CN118284431A - SARS-CoV-2亚单位疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含至少一种抗原的蛋白质亚单位疫苗，其特征在于其包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)的至少一种变体的至少一个单体，其中至少一个单体选自由刺突蛋白的S1亚单位或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)组成的组。在本发明的一个方面，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种抗原，其特征在于其包含来自SARS‑CoV‑2的至少一种变体的两个单体，其中每个单体选自由S1亚单位或RBD蛋白组成的组，并且其中单体可选地通过接头彼此化学结合，从而形成融合二聚体或非融合二聚体。蛋白质亚单位疫苗还可以包含至少佐剂和至少免疫刺激剂。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质亚单位疫苗，其包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的至少一种抗原，以及可选的至少一种佐剂和至少一种免疫刺激剂。本发明还涉及所述疫苗用于产生针对SARS-CoV-2的至少一种变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的用途，以及包含一剂或多剂所述疫苗的试剂盒。
背景技术
SARS-CoV-2是一种携带单链正义RNA基因组(约30kb)的包膜病毒，属于冠状病毒科乙型冠状病毒属。病毒RNA编码4种结构蛋白(包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N))、16种非结构蛋白和9种辅助蛋白。S糖蛋白由胞外结构域(可加工成S1和S2亚单位)、跨膜结构域和胞内结构域组成。与SARS-CoV类似，SARS-CoV-2通过S1亚单位内的受体结合结构域(RBD)与人血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，以促进进入宿主细胞，然后通过S2亚单位介导膜融合。
开发安全有效的COVID-19疫苗并不容易，但疫苗的制造、分销和管理也可能面临巨大的挑战，特别是在发展中国家以及如果必须注射疫苗的情况下，因为需要冷链来保持其稳定性和活性。针对COVID-19的多种疫苗策略也在深入研究中，其中刺突蛋白是主要目标。这些疫苗由不同的平台生产：RNA、DNA、重组蛋白、基于病毒运载体、病毒样颗粒(VLP)、减毒活病毒和灭活病毒。这些不同类型的候选疫苗面临着与开发、制造、储存和分销进行大规模疫苗接种相关的各种挑战。
亚单位疫苗或重组蛋白疫苗使用完整蛋白(例如刺突蛋白)或蛋白片段(例如S1、RBD或融合蛋白)作为抗原。与其他类型的疫苗相比，亚单位疫苗具有若干优点，例如它们便宜且易于生产，并且比其他类型的疫苗(例如基于mRNA或含有完整病毒或细菌的疫苗)更稳定。
然而，亚单位疫苗的主要缺点是用于引发免疫应答的抗原可能缺乏某类病原体所共有的称为病原体相关分子模式的分子结构。这些结构可以被免疫细胞读取并识别为危险信号，因此它们的缺失可能会导致免疫应答较弱。此外，由于这些类型的抗原不感染细胞，因此亚单位疫苗主要专门触发抗体介导的免疫应答。同样，这意味着该免疫应答可能弱于其他类型的疫苗。为了克服这个问题，亚单位疫苗有时与佐剂一起递送。因此，亚单位疫苗在制剂中往往需要佐剂以增加免疫原性。
已经开发或研究了若干种佐剂和免疫刺激剂，例如铝盐、水包油乳剂(MF59、AS03和AF03)、病毒体和AS04作为佐剂，以及QS-21或其他皂苷、单磷酰脂A(MPLA)、CpG(ODN)作为免疫刺激剂。然而，选择合适的佐剂有助于在先天水平和适应性水平上促进针对目标病原体的适当免疫应答，从而在保持安全性的同时引发保护性免疫，这一点至关重要，但并不简单。选择错误的佐剂可能会导致特定的疫苗抗原不能胜任。因此，疫苗抗原的选择必须考虑佐剂的选择，以避免丢弃潜在有效的候选疫苗抗原。开发安全的疫苗同时获得适当的功效仍然是最重要的需求。
因此，需要针对SARS-CoV-2的安全且有效的新的疫苗，特别是使免疫原性增强的疫苗。
附图说明
图1：通过假病毒中和测定(PBNA)对各处理组的SARS-CoV-2中和抗体滴度的定量。横坐标表示各组(A至I)，纵坐标表示各组对应于IC50的稀释度的log10。
图2A-H：每组用相应疫苗抗原(RBD或S1)刺激的脾细胞培养物中的细胞因子浓度。图2A中，横坐标为A组至E组，纵坐标为A组至E组的IFN-γ浓度(pg/ml)。图2B中，横坐标为A组至E组，纵坐标为A组至E组的IL-4浓度(pg/ml)。图2C中，横坐标为A组至E组，纵坐标为A组至E组的IL-6浓度(pg/ml)。图2D中，横坐标为A组至E组，纵坐标为A组至E组的IL-10浓度(pg/ml)。图2E中，横坐标为A组、和F组至I组，纵坐标为A组、和F组至I组的IFN-γ浓度(pg/ml)。图2F中，横坐标为A组、和F组至I组，纵坐标为A组、和F组至I组的IL-4浓度(pg/ml)。图2G中，横坐标为A组、和F组至I组，纵坐标为A组、和F组至I组的IL-6浓度(pg/ml)。图2H中，横坐标为A组、和F组至I组，纵坐标为A组、和F组至I组的IL-10浓度(pg/ml)。
图3A-B：通过ELISA定量的恢复期人血清样本和阴性人血清样本中抗SARS-CoV-2RBD总IgG抗体滴度(log10 EC50)的比较。误差线代表几何平均值和几何标准差(几何SD)。图3A示出了HEK293细胞中产生的针对RBD的IgG抗体滴度。图3B示出了CHO细胞中产生的针对RBD的IgG抗体滴度。
图4：通过ELISA定量的恢复期人血清样本中抗SARS-CoV-2RBD(在CHO细胞中产生)和抗SARS-CoV-2RBD(在HEK293细胞中产生)总IgG抗体滴度(log10 EC50)的分组比较。误差线代表几何平均值和几何标准差(几何SD)。
图5：纵坐标表示的抗SARS-CoV-2RBD总IgG抗体滴度(log10 EC50)与横坐标表示的首次阳性PCR到血清捐赠间经过的天数之间的相关性。黑色方块：CHO细胞中产生的针对RBD的IgG抗体滴度。灰色三角形：HEK293细胞中产生的针对RBD的IgG抗体滴度。
图6：通过ELISA定量的各恢复期人血清样本(横坐标)中抗SARS-CoV-2RBD(在CHO细胞中产生)和抗SARS-CoV-2RBD(在HEK293细胞中产生)总IgG抗体滴度(log10 EC50)(纵坐标)的成对比较。每个点代表单个血清样本。灰色点：CHO细胞中产生的针对RBD的IgG抗体滴度。黑色点：HEK293细胞中产生的针对RBD的IgG抗体滴度。
图7：横坐标为各治疗组(A至E)，纵坐标描绘了各治疗组(A至E)的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度(Log10 EC50)，其中，(A)研究的第18天的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度(Log10 EC50)，(B)研究的第30天的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度(Log10 EC50)。
图8：横坐标为各治疗组(A至I)，纵坐标描绘了各治疗组(A至I)施用一个剂量的不同疫苗制剂后的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度(Log10 EC50)。
图9：横坐标为各治疗组(A至I)，纵坐标描绘了各治疗组(A至I)施用第二剂量的不同疫苗制剂后的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度(Log10 EC50)。
