基因编码。当本文提及特定同种型(例如IgG1)时，该术语不限于特定同种型序列(例如特定IgG1序列)，而是用于指示该抗体在序列上比其他同种型更接近于该同种型(例如IgG1)。因此，例如本文公开的IgG1抗体可以是天然存在的IgG1抗体的序列变体，这包括恒定区中的变异。

IgG1抗体可以存在于称为同种异型的多种多态性变体中(在Jefferis和Lefranc2009.mAbs Vol 1 Issue 4 1-7中综述)，其中任何一种都适合用于本文的一些实施方案中。人群中常见的同种异型变体是由字母a、f、n、z或其组合指定的那些。在本文的任何实施方案中，抗体可以包含含有人IgG Fc区的重链Fc区。在进一步的实施方案中，人IgG Fc区包含人IgG1。

在本公开的上下文中，术语“多特异性抗体”是指具有由不同抗体序列定义的至少两个不同的抗原结合区的抗体。在一些实施方案中，所述不同的抗原结合区结合相同抗原上的不同表位。然而，在优选的实施方案中，所述不同的抗原结合区结合不同的靶抗原。在一个实施方案中，多特异性抗体是“双特异性抗体”或“bs”。多特异性抗体，诸如双特异性抗体，可以是任何形式，包括本文下文所述的任何双特异性或多特异性抗体格式。

当在抗体的上下文中使用时，术语“全长”指示该抗体不是片段，而是含有该同种型在自然界中通常存在的特定同种型发现的的所有域，例如IgG1抗体的VH、CH1、CH2、CH3、铰链、VL和CL域。

如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和框架区以及人免疫球蛋白恒定域的抗体。本文公开的人抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变、插入或缺失)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括如下抗体，其中已经将衍生自另一非人物种诸如小鼠的种系的CDR序列移植到人框架序列上。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指如下抗体，其中可变区衍生自非人物种(例如衍生自啮齿类动物)并且恒定区衍生自不同物种诸如人。嵌合抗体可以通过抗体工程化产生。“抗体工程化”是一般用于不同种类的抗体修饰的术语，并且抗体工程化的过程对于技术人员来说是众所周知的。具体地，嵌合抗体可以通过使用如Sambrook等人,1989,MolecularCloning:Alaboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,第15章中所述的标准DNA技术来生成。因此，嵌合抗体可以是遗传地或酶促地经工程化的重组抗体。生成嵌合抗体在本领域技术人员的知识之内，并且因此，嵌合抗体的生成可以通过除了本文所述的方法之外的其他方法进行。开发了针对在人中的治疗性应用的嵌合单克隆抗体以降低非人抗体(例如啮齿动物抗体)的预期抗体免疫原性。它们通常可以含有对感兴趣的抗原特异的非人(例如鼠类或兔)可变区以及人恒定抗体重链和轻链域。如在嵌合抗体的上下文中所用，术语“可变区”或“可变域”是指如下区，其包含免疫球蛋白的重链和轻链两者的CDR和框架区，如下所述。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指经遗传工程化的非人抗体，其含有人抗体恒定域和经修饰以含有与人可变域的高水平的序列同源性的非人可变域。这可以通过将共同形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人受体框架区(FR)上来实现(参见WO 92/22653和EP 0 629 240))。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基取代成人框架区(回复突变)。结构同源性建模可以有助于鉴定框架区中对抗体结合特性很重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可以包含非人CDR序列、任选地包含非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变的主要人框架区，以及完全人恒定区。任选地，可以应用额外的氨基酸修饰(其不一定是回复突变)来获得具有优选特征(诸如亲和力和生物化学特性)的人源化抗体。

如本文所用，“衍生自”另一蛋白质(例如亲本蛋白质)的蛋白质，意指该蛋白质的一个或多个氨基酸序列与该另一蛋白质或亲本蛋白质中的一个或多个氨基酸序列相同或相似。例如，在衍生自另一或亲本抗体、结合臂、抗原结合区、恒定区等的抗体、结合臂、抗原结合区、恒定区等中，一个或多个氨基酸序列是与另一或亲本抗体、结合臂、抗原结合区或恒定区的氨基酸序列相同或相似。此类一个或多个氨基酸序列的实例包括但不限于VH和VLCDR和/或框架区、VH、VL、CL、铰链或CH区中的一者或多者或全部的氨基酸序列。例如，人源化抗体在本文中可以描述为“衍生自”非人亲本抗体，这意指至少VL和VH CDR序列与所述非人亲本抗体的VH和VL CDR序列相同或相似。嵌合抗体在本文中可以描述为“衍生自”非人亲本抗体，这意指通常VH和VL序列可以与该非人亲本抗体的序列相同或相似。另一个例子是结合臂或抗原结合区，其在本文中可以描述为“衍生自”特定亲本抗体，这意指所述结合臂或抗原结合区通常包含与所述亲本抗体的结合臂或抗原结合区相同的或相似的VH和/或VLCDR，或者VH和/或VL序列。然而，如本文别处所述，可以在抗体、结合臂、抗原结合区等的CDR、恒定区或别处中进行氨基酸修饰，诸如突变，以引入期望的特征。当用于衍生自第一蛋白或亲本蛋白质的一个或多个序列的上下文时，“相似的”氨基酸序列优选具有至少约50％、例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约97％、98％或99％的序列同一性。

非人抗体可以在许多不同物种诸如小鼠、兔、鸡、豚鼠、美洲驼和山羊中生成。

单克隆抗体可以通过多种技术产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。可以采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术，并且此类方法是本领域技术人员众所周知的。

在此类非人物种中生产杂交瘤是建立非常完善的程序。用于分离经免疫的动物/非人物种的脾细胞以进行融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。

当在本文使用时，除非与上下文矛盾，否则术语“Fab臂”或“臂”是指一个重链-轻链对并且在本文中与“半分子”可互换地使用。

术语“包含抗原结合区的结合臂”意指包含抗原结合区的抗体分子或片段。因此，结合臂可以包含例如六个VH和VL CDR序列、VH和VL序列、Fab或Fab’片段或Fab臂。

当在本文使用时，除非与上下文矛盾，术语“Fc区”意指由免疫球蛋白重链的两个Fc序列组成的抗体区，其中所述Fc序列至少包含铰链区、CH2域和CH3域。在一个实施方案中，如本文所用，术语“Fc区”是指如下区，其在抗体的N末端端到C末端端的方向上至少包含铰链区、CH2区和CH3区。抗体的Fc区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(诸如效应细胞)和补体系统的组分。

在本公开的上下文中，与抗体(包括多特异性抗体)相关使用的术语“以较小程度诱导Fc介导的效应器功能”意指与包含(i)与所述抗体相同的CDR序列，特别是包含相同的第一和第二抗原结合区以及(ii)两个包含人IgG1铰链、CH2和CH3区的重链的人IgG1抗体相比，该抗体以较小程度诱导Fc介导的效应器功能，此类功能特别选自IgG Fc受体(FcgammaR、FcγR)结合、C1q结合、ADCC或CDC的列表。

Fc介导的效应器功能可以通过与FcγR的结合、与C1q的结合或经由FcγR的Fc介导的交联的诱导来测量。

如本文所用，术语“铰链区”是指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如，人IgG1抗体的铰链区对应于根据如Kabat中所述的EU编号的氨基酸216-230(Kabat,E.A.等人,Sequences of proteins of immunological interest.第5版-USDepartment of Healthand Human Services,NIH公开号91-3242,pp662,680,689(1991)。然而，铰链区域还可以是如本文所述的任何其他亚型。

如本文所用，术语“CH1区”或“CH1域”是指免疫球蛋白重链的CH1区。因此，例如，人IgG1抗体的CH1区对应于根据Kabat中所述的EU编号的氨基酸118-215(同上)。然而，CH1还可以是如本文所述的任何其他亚型。

如本文所用，术语“CH2区”或“CH2域”是指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如，人IgG1抗体的CH2区对应于根据Kabat中所述的EU编号的氨基酸231-340(同上)。然而，CH2还可以是如本文所述的任何其他亚型。

如本文所用，术语“CH3区”或“CH3域”是指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如，人IgG1抗体的CH3区对应于根据Kabat中所述的EU编号的氨基酸341-447(同上)。然而，CH3还可以是如本文所述的任何其他亚型。

术语“单价抗体”在本公开的上下文中意指抗体分子能够结合单一抗原分子，并且因此不能进行抗原交联。

“CD137抗体”或“抗CD137抗体”是如上所述的抗体，其与抗原CD137特异性结合。

“CD137xPD-L1抗体”或“抗CD137xPD-L1抗体”是双特异性抗体，其包含两个种不同的抗原结合区，其中之一与抗原CD137特异性结合，并且其中之一与抗原PD-L1特异性结合。

如本文所用，“生物类似物(biosimilar)”(例如，批准的参考产品/生物药物的)指基于来自以下的数据，与参考产品相似的生物产品：(a)分析研究，其证明该生物产品与参考产品高度相似，尽管临床非活性组分存在微小差异；(b)动物研究(包括毒性评估)；和/或(c)一项或多项临床研究(包括免疫原性和药代动力学或药效学的评估)，其足以证明参考产品在一个或多个适当的使用条件下的安全性、纯度和效力，并且该参考产品已经批准并预期用于该条件，并且寻求该使用的批准(例如，生物产品和参考产品在产品的安全性、纯度和效力方面不存在临床上有意义的差异)。在一些实施方案中，对于所提议的标签中规定、推荐或建议的使用条件，生物类似物生物产品和参考产品使用相同的机制或作用机制，但仅限机制或作用机制是该参考产品已知的。在一些实施方案中，在为生物产品提议的标签中规定、推荐或建议的使用条件此前已经批准用于参考产品。在一些实施方案中，生物产品的施用途径、剂型和/或强度与参考产品的那些相同。生物类似物可以是例如与上市抗体具有相同一级氨基酸序列的目前已知的抗体，但可以在不同的细胞类型中或通过不同的生产、纯化或配制剂方法来制备。

如本文所用，在抗体与预定抗原或表位结合的上下文中，术语“结合”或“能够结合”通常是使用抗原作为配体并且抗体作为分析物，当使用生物层干涉测量法(BLI)测定时或例如当使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIAcore3000仪器中测定时，以对应于约10^-7M或更小，诸如约10^-8M或更小，诸如约10^-9M或更小、约10^-10M或更小或约10^-11M或甚至更小的K_D的亲和力的结合。抗体以对应于比其与除了预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的K_D低至少十倍，诸如低至少100倍，例如低至少1,000倍，诸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍的K_D的亲和力与预定抗原结合。亲和力较高的数量取决于抗体的K_D，使得当抗体的K_D非常低(即抗体是高度特异的)时，则针对抗原的亲和力比针对非特异性抗原的亲和力低的程度可以是至少10,000倍。

如本文所用，术语“k_d”(sec^-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为k_off值。

如本文所用，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。

如果两种抗体与相同的抗原并与相同的表位结合，则它们具有“相同的特异性”。待测抗体是否识别与某种抗原结合抗体相同的表位，即抗体是否与相同的表位结合，可以通过本领域技术人员熟知的不同方法来测试。

抗体之间的竞争可以通过交叉阻断测定来检测。例如，竞争性ELISA测定可以用作交叉阻断测定。例如，可以将靶抗原包被在微量滴定板的孔上，并且可以添加抗原结合抗体和候选竞争性测试抗体。结合到孔中的抗原的抗原结合抗体的量与同其竞争结合至相同表位的候选竞争性测试抗体的结合能力间接相关。具体来说，候选竞争性测抗体针对相同表位的亲和力越大，结合到抗原包被孔的抗原结合抗体的量越少。结合到孔的抗原结合抗体的量可以通过用可检测或可测量的标记物质来标记抗体进行测量。

与另一抗体竞争与抗原结合的抗体，例如，包含如本文所述的重链和轻链可变区的抗体，或对另一抗体的抗原具有特异性的抗体(例如，包含如本文所述的重链和轻链可变区的抗体)，可以是包含如本文所述的所述重链和/或轻链可变区的变体(例如如本文所述的CDR中的修饰和/或一定程度的同一性)的抗体。

如本文所用，“分离的多特异性抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的多特异性抗体(例如与CD137和PD-L1特异性结合的分离的双特异性抗体，基本上不含与CD137或PD-L1特异性结合的单特异性抗体)。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单一分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物展示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

当在本文使用时，术语“第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用”指第一CH3/第二CH3异二聚抗体中第一CH3区和第二CH3区之间的相互作用。

当在本文使用时，术语“第一和第二CH3区的同二聚相互作用”指第一CH3/第一CH3同二聚抗体中的第一CH3区和另一个第一CH3区之间的相互作用，以及第二CH3/第二CH3同二聚抗体中的第二CH3区和另一个第二CH3区之间的相互作用。

当在本文使用时，术语“同二聚抗体”是指包含两个第一Fab臂或半分子的抗体，其中所述Fab臂或半分子的氨基酸序列是相同的。

当在本文使用时，术语“异二聚抗体”是指包含第一和第二Fab臂或半分子的抗体，其中所述第一和第二Fab臂或半分子的氨基酸序列不同。特别地，所述第一和第二Fab臂/半分子的CH3区，或抗原结合区，或CH3区和抗原结合区不同。

术语“还原性条件”或“还原性环境”是指如下条件或环境，其中底物诸如抗体铰链区中的半胱氨酸残基更可能变成还原的而不是氧化的。

本公开还描述了多特异性抗体，诸如双特异性抗体，其包含实例的双特异性抗体的VL区、VH区或一个或多个CDR的功能变体。在双特异性抗体的上下文使用的VL、VH或CDR的功能性变体仍，然允许双特异性抗体的每个抗原结合区保留至少相当大的比例(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的亲本双特异性抗体的亲和力和/或特异性/选择性，并且在一些情况下，此类双特异性抗体可以与比亲本双特异性抗体更大的亲和力、选择性和/或特异性相关联。

此类功能性变体通常保留与亲本双特异性抗体的显著的序列同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置数量的函数(即，同源性％＝相同位置的#/位置的总#x100)，考虑到空位的数量和每个空位的长度，为了两个序列的最佳比对，需要引入这些空位。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，可以例如使用已经并入到ALIGN程序(第2.0版)中的E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11-17(1988)的算法，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)算法来确定。

在本公开的上下文中，除非另有说明，否则使用以下符号来描述突变：i)给定位置中的氨基酸的取代写为例如K409R，其意指用精氨酸取代位置409位中的赖氨酸；ii)对于特定变体，使用特定的三字母或一字母代码(包括代码Xaa和X)以指示任何氨基酸残基。因此，在位置409中，用精氨酸取代赖氨酸被指定为K409R，并且在位置409中，用任意氨基酸残基取代赖氨酸被指定为K409X。如果位置409中赖氨酸缺失，这则用K409*指示。

示例性变体包括主要由于保守取代而与亲本序列的VH和/或VL和/或CDR不同的变体；例如，变体中的12个，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代是保守氨基酸残基替代。

在本公开的上下文中，保守取代可以通过如表2和3中定义的氨基酸的类别之内的取代来定义。

如本文所用，术语“CD137”是指CD137(4-1BB)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)，其是配体TNFSF9/4-1BBL的受体。据信，CD137(4-1BB)参与T细胞活化。CD137的其他同义词包括但不限于4-1BB配体受体、CDw137、T细胞抗原4-1BB同系物和T细胞抗原ILA。在一个实施方案中，CD137(4-1BB)是人CD137(4-1BB)，其具有UniProt登录号Q07011。人CD137的序列还显示于SEQ ID NO:37中。SEQ ID NO:37的氨基酸1-23对应于人CD137的信号肽；而SEQ ID NO:37的氨基酸24-186对应于人CD137的细胞外域；并且该蛋白的剩余部分，即来自SEQ ID NO:37的氨基酸187-213和214-255，分别是跨膜域和胞质域。

“程序性死亡1(PD-1)”受体指属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1(也称为CD279或SLEB2)主要在体内此前已活化的T细胞上表达，并与两种配体结合：PD-L1(也称为B7-H1或CD274)和PD-L2(也称为B7-DC或CD273)。如本文所用，术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、同工型和物种同源物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物，特别是具有如序列表的SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列(NCBI参考序列：NP_005009.2)的蛋白质，或为优选由如SEQ ID NO:115中所示的核酸序列(NCBI参考序列：NM_005018.2)编码的蛋白质。“程序性死亡配体1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2)，其在与PD-1结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌。

如本文所用，术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、同工型和物种同源物，诸如猕猴(食蟹猴)、非洲象、野猪和小鼠PD-L1(分别参见例如Genbank登录号NP_054862.1、XP_005581836、XP_003413533、XP_005665023和NP_068693)，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。人PD-L1的序列还显示在SEQ ID NO:40(成熟序列)和SEQ IDNO:39中，其中预测氨基酸1-18为信号肽。如本文所用，术语“PD-L2”包括人PD-L2(hPD-L2)、hPD-L2的变体、同工型和物种同源物，以及与hPD-L2具有至少一个共同表位的类似物。PD-1的配体(PD-L1和PD-L2)在抗原呈递细胞，诸如树突状细胞或巨噬细胞以及其他免疫细胞的表面表达。PD-1与PD-L1或PD-L2的结合导致T细胞活化的下调。表达PD-L1和/或PD-L2的癌细胞能够关闭表达PD-1的T细胞，这导致抗癌免疫应答的抑制。PD-1及其配体之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少以及通过癌细胞的免疫逃避。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，效应是相加的。

如本文所用，术语“功能障碍”是指处于对抗原刺激的免疫应答性降低的状态的免疫细胞。功能障碍包括对抗原识别无响应以及将抗原识别转化为下游T细胞效应器功能，诸如增殖、细胞因子产生(例如IL-2)和/或靶细胞杀伤的能力受损。

如本文所用，术语“无变应性(anergy)”是指由于通过T细胞受体(TCR)递送的不完整或不充分的信号导致的对抗原刺激无响应的状态。在不存在共刺激的情况下，用抗原刺激后也可以导致T细胞无变应性，这导致细胞即使在共刺激的情况下也变得对于后续的通过抗原的活化是难治的。无响应状态通常可以通过IL-2的存在覆盖(override)。无变应性T细胞不会进行克隆扩增和/或获得效应器功能。

如本文所用，术语“耗竭”是指免疫细胞耗竭，诸如作为T细胞功能障碍的状态的T细胞耗竭，其源于在许多慢性感染和癌症期间发生的持续TCR信号传导。其与无变应性的区别在于，它不是通过不完整或有缺陷的信号传导产生的，而源于持续的信号传导。耗竭由差的效应器功能、抑制性受体的持续表达以及与功能性效应T细胞或记忆T细胞不同的转录状态定义。耗竭防止疾病(例如感染和肿瘤)的最佳控制。耗竭可由外在负调节途径(例如，免疫调节细胞因子)以及细胞内在负调节途径(抑制性免疫检查点途径，诸如本文所述)引起。

“增强T细胞功能”意指诱导、引起或刺激T细胞以具有持续的或放大的生物功能，或者更新或重新活化耗竭的或失活的T细胞。增强T细胞功能的实例包括相对于干预前的那些水平，增加的来自CD8+T细胞的γ干扰素的分泌、增加增殖、增加的抗原应答性(例如肿瘤清除)。在一个实施方案中，增强的水平为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％或更多。测量这种增强的方式是本领域普通技术人员已知的。

如本文所用，术语“抑制性核酸”或“抑制性核酸分子”是指完全或部分减少、抑制、干扰或负向调节一个或多个PD-1蛋白的核酸分子，例如DNA或RNA。抑制性核酸分子包括但不限于寡核苷酸、siRNA、shRNA、反义DNA或RNA分子以及适体(例如DNA或RNA适体)。

如本文所用，术语“寡核苷酸”是指能够降低蛋白质表达，特别是PD-1蛋白(诸如本文所述的PD-1蛋白)的表达的核酸分子。寡核苷酸是短DNA或RNA分子，通常包含2至50个核苷酸。寡核苷酸可以是单链的或双链的。PD-1抑制剂寡核苷酸可以是反义寡核苷酸。

反义寡核苷酸是与给定序列，特别是与PD-1蛋白的核酸序列(或其片段)的序列互补的单链DNA或RNA分子。反义RNA通常用于阻止mRNA的蛋白翻译，例如通过与编码PD-1蛋白的mRNA结合来阻止所述mRNA的蛋白翻译。反义DNA通常用于靶向特定的互补(编码性或非编码性)RNA。如果发生结合，此类DNA/RNA杂合体可以被RNase H酶降解。此外，吗啉代反义寡核苷酸可以用于脊椎动物中的基因敲低(knockdown)。例如，Kryczek等人,2006(J ExpMed,203:871-81)设计了B7-H4特异性吗啡啉，其特异性阻断巨噬细胞中的B7-H4表达，这在具有肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞的小鼠中导致增加的T细胞增殖和减小的肿瘤体积。

术语“siRNA”或“小干扰RNA”或“小抑制RNA”在本文中可互换地使用，并且指干扰具有互补的核苷酸序列的特定基因(诸如编码PD-1蛋白的基因)的表达的长度通常为20-25个碱基对的双链RNA分子。在一个实施方案中，siRNA干扰mRNA，因此阻断翻译，例如PD-1蛋白的翻译。外源siRNA的转染可以用于基因敲低，然而，效应可能仅是瞬时的，尤其是在快速分裂的细胞中。例如，可以通过RNA修饰或通过使用表达载体来实现稳定转染。用于用siRNA稳定转染细胞的有用修饰和载体是本领域已知的。siRNA序列还可以经修饰以在两条链之间引入短环，这导致“小发夹RNA”或“shRNA”。shRNA可以被Dicer加工成功能性siRNA。shRNA具有相对较低的降解率和周转(turnover)率。因此，PD-1抑制剂可以是shRNA。

如本文所用，术语“适体”是指单链核酸分子，诸如DNA或RNA，通常长度为25-70个核苷酸，其能够与靶分子，诸如多肽结合。在一个实施方案中，适体与免疫PD-1蛋白，诸如本文所述的PD-1检查点蛋白结合。例如，根据本公开的适体可以与PD-1蛋白或多肽特异性结合，或与信号传导途径中调节PD-1蛋白或多肽表达的分子特异性结合。适体的生成和治疗性用途是本领域众所周知的(参见例如US 5,475,096)。

术语“小分子抑制剂”或“小分子”在本文中可互换地使用，并且指完全或部分减少、抑制、干扰或负调节一个或多个如上所述的PD-1蛋白的低分子量(通常多至1000道尔顿)有机化合物。此类小分子抑制剂通常通过有机化学合成，但也可以分离自天然来源，诸如植物、真菌和微生物。小分子量允许小分子抑制剂快速扩散穿过细胞膜。例如，本领域已知的各种A2AR拮抗剂是具有低于500道尔顿的分子量的有机化合物。

术语“基于细胞的疗法”是指出于治疗疾病或病症(例如，癌症疾病)的目的，将表达免疫PD-1抑制剂的细胞(例如，T淋巴细胞、树突状细胞或干细胞)移植到受试者中。

如本文所用，术语“溶瘤病毒”是指如下病毒，其能够在体外或者体内选择性地在癌性或过度增殖性细胞中复制并减慢其生长或诱导其死亡，同时对正常细胞没有影响或具有极小的影响。用于递送PD-1抑制剂的溶瘤病毒包含可以编码PD-1抑制剂的表达盒，该PD-1抑制剂是抑制性核酸分子，诸如siRNA、shRNA、寡核苷酸、反义DNA或RNA、适体、抗体或其片段或可溶性PD-1蛋白或融合物。溶瘤病毒优选具有复制能力并且表达盒在病毒启动子例如合成的早期/晚期痘病毒启动子的控制下。示例性溶瘤病毒包括水泡性口炎病毒(VSV)、弹状病毒(例如小核糖核酸病毒，诸如Seneca Valley病毒；SVV-001)、柯萨奇病毒、细小病毒、新城疫病毒(NDV)、单纯疱疹病毒(HSV；OncoVEX GMCSF)、逆转录病毒(例如，流感病毒)、麻疹病毒、呼肠孤病毒(reovirus)、Sinbis病毒、痘苗病毒，如WO 2017/209053中示例性描述的(包括Copenhagen,Western Reserve,Wyeth株)和腺病毒(例如，Delta-24、Delta-24-RGD)、ICOVIR-5、ICOVIR-7、Onyx-015、ColoAd1、H101、AD5/3-D24-GMCSF)。包含可溶形式的PD-1抑制剂的重组溶瘤病毒的生成及其使用方法公开于WO2018/022831中，该文献通过引用以其整体并入本文。溶瘤病毒可以用作减毒病毒。

“治疗周期”在本文中定义为如下时间段，由于结合剂的药效动力学，单独剂量的结合剂的效应该时间段之内相加，或者换句话说，在受试者的身体基本上从施用的结合剂中清除之后的时间段。在小的时间窗口之内，例如在2-24小时诸如2-12小时之内，或在同一天，多次小剂量可以等同于较大的单剂量。

在本文中，术语“治疗(treatment)”、“处理(treating)”或“治疗性干预(therapeutic intervention)”涉及出于对抗病况，诸如疾病或病症的目的而对受试者进行管理和护理。该术语旨在包括对受试者所患有的给定病况的全谱治疗，诸如施用治疗上有效的化合物以减轻症状或并发症，以延迟疾病、病症或病况的进展，以减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、病症或病症，以及以预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病况或病症的目的而对个体进行的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。在一个实施方案中，“治疗”是指施用有效量的本公开的治疗活性结合剂，诸如治疗活性抗体，其中目的是缓解、改善、停止或根除(治愈)症状或疾病状态。

对治疗的响应以及对用本公开的结合剂的治疗的抗性、无响应和/或从其复发可以根据实体瘤中的响应评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)；版本1.1(RECIST标准v1.1)来确定。RECIST标准如下表中所示(LD：最长尺寸)。

表4：响应的定义(RECIST标准v1.1)

“最佳总体响应”是从治疗开始直至疾病进展/复发而记录的最佳响应(自治疗开始以来记录的最小测量将用作PD的参考)。具有CR或PR的受试者被视为是客观响应。具有CR、PR或SD的受试者被视为为处于疾病控制中。具有NE的受试者被视为无响应者。最佳总体响应是从治疗开始直至疾病进展/复发而记录的最佳响应(自治疗开始以来记录的最小测量将用作PD的参考)。具有CR、PR或SD的受试者被视为为处于疾病控制中。具有NE的受试者被视为无响应者。

“响应持续时间(DOR)”仅适用于已确认的最佳总体响应为CR或PR的受试者，并定义为从首次记录客观肿瘤响应(CR或PR)到首次PD或由于潜在的癌症死亡的日期的时间。

“无进展生存(PFS)”定义为从第1周期中的第1天到首次记录的进展或由于任何原因死亡的天数。

“总体生存(OS)”定义为从第1周期中的第1天到由于任何原因死亡的天数。如果受试者是否已经死亡未知，则OS将在已知受试者还活着的最晚日期(在截止日期或之前)审查(censor)。

在本公开的上下文中，术语“治疗方案”是指经设计以改善和维持健康的结构化治疗计划。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望的治疗结果的量。结合剂(诸如抗体，如同多特异性抗体或单克隆抗体)的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素和以及结合剂引发个体中的期望的响应的能力而变化。治疗有效量还是其中结合剂或其片段的任何毒性或有害效应被治疗有益效应所抵消的量。在使用初始剂量的患者中的反应不充分的情况下，可以使用更高剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现的有效更高剂量)。在使用某一剂量的患者中出现不需要的副作用的情况下，可以使用更低剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现的有效更低剂量)。

如本文所用，术语“癌症”包括特征在于异常调控的细胞生长、增殖、分化、黏附和/或迁移的疾病。所谓“癌细胞”，意指通过快速、不受控制的细胞增殖而生长并且在起始新生长的刺激停止之后继续生长的异常细胞。

根据本公开的术语“癌症”还包括癌症转移。所谓“转移”，意指癌细胞从其原始部位扩散(spread)到身体的另一个部分。转移瘤的形成是一个非常复杂的过程，并且依赖于恶性细胞从原发肿瘤脱离，侵袭细胞外基质，穿透内皮基底膜以进入体腔和血管，并且在被血液输送之后，浸润靶器官。最后，新肿瘤(即继发性肿瘤或转移性肿瘤)在靶位点的生长依赖于血管生成。即使在除去原发肿瘤后，肿瘤转移还是经常发生，因为肿瘤细胞或组分可能保留并发展出转移潜力。在一个实施方案中，根据本公开的术语“转移”涉及“远处转移”，其涉及远离原发肿瘤和区域淋巴结系统的转移。

如本文所用，术语诸如“减少”、“抑制”、“干扰”和“负调节”，意指引起水平中的总体减少的能力，例如约5％或更大、约10％或更大、约15％或更大、约20％或更大、约25％或更大、约30％或更大、约40％或更大、约50％或更大、或约75％或更大的减少。术语“抑制”或相似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上至零。

在一个实施方案中，术语诸如“增加”或“增强”涉及增加或增强了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％，或至少约100％。

如本文所用，“生理pH”是指7.5或约7.5的pH。

如本公开中所用，“按重量计的％”是指重量百分比，其是测量按克(g)计的物质的量的浓度单位，其表示为按克(g)计的总组合物的总重量的百分比。

术语“冷冻”涉及液体的凝固，通常伴随着热的除去。

术语“冻干(lyophilizing、lyophilization)”是指通过冷冻物质并且然后降低周围的压力(例如，低于15Pa，诸如低于10Pa，低于5Pa，或1Pa或更小)以使物质中的冷冻介质直接从固相升华到气相来冷冻干燥物质。因此，术语“冻干”和“冷冻干燥”在本文中可互换地使用。

在本公开的上下文中，术语“重组”意指“通过基因工程化制备”。在一个实施方案中，本公开上下文中的“重组对象”不是天然存在的。

如本文所用，术语“天然存在的”是指对象可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界中的来源分离出来并且未经人在实验室中有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”意指“在自然界中存在”，并且包括已知的对象以及尚未发现和/或从自然界中分离出来的对象，但是将来可以从天然来源发现和/或分离出的对象。

根据本公开，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且指包含经由肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多、约16个或更多、约20个或更多、以及最多约50个、约100个或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大的肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常作为同义词使用。

当以治疗有效量提供给受试者时，“治疗性蛋白”对受试者的病况或疾病状态具有积极或有利的效应。在一个实施方案中，治疗性蛋白具有治疗或缓和特性并且可以进行施用以改善、缓解、减轻、逆转、延迟疾病或病症的一个或多个症状的发作或减轻疾病或病症的一个或多个症状的严重性。治疗性蛋白质可以具有防治性的性质并且可以用于延迟疾病的发作或减轻此类疾病或病理学病况的严重性。术语“治疗性蛋白”包括整体的蛋白质或肽，也可以指其治疗活性片段。它还可以包括蛋白质的治疗活性变体。治疗活性蛋白质的实例包括但不限于用于疫苗接种的抗原和免疫刺激剂诸如细胞因子。

术语“部分(portion)”是指部分(fraction)。就特定结构诸如氨基酸序列或蛋白质而言，术语其“部分”可以指定所述结构的连续或不连续的部分。

术语“部分(part)”和“片段”在本文中可互换地使用并且指连续的要素。例如，结构(诸如氨基酸序列或蛋白质)的一部分，指所述结构的连续要素。当在组合物的上下文中使用时，术语“部分”是指组合物的一部分。例如，组合物的一部分可以是所述组合物的0.1％至99.9％(例如0.1％、0.5％、1％、5％、10％、50％、90％或99％)的任何部分。

就氨基酸序列(肽或蛋白质)而言，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即代表在N末端和/或C末端处缩短的该氨基酸序列的序列。在C末端处缩短的片段(N末端片段)是可获得的，例如通过翻译缺少开放阅读框的3’端的截短的开放阅读框来获得。在N末端处缩短的片段(C末端片段)是可获得的，例如通过翻译缺少开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框，只要该截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子。氨基酸序列的片段包含例如，来自氨基酸序列的氨基酸残基的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。

