CN118290524A - 一种改善皮肤损伤或衰老的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种改善皮肤损伤或衰老的多肽PEP‑SKP，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本申请所述多肽PEP‑SKP针对Granzyme B蛋白靶点，在抑制Granzyme B的体内体外实验中显示良好的效果，可用于制备治疗具有改善皮肤损伤或衰老作用的药物。

Description

一种改善皮肤损伤或衰老的多肽及其应用

技术领域

本申请涉及一种改善皮肤损伤或衰老的多肽及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

Granzyme B(颗粒酶B，简写GzmB)是一种丝氨酸蛋白酶，是皮肤损伤、炎症和修复的重要介体。在健康皮肤中发现含有低含量的GzmB，但在慢性疾病和炎症皮肤(包括糖尿病性溃疡、肥厚性瘢痕、自身免疫性皮肤疾病、皮肤利什曼病和紫外线引起的皮肤老化与伤害)中GzmB的含量显着升高。GzmB是在生物功能和疾病领域研究最广泛的颗粒酶，主要是由CTL和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)分泌的蛋白酶，参与细胞凋亡的过程，是免疫细胞发挥抗肿瘤作用的重要因子。它可以通过细胞凋亡途径和非凋亡途径杀伤细胞。在细胞凋亡途径中，GzmB一方面通过直接激活caspase级联反应来诱导细胞凋亡的发生；另一方面还可以通过线粒体外膜的透化来间接激活caspase的级联反应从而引起细胞凋亡，杀灭许多已经对细胞毒性药物有抗性的肿瘤细胞，此酶以具有促细胞凋亡的功能而闻名。近些年的研究发现，GzmB涉及细胞外基质蛋白裂解、上皮屏障破坏、纤维化、血管通透性、失神经、炎症和自身免疫等其他生物活性。由此，GzmB在疾病中的作用已被扩展。GzmB介导的蛋白水解会影响诸如组织重塑、屏障功能、自身抗原生成和血管生成等过程。

在人类中，GzmB由染色体14q.11.2上的GZMB基因编码，该染色体长3.2kb，由5个外显子组成。GzmB酶最初是无活性的前体酶原形式，具有额外的氨基末端肽序列，该序列可以被组织蛋白酶C切割，去除2个氨基酸。GzmB的结构由两个6链β片层和3个反式结构域片段组成。在细胞毒性淋巴细胞颗粒中，该酶可以两种糖基化形式存在。高甘露糖形式重32kDa，复合形式重35kDa。GzmB在其活性位点含有催化三联体His-Asp-Ser，并优先在位于P1位的天冬氨酸残基后裂解。待切割的天冬氨酸残基与酶结合袋中的精氨酸残基结合。GzmB在中性pH下有活性，因此在酸性CTL颗粒中无活性。当与颗粒中的丝甘氨酸结合时，该酶也会失活，以避免在细胞毒性T细胞本身内部触发细胞凋亡。

由于缺乏内源性细胞外抑制剂，细胞外GzmB的积累由于持续的蛋白水解活性而对慢性伤口的正常愈合有害。因此，特异性GzmB抑制剂可以开发为新的治疗方法来治疗慢性、不愈合和/或者疾病引起的皮肤伤害。除了在伤口愈合中的应用之外，与颗粒酶B活性加剧相关的其他自身免疫和/或慢性炎症也可能受益于这些抑制剂的开发。然而，迄今为止尚未鉴定出细胞外GzmB的内源性抑制剂。因此，对于以局部和/或靶向方式阻断疾病分子驱动因素的新疗法存在迫切的需求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种小分子多肽PEP-SKP，多肽PEP-SKP针对Granzyme B蛋白靶点，在抑制Granzyme B的实验中显示良好的效果，可作为针对Granzyme B蛋白靶点的小分子多肽抑制剂，用于制备改善多种原因所致皮肤损伤或衰老的的药物。