图10：横坐标为各治疗组(A至D)，纵坐标描绘了各治疗组(A至D)的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度(Log10终点滴度)。(A)研究的第21天的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度(Log10终点滴度)，(B)研究的第35天和第37天之间的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度(Log10终点滴度)。
图11：通过PBNA测量的针对SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1变体的中和抗体应答。横坐标为各治疗组(A至D)，纵坐标描绘了各治疗组(A至D)在研究的第35天和第37天之间的中和抗体滴度(Log10 IC50)。
图12：通过PBNA测量的针对多种SARS-CoV-2变体的中和抗体应答。横坐标描绘了不同的SARS-CoV-2假病毒变体，纵坐标描绘了不同SARS-CoV-2假病毒变体的中和抗体滴度(Log10 IC50)。评估的SARS-CoV-2变体为Wu-1(Wuhan-Hu-1原始序列)、阿尔法变体(英国；B.1.1.7)、贝塔变体(南非；B.1.351)、伽马变体(巴西；P.1)和德尔塔变体(印度；B.1.617.2)。(A)从D组动物获得的中和抗体滴度，(B)从E组动物获得的中和抗体滴度，(C)从F组动物获得的中和抗体滴度。LD虚线代表测定检测限。仅对D组测定了印度变体(德尔塔；B.1.617.2)的中和抗体滴度(图12A)。
图13：横坐标为各组(A至C)，纵坐标描绘了各组(A至C)在研究的不同天数的平均直肠温度(℃)。(A)施用第一剂前一天(第-1天)、施用第一剂时(第0天)、以及首次接种后4小时、6小时、1天、2天和3天(第0天+4小时、第0天+6小时、第1天、第2天和第3天)的平均直肠温度。(B)施用第二剂前一天(第20天)、施用第二剂时(第21天)、以及第二剂后4小时、6小时、1天、2天和3天(第21天+4小时、第21天+6小时、第22天和第23天)的平均直肠温度。
图14：横坐标为各治疗组(A至C)，纵坐标描绘了各治疗组(A至C)的抗SARS-CoV-2中和抗体滴度(Log10 IC50)。描绘了以下各不同变体的中和抗体滴度：阿尔法变体(英国；B.1.1.7)、贝塔变体(南非；B.1.351)、伽马变体(巴西；P.1)和德尔塔变体(印度；B.1.617.2)。
图15：描绘了不同治疗组(A至C)的实验感染后的每天的存活率。横坐标表示实验感染后经过的天数，纵坐标表示存活率(％)。A组动物接受包含20μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗组合物；B组动物接受包含10μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗组合物；C组的动物接受包含PBS的模拟疫苗。
发明内容
一般定义
必须注意的是，除非上下文另有明文说明，否则如本文所使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代。此外，除非另有说明，否则一系列元素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的发明的具体实施方式的许多等同物。这样的等同物旨在涵盖在本发明中。
当涉及给定的量或数量时，术语“约”表示数字可以在其指定值附近±20％之间变化。优选地，“约”意指其值附近±15％，更优选地，“约”意指其值附近±10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％，甚至“约”意指其值附近±1％，按照该优先顺序。
如本文所使用的，多个引用的元素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖单独的和组合的选项。例如，当两个元素通过“和/或”连接时，第一选项指的是在没有第二元素的情况下第一元素适用。第二选项是指在没有第一元素的情况下第二元素适用。第三选项是指第一元素和第二元素一起适用。这些选项中的任何一个都被理解为落入该含义内，并且因此满足如本文所使用的术语“和/或”的要求。多于一个选项同时适用也被理解为落入该含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
在通篇说明书以及权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise、comprises和comprising)”及变形将被理解为暗示包括所称的整体或步骤、或整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤、或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以被术语“含有”或“包括”替代，或者有时当在本文中使用时被术语“具有”替代。任何前述术语(包含、含有、包括、具有)，无论何时在本发明的方面或实施方式的上下文中使用时，都可以用术语“由......组成”替代，尽管是次优选的。
当本文使用“由......组成”时，排除权利要求元素中未指定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”并不排除不会实质上影响权利要求的基本特征和新颖特征的材料或步骤。
本文中的术语“亚型”可以替换为“物种”。它包括任何严重急性呼吸综合征冠状病毒(即SARS-CoV-2)的株、分离株、进化枝、谱系(lineage)、系(linage)和/或变体。术语“株”、“进化枝”、“谱系或系”、“分离株”和/或“变体”是本领域技术人员熟知的技术术语，涉及微生物的分类学，即，涉及所有表征为科、属、种、株的等级顺序的微生物。科成员的标准是其系统发育关系，属包括具有共同特征的所有成员，而种则被定义为构成复制谱系并占据特定生态位的多原则分类。术语“株”或“进化枝”描述了与其他微生物具有共同特征(如基本形态或基因组结构和组织)但在生物学特性(如宿主范围、组织嗜性、地理分布、减毒或致病性)上有所不同的一种微生物(在本发明中即病毒)。在本发明中，术语“变体”描述了复制并将一个或多个新突变引入其基因组中从而导致与原始病毒的差异的微生物(在本发明中即病毒)。术语“谱系”或“系”描述了衍生自共同祖先的一组病毒序列，这些序列与流行病学事件相关，例如，病毒被引入到不同的地理区域，并有进一步传播的证据。谱系旨在捕捉大流行的即将来临，并具有适合基因组流行病学监测和暴发调查的细粒度分辨率。例如，Rambaut A.et al.A dynamic nomenclature proposal for SARS-CoV-2lineages toassist genomic epidemiology.Nat Microbiol.2020；5(11):1403-1407中描述了SARS-CoV-2谱系命名法。因此，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体”是指SARS-CoV-2病毒的至少一种变体、毒株、分离株、谱系或系、和/或进化枝。优选地，术语“变体”与之前的定义一致，并且也与WHO网站一致，特指衍生自相同祖先或病原学病毒(即，在这种情况下为SARS-CoV-2病毒)的具有一个或多个突变的不同SARS-CoV-2病毒序列。因此，在该具体上下文中，术语“SARS-CoV-2变体”或“SARS-CoV-2谱系或谱系”优选地理解为不包括来自其他病毒(例如SARS或MERS病毒)的病毒基因组，也不包括衍生自所述其他病毒的病毒基因组。
更优选地，术语“变体”或“系”包括编码与参考毒株SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1的刺突蛋白(GenBank登录号QHD43416.1或UniprotID：P0DTC2)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、优选至少95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性百分比的刺突蛋白的所有SARS-CoV-2病毒序列(当两个刺突蛋白进行局部比对时，例如通过使用基本局部比对搜索工具(BLAST)进行局部比对时)。