根据本发明，肽或蛋白质的部分或片段优选具有其所已经衍生自的肽或蛋白质的至少一个功能特性。此类功能特性包括药理学活性、与其他肽或蛋白质的相互作用、酶活性、与抗体的相互作用以及核酸的选择性结合。例如，肽或蛋白质的药理学活性片段具有该片段所已经衍生自的肽或蛋白质的至少一个药理学活性。肽或蛋白质的部分或片段优选包含该肽或蛋白质的至少6个、特别是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸的序列。肽或蛋白质的部分或片段优选包含该肽或蛋白质的最多8个、特别是最多10个、最多12个、最多15个、最多20个、最多30个或最多55个连续氨基酸的序列。

本文所谓“变体”，意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的经修饰的版本。优选地，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比的1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10个或1至约5个氨基酸修饰。

本文所谓“野生型”或“WT”或“天然”意指在自然界中发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列。

优选地，给定氨基酸序列和作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性、优选同一性的程度将是至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地给出的参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区的相似性或同一性的程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选给出至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸(在一些实施方案中是连续氨基酸)的相似性或同一性的程度。在一些实施方案中，给出参考氨基酸序列的全长的相似性或同一性的程度。用于确定序列相似性、优选序列同一性的比对可以使用本领域已知的工具进行，优选使用最佳序列比对，例如使用Align、使用标准设置、优选EMBOSS::needle,Matrix:Blosum62,Gap Open 10.0,GapExtend 0.5。

“序列相似性”指示相同的或者代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的核苷酸的百分比。

术语“％相同的”和“同一性％”或相似的术语特别是旨在指，在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比纯粹是统计性的，并且两个序列之间的差异可以但不一定随机分布在待比较序列的整个长度上。两个序列的比较通常通过在最佳比对后相对于区段或“比较窗口”对序列进行比较来进行，以便鉴定出相应序列的局部区。用于比较的最佳比对可以手动进行，或者借助Smith和Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法，借助Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源算法，借助Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA88,2444的相似性搜索算法，或者借助使用所述算法的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)进行。在一些实施方案中，使用BLASTN或BLASTP算法，如可在United States National Center for Biotechnology Information(NCBI)网站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上获得的，来确定两个序列的百分比同一性。在一些实施例中，NCBI网站上用于BLASTN算法的算法参数包括：(i)设置为10的ExpectThreshold；(ii)设置为28的Word Size；(iii)设置为0的查询范围内的Max匹配；(iv)设置为1、-2的Match/Mismatch Scores；(v)设置为线性的Gap Costs；以及(vi)正在使用的低复杂度区的过滤器。在一些实施例中，NCBI网站上用于BLASTP算法的算法参数包括：(i)设置为10的Expect Threshold；(ii)设置为3的Word Size；(iii)设置为0的查询范围内的Maxmatches；(iv)设置为BLOSUM62的Matrix；(v)设定为Existence:11Extension:1的GapCosts；和(vi)条件成分得分矩阵调整。

通过确定待比较的序列对应的相同位置的数量，将该数量除以所比较的位置的数量(例如，参考序列中的位置的数量)并将该结果乘以100来获得百分比同一性。

在一些实施方案中，给出参考序列的整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区的相似性或同一性的程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸残基组成，则给出至少约100个、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸残基(在一些实施方案中是连续氨基酸残基)的相似性或同一性的程度。在一些实施方案中，给出参考序列的全长的相似性或同一性的程度。

根据本公开的同源氨基酸序列展示出氨基酸残基的至少40％，特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、优选至少95％、至少98％或至少99％同一性。

本领域技术人员可以容易地制备本文所述的氨基酸序列变体，例如通过重组DNA操作。例如，Sambrook等人1989)中详细描述了用于制备具有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操作。此外，本文所述的肽和氨基酸变体可以借助已知的肽合成技术，诸如通过固相合成和相似方法容易地制备。

在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及如下的任何片段或变体，其展示出与其所衍生自的氨基酸序列的一个或多个功能性特性相同或相似的一个或多个功能性特性，即，其是功能上等同的。就抗原或抗原序列而言，一个特定的功能是由该片段或变体所衍生自的氨基酸序列所展示出的一个或多个免疫原性活性。如本文所用，术语“功能性片段”或“功能性变体”特别指如下变体分子或序列，其与亲本分子或序列的氨基酸序列相比包含被一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列，并且仍然能够实现亲本分子或序列的一个或多个功能，例如，诱导免疫应答。在一个实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变该分子或序列的特征。在不同的实施方案中，功能性片段或功能性变体的功能可以降低但仍然显著存在，例如功能性变体的免疫原性可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在其他实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能性片段或功能性变体的免疫原性可以增强。

“衍生自”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)指第一氨基酸序列的起源。优选地，衍生自特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。衍生自特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员应当理解，可以改变适合于用于本文的抗原，使得它们在序列中不同于其所衍生自的天然存在或天然的序列，而保留该天然序列的期望的活性。

“分离的”是指改变的或从自然状态除去。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分地或完全地分离自其天然状态的共存材料的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯的形式存在，或者可以存在于非天然环境，例如宿主细胞中。在优选的实施方案中，用于本公开的结合剂是基本上纯的形式。

术语“遗传修饰”或简单的“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸、特别是RNA引入到细胞中。出于本公开的目的，术语“转染”还包括将核酸引入到细胞中或由此类细胞摄取核酸，其中该细胞可以存在于受试者(例如患者)中。因此，根据本发明，用于转染本文所述核酸的细胞可以体外或体内存在，例如该细胞可以形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本公开，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的某些应用，如果转染的遗传物质仅瞬时表达就足够了。可以将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。由于转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中，所以外源核酸将通过有丝分裂稀释或降解。允许核酸的游离型(episomal)扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望的是转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定转染。此类稳定转染可以通过使用基于病毒的系统或基于转座子的系统进行转染来实现。通常，将编码抗原的核酸瞬时转染至细胞中。可以将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。

根据本发明，肽或蛋白质的类似物是其所已经衍生自的所述肽或蛋白质的修饰形式，并且具有所述肽或蛋白质的至少一个功能性特性。例如，肽或蛋白质的药理学类似物具有该类似物所已经衍生自的肽或蛋白质的至少一个药理学活性。此类修饰包括任何化学修饰并且包括与蛋白质或肽相关联的任何分子(例如碳水化合物、脂质和/或蛋白质或肽)的单个或多个取代、缺失和/或添加。在一个实施方案中，蛋白质或肽的“类似物”包括由以下引起的那些修饰形式：糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白水解切割或与抗体或另一个细胞配体结合。术语“类似物”还延伸至所述蛋白质和肽的所有功能性化学等同物。

如本文所用，“活化”或“刺激”是指免疫效应细胞(诸如T细胞)已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的状态。活化还可以与信号传导途径的启起始、诱导的细胞因子产生和可检测的效应器功能相关联。除了其他事项之外，术语“活化的免疫效应细胞”还指正在经历细胞分裂的免疫效应细胞。

术语“引发(priming)”是指如下过程，其中免疫效应细胞(诸如T细胞)与其特异性抗原进行首次接触并引起分化为效应细胞(诸如效应T细胞)。

术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在本公开的上下文中，该术语优选地在免疫应答的上下文中使用，其中免疫效应细胞通过抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特异性免疫效应细胞扩增。优选地，克隆扩增导致免疫效应细胞的分化。

根据本公开的“抗原”覆盖引发免疫应答的任何物质和/或免疫应答或免疫机制诸如细胞应答所针对的任何物质。这还包括如下情况，其中抗原被加工成抗原肽并且免疫应答或免疫机制针对一个或多个抗原肽(特别是如果出现在MHC分子的上下文中)。具体地，“抗原”涉及与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应的任何物质，优选肽或蛋白质。根据本发明，术语“抗原”包括包含至少一个表位，例如T细胞表位的任何分子。优选地，本公开上下文中的抗原是如下分子，任选地其在加工后诱导免疫反应，该免疫反应优选对该抗原(包括表达该抗原的细胞)特异。在一个实施方案中，抗原是疾病相关联的抗原，诸如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，或衍生自此类抗原的表位。

术语“表位”是指分子诸如抗原中的抗原决定簇，即指由免疫系统识别的分子的一部分或片段，例如由抗体T细胞或B细胞识别的部分或片段(特别是当出现在MHC分子的上下文中时)。在一个实施方案中，“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子(诸如氨基酸或糖侧链)的表面分组组成，并且通常具有特异性的三维结构特征以及特异性的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合丢失，而与后者的结合不丢失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基，以及不直接参与结合的其他氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断或覆盖的氨基酸残基(换句话说，该氨基酸残基位于特异性抗原结合肽的占用空间(footprint)内)。

蛋白质的表位优选包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且优选长度在约5个和约100个氨基酸之间，优选在约5个和约50个氨基酸之间，更优选在约8个和约0个氨基酸之间，最优选在约10个和约25个氨基酸之间，例如，表位可以优选长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。特别优选的是，本公开上下文中的表位是T细胞表位。

如本文所用，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、情况或条件可以发生或可以不发生，并且该描述包括其中所述事件、情况或条件发生的实例和不发生的实例。

如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换地使用。这些术语指两个或多个要素或组分或域连接在一起。

术语“疾病”(本文也称为“病症”)指影响个体身体的异常病况。疾病通常被解释为与特定症状(symptom)和体征(sign)相关联的医学病况。疾病可以是由最初来自外部来源的因素引起的，诸如感染性疾病，或者其可以是由内部功能障碍引起的，诸如自身免疫性疾病。在人中，“疾病”通常更广泛地用来指引起受折磨的个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡，或者与该个体接触的人的相似的问题的任何病况。在更广泛的意义上，它有时包括伤害、残疾、病症、综合征、感染、孤立症状、反常行为以及结构和功能的非典型变异，而在其他上下文中和出于其他目的，这些可以被视为是可区分的类别。疾病通常不仅在肉体上影响个体，还在情感上影响个体，因为感染(contracting)许多疾病和与许多疾病生活可以改变一个人对生活的看法和一个人的性格。

术语“治疗性处理”涉及改善个体健康状况和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述处理可以消除个体中的疾病、停止或减缓个体中疾病的发展、抑制或减缓个体中疾病的发展、降低个体中症状的频率或严重性，和/或降低当前患有或此前已经患有疾病的个体中的复发。

术语“防治性处理”或“预防性处理”涉及旨在防止个体中发生疾病的任何治疗。术语“防治性处理”或“预防性处理”在本文中可互换地使用。相似地，在疾病的进展诸如肿瘤或癌症的进展的上下文中，术语“用于预防的方法”涉及旨在防止个体中的疾病进展的任何方法。

术语“个体”和“受试者”在本文中可互换地使用。它们指人或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)，或任何其他非哺乳动物，包括鸟(鸡)、鱼或可以患有或易患疾病或病症(例如癌症)的任何其他动物物种。除非另有说明，术语“个体”和“受试者”并不表示特定年龄，并且因此涵盖成人、老人、儿童和新生儿。在本公开的实施方案中，“个体”或“受试者”是“患者”。

术语“患者”意指进行治疗的个体或受试者，特别是患病的个体或受试者。

本公开的方面和实施方案

在第一方面，本公开提供了结合剂，其用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法中，所述方法包括在施用PD-1抑制剂之前、同时或之后将结合剂施用至所述受试者，其中结合剂包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区；并且

其中当

应当理解，包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区的结合剂与如下抗体的组合或组合使用不是本文提供的本发明的一部分，该抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含分别如SEQ ID NO:59、60和61中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，该VL包含分别如SEQ ID NO:62、63和64中所示的CDR1、CDR 2和CDR3序列。还应当理解，包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区的结合剂与如下抗体的组合或组合使用不是本文提供的本发明的一部分，该抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含分别如SEQ ID NO:146、147和148中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，该VL包含分别如SEQ ID NO:149、150和151中所示的CDR1、CDR 2和CDR3序列(CDR由Kabat编号定义)。尽管在本申请中提及了派姆单抗并且本文呈现了与派姆单抗相关的实验数据，但与派姆单抗的组合或组合使用并不旨在包括在本发明的任何方面或实施方案中。

与CD137和PD-L1结合的结合剂

在一个实施方案中，CD137是人CD137，特别是包含SEQ ID NO:38所示序列的人CD137。在一个实施方案中，PD-L1是人PD-L1，特别是包含SEQ ID NO:40中所示序列的人PD-L1。在一个实施方案中，CD137是人CD137并且PD-L1是人PD-L1。在一个实施方案中，CD137是包含SEQ ID NO:38中所示序列的人CD137，并且PD-L1是包含SEQ ID NO:40中所示序列的人PD-L。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，

a)与人CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:1或9的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL包含SEQ ID NO:5或10的CDR1、CDR2和CDR3序列；

并且

b)与人PD-L1结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:11的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL包含SEQ ID NO:15的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，

a)与人CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:2、3和4中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ IDNO:6、7和8中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；

并且

b)与人PD-L1结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:12、13和14中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ ID NO:16、17和18中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，与人CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区，所述VH包含与SEQ ID NO:1或9具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:5或10具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在根据第一方面的结合剂的进一步实施方案中，与人PD-L1结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区，所述VH包含与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述VL包含与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，

a)与人CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区，所述VH包含与SEQ ID NO:1或9具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:5或10具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸；并且

b)与人PD-L1结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区，所述VH包含与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述VL包含与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，与人CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:1或9中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:5或10中所示的氨基酸序列。

在根据第一方面的结合剂的另一个实施方案中，与人PD-L1结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，

a)与人CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:1或9中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:5或10中所示的氨基酸序列；

并且

b)与人PD-L1结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，

a)与人CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列；

并且

结合剂可以特别地是抗体，诸如多特异性抗体，例如双特异性抗体。此外，结合剂可以是全长抗体或抗体片段的形式。

进一步优选的是，结合剂是人抗体或人源化抗体。

每个可变区可以包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和四个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)。

互补决定区(CDR)和框架区(FR)可以从氨基末端到羧基末端按如下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

在第一方面的一个实施方案中，结合剂包含

i)多肽，其包含所述第一重链可变区(VH)和第一重链恒定区(CH)，以及

ii)多肽，其包含所述第二重链可变区(VH)和第二重链恒定区(CH)。

在第一方面的一个实施方案中，结合剂包含

i)多肽，其包含所述第一轻链可变区(VL)并进一步包含第一轻链恒定区(CL)，以及

ii)多肽，其包含所述第二轻链可变区(VL)并进一步包含第二轻链恒定区(CL)。

在第一方面的一个实施方案中，结合剂是包含第一结合臂和第二结合臂的抗体，其中第一结合臂包含

i)多肽，其包含所述第一重链可变区(VH)和所述第一重链恒定区(CH)，以及

ii)多肽，其包含所述第一轻链可变区(VL)和所述第一轻链恒定区(CL)；

并且，第二结合臂包含

iii)多肽，其包含所述第二重链可变区(VH)和所述第二重链恒定区(CH)，以及

iv)多肽，其包含所述第二轻链可变区(VL)和所述第二轻链恒定区(CL)。

在第一方面的一个实施方案中，结合剂包含i)第一重链和第一轻链，其包含所述能够与CD137结合的抗原结合区，第一重链包含第一重链恒定区并且第一轻链包含第一轻链恒定区；和ii)第二重链和第二轻链，其包含所述能够结合PD-L1的抗原结合区，第二重链包含第二重链恒定区并且第二轻链包含第二轻链恒定区。

第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)的每个包含恒定重链1(CH1)区、铰链区、恒定重链2(CH2)区和恒定重链3(CH3)区中的一个或多个，优选至少包含铰链区、CH2区和CH3区。

第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)的每个可以包含CH3区，其中两个CH3区包含不对称突变。不对称突变意指所述第一和第二CH3区的序列含有在不相同的位置处的氨基酸取代。例如，所述第一CH3区和第二CH3区之一者含有对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置405的位置处的突变，并且所述第一CH3区和第二CH3区中的另一者含有对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置409的位置处的突变。

在所述第一重链恒定区(CH)中，对应于选自由根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409组成的组的位置的位置中的至少一个氨基酸可以已经进行取代，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，对应于选自由根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409组成的组的位置的位置中的至少一个氨基酸已经进行取代。在特定的实施方案中，第一重链和第二重链不在相同位置进行取代(即，第一重链和第二重链含有不对称突变)。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，(i)在所述第一重链恒定区(CH)中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置中的氨基酸是R，或(ii)在所述第一重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置中的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置中的氨基酸是L。

在第一方面的结合剂的一个实施方案中，结合剂与另一抗体相比以较小的程度诱导Fc介导的效应器功能，该另一抗体包含相同的第一抗原结合区和第二抗原结合区以及两个包含人IgG1铰链、CH2区和CH3区重链恒定区(CH)的另一抗体。

在根据第一方面的结合剂的一个具体实施方案中，所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区经修饰，使得抗体与除了包含未经修饰的第一重链恒定区和第二重链恒定区(CH)以外相同的抗体相比以较小的程度诱导Fc介导的效应器功能。具体地，所述未经修饰的第一重链恒定区和第二重链恒定区(CH)中的每一者或两者可以包含SEQ ID NO:19或25中所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

Fc介导的效应器功能可以通过测量结合剂与Fcγ受体的结合、与C1q的结合或Fc介导的Fcγ受体的交联的诱导来确定。特别地，Fc介导的效应器功能可以通过测量结合剂与C1q的结合来确定。

结合剂的第一重链恒定区和第二重链恒定区可以已经被修饰，使得C1q与所述抗体的结合与野生型抗体相比减少，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合优选通过ELISA测定。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，在所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区的至少一个中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置中的一个或多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，在所述第一重链和第二重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别可以是F和E。

特别地，在所述第一重链恒定区和第二重链恒定区中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置分别可以是F、E和A。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第一重链恒定区和第二重链恒定区两者的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别是F和E，其中(i)第一重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L，并且第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，或(ii)第一重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，并且第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第一重链恒定区和第二重链恒定区两者的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置分别是F、E和A，其中(i)第一重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L，并且第二重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，或(ii)第一重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，并且第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链和/或第二重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:25中所示的序列[IgG1-FC]；

b)a)中的序列的子序列，诸如如下子序列，其中从a)中定义的序列的N末端或C末端开始，已经缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸；和

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多10个取代，诸如至多9个取代、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个取代的序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链或第二重链，诸如第二重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:26中所示的序列[IgG1-F405L]；

b)a)中的序列的子序列，诸如如下子序列，其中从a)中的序列的N末端或C末端开始，已经缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸；和

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多9个取代，诸如至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个取代的序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链或第二重链，诸如第一重链的恒定区，包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:21或27中所示的序列[IgG1-F409R]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多10个取代，诸如至多9个取代、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个取代、至多3个、至多2个或至多1个取代的序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链和/或第二重链的恒定区包含选自由以下组成的组或基本上由其组成或由其组成的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:28中所示的序列[IgG1-Fc_FEA]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多7个取代，诸如至多6个取代、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个取代的序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链和/或第二重链，诸如第二重链的恒定区，包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30中所示的序列[IgG1-Fc_FEAL]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多6个取代，诸如至多5个取代、至多4个取代、至多3个、至多2个或至多1个取代的序列。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链和/或第二重链，诸如第一重链的恒定区，包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:29中所示的序列[IgG1-Fc_FEAR]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多6个取代，诸如至多5个取代、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个取代的序列。

在第一方面的一个实施方案中，结合剂包含kappa(κ)轻链恒定区。

在第一方面的一个实施方案中，结合剂包含lambda(λ)轻链恒定区。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区或lambda(λ)轻链恒定区。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区或kappa(κ)轻链恒定区。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区并且第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区，或第一轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区并且第二轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区。

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，kappa(κ)轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO:35中所示的序列；

在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，lambda(λ)轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO:36中所示的序列；

根据第一方面的结合剂(特别是抗体)具有选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的同种型的。具体地，结合剂可以是全长IgG1抗体。在第一方面的优选实施方案中，结合剂(特别是抗体)是IgG1m(f)同种异型。

在根据第一方面的结合剂的一个优选实施方案中，结合剂包含

i)第一重链和第一轻链，其包含所述能够与CD137结合的抗原结合区，其中第一重链包含SEQ ID NO:31中所示的序列，并且第一轻链包含SEQ ID NO:32中所示的序列；

ii)第二重链和第二轻链，其包含所述能够与PD-L1结合的抗原结合区，其中第二重链包含SEQ ID NO:33中所示的序列，并且第二轻链包含SEQ ID NO:34中所示的序列。

根据第一方面使用的结合剂可以特别是acasunlimab或其生物类似物。

在目前优选的实施方案中，在每个剂量和/或在每个治疗周期中施用的结合剂的量是

a)约0.3-5mg/kg体重或总共约25-400mg；和/或

b)约2.1x10^-9–3.4x10^-8mol/kg体重或总共约1.7x10^-7–2.7x10^-6mol。

根据这些实施方案，基于施用结合剂的受试者的中位体重为80kg，以mg/kg定义的剂量可以转变为固定剂量，反之亦然

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约0.3-4.0mg/kg体重或总共约25-320mg；和/或

约2.1x10^-9–2.7x10^-8mol/kg体重或总共约1.7x10^-7–2.2x10^-6mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约0.38-4.0mg/kg体重或总共约30-320mg；和/或

约2.6x10^-9–2.7x10^-8mol/kg体重或总共约2.4x10^-7–2.2x10^-6mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约0.5-3.3mg/kg体重或总共约40-260mg；和/或

约3.4x10^-9–2.2x10^-8mol/kg体重或总共约2.7x10^-7–1.8x10^-6mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约0.6-2.5mg/kg体重或总共约50-200mg；和/或

约4.3x10^-9–1.7x10^-8mol/kg体重或总共约3.4x10^-7–1.4x10^-6mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约0.8-1.8mg/kg体重或总共约60-140mg；和/或

约5.1x10^-9–1.2x10^-8mol/kg体重或总共约4.1x10^-7–9.5x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约0.9-1.8mg/kg体重或总共约70-140mg；和/或

约6.0x10^-9–1.2x10^-8mol/kg体重或总共约4.8x10^-7–9.5x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约1-1.5mg/kg体重或总共约80-120mg；和/或

约6.8x10^-9–1.0x10^-8mol/kg体重或总共约5.5x10^-7–8.2x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约1.1-1.4mg/kg体重或总共约90-110mg；和/或

约7.7x10^-9–9.4x10^-9mol/kg体重或总共约6.1x10^-7–7.5x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约1.2-1.3mg/kg体重或总共约95-105mg；和/或

约6.8x10^-9–8.9x10^-9mol/kg体重或总共约6.5x10^-7–7.2x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约0.8-1.5mg/kg体重或总共约65-120mg；和/或

约5.5x10^-9–1.0x10^-8mol/kg体重或总共约4.4x10^-7–8.2x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为约0.9-1.3mg/kg体重或总共约70-100mg；和/或

约6.0x10^-9–8.5x10^-9mol/kg体重或总共约4.8x10^-7–6.8x10^-7mol。

约0.9-1.1mg/kg体重或总共约75-90mg；和/或

约6.4x10^-9–7.7x10^-9mol/kg体重或总共约5.1x10^-7–6.1x10^-7mol。

进一步，特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为0.3-4.0mg/kg体重或总共25-320mg；和/或

2.1x10^-9–2.7x10^-8mol/kg体重或总共1.7x10^-7–2.2x10^-6mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为0.38-4.0mg/kg体重或总共30-320mg；和/或

2.6x10^-9–2.7x10^-8mol/kg体重或总共2.4x10^-7–2.2x10^-6mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为0.5-3.3mg/kg体重或总共40-260mg；和/或

3.4x10^-9–2.2x10^-8mol/kg体重或总共2.7x10^-7–1.8x10^-6mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为0.6-2.5mg/kg体重或总共50-200mg；和/或

4.3x10^-9–1.7x10^-8mol/kg体重或总共3.4x10^-7–1.4x10^-6mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为0.8-1.8mg/kg体重或总共60-140mg；和/或

5.1x10^-9–1.2x10^-8mol/kg体重或总共4.1x10^-7–9.5x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为0.9-1.8mg/kg体重或总共70-140mg；和/或

6.0x10^-9–1.2x10^-8mol/kg体重或总共4.8x10^-7–9.5x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为1-1.5mg/kg体重或总共80-120mg；和/或

6.8x10^-9–1.0x10^-8mol/kg体重或总共5.5x10^-7–8.2x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为1.1-1.4mg/kg体重或总共90-110mg；和/或

7.7x10^-9–9.4x10^-9mol/kg体重或总共6.1x10^-7–7.5x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为1.2-1.3mg/kg体重或总共95-105mg；和/或

6.8x10^-9–8.9x10^-9mol/kg体重或总共6.5x10^-7–7.2x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为0.8-1.5mg/kg体重或总共65-120mg；和/或

5.5x10^-9–1.0x10^-8mol/kg体重或总共4.4x10^-7–8.2x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为0.9-1.3mg/kg体重或总共70-100mg；和/或

6.0x10^-9–8.5x10^-9mol/kg体重或总共4.8x10^-7–6.8x10^-7mol。

特别地，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以为0.9-1.1mg/kg体重或总共75-90mg；和/或

6.4x10^-9–7.7x10^-9mol/kg体重或总共5.1x10^-7–6.1x10^-7mol。

在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以是

a)约1.1mg/kg体重或总共约80mg；和/或

b)约6.8x10^-9mol/kg体重或总共约5.5x10^-7mol。

在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量可以是

a)约1.1mg/kg体重或总共约80mg；和/或

b)6.8x10^-9mol/kg体重或总共5.5x10^-7mol。

目前优选的是，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量是

a)约1.25mg/kg体重或总共约100mg；和/或

b)约8.5x10^-9mol/kg体重或总共约6.8x10^-7mol。

同样优选的是，在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的结合剂的量是

a)约1.25mg/kg体重或总共约100mg；和/或

b)8.5x10^-9mol/kg体重或总共6.8x10^-7mol。

结合剂可以以本领域中已知的任何方式和任何途径施用。在优选的实施方案中，结合剂全身施用，诸如肠胃外施用，特别是静脉内施用。

结合剂可以以如本文所述的任何合适的药物组合物的形式进行施用。在一个优选的实施方案中，结合剂以输注剂的形式进行施用。

根据本发明使用的结合剂可以通过使用静脉内(IV)输注，诸如通过静脉内输注持续在最少30分钟内，诸如最少60分钟内，例如通过使用静脉内输注在30至120分钟内施用。优选地，根据本发明使用的结合剂通过使用静脉内(IV)输注在30分钟内施用。

结合剂可以在施用PD-1抑制剂之前、同时或之后施用。

在一个实施方案中，在施用PD-1抑制剂之前施用结合剂。例如，结合剂施用结束与PD-1抑制剂施用开始之间的间隔可以是至少约10分钟，诸如至少约15分钟、至少约20分钟，至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、至少约45分钟、至少约50分钟、至少约55分钟、至少约60分钟、至少约90分钟，或至少约120分钟，和多至约14天(多至约2周)，诸如多至约13天、多至约12天、多至约11天、多至约10天，多至约9天、多至约8天、多至约7天(多至约1周)、多至约6天、多至约5天、多至约4天、多至约3天、多至约2天、多至约1天(多至约24h)、多至约18h、多至约12h、多至约6h、多至约5h、多至约4h、多至约3h、多至约2.5h或多至约2h。

在一个实施方案中，在施用PD-1抑制剂之后施用结合剂。例如，PD-1抑制剂施用结束与结合剂施用开始之间的间隔可以是至少约10分钟，诸如至少约15分钟、至少约20分钟，至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、至少约45分钟、至少约50分钟、至少约55分钟、至少约60分钟、至少约90分钟，或至少约120分钟，和多至约14天(多至约2周)，诸如多至约13天、多至约12天、多至约11天、多至约10天，多至约9天、多至约8天、多至约7天(多至约1周)、多至约6天、多至约5天、多至约4天、多至约3天、多至约2天、多至约1天(多至约24h)、多至约18h、多至约12h、多至约6h、多至约5h、多至约4h、多至约3h、多至约2.5h或多至约2h。

在一个实施方案中，结合剂与PD-1抑制剂同时施用。例如，可以使用包含两种药物的组合物来施用结合剂和PD-1抑制剂。或者，可以将结合剂施用到受试者的一个肢体中，并且可以将PD-1抑制剂施用到受试者的另一肢中。

PD-1抑制剂

在一个实施方案中，PD-1抑制剂防止与PD-1相关联的抑制性信号。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是破坏或抑制与PD-1相关联的抑制性信号传导的抗体或其片段。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是破坏或抑制抑制性信号传导的小分子抑制剂。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是破坏或抑制抑制性信号传导的基于肽的抑制剂。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是破坏或抑制抑制性信号传导的抑制性核酸分子。

如本文所述，抑制或阻断PD-1信号传导导致防止或逆转免疫抑制以及针对癌细胞的T细胞免疫的建立或增强。在一个实施方案中，如本文所述，PD-1信号传导的抑制减少或抑制免疫系统的功能障碍。在一个实施方案中，如本文所述，PD-1信号传导的抑制使得功能障碍的免疫细胞较少功能障碍。在一个实施方案中，如本文所述，PD-1信号传导的抑制使功能障碍的T细胞较少功能障碍。

在一个实施方案中，PD-1抑制剂防止PD-1和PD-L1之间的相互作用。

PD-1抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段，或其包含具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的构建体。抗体或其抗原结合片段如本文所述。作为PD-1抑制剂的抗体或其抗原结合片段特别包括与PD-1结合的抗体或其抗原结合片段。如本文所述，抗体或抗原结合片段还可以缀合至进一步的部分。特别地，抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

在一个优选的实施方案中，作为PD-1抑制剂的抗体是分离的抗体。

在一个实施方案中，PD-1抑制剂是防止PD-1和PD-L1之间相互作用的抗体、其片段或构建体。

PD-1抑制剂可以是抑制性核酸分子，诸如寡核苷酸、siRNA、shRNA、反义DNA或RNA分子和适体(例如DNA或RNA适体)，特别是反义寡核苷酸。在一个实施方案中，作为siRNA的PD-1检查点抑制剂干扰mRNA，因此阻断翻译，例如PD-1蛋白的翻译。

在一个实施方案中，PD-1抑制剂是抗体、其抗原结合部分或其构建体，其破坏或抑制PD-1受体与其配体PD-L1和/或PD-L2中的一种或多种之间的相互作用。与PD-1结合并破坏或抑制PD-1与其配体中的一种或多种之间的相互作用的抗体是本领域已知的。在某些实施方案中，抗体、其抗原结合部分或其构建体与PD-1特异性结合。

在进一步优选的实施方案中，PD-1抑制剂是与PD-1结合的抗体，诸如PD-1阻断性抗体。不受理论的束缚，相信包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区的结合剂与结合至PD-1的抗体的组合，在接受组合疗法的受试者中增加响应率并导致改进的响应的持续时间，因为组合疗法导致PD-1途径完全阻断以及4-1BB的并行条件性活化。PD-1阻断性抗体阻断与PD-L1和PD-L2两者的相互作用。进一步相信，具有与PD-1结合的抗体进行的组合疗法使得可由结合剂结合的PD-L1的量增加。