作为本发明的第一个方面，本发明提供一种改善皮肤损伤或衰老的多肽PEP-SKP，所述多肽的氨基酸序列为：

Ala-Lys-Arg-Arg-Met-Ala-Pro-Thr-Trp-Pro-Phe(如SEQ ID NO：1所示)。

其中，所述氨基酸序列是从C端到N端，即多肽序列最左端的氨基酸残基Ala的游离基团是COOH或COO-，而多肽序列的最右端氨基酸残基Phe的游离残基是NH₂或者NH³⁺。

本发明所述多肽PEP-SKP可以采用本领域技术人员已知的方法(例如化学合成方法、生物学合成法)制备得到，以及可以采用本领域已知的分离纯化方法(例如高效液相色谱法)分离纯化。本发明所述多肽PEP-SKP首选化学合成方法来制备得到。

作为本发明的第二个方面，本发明提供所述多肽PEP-SKP的制备方法，该方法包括如下步骤：

采用固相合成法从C-端到N-端合成多肽，用Fmoc保护的氨基酸作为原料，以Fmoc-Rink linker resin树脂为附着基质，用HOBT作为缩合剂，DIC作为激活剂，逐层合成多肽；

合成过程中用2％乙酸酐的DMF溶液做侧链封闭试剂；用20％哌啶做Fmoc去除试剂，合成完毕经过TFA切割和侧链基团的去除操作；合成完毕的粗产物经离心收集，用HPLC色谱法纯化得到纯度大于99％的多肽，冻干成粉末；

在具体的实施方式中，所述HPLC色谱条件为：

流动相：流动相A：含三氟乙酸的水溶液；流动相B：含三氟乙酸的乙腈-水溶液；

洗脱程序：0-20min，流动相B(30％～40％)-(50％～60％)；

检测波长：200nm～260nm；

保留时间：8-15min。

优选的，流动相A为含0.1％～0.5％三氟乙酸的水溶液；流动相B：含0.1％～0.5％三氟乙酸的乙腈-水(75～85:25～15)溶液；

洗脱程序：0-20min，流动相B 36％-56％；

检测波长：220nm。

作为本发明的第三个方面，本发明提供所述多肽PEP-SKP作为Granzyme B蛋白抑制剂的应用。

在具体的实施方式中，所述多肽PEP-SKP在制备改善皮肤损伤或衰老的药物中的应用。

在具体的实施方式中，所述皮肤损伤或衰老由外部因素或疾病因素导致；具体的，所述外部因素包括紫外线、化学物质、物理因素、病菌感染或者/和药物过敏等；所述疾病因素包括糖尿病性溃疡、肥厚性瘢痕、自身免疫性皮肤疾病、皮肤利什曼病、银屑病、紫癜等。

在具体的实施方式中，所述多肽PEP-SKP在抑制皮肤损伤所致炎症反应中的应用。

在具体的实施方式中，所述多肽PEP-SKP在促进皮肤伤口愈合中的应用。

作为本发明的第四个方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括活性成分多肽PEP-SKP和药学上可接受的载体。

所述药物组合物包括但不限于注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂、凝胶制剂、乳剂等。

所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明所述多肽作为活性成分时应为“有效量”的，所述“有效量”是指无毒性，但足够量的提供所需的作用的药物或药剂。在本发明的药物组合物中，一种成分的“有效量”是指该成分在和其他成分联合应用时有效提供所需效应的量。“有效量”会因受试者的不同而不同，依据年龄和个体的一般情况，特定的活性药物等等。因此，不可能总是指精确的“有效量”，然而，任何个体病例中合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员应用常规的实验方法来测定。

本发明的有益效果：

本发明初次发现并合成多肽PEP-SKP，氨基酸序列为：Ala-Lys-Arg-Arg-Met-Ala-Pro-Thr-Trp-Pro-Phe(如SEQ ID NO：1所示)。该多肽在抑制Granzyme B方面表现出优异效果，进而达到治疗多种原因引起的皮肤伤害(如糖尿病性溃疡、肥厚性瘢痕、自身免疫性皮肤疾病、皮肤利什曼病和紫外线引起的皮肤老化与伤害)以及由此带来的其他症状的效果，此应用属于本多肽在次领域中的首次应用。