还更优选地，术语“变体”或“系”包括编码与参考毒株SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1的刺突蛋白的RBD(GenBank登录号QHD43416.1或UniprotID：P0DTC2，氨基酸残基319至541)具有至少85％、86％、87％、88％或89％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％、最优选至少95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性百分比的刺突蛋白的RBD的所有SARS-CoV-2病毒序列(当两个RBD蛋白进行局部比对时，例如通过使用基本局部比对搜索工具(BLAST)进行局部比对时)。
SARS-CoV-2的不同变体可以在数据库中找到，例如Emma B.Hodcroft.2021.“CoVariants:SARS-CoV-2Mutations and Variations of Interest”(covariants.org/variants)或O’Toole A.et al.,2020“A dynamic nomenclature proposal for SARS-CoV-2lineages to assist genomic epidemiology”,PANGO谱系(cov-lineages.org/)。
在两个或更多个核苷酸序列、多肽序列或蛋白质序列的背景下，术语“序列同一性”或“同一性百分比”是指当使用序列比较算法(例如，通过BLAST比对或本领域技术人员已知的任何其他算法)或者通过目视检查进行比较和比对与第二分子的最大对应时，两个或更多个序列或子序列是相同的(“同样的”)，或具有相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分比(“同一性百分比”)。“序列同一性”或“同一性百分比”可以通过计算核酸、多肽或蛋白质中相同位置处相同核苷酸或氨基酸的数量来确定。同一性百分比的计算包括确定两个或更多个序列之间的最佳比对。比对可以考虑每个待测试序列中的插入和缺失(即“空位”)，例如但不限于核酸的非编码区以及多肽序列的截短或延伸。诸如基本局部比对搜索工具(BLAST)的计算机程序和算法可用于确定同一性百分比。BLAST是美国国家生物技术信息中心提供的众多资源之一。因为遗传密码是简并的，并且超过一个密码子就可以编码给定的氨基酸，所以如果核酸编码相同的多肽，则核酸的编码区被认为是相同的。因此，同一性百分比也可以基于核酸编码的多肽来计算。同一性百分比可以基于全长共有基因组序列或基因组序列的一部分来计算，例如但不限于单独的开放阅读框(ORF)。
如果经最佳比对，本发明的蛋白质或肽与合成的或天然存在的蛋白质或衍生自其的肽具有至少约60％同一性的氨基酸序列同一性，通常至少约70％的同一性，更通常至少约80％的同一性，优选至少约90％的同一性，更优选至少约95％的同一性，最优选至少约98％或100％的同一性，则本发明的蛋白质或肽与另一种蛋白质或肽基本上相同。同一性是指两个多肽或两个多核苷酸序列之间的序列相关性程度，这通过两串这种序列、例如全部且完整的序列之间匹配的同一性确定的。同一性可以很容易地计算出来。虽然存在多种测量多肽序列之间同一性的方法，但术语“同一性”是本领域技术人员众所周知的。
关于本文所述的蛋白质、多肽、抗原蛋白质片段、抗原和表位的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在对序列进行比对并且如有必要引入空位(以实现最大序列同一性百分比)、并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考序列(即，其所衍生自的蛋白质、多肽、抗原蛋白质片段、抗原或表位)中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
本文所用的术语“对象”或“宿主”是活的多细胞脊椎动物生物体，包括例如人和非人哺乳动物，包括(非人)灵长类动物，伴侣动物例如狗和猫，和家养动物例如马、牛物种例如牛和羊、雪貂、猪物种例如猪、仔猪、母猪或后备母猪，以及动物园哺乳动物例如猫科动物、犬科动物和牛科动物。因此，术语“对象”或“宿主”在本文中可以与术语“动物”或“人”互换使用。通常，“对象”是人。例如，人可以是新生儿(2个月以下)、婴儿(出生至2岁)、儿童(2岁至14岁)、青少年(15岁至18岁)、成人(18岁以上)或老年人(约65岁或以上)。
针对抗原或组合物的“免疫学应答”或“免疫应答”是对象对目标组合物中存在的抗原产生的先天免疫应答、体液免疫应答和/或细胞免疫应答。当术语“增强”用于针对SARS-CoV-2抗原的免疫应答时，例如抗体应答(例如，中和抗原特异性抗体应答)、细胞因子应答、CD8 T细胞应答(例如，免疫显性CD8 T细胞应答)或CD4 T细胞应答，是指施用了包含至少一种SARS-CoV-2抗原的对象中免疫应答相对于从施用不包含任何SARS-CoV-2抗原的疫苗观察到的相应免疫应答而言的增加。
在本发明的上下文中，术语“单体”优选用于指但不限于来自SARS-CoV-2病毒的任何变体的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)或S1亚单位。具体地，本文使用的术语“单体”指包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的任何蛋白质：SEQ ID NO：1、2、3或4、或在其全长上与序列SEQ ID NO：1、2、3或4中的任意一个具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。单体具有与至少一个其他单体分子形成化学键以形成多聚体即二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等的能力。二聚体是由两个单体形成的多聚体，这些单体的序列可以相同，也可以不同。
“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原或免疫原可以包含：完整的生物体，其是灭活的、减毒的或活的；生物体的亚单位或部分片段；包含具有免疫原性特性的插入物的重组运载体；能够在呈递给宿主动物后诱导免疫应答的DNA片段；多肽、蛋白质或其片段、表位或其任意组合。在本发明的上下文中，“抗原”是指包含至少一个单体或由至少一个单体组成的蛋白质。在本发明的上下文中，“抗原”是指包含至少一种多聚体或由至少一种多聚体组成的蛋白质。多聚体或抗原可包含两个单体(二聚体抗原或二聚抗原)、三个单体(三聚体抗原或三聚抗原)、四个单体(四聚体抗原或四聚抗原)或更多个单体。术语“多聚抗原”或“多聚体抗原”是同义的。在抗原由两个单体(理解为两个RBD、两个S1、或各一个)组成的特定情况下，则该抗原被理解为二聚体的形式。应注意，“二聚抗原”和“二聚体形式的抗原”是同义的并且在本文中可互换使用。在本发明的上下文中，二聚抗原的两个单体可选地通过接头彼此化学连接或结合。“彼此结合”是指二聚体的单体通过非常弱、弱、强或非常强的键化学连接，例如通过共价键、非共价键、二硫键或肽键化学连接。
在本发明中，描述了两种二聚体形式的抗原：“非融合二聚体”和“融合二聚体”。在本文中“非融合二聚体”理解为由两个单体形成的抗原，其中两个单体通过可逆键彼此结合，例如通过它们的半胱氨酸之间形成的分子间二硫键，从而形成非融合二聚抗原。例如，本文提及的“非融合二聚体”是在被编码所述RBD单体的核酸转染后在细胞内产生的两个可溶性RBD单体，并且当RBD单体释放到细胞上清液时它们例如通过其游离的(未结合的)半胱氨酸彼此相互作用以形成二硫键，从而形成本文所称的“非融合二聚体”。重要的是，非融合二聚体中的两个单体不是通过肽键连接的，也不是单个多肽的一部分。
在本文中“融合二聚体”是指由两个单体形成的抗原，其中两个单体一个接一个地连接，使得它们合成或翻译为单个单位，并因此融合二聚体的两个单体是单个多肽的一部分。因此，与非融合二聚体的单体相反，融合二聚体中包含的两个单体通过肽键连接，可选地通过接头连接。