示例性的PD-1抑制剂包括但不限于抗PD-1抗体，诸如BGB-A317(BeiGene；参见US8,735,553,WO 2015/35606和US2015/0079109)、lambrolizumab(例如，在WO2008/156712中公开为hPD109A，及其人源化衍生物h409A1、h409A16和h409A17)、AB137132(Abcam)、EH12.2H7和RMP1-14(#BE0146；Bioxcell Lifesciences Pvt.LTD.)、MIH4(AffymetrixeBioscience)、纳武单抗(OPDIVO、BMS-936558；Bristol Myers Squibb；参见U.S.专利号8,008,449；WO 2013/173223；WO 2006/121168)、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475；Merck；参见WO2008/156712)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011；CureTech；参见Hardy等人,1994,Cancer Res.,54(22):5793-6和WO 2009/101611)、PDR001(Novartis；参见WO2015/112900)、MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca；参见WO 2012/145493)、TSR-042(参见WO 2014/179664)、西米普利单抗(REGN-2810；Regeneron；H4H7798N；参见US2015/0203579和WO2015/112800)、JS001(TAIZHOU JUNSHIPHARMA；参见(TAIZHOU JUNSHIPHARMA；参见Si-YangLiu等人.,2007,J.Hematol.、AMP-224(GSK-2661380；参见Li等人,2016,Int J Mol Sci 17(7):1151和WO 2010/027827和WO 2011/066342)、PF-06801591(Pfizer)、替雷利珠单抗(tislelizumab)(BGB-A317；BeiGene；参见WO 2015/35606,U.S.专利号9,834,606,和US2015/0079109)、BI 754091、SHR-1210(参见WO2015/085847)和如WO 2006/121168中所述的抗体17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4,INCSHR1210(Jiangsu Hengrui Medicine；也称为SHR-1210；参见WO 2015/085847)、TSR-042(Tesaro Biopharmaceutical；也称为ANB011；参见WO2014/179664)、GLS-010(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals；也称为WBP3055；参见Si-Yang等人,2017,J.Hematol.Oncol.70:136)、STI-1110(Sorrento Therapeutics；参见WO 2014/194302)、AGEN2034(Agenus；参见WO 2017/040790)、MGA012(Macrogenics；参见WO2017/19846)、IBI308(Innovent；参见WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825和WO 2017/133540)，西利单抗(cetrelimab)(JNJ-63723283；JNJ-3283；参见Calvo等人,J.Clin.Oncol.36,no.5_suppl(2018)58)，genolimzumab(CBT-501；参见Patel等人J.ImmunoTher.Cancer,2017,5(Suppl 2):P242)、萨善利单抗(sasanlimab)(PF-06801591；参见Youssef等人，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.Ann.Meeting 2017；Cancer Res 2017；77(13Suppl):Abstract)、特瑞普利单抗(toripalimab)(JS-001；参见US2016/0272708)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)(SHR-1210；INCSHR-1210；参见US2016/376367；Huang等人，Clin.Cancer Res.2018；24(6):1296-1304)、spartalizumab(PDR001；参见WO2017/106656；Naing等人，J.Clin.Oncol.34,no.15_suppl(2016)3060-3060)、BCD-100(JSCBiocad，俄罗斯；参见WO2018/103017)、巴替利单抗(balstilimab)(AGEN2034；参见WO2017/040790)、信迪利单抗(sintilimab)(IBI-308；参见WO 2017/024465和WO 2017/133540)、埃本利单抗(ezabenlimab)(BI-754091；参见US2017/334995；Johnson等人，J.Clin.Oncol.36,no.5_suppl(2018)212-212)、赛帕利单抗(zimberelimab)(GLS-010；参见WO 2017/025051)、LZM-009(参见US2017/210806)、AK-103(参见WO 2017/071625、WO 2017/166804和WO 2018/036472)、瑞弗利单抗(retifanlimab)(MGA-012；参见WO 2017/019846)、Sym-021(参见WO2017/055547)、CS1003(参见CN107840887)、抗PD-1抗体，如描述于例如US 7,488,802、US8,008,449、US 8,168,757、WO 03/042402、WO 2010/089411(进一步公开了抗PD-L1抗体)、WO 2010/036959、WO 2011/159877(进一步公开了针对TIM-3的抗体)、WO 2011/082400、WO2011/161699、WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2012/145493(进一步公开了针对PD-L1的抗体)、WO 2015/035606、WO 2014/0555648(进一步公开了抗KIR抗体)、US2018/0185482(进一步公开了抗PD-L1和抗TIGIT抗体)、US 8,008,449、US 8,779,105、US6,808,710、US 8,168,757、US2016/0272708和US 8,354,509中、对PD-1信号传导途径的小分子拮抗剂，如公开于例如Shaabani等人，2018,Expert Op Ther Pat.,28(9):665-678以及Sasikumar和Ramachandra，2018,BioDrugs,32(5):481-497中、针对PD-1的siRNA，如公开于例如WO 2019/000146和WO 2018/103501中、可溶性PD-1蛋白，如公开于WO2018/222711中以及包含可溶形式PD-1的溶瘤病毒，如描述于例如WO 2018/022831中。

在某个实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗(OPDIVO；BMS-936558)或其生物类似物、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475)或其生物类似物、匹地利珠单抗(CT-011)、PDR001、MEDI0680(AMP-514)或其生物类似物、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091或SHR-1210。

PD-1抑制剂可以特别地是派姆单抗或其生物类似物。或者，抗体可以是纳武单抗或其生物类似物。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂免疫调节剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含上述抗PD-1抗体或抗原结合片段中的一者的互补决定区(CDR)，诸如选自下组的一种抗PD-1抗体或抗原结合片段的CDR：纳武单抗、Amp-514、替雷利珠单抗、西米普利单抗、TSR-042、JNJ-63723283、CBT-501、PF-06801591、JS-001、卡瑞利珠单抗、PDR001、BCD-100、AGEN2034、IBI-308、BI-754091、GLS-010、LZM-009、AK-103、MGA-012、Sym-021和CS1003。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体的CDR使用Kabat编号方案描绘(Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Departmentof Health and Human Services,NTH出版物编号91-3242)。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含如上所述的抗PD-1抗体或抗原结合片段中的一者的重链可变区和轻链可变区，例如选自下组的一种抗PD-1抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区：纳武单抗、Amp-514、替雷利珠单抗、西米普利单抗、TSR-042、JNJ-63723283、CBT-501、PF-06801591、JS-001、卡瑞利珠单抗、PDR001、BCD-100、AGEN2034、IBI-308、BI-754091、GLS-010、LZM-009、AK-103、MGA-012、Sym-021和CS1003。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是选自下组的抗PD-1抗体或其抗原结合片段：纳武单抗、Amp-514、替雷利珠单抗、西米普利单抗、TSR-042、JNJ-63723283、CBT-501、PF-06801591、JS-001、卡瑞利珠单抗、PDR001、BCD-100、AGEN2034、IBI-308、BI-754091、GLS-010、LZM-009、AK-103、MGA-012、Sym-021和CS1003。

派姆单抗的CDR序列在本文中由SEQ ID NO:59-61(分别为VH CDR 1、2和3)和SEQID NO:62-64(分别为VL CDR 1、2和3)标识。VH和VL序列分别由SEQ ID NO:65和66标识，并且重链和轻链序列分别由SEQ ID NO:67和68标识。因此，在一个实施方案中，PD-1抑制剂是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，所述VH包含分别如SEQ ID NO:59、60和61中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL包含分别如SEQ ID NO:62、63和64中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在进一步实施方案中，PD-1抑制剂是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，所述VH包含SEQ ID NO:65中所示的序列或由SEQ ID NO:65中所示的序列组成或基本上由SEQ ID NO:65中所示的序列组成，所述VL包含SEQ ID NO:66中所示的序列、由SEQ IDNO:66中所示的序列组成或基本上SEQ ID NO:66中所示的序列组成。特别地，PD-1抑制剂可以是包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列、由SEQ IDNO:67中所示的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列组成，所述轻链包含SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列、由SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列组成或基本上SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列组成。

纳武单抗的CDR序列在本文中由SEQ ID NO:69-71(分别为VH CDR 1、2和3)和SEQID NO:72-74(分别为VL CDR 1、2和3)标识。VH和VL序列分别由SEQ ID NO:75和76标识，并且重链和轻链序列分别由SEQ ID NO:77和78标识。因此，在一个实施方案中，PD-1抑制剂是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，所述VH包含分别如SEQ ID NO:69、70和71中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL包含分别如SEQ ID NO:72、73和74中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在进一步实施方案中，PD-1抑制剂是包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，所述VH包含SEQ ID NO:75中所示的序列或由SEQ ID NO:75中所示的序列组成或基本上由SEQ ID NO:75中所示的序列组成，所述VL包含SEQ ID NO:76中所示的序列、由SEQ IDNO:76中所示的序列组成或基本上由SEQ ID NO:76中所示的序列组成。特别地，PD-1抑制剂可以是包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:77中所示的氨基酸序列、由SEQID NO:77中所示的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:77中所示的氨基酸序列组成，所述轻链包含SEQ ID NO:78中所示的氨基酸序列、由SEQ ID NO:78中所示的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:78中所示的氨基酸序列组成。

本公开的抗PD-1抗体优选是单克隆抗体，并且可以是多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab‘)片段、由Fab表达文库产生的片段和上述任一者的PD-1结合片段。在一些实施方案中，本文所述的抗PD-1抗体与PD-1(例如，人PD-1)特异性结合。本公开的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

在本公开的某些实施方案中，抗PD-1抗体是如本文所述的抗原结合片段(例如，人抗原结合片段)并且包括但不限于Fab、Fab‘和F(ab‘)₂、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)以及包含V_L或者V_H域的片段。抗原结合片段，包括单链抗体，可以包含单独的可变区或与以下的全部或部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2、CH3和CL域。本公开中还包括包含可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3和CL域的任何组合的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼科、马或鸡。

本文公开的抗PD-1抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以是对PD-1的不同表位特异的，也可以是对PD-1以及对异源蛋白两者都特异的。参见例如PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt,等人,1991,J.Immunol.147:60 69；U.S.专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人,1992,J.Immunol.148:1547 1553。

本文公开的抗PD-1抗体可以根据它们包含的特定CDR来描述或指定。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任何一个来容易地确定，这些方案由以下描述的那些：Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,"第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD("Kabat"编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948("Chothia"编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),"Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,"J.Mol.Biol.262,732-745.”("Contact"编号方案)；Lefranc MP等人,"IMGT unique numbering for immunoglobulinand T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,"DevComp Immunol,2003；27(1):55-77("IMGT"编号方案)；Honegger A和Plückthun A,"Yetanother numbering scheme for immunoglobulin variabledomains:an automaticmodeling and analysis tool,"J Mol Biol,2001；309(3):657-70,("Aho"numberingscheme)；和Martin等人,"Modeling antibody hypervariable loops:a combinedalgorithm,"PNAS,1989,86(23):9268-9272,("AbM"编号方案)。给定CDR的边界可以取决于用于鉴定的方案而变化。在一些实施方案中，给定抗体或其区(例如，其可变区)的CDR或个别指定CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应理解为涵盖由任何上述方案定义的(或特定的)CDR。例如，在叙述了特定CDR(例如CDR-H3)含有给定V_H或V_L区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列之处，应当理解，此类CDR具有如任何前述方案所定义的可变区之内的相应的CDR(例如，CDR-H3)的序列。可以指定用于标识特定CDR的方案，诸如由Kabat、Chothia、AbM或IMGT方法所定义的CDR。

在一些实施方案中，本文提供的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的CDR序列中的氨基酸残基的编号是根据如Lefranc,M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,2003,27,55-77中所述的IMGT编号方案。

在一些实施方案中，本文公开的抗PD-1抗体包含抗体纳武单抗的CDR。参见WO2006/121168。在一些实施方案中，抗体纳武单抗的CDR使用Kabat编号方案描绘(Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NTH出版物编号91-3242)。本公开涵盖包含重链可变域或轻链可变域的抗PD-1抗体或其衍生物，所述可变域包含(a)三个CDR的集，其中所述CDR集来自单克隆抗体纳武单抗，和(b)四个框架区的集，其中所述框架区集不同于单克隆抗体纳武单抗中的框架区集，并且其中所述抗PD-1抗体或其衍生物与PD-1结合。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗。

本文公开的抗PD-1抗体还可以根据其与PD-1(例如，人PD-1)的结合亲和力来描述或指定。优选的结合亲和力包括具有小于5x10^-2 M、10^-2M、5x10^-3M、10^-3M、5x10^-4 M、10^-4M、5x10^-5 M、10^-5M、5x10^-6 M、10^-6M、5x10^-7M、10^-7M、5x10^-8 M、10^-8M、5x10^-9 M、10^-9M、5x10^-10 M、10^-10M、5x10^-11M、10^-11M、5x10^-12 M、10^-12M、5x10^-13 M、10^-13M、5x10^-14 M、10^-14M、5x10^-15 M或10^-15M的解离常数或Kd的那些。

抗PD-1抗体还包括经修饰的衍生物和构建体，即通过将任何类型的分子共价附接至抗体，使得共价附接不防止抗体与PD-1结合。例如但不通过限于，抗PD-1抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白的连接等被修饰的抗体。可以通过已知技术进行多种化学修饰中的任一种，这包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物或构建体可以含有一种或多种非经典氨基酸。

在优选的实施方案中，PD-1抑制剂是抗体，特别是拮抗性或阻断性抗体，其破坏或抑制PD-1途径(PD-1与其配体(诸如PD-L1和/或PD-L2)中的一种或多种的相互作用)。在一个优选的实施方案中，PD-1抑制剂是抗体，特别是拮抗性或阻断性抗体，其破坏或抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用。

PD-1抑制剂可以以编码PD-1抑制剂的核酸(诸如DNA或RNA分子，例如抑制性核酸分子或抗体或其片段)的形式施用。例如，如本文所述，可以递送在表达载体中编码的抗体。核酸分子可以原样递送，例如以质粒或mRNA分子的形式，或与递送载体例如脂质体、lipoplex或核酸脂质颗粒复合。PD-1t抑制剂还可以经由包含编码PD-1抑制剂的表达盒的溶瘤病毒来施用。PD-1还可以通过施用能够表达PD-1抑制剂的内源性或同种异体细胞来施用，例如形式为基于细胞的疗法。

优选地，PD-1抑制剂以合适的量施用。特别地，在每个剂量和/或治疗周期中施用的PD-1抑制剂的量可以在一个范围中，其中大于5％，优选大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％，甚至更优选大于25％，甚至更优选大于30％，甚至更优选大于35％，甚至更优选大于40％，甚至更优选大于45％，最优选大于50％的所述PD-1抑制剂与PD-1结合。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且例如在每个剂量中和/或每个治疗周期中所施用的PD-1抑制剂的量为总共约10-约1000mg，诸如约总共约100-约600mg，例如总共约150-约600mg、总共约150-约500mg、总共约175-约500mg、总共约175-约450mg、总共约200-约450mg，或诸如总共约200-约400mg。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且例如在每个剂量中和/或每个治疗周期中所施用的PD-1抑制剂的量为总共10-1000mg，诸如总共约100-600mg，例如总共150-600mg、总共150-500mg、总共175-500mg、总共175-450mg、总共200-450mg，或诸如总共200-400mg。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且例如在每个剂量中和/或每个治疗周期中所施用的PD-1抑制剂的量为

总共约100-600mg；和/或

总共约6.84x10^-7–4.11x10^-7mol。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且例如在每个剂量中和/或每个治疗周期中所施用的PD-1抑制剂的量为约100-400mg；和/或总共约6.84x10^-7–2.73x10^-6mol，诸如总共100-400mg；和/或总计6.84x10^-7–2.73x10^-6mol。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且例如在每个剂量中和/或每个治疗周期中所施用的PD-1抑制剂的量为约200-400mg；和/或总共约6.84x10^-7–2.73x10^-6mol，诸如总共200-400mg；和/或总共6.84x10^-7–2.73x10^-6mol。

在某些实施方案中，例如在每个剂量中和/或每个治疗周期中所施用的PD-1抑制剂的量为总共约200mg或约1.37x10^-6mol，诸如总共200mg或1.37x10^-6mol。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且例如在每个剂量中和/或每个治疗周期中所施用的PD-1抑制剂的量为总共约200mg或约1.37x10^-6mol，诸如总共200mg或1.37x10^-6mol。

在某些实施方案中，例如在每个剂量中和/或每个治疗周期中所施用的PD-1抑制剂的量为总共约400mg或总共约2.73x10^-6mol，诸如总共400mg或总共2.73x10^-6mol。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物，并且例如在每个剂量中和/或每个治疗周期中所施用的PD-1抑制剂的量为总共约400mg或总共约2.73x10^- ⁶mol，诸如总共400mg或总共2.73x10^-6mol。

PD-1抑制剂可以以本领域已知的任何方式和任何途径施用。施用的方式和途径将取决于所使用的PD-1抑制剂的类型。在优选的实施方案中，PD-1抑制剂全身施用，诸如肠胃外施用，特别是静脉内施用。

PD-1抑制剂可以以如本文所述的任何合适的药物组合物的形式进行施用。在优选的实施方案中，PD-1抑制剂以输注剂的形式施用，诸如静脉内输注。

与PD-1结合的抗体可以包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区(VH)和含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区(VL)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含或具有如SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:100中所示的序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含或具有如SEQ ID NO:107、QAS和SEQ ID NO:105中所示的序列。此类抗体的具体的但非限制性实例是MAB-19-0202。

术语“重链可变区”(也称为“VH”)和“轻链可变区”(也称为“VL”)在本文以其最一般的含义使用并且包含能够包含互补决定区(CDR)，其散布有其他区，该其他区也称为框架区(FR)。框架区尤其间隔CDR，使得它们能够形成抗原结合位点，特别是在VH和VL折叠和配对之后。优选地，每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，其从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。也就是说，术语“重链可变区”和“轻链可变区”不应解释为限于此类序列，因为它们可以在天然抗体中或在如本文示例的VH和VL序列中找到(序列表的SEQ ID NO:109至112)。这些术语包括能够包含并充分定位CDR的任何序列，例如如衍生自天然抗体的VL和VH区或衍生自序列表的SEQ ID NO:109至112中所示的序列的此类序列。本领域技术人员应当理解，特别是框架区的序列可以经修饰(包括就氨基酸取代而言的变体和就序列长度而言的变体，即插入或缺失变体)而不丧失分别是VH和VL的特征。在优选的实施方案中，任何修饰限于框架区。但是，本领域技术人员还熟知以下事实：CDR、高变区和可变区也可以经修饰而不丧失与PD-1结合的能力。例如，CDR区将与本文指定的区相同或高度同源。所谓“高度同源”，预期的是可以在CDR中进行1个至5个、优选1个至4个、诸如1个至3个或1个或2个取代。另外，高变区和可变区可以经修饰，使得它们显示出与本文具体公开的区的实质同源性。

在与PD-1结合的抗体中，如本文所指定的CDR已经通过使用两种不同的CDR鉴定方法来鉴定。本文使用的第一个编号方案是根据Kabat(Wu和Kabat，1970；Kabat等人，1991)，第二个方案是IMGT编号方案(Lefranc，1997；Lefranc等人，2005)。在第三种方法中，已经使用了两种鉴定方案的相交。

与PD-1结合的抗体可以包含如本文所述的一个或多个CDR、CDR的组或CDR的组的组合，其包含所述CDR连同其居间的框架区(本文中也称为框架区或FR)或连同部分的所述框架区。优选地，该部分将包括第一和第四框架区之一或两者的至少约50％，该50％是第一框架区的C末端50％和第四框架区的N末端50％。通过重组DNA技术制备的抗体的构建可以导致将残基N末端或C末端引入到由接头(该接头被引入以促进克隆或其他操作步骤)编码的可变区，包括引入接头以将本公开的可变区连接到进一步的蛋白质序列，该蛋白质序列包括免疫球蛋白重链、其他可变域(例如在双抗体的生产中)或蛋白质标记。

与PD-1结合的抗体可以包含重链可变区(VH)，该VH包含与如SEQ ID NO:111中任一个中所示的VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，抗体包含重链可变区(VH)，其中该VH包含如SEQ ID NO:111中任一个中所示的序列。在一个实施方案中，该抗体包含轻链可变区(VL)，该VL包含与如SEQ ID NO:112中任一个中所示的VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，抗体包含轻链可变区(VL)，其中该VL包含如SEQ ID NO:112中任一个中所示的序列。

与PD-1结合的抗体可以包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含或具有如SEQ ID NO:111中所示的序列，并且该VL包含或具有序列如SEQ ID NO:112所示，或这些序列的各自的变体。与PD-1结合的抗体的另一个实例可以包含VH以及VL，该VH包含或具有如SEQ ID NO:111中所示的序列或其变体，该VL包含或具有如SEQ ID NO:112中所示的序列或其变体。此类抗体的具体的但非限制性实例是MAB-19-0618。抗体MAB-19-0618已经衍生自MAB-19-0202。本公开还涵盖的是，所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)的变体以及这些变体VH和VL的各自组合。

与PD-1结合的抗体可以包含重链和轻链；其中该重链包含重链恒定区和重链可变区(VH)，该重链恒定区包含或具有如SEQ ID NO:93或90中所示的序列，并且该VH包含或具有如SEQ ID NO:111中所示的序列；并且该轻链包含轻链恒定区和轻链可变区(VL)，其中该轻链恒定区包含或具有如SEQ ID NO:97中所示的序列，并且该VL包含或具有如SEQ ID NO:112中所示的序列。

与PD-1结合的抗体可以包含重链和轻链；其中该重链包含重链恒定区和重链可变区(VH)，该重链恒定区包含如SEQ ID NO:93或90中所示的序列，并且该VH包含如SEQ IDNO:111中所示的CDR1、CDR2和CDR3的序列；并且该轻链包含轻链恒定区和轻链可变区，其中该轻链恒定区包含或具有如SEQ ID NO:97中所示的序列，并且该轻链可变区包含如SEQ IDNO:112中所示的CDR1、CDR2和CDR3的序列。例如，CDR1、CDR2和CDR3序列如本文所指定。

与PD-1结合的抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体或单克隆抗体、人源化抗体或此类抗体的片段。抗体可以是整个抗体或其抗原结合片段，包括例如双特异性抗体。

在与PD-1结合的抗体中，一个或多个、优选两个重链恒定区都可以已经经修饰，使得与野生型抗体相比，C1q与所述抗体的结合减少，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。在一个实施方案中，C1q结合可以通过ELISA确定。

在与PD-1结合的抗体中，一个或多个、优选两个重链恒定区可以已经经修饰，使得与野生型抗体相比，一个或多个IgG Fc-γ受体与抗体的结合减少，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。在一个实施方案中，一个或多个IgG Fc-γ受体选自Fc-γRI、Fc-γRII和Fc-γRIII中的至少一个。在一个实施方案中，IgG Fc-γ受体是Fc-γRI。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体不能诱导Fc-γRI介导的效应器功能，或者其中与野生型抗体相比，所述诱导的Fc-γRI介导的效应器功能降低，优选降低了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体不能诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、细胞凋亡、同型黏附和/或吞噬作用中的至少一种，或者，其中以减少的程度诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、细胞凋亡、同型黏附和/或吞噬作用中的至少一种，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性在本文中也称为“ADCC”。ADCC描述了如本文所述的效应细胞，特别是淋巴细胞的细胞杀伤能力，其优选需要通过抗体正在标记的靶细胞。

ADCC优选在抗体与肿瘤细胞上的抗原结合并且抗体Fc域接合免疫效应细胞表面上的Fc受体(FcR)时发生。已经鉴定出几个Fc受体的家族，并且特定细胞群特征性地表达确定的Fc受体。ADCC可以视为直接诱导不同程度的即刻的肿瘤破坏的机制，其导致抗原呈递和诱导肿瘤定向的T细胞应答。优选地，ADCC的体内诱导将导致肿瘤定向的T细胞应答和宿主衍生的抗体应答。

补体依赖性细胞毒性在本文也称为“CDC”。CDC是另一种可以由抗体指导的细胞杀伤方法。IgM是补体活化最有效的同种型。IgG1和IgG3在经由经典补体活化途径指导CDC中也都非常有效。优选地，在该级联中，抗原-抗体复合物的形成导致参与抗体分子诸如IgG分子(C1q是补体C1的三个子组分之一)的C_H2域上非常接近的多个C1q结合位点的去掩盖(uncloaking)。优选地，这些去掩盖的C1q结合位点将此前的低亲和力C1q-IgG相互作用转变为高亲合力的相互作用，这触发涉及一系列其他补体蛋白的级联事件，并导致效应细胞趋化剂/活化剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，补体级联在攻膜复合物的形成中结束，其在细胞膜中产生孔，这促进水和溶质自由进出细胞并可以导致细胞凋亡。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体具有降低或消减的效应器功能。在一个实施方案中，抗体不介导ADCC或CDC或两者。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体的一个或多个、优选两个重链恒定区已经经修饰，使得与野生型抗体相比，新生儿Fc受体(FcRn)与抗体的结合不受影响。

在一个实施方案中，抗体能够结合的PD-1是人PD-1。在一个实施方案中，PD-1具有或包含如SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:114中所示的氨基酸序列，或PD-1的氨基酸序列与SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:114中所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性，或是其免疫原性片段。在一个实施方案中，抗体具有与活细胞的表面上存在的PD-1的天然表位结合的能力。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含：对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234的位置处的芳香族氨基酸或非极性氨基酸，和对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置236的位置处的除了甘氨酸以外的氨基酸。

例如，参照根据本公开的序列列表的SEQ ID NO.93的氨基酸序列，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234至236的氨基酸位置是SEQ ID NO.93的氨基酸位置117至119，其中F位于位置117(对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234)，E位于位置118(对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置235)，R位于位置119(对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置236)。在如下所示的序列中，FER氨基酸序列加下划线并以粗体字母显示。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在本公开中对抗体重链恒定区中的氨基酸位置的所有提及，均指对应于根据如Kabat中所示的EU编号(描述于Kabat,E.A.等人,Sequences of proteins of immunological interest.第5版USDepartment ofHealth and Human Services,NIH公开号91-3242,pp 662,680,689(1991))的人IgG1重链中的相应位置。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体包含重链恒定区，其与包含相同抗原结合区以及含有人IgG1铰链区、CH2和CH3区的重链恒定区(CH)的另一种抗体相比，具有降低的或消减的Fc介导的效应器功能或以较小程度诱导Fc介导的效应器功能。

在一个特定的实施方案中，与PD-1结合的抗体中的所述重链恒定区(CH)经修饰，使得与除了包含未经修饰的重链恒定区(CH)以外相同的抗体相比，该抗体以较小程度诱导Fc介导的效应器功能。

如本文所用，术语“Fc介导的效应器功能”是指特别选自IgG Fc受体(FcγR、FcγR)结合、C1q结合、ADCC、CDC及其任何组合的列表的此类功能。

在本公开的上下文中，与抗体(包括多特异性抗体)相关使用的术语“具有降低的或消减的Fc介导的效应器功能”意指该抗体引起Fc介导的效应器功能总体降低，此类功能特别选自IgG Fc受体(FcgammaR、FcγR)结合、C1q结合、ADCC或CDC的列表，在与包含(i)与所述抗体相同的CDR序列，特别是包含相同的第一和第二抗原结合区以及(ii)两个包含人IgG1铰链、CH2和CH3区的重链的人IgG1抗体相比的水平上，优选5％或更大、10％或更大、20％或更大、更优选50％或更大，并且最优选75％或更大的降低。“消减的Fc介导的效应器功能”或类似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上至零。

在本公开的上下文中，与抗体(包括多特异性抗体)相关使用的术语“以较小程度诱导Fc介导的效应器功能”意指与包含(i)与所述抗体相同的CDR序列，特别是包含相同的第一和第二抗原结合区以及(ii)两个包含人IgG1铰链、CH2和CH3区的重链的人IgG1抗体相比，该抗体以较小程度诱导Fc介导的效应器功能，此类功能特别是选自IgG Fc受体(FcgammaR、FcγR)结合、C1q结合、ADCC或CDC的列表。

Fc介导的效应器功能可以通过测量结合剂与Fcγ受体的结合、与C1q的结合或Fc介导的Fcγ受体的交联的诱导来确定。特别地，可以通过测量结合剂与C1q和/或IgG Fc-γRI的结合来确定Fc介导的效应器功能。

在涉及与PD-1结合的抗体的用途的一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置236的位置处的氨基酸是碱性氨基酸。

术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在本文中可互换地使用，并且不应理解为限制性的。氨基酸是含有胺(-NH2)和羧基(-COOH)官能团以及对每种氨基酸特异的侧链(R基团)的有机化合物。在本公开的上下文中，氨基酸可以基于结构和化学特征进行分类。

在本公开中，氨基酸残基通过使用以下缩写来表达。另外，除非另有明确说明，肽和蛋白质的氨基酸序列从N末端到C末端(左末端到右末端)来定义，将N末端定义为第一残基。氨基酸通过其3字母缩写、1字母缩写或全名指定，如下。Ala:A:丙氨酸；Asp:D:天冬氨酸；Glu:E:谷氨酸；Phe:F:苯丙氨酸；Gly:G:甘氨酸；His:H:组氨酸；Ile:I:异亮氨酸；Lys:K:赖氨酸；Leu:L:亮氨酸；Met:M:甲硫氨酸；Asn:N:天冬酰胺；Pro:P:脯氨酸；Gln:Q:谷氨酰胺；Arg:R:精氨酸；Ser:S:丝氨酸；Thr:T:苏氨酸；Val:V:缬氨酸；Trp:W:色氨酸；Tyr:Y:酪氨酸；Cys：C：半胱氨酸。

天然存在的氨基酸通常也可分成四个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、和不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。

在涉及与PD-1结合的抗体的用途的一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置236的位置处的碱性氨基酸选自由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成的组。在一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置236的位置处的碱性氨基酸是精氨酸(G236R)。此类氨基酸取代在本文也称为G236R。术语“G236R”表示在根据EU编号的人IgG1重链中的位置236处，氨基酸甘氨酸(G)由精氨酸(R)取代。在本公开之内，相似的术语用于其他氨基酸位置和氨基酸。除非有相反指示，这些术语中所提及的氨基酸位置是根据EU编号的人IgG1重链中的氨基酸位置。

在涉及与PD-1结合的抗体的用途的一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234的位置处的氨基酸是芳香族氨基酸。在一个实施方案中，该位置处的芳香族氨基酸选自由苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸组成的组。

在涉及与PD-1结合的抗体的用途的一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234的位置处的氨基酸是非极性氨基酸。在一个实施方案中，该位置处的非极性氨基酸选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组。在一个实施方案中，该位置处的非极性氨基酸选自由异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组。

在涉及与PD-1结合的抗体的用途的一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234的位置处的氨基酸是芳香族氨基酸。

对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234和236的位置处的可能氨基酸的示例性组合如下表所示：

表5：

例如，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234和236的位置处，具体地，以下氨基酸可以存在于与PD-1结合的抗体的重链恒定区中：234F/236R、234W/236R、234Y/236R、234A/236R、234L/236R、234F/236K、234W/236K、234Y/236K、234A/236K、234L/236K、234F/236H、234W/236H、234Y/236H、234A/236H或234L/236H。

上述位置234和位置236处的氨基酸或氨基酸取代可以仅存在于与PD-1结合的抗体的一条重链中，或者存在于与PD-1结合的抗体的两条重链中。抗体的第一重链和第二重链中存在的各个氨基酸可以彼此独立地选择。

例如，与PD-1结合的抗体的至少一条重链可以包含以下序列(SEQ ID NO:93)：

在涉及与PD-1结合的抗体的一个实施方案中，所述重链中对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234和位置236的位置处的氨基酸如上文所指定，此外对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置235的位置处的氨基酸是酸性氨基酸。在一个实施方案中，该位置处的酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸。在一个实施方案中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置235的位置处的氨基酸是谷氨酸(L235E)。

在涉及与PD-1结合的抗体的一个实施方案中，在重链恒定区中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234、235和236的位置处的氨基酸在位置234处是非极性或芳香族氨基酸、在位置235处是酸性氨基酸和在位置236处是碱性氨基酸。

对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234、235和236的位置处的可能氨基酸的示例性组合如下表所示：

表6：

例如，在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234、235和236的位置处，具体地，以下氨基酸可以存在于与PD-1结合的抗体的重链恒定区中：234F/235E/236R、234W/235E/236R、234Y/235E/236R、234A/235E/236R、234L/235E/236R、234F/235D/236R、234W/235D/236R、234Y/235D/236R、234A/235D/236R、234L/235D/236R、234F/235L/236R、234W/235L/236R、234Y/235L/236R、234A/235L/236R、234L/235L/236R、234F/235A/236R、234W/235A/236R、234Y/235A/236R、234A/235A/236R、234L/235A/236R、234F/235E/236K、234W/235E/236K、234Y/235E/236K、234A/235E/236K、234L/235E/236K、234F/235D/236K、234W/235D/236K、234Y/235D/236K、234A/235D/236K、234L/235D/236K、234F/235L/236K、234W/235L/236K、234Y/235L/236K、234A/235L/236K、234L/235L/236K、234F/235A/236K、234W/235A/236K、234Y/235A/236K、234A/235A/236K、234L/235A/236K、234F/235E/236H、234W/235E/236H、234Y/235E/236H、234A/235E/236H、234L/235E/236H、234F/235D/236H、234W/235D/236H、234Y/235D/236H、234A/235D/236H、234L/235D/236H、234F/235L/236H、234W/235L/236H、234Y/235L/236H、234A/235L/236H、234L/235L/236H、234F/235A/236H、234W/235A/236H、234Y/235A/236H、234A/235A/236H或234L/235A/236H.