附图说明

图1为Granzyme B蛋白三级结构。

图2为候选多肽与Granzyme B蛋白活性中心结合示意图，

其中，A为多肽RIPVVPLRA与Granzyme B蛋白活性中心结合示意图；B为多肽AKRRMAPTWPF与Granzyme B蛋白活性中心结合示意图；C为多肽LAFFERF与Granzyme B蛋白活性中心结合示意图。

图3为Granzyme B活性检测标准曲线。

图4为不同浓度的PEP-SKP对Granzyme B的抑制效应。

图5为1μg/ml浓度的PEP-SKP对Granzyme B的抑制效应。

图6为多肽PEP-SKP的HPLC图谱。

图7为多肽PEP-SKP的MS图谱。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。

实施例1抑制PCSF9蛋白的多肽筛选

(一)设计抑制Granzyme B蛋白多肽的候选序列

Granzyme B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所设计的针对Granzyme B有抑制作用的多肽抑制剂即基于Granzyme B蛋白的三级结构(见图1)为基础设计和合成的。

其中，Granzyme B蛋白由两个6链β片层和3个反式结构域片段组成。在结构上在其活性位点含有催化三联体His-Asp-Ser，三联体组构成催化中心。本发明所设计和验证对Granzyme B有抑制作用的多肽抑制剂即基于这一关键结构进行设计的。

本发明根据上述Granzyme B蛋白的结构信息，设计出3个Granzyme B候选抑制肽。候选多肽模拟参数见表1，与Granzyme B蛋白活性中心结合示意图见图2。

表1抑制Granzyme B蛋白的多肽候选序列

(二)候选多肽抑制Granzyme B蛋白活性研究

1、候选多肽抑制Granzyme B蛋白的细胞学实验

准备抗体预处理24孔板。抗CD3抗体(OKT3)5μg/ml的DPBS溶液加入24孔板，每孔0.2ml，放置4度冰箱过夜。对照孔加入DPBS不含抗CD3抗体。

30ml健康人外周血，Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心获得外周血单个核细胞(PBMC)，3x10e6/ml细胞密度加入T75培养瓶中，X-VIVO 15含5％人AB型血清(HABS)，37℃，5％ CO₂细胞培养箱中静置2小时，收集悬浮细胞。1.2E+6/ml细胞浓度接种24孔板，每孔1ml。对照孔培养液为X-VIVO 15含5％HABS。其余组分别按表2浓度加入候选多肽DPBS溶液，X-VIVO 15含5％HABS和10ng/ml的IL-7和10ng/ml的IL-15。

表2PEP-SKP多肽对单个核细胞的影响

第三天，按照Granzyme B activity-assay说明书准备酶标板和标准样品。收集24孔板培养液上清。用酶标仪分别在0小时和2小时测定A405值，结果见图3-5，图3为GranzymeB活性检测标准曲线，图4为不同浓度的PEP-SKP对Granzyme B的抑制效应，图5为1μg/ml浓度的PEP-SKP对Granzyme B的抑制效应。

结果显示，多肽PEP-SKP明显抑制T淋巴细胞Granzyme B的活性，半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration)IC₅₀约0.9μg/ml(见图4)。1μg/ml浓度的PEP-SKP即可明显抑制Granzyme B的活性，***p<0.001(见图5)。

从上述结果可以看出，在细胞学实验中，多肽PEP-SKP能够明显抑制Granzyme B的活性，而PEP-1和PEP-2表现的抑制活性则不足。

2、候选多肽抑制Granzyme B蛋白的体内活性研究

多肽PEP-SKP凝胶配方：0.1g卡波姆凝胶980，0.5g甘油，1g尼泊金乙酯，0.01g三乙醇胺，蒸馏水加至10g，多肽PEP-SKP粉末(低剂量10mg，高剂量40mg)。凝胶制备方法：将卡波姆加入适量蒸馏水中，不断搅拌，待其溶胀成半透明溶液之后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，然后加入多肽PEP-SKP粉末、1/2处方量的三乙醇胺，搅拌均匀逐渐后加入尼泊金乙酯溶液以及余量三乙醇胺及蒸馏水，搅拌均匀。