此外，在本发明中，当提到“二聚抗原”或“二聚体形式的抗原”时，应当理解为包括上述非融合二聚抗原和融合二聚抗原。“单体RBD抗原”或“RBD-单体”在本文中是指包含一个单体或由一个单体组成的抗原，其中该单体是RBD。“二聚RBD抗原”或“RBD-二聚体”在本文中是指包含彼此结合的两个单体或由彼此结合的两个单体组成的抗原，其中所述单体是RBD。如果“二聚RBD抗原”是非融合二聚体，则在本文中将其称为“非融合二聚RBD抗原”或“非融合RBD-二聚体”。如果“二聚RBD抗原”是融合二聚体，则其被称为“融合二聚RBD抗原”或“融合RBD-二聚体”。除非指定“二聚RBD抗原”是“非融合二聚RBD抗原”或“融合二聚RBD抗原”，否则应理解，“二聚RBD抗原”涵盖两种类型，即RBD的融合二聚体和非融合二聚体。“单体S1抗原”或“S1-单体”在本文中是指包含一个单体或由一个单体组成的抗原，其中该单体是S1。“二聚S1抗原”或“S1-二聚体”在本文中是指包含彼此结合的两个单体或由彼此结合的两个单体组成的抗原，其中所述单体是S1。如果“二聚S1抗原”是非融合二聚体，则在本文中将其称为“非融合二聚S1抗原”或“非融合S1-二聚体”。如果“二聚S1抗原”是融合二聚体，则其被称为“融合二聚S1抗原”或“融合S1-二聚体”。除非指定“二聚S1抗原”是“非融合二聚S1抗原”或“融合二聚S1抗原”，否则应理解，“二聚S1抗原”涵盖两种类型，即S1的融合二聚体和非融合二聚体。
体内抗原的存在通常会引发免疫应答。因此，抗原被抗体“靶向”。“表位”是指抗原的特异性抗原决定簇。表位可包含空间构象中的三个氨基酸，该空间构象对该表位是独特的。通常，表位由至少五个这样的氨基酸组成，更通常由至少8-10个这样的氨基酸组成。确定此类氨基酸的空间构象的方法是本领域已知的。
亚单位疫苗是向免疫系统呈递一种或多种抗原而不引入完整或其他形式的病原体颗粒的疫苗。“蛋白质亚单位疫苗”在本文中是指来自病毒或细菌病原体的特异性分离抗原。“蛋白质亚单位疫苗”在本文中也指来自病毒病原体的特异性重组抗原。
“SARS-CoV-2刺突(S)蛋白”是指SARS-CoV-2病毒的四种结构蛋白(刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白和膜(M)蛋白)中的一种。S蛋白的大小约为180-200kDa，由胞外N端、锚定在病毒膜上的跨膜(TM)结构域和胞内C端短片段组成。SARS-CoV-2S蛋白的总长度约为1273个氨基酸，由位于N端的信号肽(氨基酸1-13)、S1亚单位(13–685残基)和S2亚单位(686–1273残基)组成；最后两个区域分别负责受体结合和膜融合。在S1亚单位中，具有N端结构域(14-305残基)和受体结合结构域(RBD，319-541残基)；融合肽(FP)(788-806残基)、七肽重复序列1(HR1)(912-984残基)、HR2(1163-1213残基)、TM结构域(1213-1237残基)和细胞质结构域(1237-1273残基)包含S2亚单位。因此，“S1”或“S1亚单位”或“S1抗原”是指位于冠状病毒(CoV)的刺突蛋白上的S1亚单位，“RBD”或“RBD抗原”是指位于冠状病毒(CoV)的刺突蛋白上的受体结合结构域。
根据本发明的抗原的“免疫原性片段”是抗原的部分氨基酸序列或也充当抗原的此类片段的功能等效物，其被抗原特异性抗体或B细胞受体检测并结合。抗原的免疫原性片段比完整抗原短，并且优选长度在约10、50或100至约1000个氨基酸之间，更优选长度在约10、50或30至约500个氨基酸之间，甚至更优选长度在约50至约250个氨基酸之间。RBD或S1抗原的片段包含具有至少15、20或65个连续氨基酸残基的氨基酸，其分别与SEQ ID NO：1、3、4或SEQ ID NO：2的至少约15、20或65个连续氨基酸残基具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、优选至少约95％、更优选地至少约98％的序列同一性。根据所选择的表达系统，蛋白质片段可以以天然糖基化形式表达，或者可以不以天然糖基化形式表达。
“基本上对应于”SARS-CoV-2病毒的蛋白质或片段的蛋白质或片段是与SARS-CoV-2病毒的指定蛋白质或片段具有基本上相同的氨基酸序列并且具有基本上相同的功能的蛋白质或片段。
与SARS-CoV-2病毒的蛋白质或片段具有“基本上相同的氨基酸序列”的蛋白质或片段通常与该蛋白质或片段具有超过90％的氨基酸同一性。该定义中包括保守氨基酸取代。
本文使用的“抗体”是多克隆和/或单克隆抗体或其片段，包括重组抗体片段及其免疫结合等效物，其能够特异性结合SARS-CoV-2蛋白和/或其片段。术语“抗体”用于指同质分子实体或混合物，例如由多种不同分子实体构成的血清产物。重组抗体片段可以例如衍生自单克隆抗体或可以从由免疫的非人动物构建的文库中分离。
本文所用的“佐剂”是用于增强免疫应答的物质。佐剂一词衍生自拉丁语：adjuve，意思是“帮助”。许多类别的化合物已被描述为佐剂，包括矿物盐、微生物产物、乳剂、皂苷、细胞因子、聚合物、微粒和脂质体。目前存在多种具有佐剂特性的化合物，它们通过不同的作用机制发挥其功能。根据作用机制，佐剂可分为递送系统和免疫刺激剂(免疫增强剂)(Apostólico J.et al.Adjuvants:Classification,Modus Operandi,and Licensing.JImmunol Res.2016；2016:1459394)。递送系统佐剂可以充当抗原可与之相关的载体，还可以产生局部促炎反应，将先天免疫应答细胞募集到注射部位。免疫刺激剂的作用是通过模式识别受体(PRR)活化先天反应或直接(即细胞因子)活化先天反应。一般来说，PRR的激动剂活化诱导“抗原呈递细胞”(APC)活化/成熟以及细胞因子/趋化因子的产生，最终导致适应性免疫应答。因此，本文使用的“免疫刺激剂”是通过诱导免疫系统的任何组分的活化或增加活性来刺激免疫系统的化合物。刺激衍生自免疫刺激剂对免疫系统本身的细胞的直接或间接刺激作用。免疫刺激剂可以通过模式识别受体(PRR)活化免疫应答或直接活化免疫应答。免疫刺激剂可以是天然化合物或合成化合物。免疫刺激剂可以单独给予以活化非特异性防御机制，或者可以与疫苗一起施用以活化非特异性防御机制并增强特异性免疫应答。免疫刺激剂可以与抗原和其他佐剂组合。
“EC50”或“半最大有效浓度”或“50％有效稀释度”在本文中是指提供半最大结合(观察到的其最大效果的50％)的血清中抗体的浓度。EC50可以通过稀释系列与靶抗原的直接且可饱和结合来确定。基于假病毒的中和测定中的EC50是在减去对照组中的背景RLU后，相对光单位(RLU)与病毒对照孔相比减少50％时的稀释度。在基于假病毒的中和测定中确定EC50的方法是本领域技术人员已知的，例如Nie J.et al.Establishment andvalidation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.EmergMicrobes Infect.2020Dec；9(1):680-686、Nie J.et al.Quantification of SARS-CoV-2neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.Nat Protoc.2020Nov；15(11):3699-3715、或Hu J.et al.Development of cell-based pseudovirus entryassay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizingantibodies against SARS-CoV-2.Genes Dis.2020Dec；7(4):551-557中描述的方法。