上述位置234、235、236处的氨基酸或氨基酸取代可以仅存在于抗体的一条重链中，或存在于抗体的两条重链中。抗体的第一重链和第二重链中存在的各个氨基酸可以彼此独立地选择。

例如，与PD-1结合的抗体的至少一条重链可以包含以下序列(SEQ ID NO:90或93)：

除非上下文指出，否则在本申请中，如果适用的话，在位置234、236和235处的所有所述的氨基酸取代的任何排列和组合，例如，如表5和6中所示，应当被视为由本申请的说明书公开。例如，在抗体的一个实施方案中，第一重链，其中对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234至236的位置处包含氨基酸FER，或第一重链包含SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成，并且所述抗体的第二重链包含其他氨基酸，例如，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234至236的位置处的氨基酸AAG或LLG，或所述抗体的第二重链包含SEQ ID NO:92或98所示的氨基酸序列或基本上由其组成或由其组成。在抗体的另一个实施方案中，第一重链和第二重链包含在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234至236的位置处的相同的氨基酸，即在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234的位置处的相同的芳香族或非极性氨基酸，例如F，以及在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置236的位置处，除甘氨酸以外的相同氨基酸，例如R，诸如FER或FLR的具体组合。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体包含至少一个或两个重链恒定区，其中对应于位置234的氨基酸为苯丙氨酸，对应于位置235的氨基酸为谷氨酸，并且对应于位置236的氨基酸为精氨酸(L234F/L235E/G236R＝FER)。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体包含一个或多个重链恒定区(CH)，其包含与如SEQ ID NO:93中所示的重链恒定区序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体包含一个或多个，例如两个重链恒定区(CH)，其中重链恒定区包含如SEQ ID NO:93中所示的序列。

抗体优选是IgG1同种型。

如本文所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别。当本文提及IgG1同种型时，该术语不限于特定同种型序列(例如特定IgG1序列)，而是用于指示该抗体在序列上比其他同种型更接近于该同种型(例如IgG1)。因此，例如本文公开的IgG1抗体可以是天然存在的IgG1抗体的序列变体，这包括恒定区中的变异。

IgG1抗体可以存在于称为同种异型的多种多态性变体中(在Jefferis和Lefranc2009.mAbs Vol 1Issue 4 1-7中综述)，其中任何一种都适合用于本文的一些实施方案中。人群中常见的同种异型变体是由字母a、f、n、z或其组合指定的那些。在本文的任何实施方案中，抗体可以包含含有人IgG Fc区的重链Fc区。在进一步的实施方案中，人IgG Fc区包含人IgG1。

哺乳动物中存在两种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型之内基本上是保守的，其中可变部分高度多样化并负责抗原识别。

例如或在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体，优选单克隆抗体是IgG1、κ同种型或λ同种型，优选包含人IgG1/κ或人IgG1/λ恒定部分，或者该抗体，优选单克隆抗体，衍生自IgG1,λ(lambda)或IgG1,κ(kappa)抗体，优选衍生自人IgG1,λ(lambda)或人IgG1,κ(kappa)抗体。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体包含轻链，该轻链具有包含与如SEQ IDNO:97中所示的LC序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列的轻链恒定区(LC)。在一个实施方案中，抗体包含轻链，该轻链具有包含如SEQ ID NO:97所示的序列的轻链恒定区(LC)。

在本发明的一个实施方案中，与PD-1结合的抗体是全长IgG1抗体，例如IgG1,κ。在本发明的一个实施方案中，结合剂是全长人IgG1抗体，例如IgG1,κ。

在一个实施方案中，与PD-1结合的抗体可以衍生化、与其他结合特异性连接或与其他结合特异性共表达。在另一个实施方案中，抗体可以衍生化、与另一个功能分子连接或与另一个功能分子共表达，该功能分子例如另一个肽或蛋白质(例如Fab’片段)。例如，可以与一个或多个其他分子实体(诸如另一个抗体)功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)(例如，以产生双特异性或多特异性抗体)。

与PD-1结合的抗体可以是人抗体。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。与PD-1结合的人抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。

本公开包含双特异性和多特异性分子的用途，该双特异性和多特异性分子包含至少一个针对PD-1的第一结合特异性和针对第二靶表位(或针对进一步的靶表位)的第二结合特异性(或进一步的结合特异性)。

在一个实施方案中，与PD-1结合的多特异性抗体的第一抗原结合区包含如本文所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。

在涉及与PD-1结合的多特异性抗体的用途的一个实施方案中，抗体包含衍生自全长抗体的第一和第二结合臂，诸如衍生自如上所述的全长IgG1,λ(lambda)或IgG1,κ(κ)抗体。在一个实施方案中，第一和第二结合臂衍生自单克隆抗体。例如或在优选的实施方案中，第一和/或第二结合臂衍生自IgG1,κ同种型或IgG1,λ同种型，优选包含人IgG1/κ或人IgG1/λ恒定部分。

根据本发明使用的多特异性或双特异性抗体的所述与PD-1结合的第一抗原结合区可以包含与PD-L1和/或PD-L2竞争PD-1结合的抗体的重链和轻链可变区。在涉及多特异性或双特异性抗体的用途的一个实施方案中，与PD-1结合的第一抗原结合区包含如本文所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。

如本文所用，术语“效应细胞”是指参与免疫应答的效应期的免疫细胞，这与免疫应答的认知期和活化期形成对比。示例性免疫细胞包括髓系或淋巴系来源的细胞，例如淋巴细胞(例如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL)、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。

“靶细胞”应当意指受试者(例如，人或动物)中可以被抗体靶向的任何不期望的细胞。在优选的实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。

待治疗的受试者和肿瘤或癌症

根据本公开待治疗的受试者优选是人受试者。

在一个优选的实施方案中，待治疗的肿瘤或癌症是实体瘤或实体癌。肿瘤或癌症可以是转移瘤或转移癌。

优选地，肿瘤或癌症可以选自由以下组成的组：黑色素瘤、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、结直肠癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、尿路上皮癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、胸腺瘤和胸腺癌、脑癌、胶质瘤、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、其他皮肤癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、子宫内膜癌、前列腺癌、阴茎癌、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、梅克尔细胞癌和间皮瘤。更优选地，肿瘤或癌症选自由黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和头颈癌组成的组。

在特定的实施方案中，肿瘤或癌症选自由以下组成的组：肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、尿路上皮癌(膀胱癌、输尿管癌、尿道癌或肾盂癌)、子宫内膜癌(EC)、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌(TNBC))、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)(例如口腔癌、咽癌或喉癌)和宫颈癌。

优选地，肿瘤是PD-L1阳性肿瘤。在某些实施方案中，优选的是PD-L1在≥1％的癌细胞或肿瘤细胞中表达。PD-L1的表达可以使用本领域技术人员已知的技术来确定，并且可以例如通过免疫组织化学(IHC)来评估。

肿瘤或癌症可以特别地是肺癌。肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)，例如鳞状或非鳞状NSCLC。肺癌是第二常见的恶性肿瘤，其中估计的年龄标准化发病率为每10万人22.4例，并且是男性和女性两者癌症死亡的主要原因(Kantar，2021)。据估计，2020年全球大约有2,206,771例肺癌新病例和1,796,144例死亡病例(GLOBOCAN，2020)。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有病例的85％至90％，其中跨越所有疾病阶段的5年生存率约为18％，并且转移性疾病仅为3.5％(Jemal等人，2011)(Kantar,2021；SEER,2018)。在1L背景中，治疗通常包含基于铂的化学疗法联合免疫疗法或靶向疗法，这具体取决于分子和生物标志物分析以及肿瘤的组织学(NCCN，2021d)。最近，PD-1和程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂的出现已经改善了没有驱动突变的患者(大约62％的非鳞状细胞群体和77％的鳞状细胞群体(Kantar，2021年))的结果。对于其肿瘤不携带某些致癌突变或不表达针对检查点抑制剂(CPI)选择的生物标志物的患者，需要更多的治疗替代选择。具有增强响应的互补的方法的新颖组合可以进一步解决该群体未得到满足的需求。对于2L背景中的患者，SOC仅限于基于化学疗法、CPI单一疗法或多西他赛(用或不用雷莫芦单抗(ramucirumab)，这取决于所接受的既往疗法)。对于三线(3L)背景的患者，化学疗法、单一疗法是标准。需要新的疗法来限制毒性并潜在地增强该群体中的疗效(NCCN，2021d)。

在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是肺癌，该肿瘤或癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)，诸如鳞状或非鳞状NSCLC。肿瘤或癌症可以特别地是转移性癌症，诸如转移性NSCLC。

在一个实施方案中，其中所述肿瘤或癌症是肺癌，特别是NSCLC，肿瘤或癌症不具有表皮生长因子(EGFR)敏化性突变和/或间变性淋巴瘤(ALK)易位/ROS1重排。EGFR敏化性突变是适合用已批准的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)进行治疗的那些突变。

在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是肺癌，特别是NSCLC，肿瘤或癌症包含癌细胞并且PD-L1在≥1％的癌细胞中表达。此类表达可以通过技术人员已知的任何手段和方法诸如通过免疫组织化学(IHC)来确定，诸如通过局部SOC测试(优选FDA批准的测试)或在中心实验室确定。

在一个实施方案中，受试者没有接受过转移性疾病的既往全身治疗，即，受试者在接受根据本发明的治疗之前没有接受过转移性疾病的任何全身治疗。根据该实施方案，肿瘤或癌症优选是肺癌，诸如NSCLC。

在一个实施方案中，受试者没有接受过用检查点抑制剂/免疫检查点(ICP)抑制剂的既往治疗，即，在根据第一方面的治疗之前，受试者没有接受过用ICP抑制剂的治疗。在进一步的实施方案中，受试者没有接受过用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的既往治疗。在这些实施方案中，肿瘤或癌症优选是肺癌，诸如NSCLC。

在进一步的实施方案中，受试者没有接受过用4-1BB(CD137)靶向剂、用抗肿瘤疫苗或用自体细胞免疫疗法的既往治疗。在一个实施方案中，受试者未接受过用抗4-1BB(CD137)抗体的既往治疗。在这些实施方案中，肿瘤或癌症优选是肺癌，诸如NSCLC。

在其他实施方案中，肿瘤或癌症在治疗诸如用检查点抑制剂的全身治疗后已经复发和/或是难治的。受试者可以已经接受了至少一次既往全身疗法，诸如包含PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的全身疗法。特别地，癌症或肿瘤可以已经复发和/或变得难治，或者所述受试者在用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的治疗后可以已经进展，该PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂作为单一疗法或作为组合疗法的一部分进行施用。

在特定的实施方案中，向已经接受过既往治疗的受试者提供根据本发明的治疗；例如，如上文所定义，其中末次既往治疗是用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体，该PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂作为单一疗法或作为组合疗法的一部分进行施用。末次既往治疗可以使用上文定义的PD1抑制剂或PD-L1抑制剂。

当距受试者用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的末次治疗进展的时间为8个月或更短，诸如7个月或更短、6个月或更短、5个月或更短、4个月或更短、3个月或更短、2个月或更短、1个月或更短、3周或更短或诸如2周或更短时，将根据本发明的疗法提供给该受试者。

通过类推，当距作为末次既往治疗的一部分的PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体末次给药的时间为8个月或更短，诸如7个月或更短、6个月或更短、5个月或更短、4个月或更短、3个月或更短、2个月或更短、1个月或更短、3周或更短或诸如2周或更短时，提供根据本发明的疗法可以是优选的。

在进一步的实施方案中，癌症或肿瘤已经复发和/或是难治的，或者受试者在以下期间或之后已经进展：

i)用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体治疗后的铂类双药化学疗法，或

ii)铂类双联化学疗法后的用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的治疗。

此外，在这些实施方案中，肿瘤或癌症优选是肺癌，诸如NSCLC。

特别地，接受根据本发明的治疗的受试者可以是没有接受过用紫杉烷化疗剂(例如，多西他赛或紫杉醇)的既往治疗；诸用紫杉烷化疗剂例如多西他赛的NSCLC的既往治疗的受试者。

治疗方案

结合剂和PD-1抑制剂可以通过任何合适的方式施用，诸如静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌内、节内或肿瘤内。

在第一方面的一个实施方案中，结合剂通过全身施用施用至受试者。优选地，结合剂通过静脉内注射或输注施用至受试者。在一个实施方案中，在至少一个治疗周期中施用结合剂。

在一个实施方案中，PD-1抑制剂特别是通过全身施用施用至受试者。优选地，通过静脉内注射或输注施用至受试者。在一个实施方案中，在至少一个治疗周期中施用PD-1抑制剂。

在一个实施方案中，结合剂和PD-1抑制剂特别是通过全身施用施用至受试者。优选地，结合剂和PD-1抑制剂通过静脉内注射或输注施用至受试者。在一个实施方案中，在至少一个治疗周期中施用结合剂和PD-1抑制剂。

在一个实施方案中，每个治疗周期为约两周(14天)、三周(21天)或四周(28天)、五周(35天)或6周(48天)。在优选的实施方案中，每个治疗周期是三周(21天)。在其他优选的实施方案中，每个治疗周期为6周(48天)。

在特定的实施方案中，每两周(1Q2W)、每三周(1Q3W)、每四周(1Q4W)、每五周(1Q5W)，优选每三周(1Q3W)施用或输注一剂结合剂和一剂PD-1抑制剂。在其他实施方案中，每六周(1Q6W)施用一剂结合剂和一剂PD-1抑制剂。结合剂的量和PD-1抑制剂的量优选如上文所定义。

在一些实施方案中，在每个治疗周期的第1天施用或输注一个剂量或每个剂量。例如，可以在每个治疗周期的第1天施用一剂结合剂和一剂PD-1抑制剂。

在一些实施方案中，每三周(1Q3W)施用100mg剂量的结合剂和200mg剂量的PD-1抑制剂。

在其他实施方案中，每六周(1Q6W)施用100mg剂量的结合剂和400mg剂量的PD-1抑制剂。

在特定的实施方案中，每三周(1Q3W)，诸如在每个三周治疗周期的第一天施用100mg剂量的结合剂(其为acasunlimab或其生物类似物)和200mg剂量的PD-1抑制剂(其为纳武单抗或其生物类似物)。

在特定的实施方案中，肿瘤或癌症是NSCLC；并且每三周(1Q3W)，诸如在每个三周治疗周期的第一天施用100mg剂量的结合剂(其为acasunlimab或其生物类似物)和200mg剂量的PD-1抑制剂(其为纳武单抗或其生物类似物)。

在其他实施方案中，每六周(1Q6W)，诸如在每个六周治疗周期的第一天施用100mg剂量的结合剂(其为acasunlimab或其生物类似物)和400mg剂量的PD-1抑制剂(其为纳武单抗或其生物类似物)。

在又一个其他实施方案中，肿瘤或癌症是NSCLC；并且其中每六周(1Q6W)，诸如在每个六周的治疗周期的第一天施用100mg剂量的为acasunlimab或其生物类似物的所述结合剂和400mg剂量的为纳武单抗的PD-1抑制剂。

可以首先施用PD-1抑制剂，然后施用结合剂。或者，首先施用结合剂，然后施用PD-1抑制剂。

每个剂量可以在最少30分钟内，例如在最少60分钟、最少90分钟、最少120分钟或最少240分钟内施用或输注。

特别地，结合剂可以通过使用静脉内(IV)输注在30分钟内，诸如在最少40分钟、最少50分钟内或诸如在最少60分钟内施用。

特别地，PD-1抑制剂可以在30分钟内，例如最少40分钟、最少50分钟内或诸如最少60分钟内作为静脉内输注施用。

可以同时施用结合剂和PD-1抑制剂。在替代性的优选的实施方案中，分开施用结合剂和PD-1抑制剂。

结合剂和PD-1抑制剂可以以任何合适的形式(例如，裸露的形式)施用。然而，优选的是结合剂和PD-1抑制剂以本文所述的任何合适的药物组合物的形式施用。在一个实施方案中，至少结合剂和PD-1抑制剂以分开的药物组合物(即，一个用于结合剂的药物组合物和一个用于PD-1抑制剂的药物组合物)，优选结合剂和PD-1抑制剂以分开的药物组合物(即，一个用于结合剂的药物组合物和一个用于PD-1抑制剂的药物组合物)的形式施用。

组合物或药物组合物可以用载剂、赋形剂和/或稀释剂以及任何其他适合于药物组合物的组分(包括已知的佐剂)根据常规技术诸如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第19版,Gennaro,编,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995中公开的技术来配制。药学上可接受的载剂或稀释剂以及任何已知的佐剂和赋形剂应当适合于结合剂和/或PD-1抑制剂以及所选择的施用模式。药物组合物的载剂和其他组分的适合性基于对所选化合物或药物组合物的期望的生物学特性没有显著负面影响来确定的(例如，小于抗原结合时的显著影响[10％或更少的相对抑制、5％或更少的相对抑制等)。

组合物，特别是结合剂的药物组合物和PD-1抑制剂的药物组合物可以包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、去垢剂(例如，非离子去垢剂，诸如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如，糖或不含蛋白质的氨基酸)、防腐剂、增溶剂和/或适合于包含在药物组合物中的其他材料。

用于治疗性用途的药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂是制药领域众所周知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.RGennaro edit.1985)中。

可以根据预期的施用途径和标准制药实践来选择药物载剂、赋形剂或稀释剂。

药学上可接受的载剂包括与活性化合物、特别是结合剂和PD-1抑制剂生理相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。

可以用于(药物)组合物中的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、葡萄糖、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄芪胶和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)和/或各种缓冲剂。其他载剂在制药领域中是众所周知的。

药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在(药物)组合物中的使用。

如本文所用，术语“赋形剂”是指可以存在于本公开的(药物)组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂或着色剂。

术语“稀释剂”涉及稀释性(diluting)剂和/或稀薄(thinning)剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一个或多个。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水

(药物)组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠(sodium metabisulfite)、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

(药物)组合物还可在组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化钠。

(药物)组合物还可以含有一种或多种适合于所选择的施用途径的佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可以提高组合物的保质期或有效性。如本文所用，组合物可以与将保护化合物免于快速释放的载剂，诸如控释配制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊化递送系统一起制备。此类载剂可以包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的、生物相容性聚合物(诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸，单独或与蜡)，或本领域众所周知的其他材料。制备此类配制剂的方法通常是本领域技术人员已知的，参见例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson,编,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

“药学上可接受的盐”包括例如酸加成盐，其可以例如通过使用药学上可接受的酸形成，诸如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。此外，合适的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐(例如钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)；铵(NH4⁺)；以及与合适的有机配体形成的盐(例如，使用平衡阴离子，例如卤化、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的季铵和胺阳离子)。药学上可接受的盐的说明性实例包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、精氨酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、依地酸钙、樟脑酸盐(camphorate)、樟脑磺酸盐(camphorsulfonate)、右旋樟脑磺酸(camsylate)、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、依地酸盐(edetate)、乙二磺酸盐(edisylate)、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、乙磺酸酯(ethanesulfonate)、甲酸盐、富马酸盐、半乳酸盐(galactate)、半乳糖醛酸盐(galacturonate)、葡萄糖酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、glycolylarsanilate、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酸盐(hexylresorcinate)、海巴胺、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、羟基萘甲酸盐(hydroxynaphthoate)、碘化物、异丁酸盐、异硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、硫酸月桂酯、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲磺酸酯、甲基硫酸盐、粘酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)(思波酸盐(embonate))、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、邻苯二甲酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、辛二酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、triethiodide、十一酸盐、戊酸盐等(参见例如S.M.Berge等人,"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.,66,pp.1-19(1977))。不是药学上可接受的盐可以用于制备药学上可接受的盐并且包括在本公开中。

在一个实施方案中，可以配制本文所用的结合剂和PD-1抑制剂以确保体内适当的分布。用于肠胃外施用的药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在组合物中的使用。其它活性或治疗性化合物也可以掺入到组合物中。

用于注射的药物组合物通常必须是无菌的并且在制备和储存条件下稳定。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载剂可以是水性或非水性溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)，和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。适当的流动性可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小并且通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，将优选的是，在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来引起可注射组合物的延长的吸收。无菌注射溶液可以通过以下来制备：将所需量的活性化合物与成分(例如，如上文所枚举)之一或组合掺入适当的溶剂中，根据需要，然后进行灭菌微滤。通常，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有基本分散介质和所需的其他成分，例如来自上文枚举的那些。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其此前经无菌过滤的溶液的任何额外期望成分的粉末。

无菌注射溶液可以通过以下来制备：将所需量的活性化合物与上文所枚举的成分之一或组合掺入适当的溶剂中，根据需要，然后进行灭菌微滤。通常，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有基本分散介质和所需的其他来自上文枚举的那些成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其此前经无菌过滤的溶液的任何额外期望成分的粉末。

在某些实施方案中，将根据本发明使用的结合剂配制在包含组氨酸、蔗糖和聚山梨酯80并且具有约5至约6(诸如5至6)的pH的组合物或配制剂中。特别地，根据本发明使用的结合剂可以是在包含约20mM组氨酸、约250mM蔗糖、约0.02％聚山梨酯80并且具有约5.5的pH的组合物或制剂中，诸如包含20mM组氨酸、250mM蔗糖、0.02％聚山梨醇酯80并且具有5.5的pH的组合物或制剂中。在特定的实施方案中，配制剂可以包含约10至约30mg结合剂/mL，诸如10-30mg结合剂/mL，特别是约20mg结合剂/mL，诸如20mg结合剂/mL。

根据本发明使用的结合剂可以在如上文所定义的组合物中提供，并且然后可以在施用之前于0.9％ NaCl(盐水)中稀释。

在第二方面，本公开提供了试剂盒，其包含(i)包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区的结合剂，以及(ii)PD-1抑制剂

其中当

a)与CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含分别如SEQ ID NO:2、3和4中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，该VH包含分别如SEQ ID NO:6、7和8中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；并且

b)与PD-L1结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含分别如SEQ ID NO:12、13和14中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ IDNO:16、17和18中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，

则该PD-1抑制剂不是如下抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含分别如SEQ ID NO:59、60和61中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，该VH包含分别如SEQ ID NO:62、63和64中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

本文公开的关于第一方面(特别是关于结合剂和PD-1抑制剂)的实施方案也应用于第二方面的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括至少两个容器，其中其一个容器含有结合剂(本身或以(药物)组合物的形式)，第二容器含有PD-1抑制剂(本身或以(药物)组合物的形式)。

在第三方面，本公开提供了第二方面的试剂盒，其用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法中。本文公开的关于第一方面(特别是关于结合剂、PD-1抑制剂、治疗方案、特定肿瘤/癌症和受试者)和/或第二方面的实施方案也应用于第三方面使用的试剂盒。

在第四方面，本公开提供了用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法，所述方法包括在施用PD-1抑制剂之前、同时或之后将结合剂施用至所述受试者，其中所述结合剂包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区，并且

其中当

b)与PD-L1结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含分别如SEQ ID NO:12、13和14中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，该VH包含分别如SEQ ID NO:16、17和18中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，

则该PD-1抑制剂不是如下抗体或其抗原结合片段。所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含分别如SEQ ID NO:59、60和61中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，该VH包含分别如SEQ ID NO:62、63和64中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

本文公开的关于第一方面(特别是关于结合剂、PD-1抑制剂、治疗方案、特定肿瘤/癌症和受试者)的实施方案也适用于第四方面的方法。

在进一步的方面，本公开提供了PD-1抑制剂，其用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法中，该方法包括在施用结合剂之前、同时或之后将所述PD-1抑制剂施用至所述受试者，其中该结合剂包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区，并且

其中当

本文公开的关于第一方面(特别是关于结合剂、PD-1抑制剂、治疗方案、特定肿瘤/癌症和受试者)的实施方案也适用于进一步的方面使用的PD-1抑制剂。

本发明的进一步的方面涉及包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区的结合剂，其用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症，其中受试者所接受的末次既往治疗是用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。

距受试者用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂(诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)的末次治疗进展的时间，优选为8个月或更短，诸如7个月或更短、6个月或更短、5个月或更短、4个月或更短、3个月或更短、2个月或更短、1个月或更短、3周或更短或诸如2周或更短。

距作为末次既往治疗的一部分的PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体末次给药的时间，优选为8个月或更短，诸如7个月或更短、6个月或更短、5个月或更短、4个月或更短、3个月或更短、2个月或更短、1个月或更短、3周或更短或诸如2周或更短。

将理解，结合剂可以具有如上文关于本发明的第一方面所定义的任何特征。同样，结合剂所施用至的肿瘤或癌症和/或受试者可以如上文所定义。结合剂的施用的途径和频率以及施用的量可以如上文关于本发明的第一方面所定义。

本发明的又一方面提供了用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用结合剂的步骤，该结合剂包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区，其中受试者所接受的末次既往治疗是用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。

对本文引用的文件和研究的引用并不旨在作为前述任何是相关的现有技术的承认。关于这些文件内容的所有叙述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。

呈现该描述(包括以下实例)以使本领域普通技术人员能够进行和使用各种实施方案。对特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文所述的实例的各种修改对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的，并且在不脱离各个实施方案的精神和范围的情况下，本文定义的一般原理可以应用于其他实例和应用。因此，各个实施方案并不旨在限于本文所述和显示的示例，而是应符合与权利要求一致的范围。

本公开的项

1.结合剂，其用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法中，所述方法包括在施用PD-1抑制剂之前、同时或之后将所述结合剂施用至所述受试者，其中所述结合剂包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区；并且

其中当

a)所述与CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:2、3和4中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQID NO:6、7和8中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；并且

b)所述与PD-L1结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:12、13和14中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ ID NO:16、17和18中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，

则所述PD-1抑制剂不是如下抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:59、60和61中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ ID NO:62、63和64中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

2.项1使用的结合剂，其中PD-L1是人PD-L1，特别是包含SEQ ID NO:40中所示的序列的人PD-L1，和/或CD137是人CD137，特别是包含SEQ ID NO:38中所示的序列的人CD137。

3.项1至3中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂是PD-1抗体。

4.项1至4中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂是PD-1阻断性抗体。

5.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物。

6.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂是纳武单抗或其生物类似物。

7.前述项中任一项使用的结合剂，其中

a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ IDNO:1或9的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL包含SEQ ID NO:5或10的CDR1、CDR2和CDR3序列；

并且

b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQID NO:11的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL包含SEQ ID NO:15的CDR1、CDR2和CDR3序列。

8.前述项中任一项使用的结合剂，其中

a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:2、3和4中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ ID NO:6、7和8中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；

并且

b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:12、13和14中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ ID NO:16、17和18中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

9.前述项中任一项使用的结合剂，其中

所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区，所述VH包含与SEQ IDNO:1或9具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:5或10具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

10.前述项中任一项使用的结合剂，其中

所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区，所述VH包含与SEQ IDNO:11具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述VL包含与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

11.前述项中任一项使用的结合剂，其中

所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:1或9中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:5或10中所示的氨基酸序列。

12.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。

13.前述项中任一项使用的结合剂，其中

a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列；

并且

b)所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ IDNO:11中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。

14.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是多特异性抗体，诸如双特异性抗体。

15.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂为全长抗体或抗体片段的格式。

16.项6-12中任一项使用的结合剂，其中每个可变区包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和四个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)。

17.项13使用的结合剂，其中所述互补决定区和所述框架区从氨基末端至羧基末端按如下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

18.项7-17中任一项使用的结合剂，其包含

i)多肽，其包含所述第一重链可变区(VH)和第一重链恒定区(CH)、由其组成或基本上由其组成，以及

ii)多肽，其包含所述第二重链可变区(VH)和第二重链恒定区(CH)、由其组成或基本上由其组成。

19.项7-18中任一项使用的结合剂，其包含

20.项7-19中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是包含第一结合臂和第二结合臂的抗体，其中

所述第一结合臂包含

ii)多肽，其包含所述第一轻链可变区(VL)和第一轻链恒定区(CL)；

并且所述第二结合臂包含

iii)多肽，其包含所述第二重链可变区(VH)和第二重链恒定区(CH)，以及

iv)多肽，其包含所述第二轻链可变区(VL)和第二轻链恒定区(CL)。

21.前述项中任一项使用的结合剂，其包含

i)第一重链和第一轻链，其包含所述能够与CD137结合的抗原结合区，和

ii)第二重链和第二轻链，其包含所述能够结合PD-L1的抗原结合区。

22.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂包含

i)第一重链和第一轻链，其包含所述能够与CD137结合的抗原结合区，所述第一重链包含第一重链恒定区并且所述第一轻链包含第一轻链恒定区；和

i)第二重链和第二轻链，其包含所述能够结合PD-L1的抗原结合区，所述第二重链包含第二重链恒定区并且所述第二轻链包含第二轻链恒定区。

23.项18-22中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)的每个包含恒定重链1(CH1)区、铰链区、恒定重链2(CH2)区和恒定重链3(CH3)区中的一个或多个，优选至少包含铰链区、CH2区和CH3区。

24.项18-23中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)的每个包含CH3区，并且其中所述两个CH3区包含不对称突变。

25.项18-23中任一项使用的结合剂，其中在所述第一重链恒定区(CH)中，对应于选自由根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409组成的组的位置的位置中的至少一个氨基酸已经进行取代，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，对应于选自由根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409组成的组的位置的位置中的至少一个氨基酸已经进行取代，并且其中所述第一重链和所述第二重链不在相同位置进行取代。

26.项25使用的结合剂，其中(i)在所述第一重链恒定区(CH)中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置中的氨基酸是R，或(ii)在所述第一重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置中的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置中的氨基酸是L。

27.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂与另一抗体相比以较小的程度诱导Fc介导的效应器功能，所述另一抗体包含相同的第一抗原结合区和第二抗原结合区以及两个包含人IgG1铰链、CH2区和CH3区的重链恒定区(CH)。

28.项27使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区被修饰，使得所述抗体与除了包含未经修饰的第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)以外相同的抗体相比以较小的程度诱导Fc介导的效应器功能。

29.项28使用的结合剂，其中所述未经修饰的第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)的每个包含SEQ ID NO:19或25中所示的氨基酸序列。

30.项28或29使用的结合剂，其中所述Fc介导的效应器功能通过与Fcγ受体的结合、与C1q的结合或Fe介导的Fcγ受体的交联的诱导来测量。

31.项30使用的结合剂，其中所述Fc介导的效应器功能通过与C1q的结合来测量。

32.项27-31中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区和第二重链恒定区已经被修饰，使得C1q与所述抗体的结合与野生型抗体相比减少，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合优选通过ELISA测定。

33.项18-32中任一项使用的结合剂，其中在所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区的至少一个中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置中的一个或多个氨基酸，分别不是L、L、D、N和P。

34.项33使用的结合剂，其中在所述第一重链和第二重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别是F和E。

35.项33或34使用的结合剂，其中在所述第一重链恒定区和第二重链恒定区中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置分别是F、E和A。

36.项33-35中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区和第二重链恒定区两者的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别是F和E，并且其中(i)所述第一重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L，并且所述第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，或(ii)所述第一重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，并且所述第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L。