按照上述相同剂量和方法制备PEP-1和PEP-2的多肽凝胶制剂。

使用水合氯醛麻醉小鼠，麻醉剂量为0.3mg/kg体重，然后将小鼠背部剃毛。75％酒精溶液消毒小鼠背部皮肤，用手术刀在其皮肤上切成全厚度约1.0cm×1.0cm矩形伤口。将所有小鼠随机分为对照组、不载药的空白凝胶组、低剂量多肽组(1.0mg/mL)、高剂量多肽组(4.0mg/mL)，每组10只小鼠，每天给与每组相同剂量的凝胶。使用Image J软件在创伤后第0d、7d和14d测量并计算伤口面积，评估伤口愈合的质量，愈合率＝(第0天创伤面积-治疗后创伤面积)/第0天创伤面积。结果见表3。

表3多肽PEP-SKP治疗小鼠创伤面积变化

与对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

实验结果显示：模型小鼠创口均未见明显的红肿现象，饮食和精神状况正常。治疗第7d，对照组、空白凝胶组、低高剂量的PEP-1与PEP-2组伤口出现较多黄色浓稠炎症产物，而多肽PEP-SKP组伤口无明显炎症反应，并且多肽PEP-SKP组伤口愈合效果高于对照组、空白凝胶组和PEP-1与PEP-2组，其愈合率分别是：低剂量组愈合率PEP-SKP 48.07％和高剂量组愈合率PEP-SKP 71.07％。实验结果还显示高剂量多肽PEP-SKP(4.0mg/mL)愈合效果高于低剂量组(1.0mg/mL)，且PEP-SKP比其他组有更高的愈合率；其他组治疗效果与模型组无明显差异。治疗14d，多肽PEP-SKP凝胶组伤口明显愈合，低剂量组愈合率为84.81％，显著高于模型组和其他用药组。PEP-SKP多肽凝胶高剂量组愈合率为93.87％，显著高于低剂量组，和其他各组，并表现出良好的全层损伤治疗效果；其他组治疗效果与模型组无明显差异。未载药的空白凝胶组对伤口愈合无明显效果。

实验结果表明，多肽PEP-SKP可以减少小鼠皮肤伤口炎症反应并且可以促进伤口愈合，同时值得注意的是多肽PEP-SKP同样具有剂量依赖效应，高剂量组具有更好的效果。

根据以上实验结果，最终选出效果优良的多肽PEP-SKP，其氨基酸序列为：Ala-Lys-Arg-Arg-Met-Ala-Pro-Thr-Trp-Pro-Phe(如SEQ ID NO：1所示)。

实施例2多肽PEP-SKP的化学合成

合成采用固相合成法从C-端到N-端合成多肽。合成采用化学合成仪(AMS586Multiple Peptide Synthesiser，ABIMED，Germany)合成，用Fmoc保护的氨基酸作为原料，以Fmoc-Rink linker resin树脂为附着基质，用HOBT作为缩合剂，DIC作为激活剂，逐层合成多肽。

合成过程中用2％乙酸酐的DMF溶液做侧链封闭试剂；用20％哌啶做Fmoc去除试剂，合成完毕经过TFA切割和侧链基团的去除操作。合成完毕的粗产物经离心收集，用R-HPLC(Waters 741)和Kromasil 100-5C18,4.6mmX250mm,5micron柱子纯化得到纯度大于99％的多肽，冻干成粉末。

多肽Ala-Lys-Arg-Arg-Met-Ala-Pro-Thr-Trp-Pro-Phe，其HPLC图谱和MS图谱分别见图6、7。如图6所示，多肽在8.95min处有一特征峰，分子量为1360.62。