“IC50”或“半最大抑制浓度”或“50％抑制稀释度”在本文中是指抑制50％感染所需的血清中抗体的浓度。IC50可以通过稀释系列与靶抗原的直接且可饱和结合来确定。基于假病毒的中和测定中的IC50是在减去对照组中的背景RLU后，相对光单位(RLU)与病毒对照孔相比减少50％时的稀释度。在假病毒中和测定中测定IC50的方法是本领域技术人员已知的，例如Nie J.et al.Establishment and validation of a pseudovirus neutralizationassay for SARS-CoV-2.Emerg Microbes Infect.2020Dec；9(1):680-686、Nie J.etal.Quantification of SARS-CoV-2neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.Nat Protoc.2020Nov；15(11):3699-3715、或Hu J.et al.Development ofcell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entryinhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.Genes Dis.2020Dec；7(4):551-557中描述的方法。
“终点滴度”在本文中是指给出高于截止值的读数的最高稀释度的倒数。截止值优选为阴性对照读数或平均背景的二至三倍，更优选为阴性对照读数或平均背景的三倍。终点滴度可以通过ELISA测定中稀释系列与靶抗原的直接且可饱和结合来确定。确定ELISA测定中终点滴度的方法是本领域技术人员已知的，例如Frey A.et al.A statisticallydefined endpoint titre determination method for immunoassays.J ImmunolMethods.1998Dec 1；221(1-2):35-41中描述的方法。
如本文所用，“接头肽”是位于融合二聚体的两个单体之间的短肽序列。放置接头肽以向融合二聚体中包含的两个单体提供运动灵活性。在本发明的上下文中，接头肽具有至少一个氨基酸残基，优选至少两个连续的氨基酸残基，可选地3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸残基。接头肽包括柔性接头、刚性接头和体内可裂解接头。
具体实施方式
对在先天和适应性水平上促进针对目标病原体的适当免疫应答的疫苗中包含的抗原进行设计和优化并不简单。尽管病原体的最具抗原性的表位或蛋白质可能是已知的，但疫苗、特别是蛋白质亚单位疫苗的产生，仍然需要对所述抗原进行微调，以增强其免疫原性并避免它们的错误折叠或低免疫原性形式，这些可能会将免疫应答推向错误的方向。选择错误的抗原可能会导致特定疫苗效率低下。因此，必须仔细考虑抗原选择，以避免丢弃潜在有效的候选疫苗，并帮助疫苗开发以及提供新的解决方案来对抗大流行，例如COVID-19。
在本发明中，发明人在本文的图1和图2以及实施例2中示出了，SARS-CoV-2病毒的RBD和S1亚单位具有引发强效中和抗体和细胞免疫应答的能力，表明它们是作为生成针对SARS-CoV-2病毒的蛋白质亚单位疫苗的起点的良好候选。
因此，在第一方面，本发明涉及包含至少一种抗原或由至少一种抗原组成的蛋白质亚单位疫苗，其特征在于该至少一种抗原包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的至少一个单体或由来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体组成，其中至少一个单体选自由刺突蛋白的S1亚单位或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、或其任何免疫原性片段组成的组。
在实施方式中，至少一种抗原中包含的至少一个单体是刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)或其免疫原性片段。优选地，包含在抗原中或由抗原组成的至少一个单体是刺突蛋白的重组受体结合结构域(RBD)或其免疫原性片段。
优选地，刺突蛋白的所述受体结合结构域(RBD)基本上对应于SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸残基319至541。优选地，刺突蛋白的所述受体结合结构域(RBD)包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：1或在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)包含SEQ ID NO：1、由SEQ ID NO：1组成或基本上由SEQ ID NO：1组成。
优选地，刺突蛋白的所述受体结合结构域(RBD)基本上对应于SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸残基319至537。优选地，刺突蛋白的所述受体结合结构域(RBD)包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：3或在其全长上与SEQ ID NO：3具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)包含SEQ ID NO：3、由SEQ ID NO：3组成或基本上由SEQ ID NO：3组成。
优选地，刺突蛋白的所述受体结合结构域(RBD)包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：4或在其全长上与SEQ ID NO：4具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)包含SEQ ID NO：4、由SEQ ID NO：4组成或基本上由SEQ ID NO：4组成。
在实施方式中，至少一种抗原中包含的至少一个单体包含受体结合结构域(RBD)或由受体结合结构域(RBD)组成，并且在其全长上与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4中的任一个具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在另一个实施方式中，至少一种抗原中包含的至少一个单体包含刺突蛋白的S1亚单位或其免疫原性片段，或由刺突蛋白的S1亚单位或其免疫原性片段组成。优选地，至少一个单体是刺突蛋白的重组S1亚单位或其免疫原性片段。优选地，S1亚单位对应于SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸残基13至685。更优选地，S1亚单位对应于SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸残基16至682。优选地，刺突蛋白的所述S1亚单位包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：2或在其全长上与序列SEQ ID NO：2具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，刺突蛋白的所述S1亚单位包含SEQ ID NO：2、由SEQ ID NO：2组成或基本上由SEQ ID NO：2组成。
在实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的至少一种抗原中包含的至少一个单体衍生自SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株。Wuhan-Hu-1的刺突蛋白由SEQ IDNO：9(UniProt No.P0DTC2)组成。在另一个实施方式中，Wuhan-Hu-1变体包含刺突蛋白中的突变D614G。
在另一个实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的至少一种抗原中包含的来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体衍生自美国疾病控制与预防中心(CDC)“SARS-CoV-2变体分类和定义”所定义的关切变体(variant of concern，VOC)。据观察，SARS-CoV-2会发生突变，其中特定点突变的某些组合被证明比其他组合更令人担忧。这些突变是传播性增加、毒力增加以及新变体中可能出现逃逸突变的原因。“关切变体”(VOC)这一术语是指新出现的SARS-CoV-2变体，其突变会增加传播性和/或发病率和/或死亡率和/或降低抗病毒或治疗药物的敏感性和/或具有逃避免疫的能力和/或感染接种疫苗的个体的能力等。如上所述，术语“变体”优选理解为指“谱系”或“系”，即衍生自相同SARS-CoV-2共同祖先的不同病毒序列。因此，优选地，本文提及的不同的“关切变体”不包括衍生自其他病毒例如SARS或MERS的病毒序列。