37.项33-36中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区和第二重链恒定区两者的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234，L235和D265的位置分别是F、E和A，并且其中(i)所述第一重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L，并且所述第二重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，或(ii)所述第一重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，并且所述第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L。

38.项18-37中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链和/或第二重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:19或25中所示的序列[IgG1-FC]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多10个取代，诸如至多9个取代、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个取代或至多1个取代的序列。

39.项18-38中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链或第二重链，诸如所述第二重链的恒定区，包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:20或26中所示的序列[IgG1-F405L]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多9个取代，诸如至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个取代或至多1个取代的序列。

40.项18-38中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链或第二重链，诸如所述第一重链的恒定区，包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:21或27中所示的序列[IgG1-K409R]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多10个取代，诸如至多9个取代、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个取代、至多3个、至多2个取代或至多1个取代的序列。

41.项18-37中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链和/或第二重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:22或28中所示的序列[IgG1-Fc_FEA]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多7个取代，诸如至多6个取代、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个取代或至多1个取代的序列。

42.项18-41中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链和/或第二重链，诸如所述第二重链的恒定区，包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:24或30中所示的序列[IgG1-Fc_FEAL]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多6个取代，诸如至多5个取代、至多4个取代、至多3个、至多2个取代或至多1个取代的序列。

43.项18-42中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链和/或第二重链，诸如所述第一重链的恒定区，包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)SEQ ID NO:23或29中所示的序列[IgG1-Fc_FEAR]；

c)与a)或b)中定义的氨基酸序列相比具有至多6个取代，诸如至多5个取代、至多4个、至多3个、至多2个取代或至多1个取代的序列。

44.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂包含kappa(κ)轻链恒定区。

45.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂包含lambda(λ)轻链恒定区。

46.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区或lambda(λ)轻链恒定区。

47.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区或kappa(κ)轻链恒定区。

48.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区并且所述第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区，或所述第一轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区并且所述第二轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区。

49.项44-48中任一项使用的结合剂，其中所述kappa(κ)轻链包含选自下组的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO:35中所示的序列，

50.项45-49中任一项使用的结合剂，其中所述lambda(λ)轻链包含选自下组的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO:36中所示的序列，

51.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的同种型的。

52.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是全长IgG1抗体。

53.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是IgG1m(f)同种异型的抗体。

54.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂包含

i)第一重链和第一轻链，其包含所述能够与CD137结合的抗原结合区，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:31中所示的序列，并且所述第一轻链包含SEQ ID NO:32中所示的序列；

ii)第二重链和第二轻链，其包含所述能够与PD-L1结合的抗原结合区，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:33中所示的序列，并且所述第二轻链包含SEQ ID NO:34中所示的序列。

55.根据前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是acasunlimab或其生物类似物。

56.根据前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂处于包含组氨酸、蔗糖和聚山梨酯-80并且具有5至6的pH的组合物或制剂中。

57.根据前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂处于包含约20mM组氨酸、约250mM蔗糖、约0.02％聚山梨酯-80并且具有约5.5的pH的组合物或制剂中。

58.根据前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂处于包含10-30mg结合剂/mL，诸如20mg结合剂/mL的组合物或配制剂中。

59.根据前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂处于如项56至58中任一项所定义的组合物中并且在施用之前在0.9％ NaCl(盐水)中稀释。

60.根据前述项中任一项使用的结合剂，所述PD-1抑制剂是与PD-1结合的抗体，其中所述与PD-1结合的抗体包括包含分别如SEQ ID NO:104、101和100中所示序列的VH区CDR1、CDR2和CDR3，以及包含分别如SEQ ID NO:107、QAS和SEQ ID NO:105所示序列的VL区CDR1、CDR2和CDR3。

61.根据项60使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含与如SEQ ID NO:111中所示的VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。

62.根据项60或61使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含如SEQ ID NO:111中所示的序列。

63.根据项60-62中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO:112中所示的VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。

64.根据项63使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含如SEQ ID NO:112中所示的序列。

65.根据项60-64中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含或具有如SEQ ID NO:111中所示的序列，并且所述VL包含或具有如SEQ ID NO:112中所示的序列。

66.根据项60-65中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234的位置处的芳香族氨基酸或非极性氨基酸，和对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置236的位置处的不同于甘氨酸的氨基酸。

67.根据项66使用的结合剂，其中对应于位置236的位置处的氨基酸是碱性氨基酸。

68.根据项67使用的结合剂，其中所述碱性氨基酸选自由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成的组。

69.根据项67或68使用的结合剂，其中所述碱性氨基酸是精氨酸(G236R)。

70.根据项66-69中任一项使用的结合剂，其中对应于位置234的位置处的氨基酸是芳香族氨基酸。

71.根据项70使用的结合剂，其中所述芳香族氨基酸选自由苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸组成的组。

72.根据项66-69中任一项使用的结合剂，其中对应于位置234的位置处的氨基酸是非极性氨基酸。

73.根据项72使用的结合剂，其中所述非极性氨基酸选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组。

74.根据项72或73使用的结合剂，其中所述非极性氨基酸选自由异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组。

75.根据项66-74中任一项使用的结合剂，其中对应于位置234的氨基酸是苯丙氨酸(L234F)。

76.根据项66-75中任一项使用的结合剂，其中在所述与PD-1结合的抗体的所述重链恒定区中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置235的位置处的氨基酸是酸性氨基酸。

77.根据项76使用的结合剂，其中所述酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

78.根据项66-77中任一项使用的结合剂，其中在所述与PD-1结合的抗体的所述重链恒定区中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置235的位置处的氨基酸是谷氨酸(L235E)。

79.根据项66-78中任一项使用的结合剂，其中在所述与PD-1结合的抗体的所述重链恒定区中，对应于位置234、235和236的位置处的氨基酸在位置234处是非极性或芳香族氨基酸、位置235处是酸性氨基酸并且位置236处是碱性氨基酸。

80.根据项66-79中任一项使用的结合剂，其中在所述与PD-1结合的抗体的所述重链恒定区中，对应于位置234的氨基酸是苯丙氨酸，对应于位置235的氨基酸是谷氨酸，并且对应于位置236的氨基酸是精氨酸(L234F/L235E/G236R)。

81.根据项60-80中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体的重链恒定区包含与如SEQ ID NO:93中所示的重链恒定区序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。

82.根据项60-81中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体的重链恒定区包含如SEQ ID NO:93中所示的序列。

83.根据项60-82中任一项使用的结合剂，其中与PD-1结合的抗体的重链恒定区的同种型是IgG1。

84.根据项60-83中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或此类抗体的片段。

85.根据项60-84中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体具有降低或消减的Fc介导的效应器功能。

86.根据项60-85中任一项使用的结合剂，其中补体蛋白C1q与所述与PD-1结合的抗体的恒定区的结合与野生型抗体相比减少，优选减少了至少70％，至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

87.根据项60-86中任一项使用的结合剂，其中一种或多种IgG Fc-γ受体与所述与PD-1结合的抗体的结合与野生型抗体相比减少，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

88.根据项87使用的结合剂，其中所述一种或多种IgG Fc-γ受体选自Fc-γRI、Fc-γRII和Fc-γRIII中的至少一种。

89.根据项87或88使用的结合剂，其中所述IgG Fc-γ受体是Fc-γRI。

90.根据项60-89中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体不能诱导Fc-γRI介导的效应器功能，或者其中所述诱导的Fc-γRI介导的效应器功能与野生型抗体相比降低，优选降低了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

91.根据项60-90中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体不能诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、细胞凋亡、同型黏附和/或吞噬作用中的至少一种，或者，其中补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、细胞凋亡、同型黏附和/或吞噬作用中的至少一种以减少的程度诱导，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

92.根据项60-91中任一项使用的结合剂，其中与野生型抗体相比，新生儿Fc受体(FcRn)与所述与PD-1结合的抗体的结合不受影响。

93.根据项60-92中任一项使用的结合剂，其中PD-1是人PD-1。

94.根据项93使用的结合剂，其中所述PD-1具有或包含如SEQ ID NO:113或SEQ IDNO:114中所示的氨基酸序列，或PD-1的氨基酸序列与SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:114中所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性，或是其免疫原性片段。

95.根据项60-94中任一项使用的结合剂，所述与PD-1结合的抗体与存在于活细胞表面上的PD-1的天然表位结合。

96.根据项60-95中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体是多特异性抗体，其包含与PD-1结合的第一抗原结合区和与另一种抗原结合的至少一个进一步的抗原结合区。

97.根据项96使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体是双特异性抗体，其包含与PD-1结合的第一抗原结合区和与另一种抗原结合的第二抗原结合区。

98.根据项96或97使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的第一抗原结合区包含如权利要求61至65任一项中所示的所述重链可变区(VH)和/或所述轻链可变区(VL)。

99.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述受试者是人受试者。

100.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是实体瘤或实体癌。

101.根据前述项中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤是PD-L1阳性肿瘤。

102.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症选自下组：黑色素瘤、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、结直肠癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、尿路上皮癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、胸腺瘤和胸腺癌、脑癌、胶质瘤、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、其他皮肤癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、子宫内膜癌、前列腺癌、阴茎癌、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、梅克尔细胞癌和间皮瘤。

103.根据前述项中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症选自下组：肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、尿路上皮癌(膀胱癌、输尿管癌、尿道癌或肾盂癌)、子宫内膜癌(EC)、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌(TNBC))和头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)(例如口腔癌、咽癌或喉癌)。

104.项102或103使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)，诸如鳞状或非鳞状NSCLC。

105.项100至104中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是转移性的，诸如转移性NSCLC。

106.项104或105使用的结合剂，其中所述肺癌，特别是NSCLC，不具有表皮生长因子(EGFR)敏化性突变和/或间变性淋巴瘤(ALK)易位/ROS1重排。

107.项104至106中任一项使用的结合剂，其中所述肺癌，特别是NSCLC，包含癌细胞并且PD-L1在≥1％的癌细胞或肿瘤细胞中表达，例如，如通过免疫组织化学(IHC)所评估的。

108.前述项使用的结合剂，其中所述受试者未接受过转移性疾病的既往全身治疗。

109.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述受试者未接受过用检查点抑制剂的既往治疗；例如，PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。

110.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述受试者未接受过用4-1BB(CD137)靶向剂诸如抗4-1BB(CD137)抗体、用抗肿瘤疫苗，或用自体细胞免疫疗法的既往治疗。

111.项1至107中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症在治疗后诸如用检查点抑制剂的全身治疗后已经复发和/或是难治的。

112.项1至107和111中任一项使用的结合剂，其中所述受试者已经接受了全身疗法的至少1条既往线，诸如包含PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的全身疗法。

113.项1至107、111和112中任一项使用的结合剂，其中所述癌症或肿瘤已经复发和/或是难治的，或者所述受试者在用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的治疗后已经进展，所述PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂作为单一疗法或作为组合疗法的一部分进行施用。

114.项1至107和111至113中任一项使用的结合剂，其中末次既往治疗是用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体，所述PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂作为单一疗法或作为组合疗法的一部分进行施用。

115.项1至107和111至114中任一项使用的结合剂，其中距用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的末次治疗进展的时间，为8个月或更短，诸如7个月或更短、6个月或更短、5个月或更短、4个月或更短、3个月或更短、2个月或更短、1个月或更短、3周或更短或诸如2周或更短。

116.项1至107和111至115中任一项使用的结合剂，其中距作为末次既往治疗的一部分的PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的末次给药的时间，为8个月或更短，诸如7个月或更短、6个月或更短、5个月或更短、4个月或更短、3个月或更短、2个月或更短、1个月或更短、3周或更短或诸如2周或更短。

117.项1至107和111至116中任一项使用的结合剂，其中所述癌症或肿瘤已经复发和/或是难治的，或者所述受试者在以下期间或之后已经进展：

i)用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体治疗后的铂类双药化学疗法，或

ii)铂类双联化学疗法后用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的治疗。

118.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述受试者未接受过用紫杉烷化疗剂例如多西他赛的既往治疗，诸如用紫杉烷化疗剂例如多西他赛对NSCLC的既往治疗。

119.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂和所述PD-1抑制剂在至少一个治疗周期中施用，每个治疗周期为两周(14天)、三周(21天)、四周(28天)、5周(35天)或六周(42天)。

120.前述项中任一项使用的结合剂，其中每两周(1Q2W)、每三周(1Q3W)、每四周(1Q4W)、每五周(1Q5W)或每六周(1Q6W)施用一剂所述结合剂和一剂所述PD-1抑制剂。

121.前述项中任一项使用的结合剂，其中每六周(1Q6W)施用一剂所述结合剂和一剂所述PD-1抑制剂。

122.前述项中任一项使用的结合剂，其中在每个治疗周期的第1天施用一剂所述结合剂和一剂所述PD-1抑制剂。

123.前述项中任一项使用的结合剂，其中在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的所述结合剂的量是100mg。

124.前述项中任一项使用的结合剂，其中在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的所述PD-1抑制剂的量是200mg。

125.前述项中任一项使用的结合剂，其中在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的所述PD-1抑制剂的量是400mg。

126.前述项中任一项使用的结合剂，其中每三周(1Q3W)施用100mg剂量的所述结合剂和200mg剂量的所述PD-1抑制剂。

127.前述项中任一项使用的结合剂，其中每六周(1Q6W)施用100mg剂量的所述结合剂和400mg剂量的所述PD-1抑制剂。

128.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是NSCLC；并且其中每三周(1Q3W)，诸如在每个三周治疗周期的第一天施用100mg剂量的所述结合剂和200mg剂量的PD-1抑制剂，所述结合剂为acasunlimab或其生物类似物，所述PD-1抑制剂为纳武单抗。

129.前述项中任一项使用的结合剂，其中首先施用所述PD-1抑制剂，然后施用所述结合剂。

130.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂通过使用静脉内(IV)输注在最少30分钟内施用，诸如在最少60分钟内施用。

131.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂通过使用静脉内(IV)输注在30分钟内施用。

132.前述项中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂作为静脉内输注在30分钟内施用。

133.试剂盒，其包含(i)包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区的结合剂，以及(ii)PD-1抑制剂；

其中当

134.项133所述的试剂盒，其中所述结合剂如项1、2和7-58中任一项所定义，和/或所述PD-1抑制剂如项3至6和59-97中任一项所定义。

135.根据项133或134所述的试剂盒，其中所述结合剂、所述PD-1抑制剂，和如果存在的话一种或多种额外治疗剂用于全身施用，特别是用于注射或输注，例如静脉内注射或输注。

136.根据项133-135中任一项所述的试剂盒，其用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法中。

137.根据项136使用的试剂盒，其中所述肿瘤或癌症和/或所述受试者和/或所述方法如权利要求1-132中任一项中所定义。

138.用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法，所述方法包括在施用PD-1抑制剂之前、同时或之后将结合剂施用至所述受试者，其中所述结合剂包含与CD137结合的第一结合区和与PD-L1结合的第二结合区，并且

其中

139.项138所述的方法，其中所述肿瘤或癌症和/或所述受试者和/或所述方法和/或所述结合剂和/或所述PD-1抑制剂如项1-132中任一项中所定义。

本文公开了本公开的进一步的方面。

实施例

实施例1：MC38小鼠结肠癌肿瘤生长

方法

MC38小鼠结肠癌细胞在补充有10％热灭活胎牛血清的Dulbecco’s ModifiedEagle Medium中在37℃、5％ CO₂下培养。从对数期生长的细胞培养物中收获MC38细胞并进行定量。

将MC38细胞(于100μL PBS的1×10⁶个肿瘤细胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右下胁腹(获得自Vital River Laboratories Research Models and Services；实验开始时年龄为6-8周)。

使用卡尺每周评价肿瘤生长三次。肿瘤体积(mm³)通过卡尺测量计算为([长度]×[宽度]²)/2，其中长度是最长的肿瘤尺寸，并且宽度是垂直于长度的最长肿瘤尺寸。

当肿瘤已经达到64mm³的中位体积时起始治疗。将小鼠随机化到具有相等的治疗前平均肿瘤体积(64mm³)的组(n＝10只/组)。在治疗日，小鼠用以下进行腹膜内注射：mbsIgG2a-PD-L1x4-1BB(5mg/kg；注射体积为10μL/g体重；每周两剂，持续三周[2QW×3])、抗小鼠PD-1抗体(抗mPD-1；10mg/kg；注射体积为10μL/g体重；2QW×3；克隆RMP1-14；LeincoTechnologies，目录号P372)、mbsIgG2a-PD-L1x4-1BB(5mg/kg)与抗mPD-1(10mg/kg；以两次单独注射[mbsIgG2a-PD-L1x4-1BB，然后在20min后注射抗mPD-1]，其中注射体积为10μL/g体重；2QW×3)的组合，或注射体积为10μL/g体重的PBS(表7)。

每天监测小鼠的疾患的临床体征。随机化后每周进行三次体重测量。当肿瘤体积超过1500mm³或当动物达到人道终点时(例如，当小鼠显示出体重减轻＞20％时、当肿瘤显示出溃疡[>75％]时、当观察到严重的临床体征时和/或当肿瘤生长阻碍小鼠的身体活动时)对该个体小鼠终止实验。

表7.治疗组和给药方案

^a 2QW×3：每周两剂，持续三周

结果

在用PBS治疗的荷有MC38的小鼠中观察到快速的肿瘤长出(outgrowth)(图2A)。在用抗mPD-1(10mg/kg)或mbsIgG2a-PD-L1x4-1BB(5mg/kg)治疗的小鼠中，观察到延迟的肿瘤长出，其中mbsIgG2a-PD-L1x4-1BB诱导的肿瘤长出更明显延迟(图2A)。与在该模型中对于单独的任一药剂所观察到的没有完全肿瘤消退相比，在用mbsIgG2a-PD-L1x4-1BB(5mg/kg)与抗mPD-1(10mg/kg；两者均为2QW×3)组合治疗的小鼠中，在治疗起始后第21天，在6/10的小鼠中观察到肿瘤完全消退(图2A)。Kaplan-Meier分析显示，当与PBS治疗组相比(p<0.001)和与单独的任一抗体相比(p≤0.001；Mantel-Cox；图2B，表8)时，用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1的组合的治疗诱导了无进展生存(定义为具有小于500mm³的肿瘤体积的小鼠的百分比)的显著增加。因此，观察到该组合的治疗性协同作用，这定义为相对于每种药剂作为单一疗法所显示的活性具有优越的(p<0.05)抗肿瘤功效。

这些结果为评价GEN1046与抗PD-1抗体的组合提供了基本原理，以进一步放大癌症患者中的抗肿瘤免疫应答，以产生持久和深入的临床响应并提高生存。

表8.在C57BL/6小鼠的MC38模型中，由mbsIgG2a-PD-L1x4-1BB、抗mPD-1(单独或者组合)诱导的无进展生存的Mantel-Cox分析

¹肿瘤体积<500mm³用作无进展生存的截止值。在第45天进行Mantel-Cox分析。

实施例2：确定GEN1046和抗PD-1抗体纳武单抗在具有活性PD1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞测定中的增殖剂量-响应的抗原特异性CD8+T细胞增殖测定。

为了测量GEN1046或纳武单抗对T细胞增殖的诱导，进行了具有活性PD1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞增殖测定。

HLA-A2+外周血单核细胞(PBMC)获得自健康供体(Transfusionszentrale,University Hospital,Mainz,Germany)。根据制造商的说明，使用抗CD14微珠MicroBeads(Miltenyi；目录号130-050-201)通过磁活化细胞分选(MACS)技术从PBMC中分离出单核细胞。冷冻外周血淋巴细胞(PBL，CD14阴性级分)以用于将来的T细胞分离。为了分化成未成熟DC(iDC)，将1x10⁶个单核细胞/ml在含有5％人AB血清(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，目录号H4522-100ML)、丙酮酸钠(Life Technologies GmbH，目录号11360-039)、非必需氨基酸(Life Technologies GmbH，目录号11140-035)、100IU/mL青霉素-链霉素(LifeTechnologies GmbH，目录号15140-122)、1000IU/mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；Miltenyi，目录号130-093-868)和1000IU/mL白细胞介素4(IL-4；Miltenyi，目录号130-093-924)的RPMI GlutaMAX(Life Technologies GmbH，目录号61870-044)中培养五天。这五天期间，将一半培养基更换为新鲜培养基一次。通过收集非贴壁细胞来收获iDC，并通过用含有2mM EDTA的PBS在37°下温育10min来分离贴壁细胞。洗涤后，将iDC冷冻在含有10％v/v DMSO(AppliChem GmbH，目录号A3672,0050)+50％v/v人AB血清的RPMI GlutaMAX中，用于将来的抗原特异性T细胞测定。

在抗原特异性CD8+T细胞增殖测定开始前一天，将来自同一供体的冷冻的PBL和iDC解冻。根据制造商的说明，使用抗CD8 MicroBead(Miltenyi，目录号130-045-201)通过MACS技术从PBL中分离出CD8+T细胞。使用BTX830 Electroporation System设备(BTX；500V，1x3ms脉冲)，在4mm电穿孔比色皿(VWR International GmbH，目录号732-0023)中，约10-15x10⁶个CD8+ T细胞用250μL X-Vivo15(Biozym Scientific GmbH，目录号881026)中的10μg的编码α链的体外翻译(IVT)-RNA加10μg的编码密蛋白6特异性鼠TCR(HLA-A2限制性；如WO 2015150327 A1中所述)的β链的IVT-RNA加10μg编码PD-1的IVT-RNA进行电穿孔。电穿孔后，立即将细胞转移到补充有5％人AB血清的新鲜IMDM培养基(LifeTechnologies GmbH，目录号12440-061)中，并在37℃、5％ CO₂下静置至少1小时。根据制造商的说明，使用PBS中的1.6μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Invitrogen，目录号C34564)标记T细胞，并在补充有5％人AB血清的IMDM培养基中温育过夜。

使用如上所述的电穿孔系统(300V，1x12ms脉冲)，在250μL X-Vivo15培养基中用1μg(GEN1046剂量-响应)或3μg(派姆单抗剂量-响应)的编码全长密蛋白6的IVT-RNA对多至5x10⁶个解冻的iDC进行电穿孔，并在补充有5％人AB血清的IMDM培养基中温育过夜。

第二天，收获细胞。通过流式细胞术检查DC上密蛋白6和PD-L1以及T细胞上TCR和PD-1的细胞表面表达。用Alexa647缀合的CLDN6特异性抗体(非市售的；内部生产)和用抗人CD274抗体(PD-L1，eBioscienes，目录号12-5983)对DC进行染色，并用抗小鼠TCRβ链抗体(Becton Dickinson GmbH，目录号553174)和用抗人CD279抗体(PD-1，eBioscience，目录号17-2799)对T细胞进行染色。在96孔圆底板中在补充有5％人AB血清IMDM GlutaMAX中，在存在GEN1046(1至0.00015μg/mL的3倍连续稀释)或临床级纳武单抗(0.8至0.00005μg/mL的4倍连续稀释；Opdivo,Phoenix Apotheke,PZN 11024601)的情况下，将电穿孔的DC与电穿孔的、CFSE标记的T细胞以1:10的比率一起温育。5天后，在BD FACSCanto^TMII或BDFACSCelesta^TM流式细胞仪(Becton Dickinson GmbH)上进行基于CFSE稀释的T细胞增殖的流式细胞术分析。使用FlowJo软件第10.7.1版分析获取的数据。计算每个治疗条件的扩增指数值(确定总体培养物的倍数扩增)并将其绘制为GEN1046或纳武单抗浓度的函数。生成剂量-响应曲线，并使用4参数对数拟合在GraphPad Prism第9版(GraphPad Software,Inc.)中计算EC₂₀、EC₅₀、EC₉₀和Hill-Slope值。

在1至0.00015μg/mL的3倍连续稀释下分析GEN1046剂量响应(图3A)，其中EC₂₀、EC₅₀、EC₉₀和Hill-Slope值在表9中给出。在测试的四个供体中看到了强烈的增殖诱导效应，平均EC₅₀为0.0064μg/mL，。

在0.8至0.00005μg/mL的4倍连续稀释下分析纳武单抗剂量响应(图3B)，其中EC₅₀、EC₉₀和Hill-Slope值在表10中给出。在测试的四个供体中看到了强烈的增殖诱导效应，平均EC₅₀为0.0784μg/mL，。

表9.基于通过抗原特异性T细胞增殖测定测量的CD8⁺T细胞扩增数据确定GEN1046的EC₂₀、EC₅₀和EC₉₀值。显示的数据是基于四参数对数拟合计算出的值。

表10.基于通过抗原特异性T细胞增殖测定测量的CD8⁺T细胞扩增数据确定获批的抗PD-1抗体纳武单抗的EC₅₀和EC₉₀值。显示的数据是基于四参数对数拟合计算出的值。平均值是算术平均值。

实施例3：在存在或不存在抗PD-1抗体纳武单抗的情况下，通过GEN1046的PD-1/PD-L1介导的T细胞抑制的释放(release)和CD8+T细胞增殖的额外共刺激。

为了测量通过DuoBody-PD-L1x4-1BB与抗PD-1抗体纳武单抗或IgG1-ctrl抗体组合对T细胞增殖的诱导作用，进行了具有活性的PD1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞增殖测定(一般测定设置类似于实施例2)。简而言之，在96孔圆底板中在补充有5％人AB血清的IMDMGlutaMAX中，在GEN1046与固定浓度的纳武单抗或IgG1-ctrl对照抗体组合的情况下，将密蛋白6-IVT-RNA电穿孔的DC与密蛋白6特异性TCR-IVT-RNA和PD1-IVT-RNA电穿孔的、CFSE标记的T细胞(1:10的比率)进行温育。测试了三种不同浓度的GEN1046，代表最佳、半最大和次优有效浓度(0.2μg/mL>EC90；0.0067μg/mL≈EC50；0.0022μg/mL≈EC20，参见实施例2，表9)。分别以1.6μg/mL和0.8μg/mL的浓度测试纳武单抗和IgG1-ctrl对照抗体，该浓度远高于纳武单抗的EC₉₀值(参见实施例2，表10)。仅使用培养基和0.8μg/mL IgG1-ctrl来确定基线增殖。纳武单抗(1.6μg/mL)用作额外的检查点抑制对照。5天后，在BD FACSCanto^TMII或BDFACSCelesta^TM流式细胞仪(Becton Dickinson GmbH)上进行基于CFSE稀释的T细胞增殖的流式细胞术分析。使用FlowJo软件第10.7.1版分析获取的数据。使用GraphPad Prism第9版(GraphPad Software,Inc.)计算并绘制每个治疗条件的扩增指数值。

将表达PD-1和密蛋白6特异性TCR的CD8+T细胞与表达PD-L1和同源抗原的DC进行温育，导致极小的增殖诱导，其中对于测试的所有三个供体，仅培养基和IgG1-ctrl治疗的培养物中扩增指数值略高于1(参见图4)。通过向共培养环境中添加纳武单抗来释放PD-1:PD-L1介导的抑制，导致扩增指数适度增加，如图中的虚线所示。添加GEN1046后观察到T细胞增殖更明显的以及剂量依赖性增加，其中与中浓度和低浓度单一化合物治疗条件相比，测试的最高浓度导致最高的增殖诱导。值得注意的是，最低浓度的0.0022μg/mL GEN1046(没有纳武单抗组合)导致的扩增指数值与针对仅纳武单抗对照记录的那些值相当或甚至低于那些值，这表明次优的PD-1:PD-L1检查点阻断。形成鲜明对比的是，不依赖于测试的GEN1046浓度，GEN1046与纳武单抗组合的T细胞增殖诱导总是优于没有纳武单抗条件的GEN1046。对于中和低GEN1046浓度，有和没有纳武单抗条件之间的扩增指数差异特别大。尤其是，在次优GEN1046条件(0.0022μg/mL≈EC20)的情况下，添加纳武单抗挽救CD8+T细胞增殖，其中与针对仅纳武单抗对照观察到的那些相比，其扩增指数显著更高。

实施例4：具有扩展(expansion)队列的首次人体、开放标签、剂量递增试验，以评价GEN1046在患有恶性实体瘤的受试者中的安全性

该研究是GEN1046(-PD-L1×4-1BB)的开放标签、多中心、1/2a期安全性试验。该试验由2部分组成；首次人体(FIH)剂量递增(1期)和扩展(2a期)。剂量递增在患有实体恶性肿瘤的受试者中评价了GEN1046，以确定最大耐受剂量(MTD)或最大施用剂量和/或推荐的2期剂量(RP2D)。

扩展进一步评价了在选择的实体瘤扩展队列针对以下的所选剂量的安全性、耐受性、PK和抗肿瘤活性：非小细胞肺癌(NSCLC)(预先经PD-1/L1治疗的和未经PD-1/L1治疗的)、尿路上皮癌(UC)、子宫内膜癌(EC)、三阴性乳腺癌(TNBC)(在已经接受过用PD-1/L1抑制剂的既往治疗的受试者中，和在未接受过此类治疗的受试者中)：以及头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。

表11：扩展队列

图5中提供了试验设计的示意图。国际专利申请WO 2021/156326中提供了剂量递增和扩展队列的进一步公开，以及剂量递增的初步结果。

初步结果和结论

·在FIH试验的递增阶段中评价的25至1200mg Q3W的剂量是安全的，并且通常良好耐受。未达到MTD。

·安全性数据的初步评价显示无剂量依赖性，这表明没有与AE的频率相关的剂量响应。

·在FIH试验的剂量递增阶段，在80至200mg Q3W的GEN1046剂量下观察到根据RECISTv1.1的响应。此外，在使用100mg Q3W的剂量的扩展中也观察到了响应。

·在剂量水平≤200mg的外周血中观察到药效学标志物的一致调节(增值性[Ki67+]效应记忆CD8+T细胞和总CD8+T细胞以及IFNγ和IP-10的增加的水平)。在更高剂量水平(≥400mg)下观察到这些终点的减少的调节。

·半机械PK/药效学模型(参见WO 2021/156326中的实施例13)预测三聚体形成的钟形响应，其在100mg Q3W附近达到峰值。为了平衡三聚体水平和与PD-L1 RO相关的靶标接合，选择了100mg Q3W的剂量，这可以为GEN1046提供最佳的初始响应。

·已经接受过用检查点抑制剂的既往治疗的受试者的无进展生存(PFS)更长(图6)。

·在检查点抑制剂预治疗的NSCLC受试者中，对GEN1046单一疗法的临床响应与距末次既往抗PD-1治疗的时间相关联(图7)。

o受益于GEN1046单一疗法的NSCLC受试者，显示出更近的用抗PD-1药剂的末次治疗的趋势

自从含有抗PD-1药物的疗法之后的时间更短，可以表明残留的抗PD-1活性正在促进对GEN1046的响应。支持这一点的是，在临床上用抗PD-1药剂进行治疗的患者展示出治疗性抗体的长期PD-1受体占据，这可以持续超过200天(Brahmer等人,JCO 2010；28(19):3167–3175)。使治疗性a-PD-1药剂仍然结合至PD-1受体可以反过来会导致大量游离PD-L1分子可用于与GEN1046结合。

残留的a-PD-1活性的存在还可以允许更完全地阻断PD-1途径(阻断PD-1与PD-L1和PD-L2两者的相互作用)，这在CPI后背景中对于GEN1046的生物活性可能很重要。

更近的抗PD-1治疗可以对肿瘤微环境产生直接影响，例如通过起始抗肿瘤免疫应答，如果在含有抗PD-1的疗法药物的进展后立即或不久给予GEN1046，则GEN1046可以增强该抗肿瘤免疫应答。

ο响应者呈现为“低”PD-1+CD8 T细胞频率，这可以反映既往a-PD-1治疗的受体占用率(RO)

ο相反，无响应者呈现为普遍高的PD-1+CD8 T细胞频率，这可以表明更加耗竭的表型

实施例5：IgG1-PD1的生成和筛选材料

本文所用的技术和方法在本文中描述或以本身已知的方式进行，并且如例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y中所述。除了特别说明以外，所有方法，包括试剂盒和试剂的使用，都根据制造商的信息进行。