HPLC色谱条件为：

流动相：流动相A：含0.1％三氟乙酸的水溶液；流动相B：含0.1％三氟乙酸的乙腈(80％)-水(20％)溶液；

洗脱程序：0-20min，流动相B36％-56％；

流速：1ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：220nm。

实施例3多肽PEP-SKP凝胶剂的制备

配方：0.1g卡波姆凝胶980，0.5g甘油，1g尼泊金乙酯，0.01g三乙醇胺，蒸馏水加至10g，多肽PEP-SKP粉末10mg。

制备方法：将卡波姆加入适量蒸馏水中，不断搅拌，待其溶胀成半透明溶液之后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，然后加入多肽PEP-SKP粉末、1/2处方量的三乙醇胺，搅拌均匀逐渐后加入尼泊金乙酯溶液以及余量三乙醇胺及蒸馏水，搅拌均匀。

实施例4多肽PEP-SKP凝胶剂的制备

配方：0.1g卡波姆凝胶980，0.5g甘油，1g尼泊金乙酯，0.01g三乙醇胺，蒸馏水加至10g，多肽PEP-SKP粉末40mg。

制备方法：将卡波姆加入适量蒸馏水中，不断搅拌，待其溶胀成半透明溶液之后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，然后加入多肽PEP-SKP粉末、1/2处方量的三乙醇胺，搅拌均匀逐渐后加入尼泊金乙酯溶液以及余量三乙醇胺及蒸馏水，搅拌均匀。

实施例5多肽PEP-SKP片剂的制备

取多肽PEP-SKP 10mg，加入片剂辅料按常规片剂工艺制备成片剂。

实施例5多肽PEP-SKP胶囊剂的制备

取多肽PEP-SKP 20mg，加入胶囊剂辅料按常规胶囊剂工艺制备成胶囊剂。

实施例6多肽PEP-SKP颗粒剂的制备

取多肽PEP-SKP 30mg，加入颗粒剂辅料按常规颗粒剂工艺制备成颗粒剂。

实施例7多肽PEP-SKP注射剂的制备

取多肽PEP-SKP 40mg，加入注射剂辅料按常规注射剂工艺制备成注射剂。

Claims (10)

1.一种改善皮肤损伤或衰老的多肽PEP-SKP，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述多肽PEP-SKP的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

采用固相合成法从C-端到N-端合成多肽，用Fmoc保护的氨基酸作为原料，以Fmoc-Rinklinker resin树脂为附着基质，用HOBT作为缩合剂，DIC作为激活剂，逐层合成多肽；

合成过程中用2％乙酸酐的DMF溶液做侧链封闭试剂；用20％哌啶做Fmoc去除试剂，合成完毕经过TFA切割和侧链基团的去除操作；合成完毕的粗产物经离心收集，用HPLC色谱法纯化，即得。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述HPLC色谱条件为：

流动相：流动相A：含三氟乙酸的水溶液；流动相B：含三氟乙酸的乙腈-水溶液；

洗脱程序：0-20min，流动相B(30％～40％)-(50％～60％)；

检测波长：200nm～260nm。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，流动相A为含0.1％～0.5％三氟乙酸的水溶液；流动相B：含0.1％～0.5％三氟乙酸的乙腈-水(75～85:25～15)溶液。

5.如权利要求1所述多肽PEP-SKP作为Granzyme B蛋白抑制剂的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多肽PEP-SKP在制备改善皮肤损伤或衰老的药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述皮肤损伤或衰老由外部因素或疾病因素导致；所述外部因素包括紫外线、化学物质、物理因素、病菌感染或者/和药物过敏；所述疾病因素包括糖尿病性溃疡、肥厚性瘢痕、自身免疫性皮肤疾病、皮肤利什曼病、银屑病或者/和紫癜。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述多肽PEP-SKP在抑制皮肤损伤所致炎症反应中的应用。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括活性成分多肽PEP-SKP和药学上可接受的载体；所述多肽PEP-SKP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂、凝胶制剂、乳剂等。