在另一个实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的至少一种抗原中包含的来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体衍生自英国SARS-CoV-2变体VOC 202012/01(Lineage B.1.1.7)。据WHO称，2020年12月14日，英国当局向WHO报告了一种被英国称为SARS-CoV-2VOC 202012/01的变体(关切变体，2020年12月，变体01)，也称为LineageB.1.1.7或501Y.V1。该变体在科学文献中有描述，例如参见Wise,J.Covid-19:Newcoronavirus variant is identified in UK.BMJ 2020,371,m4857。该变体包含23个核苷酸取代，与检测到该变体时在英国流行的SARS-CoV-2病毒在系统发育上不相关。在该变体的几个突变中，刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)中的一个突变将第501位的天冬酰胺更改为酪氨酸(N501Y)。VOC 202012/01变体中的另一个突变，即69/70del位置的缺失，被发现会影响针对S基因目标的一些诊断性PCR检测的性能。截至12月30日，6个WHO区域中的5个区域的31个其他国家/地区/区域已报告了VOC-202012/01变体。
在另一个实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的至少一种抗原中包含的来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体衍生自南非SARS-CoV-2变体(谱系B.1.351)。12月18日，南非国家当局宣布检测到SARS-CoV-2的新变体，该变体正在南非三个省份迅速传播。南非将此变体命名为Lineage B.1.351，也称为501Y.V2。该变体在科学文献中有描述，参见，例如，Tegally et al.Emergence and rapid spread of a new severeacute respiratory syndrome-related coronavirus 2(SARS-CoV-2)lineage withmultiple spike mutations in South Africa.medRxiv 2020。SARS-CoV-2南非变体的特征是RBD中存在三个突变K417N、E484K和N501Y。虽然来自英国的SARS-CoV-2VOC 202012/01也具有N501Y突变，但系统发育分析表明来自南非的病毒是不同的病毒变体。
在另一个实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的至少一种抗原中包含的来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体衍生自巴西SARS-CoV-2变体VOC-202101/02(Linage B.1.1.28)。巴西变体也称为Lineage P.1，也称为20J/501Y.V3、关切变体202101/02(VOC-202101/02)。该变体在科学文献中有描述，参见例如Faria,et al.GenomicCharacterisation of an Emergent SARS-CoV-2Lineage in Manaus:PreliminaryFindings。SARS-CoV-2的这种变体有17个独特的氨基酸变化，其中10个位于其刺突蛋白中，其中包括指定为特别值得关注的三个：N501Y、E484K和K417T。日本国家传染病研究所(NIID)于2021年1月6日在抵达东京的四人中首次检测到这种SARS-CoV-2变体，这四人在四天前访问了巴西亚马逊州。随后宣布它在巴西流通并传播到世界各地。
最近，加利福尼亚变体也被称为关切变体CAL.20C。因此，在另一个实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的至少一种抗原中包含的来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体衍生自加利福尼亚SARS-CoV-2(Linage B.1.427或B.1.429)。该变体的特征是刺突蛋白的N端结构域(NTD)中的突变S131、W152C以及刺突蛋白的RBD中的L452R突变。该变体最初在加利福尼亚州检测到(Linage B.1.427或B.1.429)。
已经描述了许多其他变体，例如，尼日利亚的B.1.207变体，其刺突蛋白(P681H)存在突变，这种突变也发现于VOC 202012/01变体中；印度的B.1.617变体(Linage B.1.617，印度变体)，其刺突蛋白中具有突变P681R、E484Q和L425R；或丹麦变体，被丹麦当局称为“Cluster 5”变体，并且具有以前未观察到的突变组合。技术人员可以容易地在例如EmmaB.Hodcroft.2021.“CoVariants:SARS-CoV-2Mutations and Variations of Interest.”(covariants.org/variants)或O’Toole A.et al.,2020“PANGO lineages”(cov-lineages.org/)公开的网站数据库中找到全世界范围内不断增加的变体。因此，应当理解，本发明涵盖包含至少一种抗原的蛋白质亚单位疫苗，其特征在于该至少一种抗原包含来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体或由来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体组成，其中来自至少一种抗原中包含的SARS-CoV-2的至少一种变体的单体衍生自SARS-CoV-2的任何株或进化枝或变体或谱系或分离株。
奥密克戎变体(Lineage B.1.1.529或GR/484A，除非特别说明，否则被认为包括所有BA谱系(BA.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5以及后代谱系))于2021年11月24日首次由南非向WHO报告，并随后被归类为VOC。该变体有大量的刺突蛋白取代，包括A67V、del69-70、T95I、del142-144、Y145D、del211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F。本文提及的奥密克戎变体还包括循环重组变体，例如BA.1/BA.2谱系，称为XE。XE结合了奥密克戎BA.1和BA.2谱系的遗传物质以及两种现有毒株中都不存在的三种新突变。
德尔塔变体(Lineage B.1.617.2或G/478K.V1和AY谱系)携带刺突蛋白取代T19R、(V70F*)、T95I、G142D、E156-、F157-、R158G、(A222V*)、(W258L*)、(K417N*)、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N。它首先在印度被发现并被归类为VOC。本文提及的德尔塔变体还包括循环重组变体，例如具有BA.1谱系的德尔塔变体，称为XD和XF。XD和XF都是来自德尔塔和BA.1谱系的遗传物质的重组体。
重要的是，鉴于SARS-CoV-2病毒的不断进化以及我们对变体影响的理解不断发展，用于指代不同变体的工作定义和术语可能会定期调整。目前科学研究中使用的用于命名和追踪SARS-CoV-2遗传谱系的命名系统由GISAID、Nextstrain和Pango制定。因此，由于变体的名称可能会随着时间的推移而变化，我们在下面提供了从WHO网站检索到的表格，其中，截至2021年8月6日，以下变体命名法代表了迄今为止已建立的命名法，因此是起草本申请时使用的命名法：