PD-1和FcγR构建体

生成了编码各种全长PD-1变体的质粒：人(智人(Homo sapiens)；UniProtKB ID：Q15116)、食蟹猴(cynomolgus monkey)(食蟹猕猴(Macaca fascicularis)；UniProtKB ID：B0LAJ3)、犬(家犬(Canis familiaris)；UniProtKB ID：E2RPS2)、兔(穴兔(Oryctolaguscuniculus)；UniProtKB ID：G1SUF0)、猪(野猪(Sus scrofa)；UniProtKB ID：A0A287A1C3)、大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus)；UniProtKB ID：D3ZIN8)和小鼠(小家鼠(Musmusculus)；UniProtKB ID：Q02242)，以及编码人FcγRIa(UniProt KB ID：P12314)的质粒。

瞬时表达全长PD-1或FcγR变体的CHO-S细胞系的生成

根据制造商的说明，使用FreeStyle^TMMAX Reagent(ThermoFisher Scientific，目录号16447100)和OptiPRO^TM无血清培养基(ThermoFisher Scientific，目录号12309019)，用PD-1或FcγR质粒转染CHO-S细胞(适合于悬浮生长的CHO细胞的亚克隆；ThermoFisherScientific，目录号R800-07)。

抗体变体的产生

IgG1-PD1

使用重组人带组氨酸标签的PD-1蛋白(R&D Systems，目录号8986-PD)对三只新西兰白兔进行免疫。对来自血液的单个B细胞进行分选，并通过人PD-1酶联免疫吸附测定(ELISA)、细胞人PD-1结合测定并通过人PD-1/PD-L1阻断生物测定针对PD-1特异性抗体的产生对上清液进行筛选。从筛选阳性的B细胞提取RNA并进行测序。重链和轻链的可变区是基因合成的，并克隆了含有突变L234A和L235A(LALA；Labrijn等人,Sci Rep2017,7:2476)的人免疫球蛋白恒定部分(IgG1/κ)的N末端以最小化与Fcγ受体的相互作用，其中氨基酸位置编号根据Eu编号(SEQ ID NO:98)。

使用不含293的转染试剂(Novagen/Merck)通过Tecan Freedom Evo装置对HEK293-FreeStyle细胞进行瞬时转染。使用带有板自动进样器的Dionex Ultimate 3000HPLC上的蛋白A亲和层析从细胞上清液中纯化产生的嵌合抗体。纯化的抗体用于进一步分析，特别是通过人PD-1ELISA、细胞人PD-1结合测定、人PD-1/PD-L1阻断生物测定和T细胞增殖测定进行重新测试。嵌合兔抗体MAB-19-0202(SEQ ID NO:109和110)鉴定为表现最佳的克隆并随后进行了人源化。

嵌合PD-1抗体MAB-19-0202的可变区序列如下表所示。表12显示重链的可变区，而表13显示轻链的可变区。在这两种情况下，都根据Kabat编号定义了框架区(FR)以及互补决定区(CDR)。下划线的氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。粗体字母表示Kabat和IMGT编号的相交。

表12：

表13：

通过结构建模辅助的CDR移植、基因合成和克隆的人免疫球蛋白恒定部分(具有LALA突变的IgG1/κ)的N末端，生成人源化重链和轻链可变区抗体序列。人源化的抗体用于进一步分析，特别是通过人PD-1ELISA、细胞人PD-1结合测定、人PD-1/PD-L1阻断生物测定和T细胞增殖测定进行重新测试。人源化抗体MAB-19-0618(SEQ ID NO:111和112)鉴定为表现最佳的克隆。

人源化轻链和重链对重组人源化序列的抗体ID的分配列于表14中。人源化轻链和重链的可变区序列显示于表15和16中。表15显示重链的可变区，而表16显示轻链的可变区。在这两种情况下，都根据Kabat编号定义了框架区(FR)以及互补决定区(CDR)。下划线的氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。

表14：

表15：

表16：

MAB-19-0618重链和轻链可变区的序列是基因合成的，并通过连接非依赖性克隆(LIC)克隆到具有编码含有Fc沉默突变L234F、L235E和G236R(FER)(其中氨基酸位置编号根据Eu编号)的人IgG1m(f)重链恒定域(SEQ ID NO:93)和人κ轻链恒定域(SEQ ID NO:97)的密码子优化序列的表达载体中。所得抗体指定为IgG1-PD1。

GSExpression System(Lonza)用于生成表达IgG1-PD1的稳定细胞系。通过Lonza Biologics plc，将编码IgG1-PD1重链和轻链的序列分别克隆到表达载体pXC-18.4和pXC-κ(含有谷氨酰胺合成酶[GS]基因)中。接下来，通过将来自重链载体的完整表达盒连接到轻链载体来构建编码IgG1-PD1的重链和轻链两者的双基因载体(DGV)。该DGV的DNA使用限制酶PvuI-HF New England Biolabs，R3150L)进行线性化，并用于稳定转染细胞。纯化IgG1-PD1用于功能表征。

IgG1-CD52-E430G

将具有在Fc域中的E430G六聚化增强突变(WO2013/004842A2)(SEQ ID NO:95)和与CAMPATH-1H(CD52特异性抗体)相同的抗原结合域的人IgG1抗体用作C1q结合实验中的阳性对照(Crowe等人,1992Clin Exp Immunol.87(1):105-110)(SEQ ID NO.116和120)。

对照抗体

将具有与b12(HIV1 gp120特异性抗体)相同的抗原结合域的人IgG1抗体用作多个实验中的阴性对照(Barbas等人,J Mol Biol.1993Apr 5；230(3):812-2)。b12的V_H和V_L域(SEQ ID NO.123和127)通过从头基因合成(GeneArt Gene Synthesis；ThermoFisherScientific,Germany)制备并克隆到如下表达载体中，视所选结合域而定，该表达载体含有人IgG1m(f)同种异型(SEQ ID NO:92)或其变体(含有L234F/L235E/G236R突变以及在本研究的背景下功能上不相关的Fc域中的K409R突变，缩写为FERR突变)的人IgG1重链恒定区(即CH1、铰链、CH2和CH3区)(SEQ ID NO:94)，或含有人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:96)；或人κ轻链(LC)的恒定区(SEQ ID NO:97)。通过在生产细胞系中转染重链和轻链表达载体获得抗体，并进行纯化以进行功能表征。

实施例6：IgG1-PD1与来自不同物种的PD-1的结合

使用瞬时表达来自不同动物物种的PD-1的CHO-S细胞，通过流式细胞术评估IgG1-PD1与常用于非临床毒理学研究的物种的PD-1的结合。

将CHO-S细胞(5×10⁴个细胞/孔)接种于圆底96孔板中。在补充有0.1％[w/v]牛血清白蛋白[BSA；Roche，目录号10735086001]和0.02％[w/v]叠氮化钠[NaN₃；bioWORLD，目录号41920044-3])的Genmab(GMB)荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液(磷酸盐缓冲盐水[PBS；Lonza，目录号BE17-517Q，在蒸馏水中稀释至1×PBS]中制备IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR和派姆单抗的抗体稀释物(1.7×10^-4–30μg/mL或5.6×10^-5–10μg/mL，3倍稀释)。仅在所测试的最高浓度(30μg/mL或10μg/mL)下包含派姆单抗的IgG4同种型对照(BioLegend，目录号403702)。离心细胞，除去上清液，并将细胞在50μL的抗体稀释物中于4℃温育30min。用GMBFACS缓冲液洗涤细胞两次，并与50μL二抗R-藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗人IgG F(ab’)₂(Jackson Immuno Research，目录号109-116-098；1:500稀释于GMB FACS缓冲液中)于4℃避光温育30min。将细胞用GMB FACS缓冲液洗涤两次，重悬于补充有2mM乙二胺四乙酸(EDTA；Sigma-Aldrich，目录号03690)和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)活力标志物(1:5,000；BDPharmingen，目录号564907)的GMB FACS缓冲液中。使用FlowJo软件在iQue PLUS Screener(Intellicyt Corporation)上通过流式细胞术分析与活细胞结合的抗体(通过DAPI排除法所鉴定的)。使用GraphPad Prism中的非线性回归分析(四参数剂量-响应曲线拟合)分析结合曲线。

使用瞬时转染以在细胞表面表达人、食蟹猴、犬、兔、猪、大鼠或小鼠PD-1蛋白的CHO-S细胞，通过流式细胞术评价IgG1-PD17与不同物种的PD-1的结合。对于人和食蟹猴PD-1，观察到IgG1-PD1的剂量依赖性结合(图8A-B)。派姆单抗表现出相当的结合。观察到IgG1-PD1与啮齿动物PD-1的交叉反应性显著降低(并且仅在最高浓度下)(小鼠、大鼠；图8C-D)，并且未观察到与毒理学研究中常用的其他物种的PD-1的结合(兔、犬、猪；图8E)。没有观察到IgG1-PD1与未转染的对照细胞的结合(图8E)，也没有观察到IgG1-ctrl-FERR(包括作为阴性对照)与任何所测试的物种的PD-1的结合(图8)。

总之，IgG1-PD1显示出与膜表达的人和食蟹猴PD-1相当的结合，并且与小鼠、大鼠、兔、犬和猪PD-1的结合显著降低或没有结合。

实施例7：通过表面等离子体共振测定与人和食蟹猴PD-1的结合

使用Biacore 8K SPR系统通过表面等离子体共振(SPR)分析固定化的IgG1-PD1、派姆单抗和纳武单抗与人和食蟹猴PD-1的结合。带有C末端His标签的重组人和食蟹猴PD-1细胞外域(ECD)获得自Sino Biological(目录号分别为HPLC-10377-H08H和90311-C08H)。

根据制造商的说明，使用胺偶联和Human Antibody Capture Kit，Type 2(Cytiva，目录号BR100050和BR100839)，用抗Fc抗体共价包被Biacore Series S SensorChips CM5(Cytiva，目录号29149603)。

随后，将HBS-EP+缓冲液(Cytiva，目录号BR100669；在蒸馏水中稀释至1×[BBraun，目录号00182479E])中稀释的IgG1-PD1(2nM)、纳武单抗(Bristol-Myers Squibb，批号ABP6534；1.25nM)和派姆单抗(Merck Sharp&Dohme，批号T019263；1.25nM)在25℃下捕获到表面上，其中流速为10μL/min，并且接触时间60秒。这导致约50个共振单位(RU)的捕获水平。

注射HBS-EP+缓冲液的三个启动循环后，将人或食蟹猴PD-1ECD样品(0.19–200nM；在HBS-EP+缓冲液中2倍稀释；12个循环)以生成结合曲线。在抗体包被的表面(活性表面)上分析的每个样品，也在没有抗体的平行流动孔(参考表面)上进行分析，其用于背景校正。

在每个循环结束时，使用10mM甘氨酸-HCl pH 1.5(Cytiva，目录号BR100354)再生表面。使用Biacore Insight Evaluation软件(Cytiva)中预定义的“使用捕获的多循环动力学”评价方法分析数据。分析中省略了具有最高浓度的人或食蟹猴PD-1(200nM)的样品，以允许数据曲线更好的拟合。

固定化IgG1-PD1以1.45±0.05nM的结合亲和力(K_D)与人PD-1ECD结合(表17)。纳武单抗和派姆单抗以与IgG1-PD1的K_D相当的结合亲和力与人PD-1ECD结合，即具有低纳摩尔范围内的K_D值(分别为4.43±0.08nM和3.59±0.10nM)(表17)。

固定化IgG1-PD1以2.74±0.58nM的K_D(与IgG1-PD1对人PD-1的亲和力相当)与食蟹猴PD-1ECD结合(表18)。纳武单抗和派姆单抗以与IgG1-PD1对食蟹猴PD-1ECD的K_D相当且与纳武单抗和派姆单抗对人PD-1ECD的K_D相当的结合亲和力结合食蟹猴PD-1ECD，，即具有低纳摩尔范围内的K_D值(分别为2.93±0.58nM和0.90±0.06nM)(表18)。

表17.如通过表面等离子体共振确定的PD-1抗体与人PD-1细胞外域的结合亲和力。

通过SPR确定IgG1-PD1、纳武单抗和派姆单抗对人PD-1的ECD的缔合速率常数k_a(1/Ms)、解离速率常数k_d(1/s)和平衡解离常数K_D(M)。

^a来自三个独立实验的平均值和SD。

^b来自两次独立实验的平均值和SD。

缩写：K_D＝平衡解离常数；k_a＝缔合速率常数；k_d＝解离速率常数或解离速率(off-rate)；SD＝标准偏差。

表18.如通过表面等离子体共振确定的PD-1抗体与食蟹猴PD-1细胞外域的结合亲和力。

通过SPR确定IgG1-PD1、纳武单抗和派姆单抗对食蟹猴PD-1的ECD的缔合速率常数ka(1/Ms)、解离速率常数kd(1/s)和平衡解离常数K_D(M)。

^a来自三个独立实验的平均值和SD。

^b来自两次独立实验的平均值和SD。

实施例8：IgG1-PD1对PD-1配体结合和PD-1/PD-L1信号传导的效应

为了证实IgG1-PD1作为经典免疫检查点抑制剂发挥作用，在体外评估了IgG1-PD1破坏PD-1配体结合和PD-1检查点功能的能力。

通过流式细胞术评估IgG1-PD1与重组人PD-L1和PD-L2与膜表达的人PD-1的竞争性结合。将用人PD-1瞬时转染的CHO-S细胞(参见实施例5；5×10⁴个细胞/孔)添加到圆底96孔板(Greiner，目录号650180)的孔中，沉淀，并置于冰上。将稀释于PBS(Cytiva，目录号SH3A3830.03)的生物素化重组人PD-L1(R&D Systems，目录号AVI156)或PD-L2(R&DSystems，目录号AVI1224)添加到细胞(终浓度：1μg/mL)，然后立即将稀释于PBS的浓度范围的IgG1-PD1、派姆单抗(MSD，批号T019263和T036998)或IgG1-ctrl-FERR(终浓度：三倍稀释步骤中的30μg/mL–0.5ng/mL)。然后将细胞在RT下温育45min。用PBS洗涤细胞两次，并与50μL链霉亲和素-别藻蓝蛋白(R&D Systems，目录号F0050；在PBS中按1:20稀释)在4℃下避光温育30min。将细胞用PBS洗涤两次，并重悬于20μL GMB FACS缓冲液中。使用FlowJo软件在iQue Screener PLUS(Sartorius)上通过流式细胞术分析链霉亲和素-别藻蓝蛋白结合。

是基本上如制造商所述，使用基于生物发光细胞的PD-1/PD-L1阻断报告物测定(Promega，目录号J1255)测定IgG1-PD1对PD-1和PD-L1功能性相互作用的效应。简而言之，将PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞和PD-1效应细胞的共培养物与连续稀释的IgG1-PD1、派姆单抗(MSD，批号10749880或T019263)、纳武单抗(Bristol-Myers Squibb，批号11024601)或IgG1-ctrl-FERR(最终测定浓度：3倍稀释物中的15–0.0008μg/mL或5倍稀释物中的10–0.0032μg/mL)，在37℃、5％ CO₂下温育6h。然后将细胞与重构的Bio-Glo^TM在RT下温育5–30min，然后使用F200PRO Reader(Tecan)或EnVision Multilabel PlateReader(PerkinElmer)测量发光(按相对光单位[RLU]计)。

使用GraphPad Prism软件通过非线性回归分析(四参数剂量-响应曲线拟合)分析剂量-响应曲线，从拟合曲线衍生出其中观察到50％的最大(抑制)效应的浓度(EC₅₀/IC₅₀)。IgG1-PD1以剂量依赖性方式破坏人PD-L1和PD-L2与膜表达的人PD-1的结合(图9)，其中对于PD-L1结合抑制IC₅₀值为2.059±0.653μg/mL(13.9±4.4nM)，并且对于PD-L2结合抑制IC₅₀值为1.659±0.721μg/mL(11.2±4.9nM)，即在纳摩尔范围内(表19)。派姆单抗显示出具有相当效力的PD-L1和PD-L2结合抑制，即具有纳摩尔范围内的IC₅₀值。

使用基于细胞的生物发光PD-1/PD-L1阻断报告物测定来测试PD-1/PD-L1轴的功能性阻断。表达人PD-1并携带NFAT-RE驱动的萤光素酶的报告Jurkat T细胞和表达人PD-L1和抗原非依赖性TCR活化剂的PD-L1aAPC/CHOK1细胞的共培养物，在IgG1-PD1、派姆单抗或纳武单抗不存在和存在浓度稀释系列的情况下进行温育。包括IgG1-ctrl-FERR作为阴性对照。阻断PD-1/PD-L1相互作用导致释放PD1/PDL1介导的抑制性信号，这导致TCR活化和NFAT-RE介导的萤光素酶表达(测量到的发光)。IgG1-PD1诱导PD-1⁺报告T细胞中TCR信号传导的剂量依赖性增加(图10)。EC₅₀为0.165±0.056μg/mL(1.12±0.38nM；表20)。相似地，派姆单抗减轻了PD-1介导的TCR信号传导抑制，其中EC₅₀为0.129±0.051μg/mL(0.86±0.34nM)，即具有相当的效力。纳武单抗减轻了TCR信号传导的抑制，其中EC₅₀为0.479±0.198μg/mL(3.28±1.36nM)，即具有稍低的效力。

总之，IgG1-PD1通过阻断PD-1配体结合并破坏PD-1免疫检查点功能在体外充当经典的免疫检查点抑制剂。

表19.IgG1-PD1介导的PD-1配体结合的抑制的IC₅₀值IC₅₀值从竞争结合曲线计算。

缩写：IC₅₀＝其中观察到50％抑制效应的浓度；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；PD-L2＝程序性细胞死亡1配体2；SD＝标准偏差。

表20.PD-1/PD-L1检查点阻断的EC₅₀

在PD-1/PD-L1阻断报告物测定中，将PD-1⁺报告T细胞和PD-L1aAPC/CHO-K细胞的共培养物与浓度系列的IgG1-PD1、派姆单抗或纳武单抗进行温育。通过测量发光来确定PD-1/PD-L1检查点功能的抑制，该抑制导致报告T细胞中下游TCR信号传导和萤光素酶表达。从所得的剂量-响应曲线，计算出EC₅₀值。

缩写：aAPC＝人工抗原呈递细胞；CHO＝中国仓鼠卵巢；EC₅₀＝其中观察到50％的最大效应的浓度；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；SD＝标准偏差；TCR＝T细胞受体。

实施例9：抗原特异性增殖测定以确定IgG1-PD1增强活化T细胞的增殖的能力

为了确定IgG1-PD1增强T细胞增殖的能力，使用过表达PD-1的人CD8⁺T细胞进行了抗原特异性增殖测定。

HLA-A*02⁺外周血单核细胞(PBMC)获得自健康供体(Transfusionszentrale,University Hospital,Mainz,Germany)。根据制造商的说明，使用抗CD14微珠MicroBeads(Miltenyi；目录号130-050-201)通过磁活化细胞分选(MACS)技术从PBMC中分离出单核细胞。将外周血淋巴细胞(PBL，CD14阴性级分)冷冻保存在含有10％ DMSO(AppliChem GmbH，目录号A3672,0050)和10％人白蛋白(CSL Behring，PZN 00504775)的RPMI 1640中，用于T细胞分离。为了分化成未成熟DC(iDC)，将1×10⁶个单核细胞/mL在含有5％合并的人血清(One Lambda Inc.，目录号A25761)、1mM丙酮酸钠(Life Technologies GmbH，目录号11360-039)、1x非必需氨基酸(Life Technologies GmbH，目录号11140-035)、200ng/mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；Miltenyi，目录号130-093-868)和200ng/mL白细胞介素4(IL-4；Miltenyi，目录号130-093-924)的RPMI 1640(Life Technologies GmbH，目录号61870-010)中培养五天。在培养物中三天后，用新鲜培养基替换一半的培养基。在第5天，通过收集非贴壁细胞收获iDC，并通过与含有2mM EDTA的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)在37°下温育10min来分离贴壁细胞。用DPBS洗涤后，将iDC冷冻保存在含有10％ DMSO的胎牛血清(FBS；Sigma-Aldrich，目录号F7524)中，以用于将来用于抗原特异性T细胞测定。

在抗原特异性CD8^+T细胞增殖测定开始前一天，将来自同一供体的冷冻的PBL和iDC解冻。根据制造商的说明，使用抗CD8 MicroBead(Miltenyi，目录号130-045-201)通过MACS技术从PBL中分离出CD8⁺T细胞。用250μL X-Vivo15培养基(Lonza，目录号BE02-060Q)中的10μg的编码对人密蛋白6(CLDN6；HLA-A*02限制性的；描述于WO 2015150327 A1中)特异的鼠TCR的α和β链的体外翻译的(IVT)-RNA加10μg编码PD-1(UniProt Q15116)的IVT-RNA电穿孔每约10×10⁶至15×10⁶个CD8⁺T细胞。将细胞转移至4-mm电穿孔比色皿(VWRInternational GmbH，目录号732-0023)并使用BTX 830Electroporation System(BTX；500V，1x3 ms脉冲)进行电穿孔。电穿孔后，立即将细胞转移到含有5％合并的人血清的新鲜IMDM GlutaMAX培养基(Life Technologies GmbH，目录号319800-030)中，并在37℃、5％ CO₂下静置至少1小时。根据制造商的说明，使用PBS中的1.6μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Life Technologies GmbH，目录号V12883)标记T细胞，并在补充有5％合并的人血清的IMDM培养基中温育过夜。

使用如上所述的电穿孔系统(300V，1x12 ms脉冲)，在250μL X-Vivo15培养基中用2μg编码全长人CLDN6的IVT-RNA(WO 2015150327 A1)电穿孔多至5×10⁶个解冻的iDC，并在补充有5％合并的人血清的IMDM培养基中温育过夜。

第二天，收获细胞。通过流式细胞术证实iDC上CLDN6的细胞表面表达，以及T细胞上CLDN6特异性TCR和PD-1的细胞表面表达。为此，iDC使用DyLight650缀合的CLDN6特异性抗体(非市售的；内部生产)进行染色。T细胞用亮紫(BV)421缀合的抗小鼠TCR-β链抗体(Becton Dickinson GmbH,cat.no.562839)和别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗人PD-1抗体(ThermoFisher Scientific，目录号17-2799-42)进行染色。

在96孔圆底板中在含有5％合并的人血清的IMDM培养基中，在存在4倍连续稀释(范围0.00005至0.8μg/mL)的IgG1-PD1、派姆单抗(MSD Sharp&Dohme GmbH，PZN 10749897)或纳武单抗(Bristol-Myers Squibb，PZN 11024601)的情况下，将电穿孔的iDC与电穿孔的CFSE标记的T细胞以1:10的比率温育。阴性对照抗体IgG1-ctrl-FERR以0.8μg/mL的单一浓度使用。4d的培养后，细胞用APC缀合的抗人CD8抗体进行染色。使用BD FACS Celesta^TM流式细胞仪(Becton Dickinson GmbH)通过CD8⁺T细胞中的CFSE稀释度(dilution)的流式细胞术分析来评价T细胞增殖。

使用FlowJo软件第10.7.1版分析流式细胞术数据。使用FlowJo中的增殖建模工具评估CD8⁺T细胞的CFSE标记稀释度，并使用积分公式计算扩增指数。使用4参数对数拟合在GraphPad Prism第9版(GraphPad Software,Inc.)中生成剂量-响应曲线。使用GraphPadPrism第9版通过Friedman’s检验和Dunn’s多重比较检验确定统计显著性。

IgG1-PD1以剂量依赖性方式增强CD8⁺T细胞的抗原特异性增殖(图11)，其中EC₅₀值在皮摩尔范围内(表21)。用派姆单抗或纳武单抗进行治疗也以剂量依赖性方式增强T细胞增殖。派姆单抗的平均EC₅₀与IgG1-PD1相当，然而纳武单抗的EC₅₀显著(P＝0.0267)高于IgG1-PD1的EC₅₀。

表21：抗原特异性增殖测定中的EC₅₀值

IgG1-PD1、派姆单抗和纳武单抗的EC₅₀值使用如通过抗原特异性T细胞增殖测定所测得的CD8⁺T细胞扩增指数来确定。显示的数据是基于4参数对数拟合计算出的值。缩写：EC₅₀＝半最大有效浓度；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；SD＝标准偏差。

实施例10：同种异体MLR测定中IgG1-PD1对细胞因子分泌的效应

为了调查IgG1-PD1在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中增强细胞因子分泌的能力，在存在IgG1-PD1的情况下共培养了人成熟树突状细胞(mDC)和CD8⁺T细胞的三个独特的同种异体对。使用IFNγ特异性免疫测定测量IFNγ的水平，而单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、GM-CSF、白细胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL12-p40、IL-15、IL-17α和肿瘤坏死因子(TNFα)的水平使用定制的Luminex多重免疫测定来确定。

人CD14⁺单核细胞获得自健康供体(BioIVT)。为了分化呈未成熟树突状细胞(iDC)，将单核细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco，目录号16140071)、100ng/mLGM-CSF和300ng/mL IL-4(BioLegend，目录号766206)的RPMI-1640完全培养基(ATCC改良配方；ThermoFisher，目录号A1049101)中于37℃培养6天。在第4天，用含有补充剂的新鲜培养基替换培养基。为了使iDC成熟，将细胞在补充有10％ FBS、100ng/mL GM-CSF、300ng/mLIL-4和5μg/mL脂多糖(LPS；Thermo Fisher Scientific，目录号00497693)的RPMI-1640完全培养基中在37℃下培养24h，然后开始MLR测定。同时，将从同种异体健康供体(BioIVT)获得的纯化CD8⁺T细胞解冻并在补充有10％FBS和10ng/mL IL-2(BioLegend，目录号589106)的RPMI-1640完全培养基中于37°培养过夜。

第二天，收获LPS成熟的树突状细胞(mDC)和同种异体CD8⁺T细胞，并将其分别以4×10⁵个细胞/mL和4×10⁶个细胞/mL重悬于预热的AIM-V培养基(Thermo FisherScientific，目录号12055091)中。在96孔圆形底板中的AIM-V培养基中，在存在抗体浓度范围(0.001-30μg/mL)的IgG1-PD1、IgG1对照FERR或派姆单抗(MSD，目录号T019263)的情况下，或在存在30μg/mL IgG4同种型对照(BioLegend，目录号403702)的情况下，将mDC(20,000个细胞/孔)与同种异体初始CD8⁺T细胞(200,000个细胞/孔)在37℃下进行温育。

5d后，将无细胞上清液从每个孔转移到新的96孔板中并储存在-80℃直至进一步分析细胞因子浓度。

根据制造商的说明，在Envision仪器上使用IFNγ特异性免疫测定(Alpha LisaIFNγ试剂盒；Perkin Elmer，目录号AL217)确定IFNγ水平。

MCP-1、GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL12-p40、IL-15、IL-17α和TNFα的水平使用基于Human TH17 Magnetic Bead Panel的定制多重免疫测定(Millipore，订单号SPR1526)来确定。简而言之，将无细胞上清液解冻，并将10μL的每个样品添加到384孔板(Greiner Bio-One，目录号781096)的孔中的10μL Assay Buffer中，该孔用1×Wash Buffer预洗涤。同时，将10μL Assay Buffer中的标准品或对照添加到孔中，然后添加10μL的测定培养基。将针对不同细胞因子的磁珠混合并在Bead Diluent中稀释至1×浓度，然后将10μL的混合的珠添加到每个孔。将板密封并在4℃下温育，摇动过夜。用60μL 1×Wash Buffer洗涤孔3次。随后，向每孔中添加10μL的Custom Detection Antibody，并且密封板并在RT下摇动温育1h。接下来，将10μL的链霉亲和素-PE添加到每个孔，并且将板密封并在RT下摇动温育30min。如上所述，用60μL 1×WashBuffer洗涤孔3次，然后通过在RT下摇动5min，将珠重悬于75μL Luminex Sheath Fluid中。样品在Luminex FlexMap 3D系统上运行。

在MLR测定开始和结束时，使用PE-Cy7缀合的抗PD-1(BioLegend，目录号329918；1:20)、别藻蓝蛋白缀合的抗PD-L1(BioLegend，目录号329708；1:80)、BUV496缀合的抗CD3(BD Biosciences，目录号612940；1):20)和BUV395缀合的抗CD8(BD Biosciences，目录号563795；1:20)，通过流式细胞术证实CD8⁺T的PD-1的表达以及mDC上的PD-L1的表达。

IgG1-PD1以剂量依赖性方式持续增强IFNγ的分泌(图12)。IgG1-PD1还增强MCP-1、GM-CSF、IL-2、IL-6、IL-12p40、IL-17α、IL-10和TNFα的分泌(图13)。派姆单抗对细胞因子分泌具有相当的效应。

实施例11：C1q与IgG1-PD1结合的评价

使用活化的人CD8⁺T细胞评估补体蛋白C1q与恒定重链区中携带FERFc沉默突变的IgG1-PD1的结合。作为阳性对照，包括了IgG1-CD52-E430G，其具有基于CD52抗体CAMPATH-1H的V_H和V_L域，并且具有Fc增强的主链，已知该主链在结合至细胞表面时高效地结合C1q。作为非结合性阴性对照抗体，包括了IgG1-ctrl-FERR和IgG1-ctrl。

全部根据制造商的说明，通过使用RosetteSep^TMHuman CD8⁺T Cell EnrichmentCocktail(Stemcell Technologies，目录号15023C.2)的负选，或通过使用CD8 MicroBeads(Miltenyi Biotec，目录号130-045-201)和LS柱(Miltenyi Biotec，目录号130-042-401)经由磁活化细胞分选(MACS)的正选，从获得自健康志愿者(Sanquin)的血沉棕黄层纯化(富集)人CD8⁺T细胞。将纯化的T细胞重悬于T细胞培养基(Roswell Park Memorial Institute[RPMI]-1640培养基，其具有25mM HEPES和L-谷氨酰胺[Lonza，目录号BE12-115F]，补充有10％热灭活的含铁供体牛血清[DBSI；Gibco，目录号20731-030]和青霉素/链霉素[pen/strep；Lonza，目录号DE17-603E])。

抗CD3/CD28珠((Dynabeads^TMHuman T-Activator CD3/CD28；ThermoFisherScientific，目录号11132D)用PBS洗涤并重悬于T细胞培养基中。将珠以1:1比率添加到富集的人CD8⁺T细胞中，并在37℃、5％ CO2下温育48h。接下来，使用磁铁除去珠，将细胞在PBS中洗涤两次并再次计数。

使用IgG1-PD1(30μg/mL)和R-藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗人IgG F(ab’)₂(1:200稀释于GMB FACS缓冲液；Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)，或商业的PE缀合的PD-1抗体(BioLegend，目录号329906；1:50稀释)，通过流式细胞术证实活化的CD8⁺T细胞上的PD-1表达。

将活化的CD8⁺T细胞接种到圆底96孔板(30,000或50,000个细胞/孔)中，沉淀并重悬于30μL测定培养基(RPMI-1640，其含有25mM HEPES和L-谷氨酰胺，补充有0.1％[w/v]牛血清白蛋白级分V BSA；Roche，目录号10735086001]和青霉素/链霉素)。随后，将50μL的IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR、IgG1-CD52-E430G或IgG1-ctrl(在测定培养基中3倍稀释步骤中的1.7×10^-4–30μg/mL的终浓度)添加到每个孔中并在37℃下温育15min，以允许抗体与细胞结合。

将人血清(20μL/孔；Sanquin，批号20L15-02)作为C1q的来源添加至终浓度为20％。将细胞在冰上温育45min，然后用冷GMB FACS缓冲液洗涤两次，并在存在或不存在别藻蓝蛋白缀合的小鼠抗CD8的情况下(BD Biosciences，目录号555369；1:50稀释于GMBFACS缓冲液)，将细胞与50μL异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的兔抗人C1q(终浓度为20μg/mL[DAKO，目录号F0254]；1:75稀释于GMB FACS缓冲液)于4℃下在黑暗中温育30min。将细胞用冷GMB FACS缓冲液洗涤两次，重悬于补充有2mM乙二胺四乙酸(EDTA；Sigma-Aldrich，目录号03690)和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)活力染料(1:5,000；BDPharmingen，目录号564907)的20μL GMB FACS缓冲液中。C1q与活细胞的结合(如通过DAPI排除法所鉴定出的)通过流式细胞术在iQue Screener PLUS(Sartorius)或iQue3(Sartorius)上进行分析。使用GraphPad Prism软件使用非线性回归分析(具有可变斜率的S形剂量-响应)来分析结合曲线。

尽管观察到对于膜结合IgG1-CD52-E430G的剂量依赖性C1q结合，但没有观察到对于膜结合IgG1-PD1或对于非结合性对照抗体的C1q结合(图14)。

这些结果表明IgG1-PD1的功能惰性主链不结合C1q。

实施例12：通过SPR确定IgG1-PD1与Fcγ受体的结合

通过SPR体外评估IgG1-PD1与固定化FcγR(FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa)的结合。FcγRIIa(H131和R131)和FcγRIIIa(V158和F158)均包括两个多态性变体。作为FcγR结合的阳性对照，包括了具有野生型Fc区的IgG1-ctrl。

在第一个实验中，使用Biacore 8K SPR系统分析了IgG1-PD1或IgG1-ctrl与固定化人重组FcγR变体(FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa)的结合。在第二组实验中，使用相同的方法，分析了IgG1-PD1、纳武单抗(Bristol-Meyers Squibb，批号ABP6534)、派姆单抗(Merck Sharp&Dohme，批号U013442)、多塔利单抗(GlaxoSmithKline，批号U013442)、西米普利单抗(Regeneron，批号1F006A)、IgG1-ctrl或IgG4-ctrl的结合。

根据制造商的说明，使用胺偶联和His捕获试剂盒(Cytiva，目录号BR100050和目录号29234602)用抗组氨酸(His)抗体将Biacore Series S Sensor Chips CM5(Cytiva，目录号29104988)共价包被。将HBS-EP+(Cytiva，目录号BR100669)中稀释的FcγRIa、FcγRIIa(H131和R131)、FcγRIIb和FcγRIIIa(V158和F158)(SinoBiological，目录号分别为10256-H08S-B、10374-H08H1、10374-H27H、10259-H27H、10389-H27H1和10389-H27H)捕获到抗His包被的传感器芯片的表面上，其中流速为10μL/min并且接触时间为60秒，以导致约350–600个共振单位(RU)的捕获水平。

在HBS-EP+缓冲液的三个启动循环后，注射测试抗体(IgG1-PD1、纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗、西米普利单抗、IgG1-ctrl或IgG4-ctrl)以生成结合曲线，使用范围如表22中所示的抗体。在具有捕获的FcγR的表面(活性表面)上分析的每个样品，也在没有捕获的FcγR的平行流动孔(参考表面)上进行分析，其用于背景校正。从其他传感图中减去包含作为(模拟品)分析物的HBS-EP+的第三个启动循环，以产生双参考数据。

在每个循环结束时，使用10mM甘氨酸-HCl pH1.5(Cytiva，目录号BR100354)再生表面。使用Biacore Insight Evaluation软件(Cytiva)生成传感图，并将四参数逻辑拟合应用于终点测量(结合平台与捕获后基线)。第一个实验的数据(n＝1；定量的SPR测定)如图15中所示；第二组实验(n＝3)的数据如图16中所示。

表22.与个体FcγR的结合的测试条件

第一个实验的结果显示出IgG1-ctrl与所有FcγR的结合，而没有观察到IgG1-PD1与FcγRIa、FcγRIIa(H131和R131)、FcγRIIb和FcγRIIIa(V158和F158)的结合(图15)。

第二组实验的结果证实了IgG1-PD1缺乏FcγR结合(图16)。IgG4-ctrl和测试的其他抗PD-1抗体(纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗；所有IgG4亚类)表现出与FcγRIa、FcγRIIa-H131、FcγRIIa-R131和FcγRIIb的明显结合，和与FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158的极小至非常极小的结合。

这些数据证实FcγR缺乏与IgG1-PD1的Fc域的结合，并证明FcγR与纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗的结合。综上所述，这些数据表明IgG1-PD1的Fc域不能诱导FcγR介导的效应器功能(ADCC、ADCP)。

实施例13：如通过流式细胞术所确定的IgG1-PD1与细胞表面表达的FcγRIa的结合

使用流式细胞术分析IgG1-PD1、纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗与人细胞表面表达的FcγRIa的结合。

FcγRIa在瞬时转染的CHO-S细胞上表达，并使用FITC缀合的抗FcγRI抗体(BioLegend，目录号305006；1:25)通过流式细胞术证实细胞表面表达。如实施例6中所述评估抗PD-1抗体与转染的CHO-S细胞的结合。简而言之，IgG1-PD1、纳武单抗(Bristol-MeyersSquibb，批号ABP6534)、派姆单抗(Merck Sharp&Dohme，批号U013442)、多塔利单抗(GlaxoSmithKline，批号1822049)、西米普利单抗(Regeneron，批号1F006A)、IgG1-ctrl和IgG1-ctrl-FERR的抗体稀释物(终浓度：1.69×10^-4–10μg/mL，3倍稀释物)在GMB FACS缓冲液中制备。离心细胞，除去上清液，并将细胞(30,000个细胞的50μL溶液)用50μL的抗体稀释物于4℃温育30min。用GMB FACS缓冲液洗涤细胞两次，并与50μL二抗(PE缀合的山羊抗人IgG F(ab’)₂；1:500)于4℃避光温育30min。用GMB FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬于补充有2mM EDTA和DAPI活力标志物(1:5,000)的GMB FACS缓冲液中。

使用FlowJo软件通过门控PE阳性、DAPI阴性细胞，在Intellicyt iQue PLUSScreener(Intellicyt Corporation)上通过流式细胞术分析与活细胞结合的抗体。使用GraphPad Prism中的非线性回归分析(四参数剂量-响应曲线拟合)分析结合曲线。

在流式细胞术结合测定中，阳性对照抗体IgG1-ctrl(具有野生型Fc区)显示出与瞬时表达FcγRIa的细胞结合，而阴性对照抗体IgG1-ctrl-FERR(具有包含FER惰性突变和在本研究中功能无关的额外地突变K409R突变的Fc区)未观察到结合(图17)。未观察到IgG1-PD1的结合，而观察到派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗和多塔利单抗的浓度依赖性结合。

这些数据证实FcγRIa缺乏与IgG1-PD1的Fc域的结合，并证明FcγRIa与纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗的结合。综上所述，这些数据表明IgG1-PD1的Fc域不能诱导FcγRIa介导的效应器功能。

实施例14：通过IgG1-PD1与新生儿Fc受体的结合

新生儿Fc受体(FcRn)通过保护IgG免遭降解负责IgG的长的血浆半衰期。IgG在酸性(pH 6.0)内体环境中与FcRn结合，但在中性pH(pH 7.4)下从FcRn解离。抗体与FcRn的这种pH依赖性结合导致抗体连同FcRn一起的回收，防止细胞内抗体降解，并且因此是该抗体体内药代动力学的指示物。在pH 6.0和pH 7.4下通过表面等离子体共振(SPR)体外评估IgG1-PD1与固定化FcRn的结合。

使用Biacore 8K SPR系统分析IgG1-PD1与固定化人FcRn的结合。根据制造商的说明，使用胺偶联和His捕获试剂盒(Cytiva，目录号BR100050和目录号29234602)用抗组氨酸(His)抗体共价包被Biacore Series S Sensor Chips CM5(Cytiva，目录号29104988)。将在PBS-P+缓冲液pH 7.4(Cytiva，目录号28995084)或具有调整至6.0的pH的PBS-P+缓冲液(通过添加盐酸[Sigma-Aldrich，目录号07102])中稀释至5nM包被浓度的FcRn(SinoBiological，目录号CT071-H27H-B)捕获到抗His包被的传感器芯片的表面上，其中流速为10μL/min，并且接触时间为60秒。这导致约50RU的捕获水平。在pH 6.0或pH 7.4PBS-P+缓冲液的三个启动循环后，注射测试抗体(6.25-100nM两倍稀释系列的IgG1-PD1、派姆单抗(MSD，批号T019263)或纳武单抗(Bristol-Myers Squibb，批号ABP6534)的pH 6.0或pH7.4PBS-P+缓冲液溶液)以生成结合曲线。在具有捕获的FcRn的表面(活性表面)上分析的每个样品，也在没有捕获的FcRn的平行流动孔(参考表面)上进行分析，其用于背景校正。从其他传感图中减去包含作为(模拟品)分析物的HBS-EP+的第三个启动循环，以产生双参考数据。在每个循环结束时，使用10mM甘氨酸HCl pH 1.5(Cytiva，目录号BR100354)再生表面。使用Biacore Insight Evaluation软件(Cytiva)中预定义的“使用捕获的多循环动力学”评价方法分析数据。数据基于具有技术重复的三个单独的实验。

在pH 6.0下，IgG1-PD1以50nM的平均亲和力(K_D)结合FcRn(表23)，这与具有野生型Fc区的IgG1-ctrl抗体相当(据报道野生型IgG1分子具有很宽范围的亲和力；在使用相同的测定设置的先前的内部实验中，在12个数据点中IgG1-ctrl的平均K_D值测得为34nM，)。派姆单抗和纳武单抗的亲和力大约低两倍(K_D分别为116nM和133nM)。在pH7.4下未观察到FcRn结合(未显示)。综上所述，这些结果证明IgG1-PD1 Fc区的FER惰性突变不影响FcRn结合，并表明IgG1-PD1将保留典型的IgG体内药代动力学特性。

表23.如通过SPR确定的FcRn亲和力

通过SPR分析IgG1-PD1、派姆单抗和纳武单抗与包被有人FcRn的传感器芯片的结合。平均亲和力和SD基于具有技术重复的三个独立测量。

实施例15：不存在靶标结合的情况下的IgG1-PD1的药代动力学分析

在小鼠中分析了IgG1-PD1的药代动力学特性。PD-1主要在活化的B细胞和T细胞上表达，并且因此，其表达预期仅限于缺乏成熟B细胞和T细胞的不荷有肿瘤的SCID小鼠。此外，IgG1-PD1显示出与瞬时过表达小鼠PD-1的细胞的显著降低的交叉反应性(实施例6)。因此，不荷有肿瘤的SCID小鼠中IgG1-PD1的药代动力学(PK)特性预期反映IgG1-PD1在不存在靶标结合的情况下的PK特性。

本研究中的小鼠饲养在Central Laboratory Animal Facility(Utrecht,theNetherlands)。将所有小鼠饲养在单独通风的笼中，其中随意提供食物和水。所有实验均符合从指令(2010/63/EU)翻译而来的Dutch动物保护法(WoD)，并得到Dutch CentralCommission对动物实验的批准并得到当地伦理委员会的批准。SCID小鼠(C.B-17/Hsd-Prkdc^scid,Envigo)用1或10mg/kg IgG1-PD1进行静脉内注射，每组使用3只小鼠。在抗体施用后10min、4h、1天、2天、8天、14天和21天从隐静脉或面颊静脉收集血液样品(40μL)。将血液收集到含有K₂-乙二胺四乙酸的小瓶中，并储存在–65℃直至确定抗体浓度。

通过总人IgG(hIgG)电化学发光免疫测定(ECLIA)，确定了特定的hIgG浓度。MesoScale Discovery(MSD)标准板(96孔MULTI-ARRAY板，目录号L15XA-3)用在PBS(Lonza，目录号BE17-156Q)中稀释的小鼠抗hIgG捕获抗体(IgG2amm-1015-6A05)在2-8℃下包被16-24h。在用PBS-Tween(PBS-T；补充有0.05％(w/v)Tween-20[Sigma，目录号P1379])洗涤板以除去未结合的抗体后，在RT下将未占据的表面封闭60±5min(补充有3％(w/v)Blocker-A[MSD，目录号R93AA-1]的PBS-T)，然后用PBS-T洗涤。小鼠血浆样品最初在测定缓冲液(补充有1％(w/v)Blocker-A的PBS-T)中稀释50倍(2％小鼠血浆)。为了产生参考曲线，将IgG1-PD1(与用于注射的材料同一批次)在Calibrator Diluent(2％小鼠血浆[K₂EDTA，合并的血浆，BIOIVT，目录号MSE00PLK2PNN]的测定缓冲液溶液)中稀释(测量范围：0.156–20.0μg/mL；锚点：0.0781和40.0μg/mL])。为了容纳样品中存在的预期的较宽范围的抗体浓度，将样品在Sample Diluent(2％小鼠血浆的测定缓冲液溶液)中额外稀释1:10或1:50。将包被和封闭的板与50μL稀释的小鼠样品、参考曲线样品和适当的质量控制样品(掺(spike)有IgG1-PD1的合并的小鼠血浆，覆盖参考曲线的范围)在RT下温育90±5min。用PBS-T洗涤后，将板与SULFO-TAG缀合的小鼠抗hIgG检测抗体IgG2amm-1015-4A01在RT下温育90±5min。用PBS-T洗涤后，通过添加Read Buffer(MSD GOLD Read Buffer，目录号R92TG-2)和使用MSDSector S600酶标仪在约620nm处测量光发射来可视化固定化抗体。使用SoftMax Pro GxPSoftware v7.1进行分析数据处理。不允许外推低于运行定量下限(LLOQ)或高于定量上限(ULOQ)。

在不存在靶标结合的情况下，IgG1-PD1的血浆清除概况与通过基于人中IgG1清除的二室模型(Bleeker等人,2001,Blood.98(10):3136-42)预测的SCID小鼠中野生型人IgG1抗体的清除概况相当(图18)。没有注意到临床观察，也没有观察到体重减轻。

总之，这些数据表明，在不存在靶标结合的情况下，IgG1-PD1的PK特性与正常人IgG抗体的PK特性相当。

实施例16：人PD-1敲入小鼠中IgG1-PD1的抗肿瘤活性

IgG1-PD1仅显示出与瞬时过表达小鼠PD-1的细胞的有限结合(实施例6)。因此，为了评估IgG1-PD1的体内抗肿瘤活性，使用了工程化以在小鼠PD-1基因座中表达人PD-1细胞外域(ECD)的C57BL/6小鼠(hPD-1敲入[KI]小鼠)。

所有动物实验均在Crown Bioscience Inc.进行，并在执行前得到其Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)的批准。根据Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)的规定所定义的良好动物实践饲养和处理动物。7-9周龄的C57BL/6背景雌性纯合人PD-1敲入小鼠(hPD-1KI小鼠；Beijing Biocytogen Co.,Ltd；C57BL/6-Pdcd1^tm1(PDCD1)/Bcgen，库存号110003)，在右下胁腹中用同基因MC38结肠癌细胞(1×10⁶个细胞)进行皮下(SC)注射。使用卡尺评价肿瘤生长(随机化后每周三次)，并从卡尺测量将肿瘤体积(mm³)计算为：肿瘤体积＝0.5×(长度×宽度²)，其中长度是最长的肿瘤尺寸，并且宽度是垂直于长度的最长肿瘤尺寸。当肿瘤已经达到约60mm³的平均体积时(表示为第0天)，基于肿瘤体积和体重对小鼠进行随机化(每组9只小鼠)。治疗开始时，用0.5、2或10mg/kg IgG1-PD1或派姆单抗(由Crown BioscienceInc.从Merck获得，批号T042260)，或用10mg/kg同种型对照抗体IgG1-ctrl-FERR对小鼠进行静脉内注射(IV；给药体积10mL/kg的PBS溶液)。随后的剂量腹膜内(IP)施用。使用每周两剂持续三周的给药方案(2QW×3)。每天监测动物的发病率和死亡率，并常规监测其他临床观察。当肿瘤体积超过1,500mm³或当动物达到其他人道终点时，个体小鼠的实验结束。

为了比较各组之间的无进展生存，将曲线拟合应用于个体肿瘤生长图，以确立每只小鼠超过500mm³的肿瘤体积的进展日。将这些日值绘制在Kaplan-Meier生存曲线中，并用于使用SPSS软件在个体曲线之间进行Mantel-Cox分析。

在所有组仍然完整的最后一天(即直到研究中第一次与肿瘤相关的死亡，即第11天)，使用非参数Mann-Whitney分析(在GraphPad Prism中)比较各组之间肿瘤体积中的差异)。P值与中位数值(每组)一起呈现，该中位数值包括中位数中的差异的95％置信区间(Hodges Lehmann)。

小鼠没有显示出疾患的体征，但发现两只小鼠死亡(一只在2mg/kg IgG1-PD1组，一只在2mg/kg派姆单抗治疗组)。这些死亡的原因没有确定。

用IgG1-PD1和派姆单抗的治疗在所有测试剂量下均抑制肿瘤生长(图19A)。在第11天，即所有治疗组均完整的最后一天，在所有测试剂量下，用IgG1-PD1或派姆单抗治疗的小鼠中的肿瘤均显著小于用10mg/kg IgG1-ctrl-FERR治疗的小鼠中的肿瘤(图19B)。此外，在10mg/kg下，用IgG1-PD1治疗的小鼠中的肿瘤体积显著小于用同等剂量的派姆单抗治疗的小鼠中的肿瘤体积(Mann-Whitney检验，p＝0.0188)。

与用10mg/kg IgG1-ctrl-FERR治疗的小鼠相比，用IgG1-PD1或派姆单抗的治疗在所有测试剂量下显著增加了无进展生存(PFS)(图19C)。在10mg/kg下，与用派姆单抗治疗的小鼠相比，用IgG1-PD1治疗的小鼠中的无进展生存显著延长(中位PFS10mg/kg IgG1-PD1：20.56天，中位PFS10mg/kg派姆单抗：13.94天；P值＝0.0021)。

总之，IgG1-PD1在荷有MC38肿瘤hPD-1KI小鼠中展示出有力的抗肿瘤活性。

实施例17：同种异体MLR测定中GEN1046与IgG1-PD1组合对IL-2分泌的效应

为了分析GEN1046与IgG1-PD1的组合是否可以导致在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中相对于单一药剂的活性增强细胞因子的产生，在存在单独的GEN1046、单独的IgG1-PD1或两种抗体的组合的情况下，将人成熟树突状细胞(mDCs)和CD8⁺ T细胞的两个独特的同种异体对进行共培养。使用IL-2特异性免疫测定评估共培养物的上清液中的白细胞介素(IL)-2分泌。

方法

来自健康供体的单核细胞和T细胞

CD14⁺单核细胞和纯化的CD8⁺ T细胞获得自BioIVT。两个独特的同种异体供体对用于MLR测定。

单核细胞分化至未成熟树突状细胞

人CD14⁺单核细胞获得自健康供体。为了分化至未成熟树突状细胞(iDC)，将1-1.5×10⁶个单核细胞/mL在T25培养瓶(Falcon，目录号353108)中补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco，目录号16140071)、100ng/mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；BioLegend，目录号766106)和300ng/mL白细胞介素4(IL-4；BioLegend，目录号766206)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640完全培养基(ATCC改良配方；ThermoFisher，目录号A1049101)中于37℃培养六天。四天后，用新鲜培养基和补充物替换培养基。

iDC到mDC的成熟

在开始MLR测定之前，iDC通过收集非贴壁细胞来收获，并通过在补充有10％ FBS、100ng/mL GM-CSF、300ng/mL IL-4和5μg/mL脂多糖(LPS；ThermoFisher，目录号00-4976-93)的RPMI 1640完全培养基中以1-1.5×10⁶个细胞/mL在37℃下培养24h来分化至成熟DC(mDC)。

混合淋巴细胞反应(MLR)

MLR测定开始前一天，将从同种异体健康供体获得的纯化CD8⁺T细胞解冻，以1×10⁶个细胞/mL重悬于补充有10％ FBS和10ng/mL IL-2的RPMI 1640完全培养基中(BioLegend，目录号589106)并在37℃下培养过夜。

第二天，收获LPS成熟的树突状细胞(mDC，参见iDC的成熟)和同种异体的纯化的CD8⁺T细胞，并分别以4×10⁵个细胞/mL和4×10⁶个细胞/mL重悬于AIM-V培养基(ThermoFisher，目录号12055091)中。

共培养物以1:10的DC:T细胞比率接种，这对应于20,000个mDC与200,000个同种异体纯化的CD8⁺T细胞一起温育，并在96孔圆底板(Falcon，目录号353227)中在AIM-V培养基中，在存在作为单一药剂的IgG1-PD1(1μg/mL)、研究-级派姆单抗(1μg/mL，Seleckchem，目录号A2005(临床产品派姆单抗的非临床/研究级版本)、作为单一药剂的GEN1046(0.001至30μg/mL)，或两种药物组合的情况下在37℃培养5天。将用bsIgG1-PD-L1x对照(30μg/mL)、bsIgG1-ctrlx4-1BB(30μg/mL)、IgG4(Biolegend，目录号403702)、IgG1-ctrl-FERR(100μg/mL)或IgG1-ctrl-FEAL(30μg/mL)治疗的共培养物包括为对照。5天后，将板以500×g离心5min，并将上清液小心地从每个孔转移到新的96孔圆底板。

将从MLR测定中收集的上清液作为Milliplex MAP-人细胞因子/趋化因子磁珠组(Millipore Sigma，目录号HCYTOMAG-60K-08)的一部分在Luminex FLEXMAP 3D仪器上分析IL-2水平。

表24：

¹基于抗HIV gp120抗体IgG1-b12(Barbas等人,1993,J Mol Biol 230:812-823)的对照结合部分

结果

与非结合对照抗体相比，单独使用GEN1046、派姆单抗或者IgG1-PD1的治疗增强IL-2的分泌。与单独的GEN1046或者IgG1-PD1相比，GEN1046与1μg/mL IgG1-PD1的组合进一步增强了IL-2的分泌(图20)。作为单一药剂，GEN1046显示出浓度依赖性响应，而IL-2诱导峰值为0.1-1μg/mL。在所有浓度的GEN1046中均观察到通过1μg/mL IgG1-PD-1或1μg/mL派姆单抗的IL-2产生的增强。

结论

这些结果表明，在mDC/CD8⁺T细胞MLR测定中，相对于单一药剂活性，将GEN1046和IgG1-PD1组合增强IL-2分泌。

实施例18：确定GEN1046与IgG1-PD1组合增强T细胞增殖和细胞因子分泌的能力的抗原特异性刺激测定。

为了确定GEN1046与IgG1-PD1组合增强T细胞增殖的能力，使用过表达PD1的人CD8⁺T细胞和表达同源抗原的未成熟树突状细胞(iDC)的共培养物进行了抗原特异性刺激测定。评估共培养物的上清液中的细胞因子浓度。

方法

细胞分离以及单核细胞至未成熟树突状细胞的分化

HLA-A*02⁺外周血单核细胞(PBMC)获得自健康供体(Transfusionszentrale,University Hospital,Mainz,Germany)。根据制造商的说明，使用抗CD14微珠MicroBeads(Miltenyi；目录号130-050-201)通过磁活化细胞分选(MACS)技术从PBMC中分离出单核细胞。冷冻保存外周血淋巴细胞(PBL，CD14阴性级分)以用于CD8⁺T细胞分离。为了分化成iDC，将1×10⁶个单核细胞/mL在含有5％合并的人血清(One Lambda Inc.，目录号A25761)、1mM丙酮酸钠(Life Technologies GmbH，目录号11360-039)、1x非必需氨基酸(LifeTechnologies GmbH，目录号11140-035)、200ng/mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；Miltenyi，目录号130-093-868)和200ng/mL白细胞介素4(IL-4；Miltenyi，目录号130-093-924)的RPMI 1640(Life Technologies GmbH，目录号61870-010)中培养5天。第3天，用含有补充物的新鲜培养基替换一半培养基。通过收集非贴壁细胞收获iDC，并通过与含有2mMEDTA的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)在37°下温育10min来分离贴壁细胞。用DPBS洗涤后，将iDC冷冻保存在含有10％ DMSO(AppliChem GmbH，目录号A3672,0050)的FBS(Sigma-Aldrich，目录号F7524)中，以用于将来用于抗原特异性T细胞测定。

iDC和CD8⁺T细胞的电穿孔以及CFSE标记

在抗原特异性CD8^+T细胞刺激测定开始前一天，将来自同一供体的冷冻的PBL和iDC解冻。根据制造商的说明，使用抗CD8 MicroBead(Miltenyi，目录号130-045-201)通过MACS技术从PBL中分离出CD8⁺T细胞。约10×10⁶至15×10⁶个CD8⁺T细胞用250μL X-Vivo15培养基(Lonza，目录号BE02-060Q)中的10μg的编码对人密蛋白6(CLDN6；HLA-A*02限制性的；描述于WO 2015150327A1中)特异的鼠TCR的α和β链的体外转录的(IVT)-RNA加10μg编码人PD1(UniProt Q15116)的IVT-RNA进行电穿孔。将细胞转移至4-mm电穿孔比色皿(VWRInternational GmbH，目录号732-0023)并使用BTX 830Electroporation System(BTX；500V，3ms脉冲)进行电穿孔。电穿孔后，立即将细胞转移到含有5％合并的人血清的新鲜IMDM GlutaMAX培养基(Life Technologies GmbH，目录号319800-030)中，并在37℃、5％CO₂下静置至少1小时。根据制造商的说明，使用PBS中的0.8μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Life Technologies GmbH，目录号V12883)标记T细胞，并在补充有5％人AB血清的IMDM培养基中温育过夜。

使用如上所述的电穿孔系统(300V，12ms脉冲)，在250μL X-Vivo15培养基中用2μg编码全长人CLDN6的IVT-RNA(WO 2015150327 A1)电穿孔多至5×10⁶个解冻的iDC，并在补充有5％合并的人血清的IMDM培养基中温育过夜。

第二天，收获细胞。通过流式细胞术证实iDC上CLDN6的细胞表面表达，以及T细胞上CLDN6特异性TCR和PD1的细胞表面表达。为此，iDC使用荧光标记的CLDN6特异性抗体(非市售的；内部生产)进行染色。T细胞用亮紫(BV)421缀合的抗小鼠TCR-β链抗体(BectonDickinson GmbH,cat.no.562839)和别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗人PD1抗体(ThermoFisherScientific，目录号17-2799-42)进行染色。

抗原特异性体外T细胞刺激测定

在96孔圆底板中在含有5％合并的人血清的IMDM培养基中，在存在IgG1-PD1(0.8μg/mL)、临床级派姆单抗(Merck Sharp&Dohme GmbH,PZN 10749897)(0.8μg/mL)或阴性对照抗体IgG1-ctrl-FERR(0.8μg/mL)(单独或者与GEN1046(0.0022、0.0067或0.2μg/mL)组合)的情况下，将电穿孔的iDC与电穿孔的CFSE标记的CD8⁺T细胞以1:10的比率进行温育。4天的培养后，细胞用APC缀合的抗人CD8抗体进行染色。使用BD FACS CelestaTM流式细胞仪(Becton Dickinson GmbH)通过CD8⁺T细胞中的CFSE稀释度(dilution)的流式细胞术分析来评价T细胞增殖。

使用FlowJo软件第10.7.1版分析流式细胞术数据。使用FlowJo中的增殖建模工具评估CD8⁺T细胞的CFSE标记稀释度，并使用积分公式计算扩增指数。

细胞因子浓度的确定

按照制造商的方案，使用定制的U-Plex生物标志物组1(人)测定法来检测10种人细胞因子的组(GM-CSF、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、干扰素[IFN]-γ、IFN-γ诱导蛋白[IP]-10[也称为C-X-C基序趋化因子配体10]、巨噬细胞趋化蛋白[MCP]-1和肿瘤坏死因子[TNF]-α；Meso Scale Discovery，目录号K15067L-2)，通过多重电化学发光免疫测定来确定已经从4天后的T细胞/iDC共培养物收集的上清液中的细胞因子浓度。

表25：

结果

与GEN1046与IgG1-ctrl-FERR组合相比以及与作为单一治疗的IgG1-PD1相比，GEN1046和IgG1-PD1的组合治疗增强了CD8⁺T细胞增殖(图21)。与单独的GEN1046相比，在所有浓度的GEN1046与IgG1-PD1组合中均观察到增加的增殖。与作为单一药剂的两种化合物相比，派姆单抗和GEN1046的组合治疗也增强了增殖。

与GEN1046与IgG1-ctrl-FERR组合相比以及与作为单一治疗的IgG1-PD1相比，用GEN1046和IgG1-PD1进行的组合治疗增强了促炎细胞因子GM-CSF、IFN-γ和IL-13的分泌(图22)。与单独的GEN1046相比，在所有浓度的GEN1046与IgG1-PD1组合中均观察到增加的细胞因子分泌。当中等浓度(0.0067μg/mL)或低浓度(0.0022μg/mL)GEN1046与IgG1-PD1组合时，检测到GEN1046单一药剂活性的显著增强。随着GEN1046浓度的增加，IgG1-PD1单一药剂活性的增强变得越来越明显。与作为单一药剂的两种化合物相比，派姆单抗和GEN1046的组合治疗也增强了细胞因子分泌。在低绝对浓度下检测到的其他测试的细胞因子的分泌，与单一疗法相比，组合没有持续增强或没有增强其他测试的细胞因子的分泌。

实施例19：用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1组合治疗后MC38小鼠结肠癌肿瘤长出中的抗肿瘤活性

目标：为了调查mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB抗体单独或者与抗mPD-1抗体组合在C57BL/6小鼠的MC38结肠癌模型中的抗肿瘤活性。

方法

MC38小鼠结肠癌细胞在补充有10％热灭活胎牛血清的Dulbecco’s ModifiedEagle Medium中在37℃、5％ CO₂下培养。从对数期中生长的细胞培养物中收获MC38细胞并进行定量。

将MC38细胞(于100μL PBS的1×10⁶个肿瘤细胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右下胁腹(获得自Shanghai Lingchang Biotechnology Co.,Ltd and Services；实验开始时年龄为6-8周)。

当肿瘤已经达到60mm³的平均体积时起始治疗。将小鼠随机化到具有相等的治疗前平均肿瘤体积的组(n＝10只/组)。在治疗日(每周两剂，持续三周[2QW×3])，以10μL/g体重的注射体积用表26中所示的抗体腹膜内注射小鼠。对于组合治疗，抗体在两次单独注射中进行注射，其中间隔20min(表26)。剂量水平基于在MC38小鼠模型中对这些抗体的先前的经验。

每天监测小鼠的疾患的临床体征。随机化后每周进行三次体重测量。抗体及其组合具有良好的耐受性，因为小鼠在治疗后显示出极小的体重减轻(<20％)，而不是体重中的增加。当肿瘤体积超过1500mm³或当动物达到人道终点时(例如，当小鼠显示出体重减轻＞20％时、当肿瘤显示出溃疡[>75％]时、当观察到严重的临床体征时和/或当肿瘤生长阻碍小鼠的身体活动时)对该个体小鼠终止实验。

抗体治疗后显示出肿瘤的完全消退的小鼠在治疗起始后121天再次用MC38肿瘤细胞攻击。在原始肿瘤细胞接种的另一侧，用1×10⁶个新鲜MC38肿瘤细胞接种小鼠。作为肿瘤长出的对照治疗，用来自同一细胞培养物的MC38肿瘤细胞接种一组年龄匹配的未处理的C57BL/6小鼠(n＝6)。