目前命名的关注变体：
*监测下显著的刺突蛋白(S)氨基酸变化，目前在少数测序样品中报道。
自2022年4月12日起，WHO网站上还包含以下变体命名法：
鉴于这些表，并且作为示例，英国变体也可以被称为变体B.1.1.7或阿尔法变体；南非变体也可称为变体B.1.351或贝塔变体；巴西变体也可称为变体P.1或伽马变体；印度变体也可称为变体B.1.617.2或德尔塔。每个变体的不同名称被认为是同义的并且在本文中可互换使用。用于指定不同SARS-CoV-2变体的不同名称和特定点突变可以由技术人员容易地检索和更新，参见例如WHO网站：who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/。
在具体实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的至少一种抗原中包含的来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体衍生自选自包括但不限于以下的组中的SASR-CoV-2变体：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、LinageB.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、LinageB.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或Linage B.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。在优选的实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的至少一种抗原中包含的来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少一个单体衍生自选自以下组的SASR-CoV-2变体，该组由以下组成：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、LinageB.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、LinageB.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或Linage B.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。
在实施方式中，至少一种抗原可以是单体或多聚体的形式，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体，或其任何组合。在实施方式中，至少一种抗原由两个单体组成，并且其为二聚体(二聚抗原)的形式。在另一个实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含一种抗原或多于一种以不同形式(例如单体和二聚体存在)的抗原的混合物，。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种不同形式(例如单体和二聚体形式)的抗原，其中所述单体和二聚体形式的单体是RBD(下文分别称为单体RBD抗原或RBD-单体抗原和二聚RBD抗原或RBD-二聚体抗原，如定义部分中所定义)。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种单体RBD抗原和至少一种二聚RBD抗原的混合物。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含比单体RBD抗原更高比例的二聚RBD抗原。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗中包含的一种或多种抗原的比例为至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％二聚RBD抗原。单体RBD抗原和二聚RBD抗原的百分比的计算可以通过使用标准方法来确定，例如尺寸排阻色谱法(SEC)或高效液相色谱法(HPLC)。在尺寸排阻色谱中，所鉴定的二聚体峰和单体峰的峰下面积代表RBD单体和RBD二聚体的相对量。通过混合例如不同体积的二聚RBD抗原和单体RBD抗原，获得二聚RBD抗原相对于单体RBD抗原的特定比例是本领域技术人员已知的。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含比单体RBD抗原更高比例的非融合二聚RBD抗原。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含在蛋白质亚单位疫苗中包含的总抗原的至少51％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％百分比的二聚RBD抗原。
此外，本发明的发明人还测试了包括不同比例的单体和非融合二聚体的不同疫苗制剂。结果如图7所示，其中显示，当疫苗制剂具有较高的二聚RBD抗原(56％)与单体RBD抗原(44％)的比例时(E组)，体液应答显著增加。也就是说，即使疫苗组合物不包含任何免疫刺激剂并且即使疫苗包含一半剂量的RBD抗原(10μg/剂)，与其他组相比，体液应答也较高(参见图7B)。这种富含RBD二聚体的非融合二聚体疫苗的免疫原性也与市售mRNA疫苗(Spikevax，COVID-19mRNA疫苗(Moderna Biotech Spain，S.L.))的免疫原性进行了比较。图10显示，在第二剂量后，所有组中均引发高水平的IgG抗体滴度，其中C组中水平呈较高趋势，证明包含非融合RBD二聚体:单体非变体SARS-CoV-2抗原的疫苗(以高比例的二聚RBD为抗原)引发的免疫原性增强。当测量中和抗体时，图11也显示了这种趋势。
发明人还通过融合两种不同SARS-CoV-2变体(英国变体和南非变体)的两个RBD单体，设计了一种新的二聚RBD抗原，从而产生了包含融合二聚RBD抗原的候选疫苗。测试了融合二聚RBD抗原与Wuhan-Hu-1变体的非融合二聚体相比的诱导针对SARS-CoV-2病毒的抗体的能力，结果如图8所示。结果表明，与接受包含20μg剂量非融合Wuhan-Hu-1 RBD二聚体和单独的佐剂的疫苗制剂的组(G组)或包含20μg剂量非融合Wuhan-Hu-1 RBD二聚体和佐剂与QS-21免疫刺激剂一起的疫苗制剂的组(I组)相比，即使当动物接受低剂量包含融合二聚RBD抗原且不含任何免疫刺激剂的疫苗(B组和C组)时，他们能够产生更高的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度。此外，在相同剂量的抗原(20μg)下，与接受非融合Wuhan-Hu-1 RBD抗原加上佐剂和MPLA免疫刺激剂的组(H组)相比，即使组合物不包含任何免疫刺激剂(D组)，融合二聚RBD抗原也引起增强的反应。本文还显示出，用所述新的重组融合二聚RBD SARS-CoV-2抗原对动物进行免疫在所有组中引发了针对不同SARS-CoV-2变体(Wuhan-Hu-1、英国、南非、印度和巴西变体)的假病毒中和抗体滴度，这还表明，无论测试的变体如何以及疫苗配方中是否存在免疫刺激剂例如MPLA(E组)或QS.21(F组)(图12)，用融合二聚RBD抗原接种小鼠产生的中和抗体滴度均保持在高水平。接下来，使用猪这种更接近人的动物模型进行了研究。结果表明，与商业疫苗相比，融合二聚RBD抗原诱导了针对南非变体的显著更高的滴度，并且包含融合二聚RBD抗原的疫苗也比基于商业mRNA的疫苗更安全，如通过在接种疫苗后的猪的温度测量所测量的(参见图14和13)。这些结果表明，与市售疫苗相比，融合二聚RBD抗原在安全性和免疫原性之间呈现出优异的平衡，因为它能够在不增加体温或引起不良反应的情况下诱导中和抗体。