表26.治疗组和给药方案

^a首先注射mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB，并且20min后注射二抗

结果

在用非结合对照抗体mIgG2a-ctrl-AAKR(5mg/kg；图23A)治疗的荷有MC38的小鼠中观察到快速肿瘤长出。

在用作为单一药剂的抗小鼠PD-1抗体(抗mPD-1；10mg/kg)或mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB(5mg/kg；图23A)进行治疗的小鼠中，观察到延迟的肿瘤长出，其中由mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB诱导的肿瘤长出更明显的延迟。在用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB(5mg/kg)组合抗mPD-1(10mg/kg；两者均为2QW×3)治疗的小鼠中，与单独的每种药剂相比，肿瘤长出进一步延迟(图23A)，并且在治疗开始后第23天，在4/10只小鼠中观察到肿瘤完全消退(与单独的mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1分别在1/10只和0/10只小鼠中观察到的肿瘤完全消退相比；表28)，这表明组合的协同活性。Kaplan-Meier分析显示，当与对照抗体治疗组相比时(p<0.001)和与单独的任一抗体相比时(p<0.05；Mantel-Cox；图23B，表27)，用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1的组合进行治疗，导致了无进展生存(定义为具有小于500mm³的肿瘤体积的小鼠的百分比)中的显著增加。因此，观察到该组合的治疗性协同作用，这定义为相对于每种药剂作为单一疗法所显示的活性具有优越的(p<0.05)抗肿瘤功效。

肿瘤完全消退的小鼠，例如在观察时段的持续时间中，肿瘤完全消失的小鼠(表28)，用MC38肿瘤细胞(再)攻击，该MC38细胞在用抗体进行的治疗起始后第121天SC注射。同时，六只年龄匹配的未用肿瘤处理的小鼠的对照组用MC38肿瘤细胞进行皮下注射。在所有未处理的小鼠中，在肿瘤接种后第24天，MC38肿瘤长出至1,500mm³，而在再攻击后35天(用MC38肿瘤细胞进行的原始接种后156天)的整个随访期期间，再攻击小鼠中没有观察到肿瘤长出，这与免疫记忆的发展一致(图24)。

表27.在C57BL/6小鼠MC38模型中，由mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB、抗mPD-1或其组合诱导的无进展生存的Mantel-Cox分析

¹肿瘤体积<500mm³用作无进展生存的截止值。在第69天进行Mantel-Cox分析。

²Ap值<0.05被视为显著的

表28.荷有MC38肿瘤的小鼠治疗后肿瘤完全消退。

实施例20：用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1抗体组合治疗的荷有MC38肿瘤的小鼠的外周血中的细胞因子分析

目标：为了调查单独使用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB或与抗mPD-1抗体组合治疗的荷有MC38肿瘤的C57BL/6小鼠的外周血中的细胞因子水平。

方法

在实施例19中所述的实验中，在以下时间点从荷有MC38肿瘤的C57BL/6小鼠收集血液样品：治疗起始后第-1天(基线；用第一剂进行治疗之前一天)、第2天(第一剂后2天)和第5天(第二剂后2天)。

根据制造商的说明，使用V-PLEX Proinflammatory Panel 1mouse Kit(MSD LLC，目录号K15048D-2)和V-PLEX Cytokine Panel 1mouse Kit(MSD LLC，目录号K15048D-2)在MESO QuickPlex SQ120仪器(MSD,LLC.R31QQ-3)上通过电化学发光(ECLIA)分析血浆样品中的细胞因子。

结果

在用作为单一药剂的mIgG2a-ctrl-AAKR(5mg/kg)或抗小鼠PD-1抗体(抗mPD-1；10mg/kg)治疗的小鼠中，与第-1天相比，在第2天或第5天观察到IFNγ、TNFα、IL-2和IP-10水平中没有变化或有轻微变化(图25)。在用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB(5mg/kg)治疗的小鼠中，IFNγ、TNFα、IL-2和IP-10的血浆水平在第2天增加，并在第5天进一步增强。在用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB(5mg/kg)和抗mPD-1(10mg/kg)组合治疗的小鼠中，相对于每种单一药剂，IFNγ、TNFα、IL-2和IP-10水平中的增加在第2天和/或第5天增强(图25)。在第5天，与mIgG2a-ctrl-AAKR和抗PD-1治疗组两者相比，用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1组合治疗的小鼠中的IFNγ、TNFα和IP-10水平高>3倍；并且与mbsIgG2-PD-L1×4-1BB治疗组相比，其TNFα和IP-10水平高>1.48倍(表29)。

这些结果为评价GEN1046与抗PD-1抗体的组合提供了基本原理，以进一步放大癌症患者中的抗肿瘤免疫应答。

表29.与单一药剂相比，应答于mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1的组合的细胞因子水平中的倍数变化

实施例21：mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1的组合经由不同且互补的免疫调节效应增强MC38小鼠结肠癌肿瘤模型中的抗肿瘤免疫

目标：如实施例19中所述，mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1组合在C57BL/6小鼠中的MC38结肠癌模型中显示出有力的抗肿瘤活性与持久的应答。因此，该模型用于进一步研究mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1组合的体内作用机制。用mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB、抗mPD-1或其组合治疗荷有MC38的小鼠。

方法

MC38结肠癌模型

收集来自两项独立研究的MC38小鼠结肠癌肿瘤进行免疫组织化学和流式细胞术评估，以表征作为单一疗法的mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1以及组合的mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1的体内活性。

如实施例19中所述建立MC38肿瘤模型。当肿瘤已经达到50-70mm³的肿瘤体积时，起始对荷有MC38皮下肿瘤的小鼠进行治疗。将小鼠随机化到具有相等的治疗前平均肿瘤体积的组中。在治疗日(每周两剂，持续两周[2QW×2])，以10μL/g体重的注射体积用表30中所示的抗体腹膜内注射小鼠。对于组合治疗，抗体在两次单独注射中进行注射，其中间隔20min(表30)。

每天监测小鼠的疾患的临床体征。随机化后每周进行三次体重测量。在起始治疗后第7天或第14天，对小鼠(每组n＝5只)进行安乐死以切除肿瘤。

表30.治疗组和给药方案

^a首先注射mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB，20min后注射二抗

肿瘤组织的免疫组织化学和原位杂交

将肿瘤解剖，固定在福尔马林中，石蜡包埋并切片(4μm)。为了进行组织学评估，将肿瘤切片脱蜡并使用Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer(Sakura)用Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit(Sakura[Torrance,CA],6190)进行染色。为了评价肿瘤之内的CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺细胞，将切片脱蜡并使用CC1缓冲液(Roche，950-124)恢复抗原，然后淬灭内源性过氧化物酶(Dako Agilent，S2003)，并使用Roche Ventana Discovery(DISC)自动染色机平台用封闭缓冲液(Roche，05268869001)封闭非特异性结合位点。将切片与一抗(列于表31中)进行温育，这些一抗使用如下的抗兔免疫组织化学检测试剂盒和用于抗HQ HRP多聚体(Roche，06442544001)的放大进行检测：对于CD3和CD4仅与抗兔DISCOmnimap((Roche,05269679001)进行温育，对于CD8依次与DISC抗兔HQ(Roche,07017812001)和DISC进行温育。根据制造商说明，使用3,3’-二氨基联苯胺(ChromoMapDAB；Roche,05266645001)对HRP进行可视化。为了评价肿瘤之内的PD-L1⁺细胞，将切片脱蜡并使用ER2缓冲液(Leica Biosystems，AR9640)恢复抗原，然后淬灭内源性过氧化物酶(Dako Agilent，S2003)，并使用Leica Bond Rx自动染色机平台用封闭缓冲液(LeicaBiosystems，DS9800)封闭非特异性结合位点。将切片与一抗(列于表31中)进行温育，这些一抗根据制造商的说明使用抗兔免疫组织化学检测试剂盒(Leica Biosystems，DS9800)来检测。为了评价肿瘤之内的4-1BB+和PD-L2+细胞，在Leica Bond Rx上使用相应的RNAscope探针(ACDBio，分别为493658和447788)和RNAscope检测试剂盒(ACDBio，322150)进行了RNAscope测定，以检测基因-特异性mRNA分子。在所有测定中，细胞核通过与Mayer苏木精进行温育来复染。通过在连续组织切片上掺入同种型、阳性和阴性对照染色来控制染色特异性。对染色的载玻片进行全载玻片成像(Zeiss、Axioscan)，并将整个载玻片图像上传至Halo软件(IndicaLabs，Albuquerque，NM)并使用预编程软件分析工具用Halo软件进行分析，以确定CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺和PD-L1⁺细胞(CytoNuclear v2.0.9)并确定4-1BB⁺和PD-L2⁺细胞(ISH v4.1.3)。随后将CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺和PD-L1⁺细胞的定量数据表示为标志物阳性细胞相对于总细胞数的百分比。通过创建四个RNAscope强度桶并使用以下公式计算H得分，将4-1BB⁺和PD-L2⁺细胞的定量数据表达为RNAscope H得分：H得分＝[(0x有0个点/细胞的细胞％)+(1x有1-3个点/细胞的细胞％)+(2x有4-9个点/细胞的细胞％)+(3x有10-15个点/细胞的细胞％)+(4x有>15个点/细胞的细胞％)]。

表31.用于免疫组织化学的抗体

肿瘤组织的流式细胞术

解离的肿瘤细胞用1μg/mL Mouse BD Fc Block^TM(Fc封闭缓冲液；BD，目录号553141)在4℃下，在黑暗中封闭10min。为了染色细胞表面标志物，将稀释于Fc封闭缓冲液中的表32中所述的荧光标记抗体混合物(除了Ki67和GzmB)添加到细胞，并在4℃下避光温育30min。为了进行胞内染色(Ki67和GzmB)，通过与稀释于Fix/Perm稀释缓冲液(1:4；eBioscience，目录号00-5223)中的200μL Fix/Perm浓缩液(eBioscience，目录号00-5123)在RT下避光温育30min来透化细胞。在透化缓冲液(eBioscience，目录号00-8333)中洗涤两次后，将细胞与稀释于透化缓冲液中的Ki67和GzmB抗体(表32)在RT下避光温育30min。最后，将细胞重悬于250μL FACS缓冲液(添加有10％ FBS[Gibco，目录号10099-141]和40mMEDTA[Boston BioProducts，目录号BM-711-K]的PBS)并在BD LSRFortessa^TM X20细胞分析仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)上进行测量。使用Kaluza Analysis Software分析数据。

表32.用于流式细胞术的抗体

靶标	标记¹	克隆	供应商	目录号
					CD45	BV785	30-F11	Biolegend	103149
CD3	BUV395	17A2	BD	740268
					CD4	BV510	GK1.5	Biolegend	100449
CD8	PE-eFluor610	53-6.7	eBiosciences	61-0081-82
					Ki67	PerCP/Cy5.5	SolA15	eBioscience	46-5698-82
GzmB	AF700	QA16A02	Biolegend	372222
					活/死	eFluor780	N/A	eBioscience	65-0865

结果&结论

在治疗起始后第7天和第14天，通过免疫组织化学(IHC)和原位杂交(ISH)评价肿瘤组织切片的T细胞亚群和靶标表达(图26)，并在治疗起始后第7天通过流式细胞术评价解离的肿瘤组织的Ki67⁺增殖性和GzmB⁺细胞毒性瘤内CD8⁺T细胞(图27)。

使用作为单一药剂的mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1的治疗增强肿瘤之内的CD3⁺细胞在治疗后第7天和第14天的百分比。mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1的组合进一步增加了CD3⁺细胞在第14天的百分比(图26A)。

在第7天，治疗组之间没有观察到CD4⁺细胞百分比中的差异。与此形成对比的是，与PBS治疗组相比，在第14天，用作为单一药剂的mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1的治疗增加了CD4⁺细胞的百分比，并且mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1的组合甚至进一步增强CD4⁺细胞的百分比(图26B)。

与PBS组相比，在第7天和第14天，mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB增加了CD8⁺细胞的百分比，但抗mPD-1没有增加。与单独的mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB相比，mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1组合显示出相似的CD8⁺细胞水平，这表明CD8⁺细胞的增加由mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB驱动(图26C)。

在第7天和/或第14天，与PBS治疗的小鼠相比，作为单一药剂的mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1增加了瘤内PD-L1和PD-L2表达。与此形成对比的是，mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1的组合并没有显示出这样的增加，因为瘤内PD-L1和PD-L2的水平与PBS治疗的小鼠中的水平相当(图26D-E)。最后，在第7天，mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB增加了4-1BB的肿瘤表达。相比之下，在第14天，作为单一药剂的抗mPD-1以及mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗mPD-1的组合降低了4-1BB的表达(图26F)。

在解离的肿瘤组织中，发现与每种单一药剂相比，mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1的组合显著增强了总体瘤内CD8⁺T细胞群之内GzmB⁺的百分比(图27A)，这表明增加的CD8 T细胞细胞毒性。类似地，与单独的每种单一药物相比，mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1的组合增强了总肿瘤浸润CD8⁺T细胞之内Ki67⁺的百分比(图27B)，这表明增加的CD8 T细胞增殖。

总之，这些结果表明，与用作为单一药剂的mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB或抗mPD-1的治疗相比，mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB和抗mPD-1的组合导致对肿瘤免疫组织(contexture)的不同且互补的调节。特别是，在mbsIgG2a-PD-L1×4-1BB与抗PD1组合治疗组中，更高频率的增殖性和细胞毒性CD8⁺TIL表明TIL的增强的功能和效应器功能可能与改善的抗肿瘤活性相关联。

Claims

其中当

a)所述与CD137结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:2、3和4中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ IDNO:6、7和8中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；并且

b)所述与PD-L1结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ ID NO:12、13和14中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ IDNO:16、17和18中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，

2.权利要求1使用的结合剂，其中PD-L1是人PD-L1，特别是包含SEQ ID NO:40中所示的序列的人PD-L1，和/或CD137是人CD137，特别是包含SEQ ID NO:38中所示的序列的人CD137。

3.权利要求1至3中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂是PD-1抗体。

4.权利要求1至4中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂是PD-1阻断性抗体。

5.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂是派姆单抗或其生物类似物。

6.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂是纳武单抗或其生物类似物。

7.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中

a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:1或9的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL包含SEQ ID NO:5或10的CDR1、CDR2和CDR3序列；

并且

b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ IDNO:11的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL包含SEQ ID NO:15的CDR1、CDR2和CDR3序列。

8.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中

a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含分别如SEQ IDNO:2、3和4中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VH包含分别如SEQ ID NO:6、7和8中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；并且

9.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中

所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区，所述VH包含与SEQ ID NO:1或9具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:5或10具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

10.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中

所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区，所述VH包含与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述VL包含与SEQ ID NO:15具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

11.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中

12.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ IDNO:15中所示的氨基酸序列。

13.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中

a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列；

并且

b)所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列。

14.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是多特异性抗体，诸如双特异性抗体。

15.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂为全长抗体或抗体片段的格式。

16.权利要求6-12中任一项使用的结合剂，其中每个可变区包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和四个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)。

17.权利要求13使用的结合剂，其中所述互补决定区和所述框架区从氨基末端至羧基末端按如下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

18.权利要求7-17中任一项使用的结合剂，其包含

19.权利要求7-18中任一项使用的结合剂，其包含

20.权利要求7-19中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是包含第一结合臂和第二结合臂的抗体，其中

所述第一结合臂包含

并且所述第二结合臂包含

21.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其包含

ii)第二重链和第二轻链，其包含所述能够与PD-L1结合的抗原结合区。

22.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂包含

i)第二重链和第二轻链，其包含所述能够与PD-L1结合的抗原结合区，所述第二重链包含第二重链恒定区并且所述第二轻链包含第二轻链恒定区。

23.权利要求18-22中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)的每个包含恒定重链1(CH1)区、铰链区、恒定重链2(CH2)区和恒定重链3(CH3)区中的一个或多个，优选至少包含铰链区、CH2区和CH3区。

24.权利要求18-23中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)的每个包含CH3区，并且其中所述两个CH3区包含不对称突变。

25.权利要求18-23中任一项使用的结合剂，其中在所述第一重链恒定区(CH)中，对应于选自由根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409组成的组的位置的位置中的至少一个氨基酸已经进行取代，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，对应于选自由根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409组成的组的位置的位置中的至少一个氨基酸已经进行取代，并且其中所述第一重链和所述第二重链不在相同位置进行取代。

26.权利要求25使用的结合剂，其中(i)在所述第一重链恒定区(CH)中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置中的氨基酸是R，或(ii)在所述第一重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置中的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置中的氨基酸是L。

27.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂与另一抗体相比以较小的程度诱导Fc介导的效应器功能，所述另一抗体包含相同的第一抗原结合区和第二抗原结合区以及两个包含人IgG1铰链、CH2区和CH3区的重链恒定区(CH)。

28.权利要求27使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区被修饰，使得所述抗体与除了包含未经修饰的第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)以外相同的抗体相比以较小的程度诱导Fc介导的效应器功能。

29.权利要求28使用的结合剂，其中所述未经修饰的第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)的每个包含SEQ ID NO:19或25中所示的氨基酸序列。

30.权利要求28或29使用的结合剂，其中所述Fc介导的效应器功能通过与Fcγ受体的结合、与C1q的结合或Fe介导的Fcγ受体的交联的诱导来测量。

31.权利要求30使用的结合剂，其中所述Fc介导的效应器功能通过与C1q的结合来测量。

32.权利要求27-31中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区和第二重链恒定区已经被修饰，使得C1q与所述抗体的结合与野生型抗体相比减少，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合优选通过ELISA测定。

33.权利要求18-32中任一项使用的结合剂，其中在所述第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区的至少一个中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置中的一个或多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。

34.权利要求33使用的结合剂，其中在所述第一重链和第二重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别是F和E。

35.权利要求33或34使用的结合剂，其中在所述第一重链恒定区和第二重链恒定区中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置分别是F、E和A。

36.权利要求33-35中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区和第二重链恒定区两者的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别是F和E，并且其中(i)所述第一重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L，并且所述第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，或(ii)所述第一重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，并且所述第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L。

37.权利要求33-36中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链恒定区和第二重链恒定区两者的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置分别是F、E和A，并且其中(i)所述第一重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L，并且所述第二重链恒定区的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，或(ii)所述第一重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，并且所述第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L。

38.权利要求18-37中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链和/或第二重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)如SEQ ID NO:19或25中所示的序列[IgG1-FC]；

39.权利要求18-38中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链或第二重链，诸如所述第二重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)如SEQ ID NO:20或26中所示的序列[IgG1-F405L]；

40.权利要求18-38中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链或第二重链，诸如所述第一重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)如SEQ ID NO:21或27中所示的序列[IgG1-K409R]；

41.权利要求18-37中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链和/或第二重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)如SEQ ID NO:22或28中所示的序列[IgG1-Fc_FEA]；

42.权利要求18-41中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链和/或第二重链，诸如所述第二重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)如SEQ ID NO:24或30中所示的序列[IgG1-Fc_FEAL]；

43.权利要求18-42中任一项使用的结合剂，其中所述第一重链和/或第二重链，诸如所述第一重链的恒定区包含选自下组的氨基酸序列或基本上由选自下组的氨基酸序列组成或由选自下组的氨基酸序列组成：

a)如SEQ ID NO:23或29中所示的序列[IgG1-Fc_FEAR]；

44.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂包含kappa(κ)轻链恒定区。

45.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂包含lambda(λ)轻链恒定区。

46.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区或lambda(λ)轻链恒定区。

47.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区或kappa(κ)轻链恒定区。

48.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区并且所述第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区，或所述第一轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区并且所述第二轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区。

49.权利要求44-48中任一项使用的结合剂，其中所述kappa(κ)轻链包含选自下组的氨基酸序列：

a)如SEQ ID NO:35中所示的序列，

50.权利要求45-49中任一项使用的结合剂，其中所述lambda(λ)轻链包含选自下组的氨基酸序列：

a)如SEQ ID NO:36中所示的序列，

51.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的同种型的。

52.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是全长IgG1抗体。

53.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是IgG1m(f)同种异型的抗体。

54.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂包含

55.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂是acasunlimab或其生物类似物。

56.根据前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂处于包含组氨酸、蔗糖和聚山梨酯-80并且具有5至6的pH的组合物或制剂中。

57.根据前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂处于包含约20mM组氨酸、约250mM蔗糖、约0.02％聚山梨酯-80并且具有约5.5的pH的组合物或制剂中。

58.根据前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂处于包含10-30mg结合剂/mL，诸如20mg结合剂/mL的组合物或配制剂中。

59.根据前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂处于如权利要求56至58中任一项所定义的组合物中并且在施用之前在0.9％NaCl(盐水)中稀释。

60.根据前述权利要求中任一项使用的结合剂，所述PD-1抑制剂是与PD-1结合的抗体，其中所述与PD-1结合的抗体包括包含分别如SEQ ID NO:104、101和100中所示序列的VH区CDR1、CDR2和CDR3，以及包含分别如SEQ ID NO:107、QAS和SEQ ID NO:105中所示序列的VL区CDR1、CDR2和CDR3。

61.根据权利要求60使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含与如SEQ ID NO:111中所示的VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。

62.根据权利要求60或61使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含如SEQ ID NO:111中所示的序列。

63.根据权利要求60-62中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO:112中所示的VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。

64.根据权利要求63使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含如SEQ ID NO:112中所示的序列。

65.根据权利要求60-64中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含或具有如SEQ ID NO:111中所示的序列，并且所述VL包含或具有如SEQ ID NO:112中所示的序列。

66.根据权利要求60-65中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置234的位置处的芳香族氨基酸或非极性氨基酸，和对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置236的位置处的不同于甘氨酸的氨基酸。

67.根据权利要求66使用的结合剂，其中对应于位置236的位置处的氨基酸是碱性氨基酸。

68.根据权利要求67使用的结合剂，其中所述碱性氨基酸选自由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成的组。

69.根据权利要求67或68使用的结合剂，其中所述碱性氨基酸是精氨酸(G236R)。

70.根据权利要求66-69中任一项使用的结合剂，其中对应于位置234的位置处的氨基酸是芳香族氨基酸。

71.根据权利要求70使用的结合剂，其中所述芳香族氨基酸选自由苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸组成的组。

72.根据权利要求66-69中任一项使用的结合剂，其中对应于位置234的位置处的氨基酸是非极性氨基酸。

73.根据权利要求72使用的结合剂，其中所述非极性氨基酸选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组。

74.根据权利要求72或73使用的结合剂，其中所述非极性氨基酸选自由异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组。

75.根据权利要求66-74中任一项使用的结合剂，其中对应于位置234的氨基酸是苯丙氨酸(L234F)。

76.根据权利要求66-75中任一项使用的结合剂，其中在所述与PD-1结合的抗体的所述重链恒定区中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置235的位置处的氨基酸是酸性氨基酸。

77.根据权利要求76使用的结合剂，其中所述酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

78.根据权利要求66-77中任一项使用的结合剂，其中在所述与PD-1结合的抗体的所述重链恒定区中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置235的位置处的氨基酸是谷氨酸(L235E)。

79.根据权利要求66-78中任一项使用的结合剂，其中在所述与PD-1结合的抗体的所述重链恒定区中，对应于位置234、235和236的位置处的氨基酸在位置234处是非极性或芳香族氨基酸、位置235处是酸性氨基酸并且位置236处是碱性氨基酸。

80.根据权利要求66-79中任一项使用的结合剂，其中在所述与PD-1结合的抗体的所述重链恒定区中，对应于位置234的氨基酸是苯丙氨酸，对应于位置235的氨基酸是谷氨酸，并且对应于位置236的氨基酸是精氨酸(L234F/L235E/G236R)。

81.根据权利要求60-80中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体的重链恒定区包含与如SEQ ID NO:93中所示的重链恒定区序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。

82.根据权利要求60-81中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体的重链恒定区包含如SEQ ID NO:93中所示的序列。

83.根据权利要求60-82中任一项使用的结合剂，其中与PD-1结合的抗体的重链恒定区的同种型是IgG1。

84.根据权利要求60-83中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或此类抗体的片段。

85.根据权利要求60-84中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体具有降低或消减的Fc介导的效应器功能。

86.根据权利要求60-85中任一项使用的结合剂，其中补体蛋白C1q与所述与PD-1结合的抗体的恒定区的结合与野生型抗体相比减少，优选减少了至少70％，至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

87.根据权利要求60-86中任一项使用的结合剂，其中一种或多种IgG Fc-γ受体与所述与PD-1结合的抗体的结合与野生型抗体相比减少，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

88.根据权利要求87使用的结合剂，其中所述一种或多种IgG Fc-γ受体选自Fc-γRI、Fc-γRII和Fc-γRIII中的至少一种。

89.根据权利要求87或88使用的结合剂，其中所述IgG Fc-γ受体是Fc-γRI。

90.根据权利要求60-89中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体不能诱导Fc-γRI介导的效应器功能，或者其中所述诱导的Fc-γRI介导的效应器功能与野生型抗体相比降低，优选降低了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

91.根据权利要求60-90中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体不能诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、细胞凋亡、同型黏附和/或吞噬作用中的至少一种，或者，其中补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、细胞凋亡、同型黏附和/或吞噬作用中的至少一种以减少的程度诱导，优选减少了至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％。

92.根据权利要求60-91中任一项使用的结合剂，其中与野生型抗体相比，新生儿Fc受体(FcRn)与所述与PD-1结合的抗体的结合不受影响。

93.根据权利要求60-92中任一项使用的结合剂，其中PD-1是人PD-1。

94.根据权利要求93使用的结合剂，其中所述PD-1具有或包含如SEQ ID NO:113或SEQID NO:114中所示的氨基酸序列，或PD-1的氨基酸序列与如SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:114中所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性，或是其免疫原性片段。

95.根据权利要求60-94中任一项使用的结合剂，所述与PD-1结合的抗体与存在于活细胞表面上的PD-1的天然表位结合。

96.根据权利要求60-95中任一项使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体是多特异性抗体，其包含与PD-1结合的第一抗原结合区和与另一种抗原结合的至少一个进一步的抗原结合区。

97.根据权利要求96使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的抗体是双特异性抗体，其包含与PD-1结合的第一抗原结合区和与另一种抗原结合的第二抗原结合区。

98.根据权利要求96或97使用的结合剂，其中所述与PD-1结合的第一抗原结合区包含如权利要求61至65任一项中所示的所述重链可变区(VH)和/或所述轻链可变区(VL)。

99.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述受试者是人受试者。

100.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是实体瘤或实体癌。

101.根据前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤是PD-L1阳性肿瘤。

102.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症选自下组：黑色素瘤、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、结直肠癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、尿路上皮癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、胸腺瘤和胸腺癌、脑癌、胶质瘤、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、其他皮肤癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、子宫内膜癌、前列腺癌、阴茎癌、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、梅克尔细胞癌和间皮瘤。

103.根据前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症选自下组：肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、尿路上皮癌(膀胱癌、输尿管癌、尿道癌或肾盂癌)、子宫内膜癌(EC)、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌(TNBC))和头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)(例如口腔癌、咽癌或喉癌)。

104.权利要求102或103使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)，诸如鳞状或非鳞状NSCLC。

105.权利要求100至104中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是转移性的，诸如转移性NSCLC。

106.权利要求104或105使用的结合剂，其中所述肺癌，特别是NSCLC，不具有表皮生长因子(EGFR)敏化性突变和/或间变性淋巴瘤(ALK)易位/ROS1重排。

107.权利要求104至106中任一项使用的结合剂，其中所述肺癌，特别是NSCLC，包含癌细胞并且PD-L1在≥1％的癌细胞或肿瘤细胞中表达，例如，如通过免疫组织化学(IHC)所评估的。

108.前述权利要求使用的结合剂，其中所述受试者未接受过转移性疾病的既往全身治疗。

109.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述受试者未接受过用检查点抑制剂的既往治疗；例如，PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。

110.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述受试者未接受过用4-1BB(CD137)靶向剂诸如抗4-1BB(CD137)抗体、用抗肿瘤疫苗，或用自体细胞免疫疗法的既往治疗。

111.权利要求1至107中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症在治疗后诸如用检查点抑制剂的全身治疗后已经复发和/或是难治的。

112.权利要求1至107和111中任一项使用的结合剂，其中所述受试者已经接受全身疗法的至少1条既往线，诸如包含PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的全身疗法。

113.权利要求1至107、111和112中任一项使用的结合剂，其中所述癌症或肿瘤已经复发和/或是难治的，或者所述受试者在用PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的治疗后已经进展，所述PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂作为单一疗法或作为组合疗法的一部分进行施用。

114.权利要求1至107和111至113中任一项使用的结合剂，其中末次既往治疗是用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体，所述PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂作为单一疗法或作为组合疗法的一部分进行施用。

115.权利要求1至107和111至114中任一项使用的结合剂，其中距用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的末次治疗进展的时间为8个月或更短，诸如7个月或更短、6个月或更短、5个月或更短、4个月或更短、3个月或更短、2个月或更短、1个月或更短、3周或更短或诸如2周或更短。

116.权利要求1至107和111至115中任一项使用的结合剂，其中距作为末次既往治疗的一部分的PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的末次给药的时间为8个月或更短，诸如7个月或更短、6个月或更短、5个月或更短、4个月或更短、3个月或更短、2个月或更短、1个月或更短、3周或更短或诸如2周或更短。

117.权利要求1至107和111至116中任一项使用的结合剂，其中所述癌症或肿瘤已经复发和/或是难治的，或者所述受试者在以下期间或之后已经进展：

i)用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的治疗之后的铂类双联化学疗法，或

ii)铂类双联化学疗法之后的用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的治疗。

118.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述受试者未接受过用紫杉烷化疗剂例如多西他赛的既往治疗，诸如用紫杉烷化疗剂例如多西他赛对NSCLC的既往治疗。

119.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂和所述PD-1抑制剂在至少一个治疗周期中施用，每个治疗周期为两周(14天)、三周(21天)、四周(28天)、5周(35天)或六周(42天)。

120.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中每两周(1Q2W)、每三周(1Q3W)、每四周(1Q4W)、每五周(1Q5W)或每六周(1Q6W)施用一剂所述结合剂和一剂所述PD-1抑制剂。

121.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中每六周(1Q6W)施用一剂所述结合剂和一剂所述PD-1抑制剂。

122.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中在每个治疗周期的第1天施用一剂所述结合剂和一剂所述PD-1抑制剂。

123.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的所述结合剂的量是100mg。

124.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的所述PD-1抑制剂的量是200mg。

125.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的所述PD-1抑制剂的量是400mg。

126.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中每三周(1Q3W)施用100mg剂量的所述结合剂和200mg剂量的所述PD-1抑制剂。

127.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中每六周(1Q6W)施用100mg剂量的所述结合剂和400mg剂量的所述PD-1抑制剂。

128.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是NSCLC；并且其中每三周(1Q3W)，诸如在每个三周治疗周期的第一天施用100mg剂量的所述结合剂和200mg剂量的所述PD-1抑制剂，所述结合剂为acasunlimab或其生物类似物，所述PD-1抑制剂为纳武单抗。

129.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中首先施用所述PD-1抑制剂，然后施用所述结合剂。

130.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂通过使用静脉内(IV)输注在最少30分钟内施用，诸如在最少60分钟内施用。

131.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述结合剂通过使用静脉内(IV)输注在30分钟内施用。

132.前述权利要求中任一项使用的结合剂，其中所述PD-1抑制剂作为静脉内输注在30分钟内施用。

其中当

134.权利要求133所述的试剂盒，其中所述结合剂如权利要求1、2和7-58中任一项所定义，和/或所述PD-1抑制剂如权利要求3至6和59-97中任一项所定义。

135.根据权利要求133或134所述的试剂盒，其中所述结合剂、所述PD-1抑制剂和如果存在的话一种或多种额外治疗剂用于全身施用，特别是用于注射或输注，例如静脉内注射或输注。

136.根据权利要求133-135中任一项所述的试剂盒，其用于在受试者中减少或预防肿瘤进展或治疗癌症的方法中。

137.根据权利要求136使用的试剂盒，其中所述肿瘤或癌症和/或所述受试者和/或所述方法如权利要求1-132中任一项中所定义。

其中

139.权利要求138所述的方法，其中所述肿瘤或癌症和/或所述受试者和/或所述方法和/或所述结合剂和/或所述PD-1抑制剂如权利要求1-132中任一项中所定义。