还进行了进一步的研究，特别是人体临床试验。结果显示，本发明的融合二聚RBD抗原引发了高水平的针对不同SARS-CoV-2变体例如贝塔、德尔塔和奥密克戎变体的中和抗体。此外，当与基于mRNA的疫苗(Comirnaty，BioNTech)相比时，还对本发明的融合二聚RBD抗原观察到针对SARS-CoV-2关切变体的增加的且更好的免疫原性应答，参见实施例11。
总而言之，这些结果出人意料地表明，包含融合二聚RBD抗原的制剂和包含非融合RBD抗原(其中二聚RBD抗原相对于单体RBD抗原的比例增加，更多超过50％)的制剂具有产生抗SARS-CoV-2RBD抗体的强大能力。此外，还显示出，基于本文产生的两种不同SARS-CoV-2变体的新的重组融合二聚RBD抗原的免疫原性和安全性的潜力增加。
因此，在本发明的第二方面，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种抗原，其特征在于该至少一种抗原包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的至少两个单体或由来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少两个单体组成，其中每个单体选自由刺突蛋白的S1亚单位、或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、或其任何免疫原性片段组成的组，并且其中两个单体可选地通过接头彼此化学结合，从而形成二聚体，优选融合二聚体或非融合二聚体。应注意，术语“融合二聚体”、“非融合二聚体”和“彼此结合”在上面的定义部分中定义。在优选的实施方式中，两个单体不同。“不同单体”是指二聚体的每个单体具有不同的氨基酸序列，例如，衍生自不同变体的RBD抗原的混合物，或衍生自相同或不同变体的RBD和S1抗原的混合物。优选地，融合二聚体中每个单体的氨基酸序列对应于不同的SARS-CoV-2氨基酸序列。
值得注意的是，上面定义的二聚抗原更优选地由两个单体形成。因此，在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种抗原，所述至少一种抗原包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的两个单体或由来自SARS-CoV-2的至少一种变体的至少两个单体组成，其中每个所述单体选自由刺突蛋白的S1亚单位、或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、或其任何免疫原性片段组成的组，并且其中两个单体可选地通过接头彼此化学结合，从而形成二聚体。
在实施方式中，二聚抗原是同二聚体，其特征在于包含两个单体、由两个单体组成或基本上由两个单体组成，其中每个单体选自由SARS-CoV-2的至少一种变体的刺突蛋白的S1亚单位或刺突蛋白的受体结合单体(RBD)或其任何免疫原性片段组成的组。在实施方式中，二聚抗原是同二聚体，其包含选定的SARS-CoV-2变体的RBD的两个单体、由或基本上由选定的SARS-CoV-2变体的RBD的两个单体组成。在另一个实施方式中，至少一种抗原是同二聚体，其包含选定的SARS-CoV-2变体的S1亚单位的两个单体、由或基本上由选定的SARS-CoV-2变体的S1亚单位的两个单体组成。在实施方式中，同二聚体抗原中包含的每个单体衍生自相同的SARS-CoV-2变体。在优选的实施方式中，二聚体抗原中包含的两个单体都是来自SARS-CoV-2病毒的至少一种变体的刺突蛋白的RBD。
在另一个实施方式中，形成二聚抗原的单体的氨基酸序列不同(也称为异二聚体)。它们氨基酸序列的差异可能是因为单体衍生自不同的SARS-CoV-2变体，或者因为它们是来自选定的SARS-CoV-2变体的不同抗原。在实施方式中，至少一种抗原是异二聚体，其特征在于由两个单体组成，其中第一单体选自由第一SARS-CoV-2变体的刺突蛋白的S1亚单位、或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、或其任何免疫原性片段组成的组，并且第二单体选自由第二SARS-CoV-2变体的刺突蛋白的S1亚单位、或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、或其任何免疫原性片段组成的组，其中第一和第二SARS-CoV-2变体相同或不同。在另一个实施方式中，异二聚体抗原由两个单体组成，其中一个单体是S1亚单位，另一个单体是RBD。
在优选的实施方式中，二聚抗原包含彼此结合的第一和第二单体或由彼此结合的第一和第二单体组成。如上文所定义，“彼此结合”是指它们通过非常弱、弱、强或非常强的键彼此化学连接。在优选的实施方式中，二聚抗原是非融合二聚体，其中非融合二聚体的两个单体通过可逆键、优选二硫键结合。在实施方式中，非融合二聚体抗原的两个单体的氨基酸序列是相同的。在另一个实施方式中，非融合二聚抗原的两个单体的氨基酸序列不同。
在另一个实施方式中，二聚体抗原是包含两个单体或由两个单体组成的融合二聚体，其中两个单体是单个多肽的一部分。在优选的实施方式中，融合二聚抗原的两个单体是单个多肽的一部分，因为它们至少通过肽键连接。在融合二聚抗原的情况下，两个单体通过相同的翻译复合物合成为相同多肽链的一部分。因此，融合二聚抗原的两个单体包含在同一分子内，这意味着形成一种抗原。在实施方式中，融合二聚体包含以任何顺序串联或串联重复而定位并且可选地通过接头肽连接的至少两个单体。在实施方式中，融合二聚体的两个单体的氨基酸序列相同。在另一个实施方式中，融合二聚抗原的两个单体的氨基酸序列不同。
在另一个实施方式中，根据第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗包含以不同形式存在的抗原的混合物，例如单体和二聚体，其中二聚体可以是非融合体和/或融合体，如上面定义的。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗优选包含单体抗原和二聚抗原的混合物，其中二聚体可以是非融合体和/或融合体，其中抗原包含RBD单体。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含比单体抗原更高比例的二聚抗原(非融合体或融合体)。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗中包含的抗原比例为至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的包含RBD单体的非融合或融合二聚体。包含一种RBD单体的单体抗原和包含两种RBD单体的二聚抗原的百分比的计算可以通过使用标准方法来确定，例如尺寸排阻色谱法(SEC)或高效液相色谱法(HPLC)。在尺寸排阻色谱中，所鉴定的二聚体峰和单体峰的峰下面积代表RBD单体和RBD二聚体的相对量。通过混合例如不同体积的二聚RBD抗原和单体RBD抗原，获得二聚RBD抗原相对于单体RBD抗原的特定比例是本领域技术人员已知的。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含比单体RBD抗原更高比例的非融合二聚RBD抗原。在一个实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少35％、40％、45％、50％、51％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％百分比的非融合二聚RBD抗原。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少单体RBD抗原和至少二聚RBD抗原的混合物，其中蛋白质亚单位疫苗中包含的总抗原的至少35％、40％、45％、50％、51％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％是二聚RBD抗原。
在第二方面的实施方式中，包含在非融合或融合二聚抗原中的每个单体均衍生自相同的SARS-CoV-2变体。在第二方面的实施方式中，非融合二聚抗原或融合二聚抗原中包含的每个单体衍生自相同的SARS-CoV-2变体，其中SARS-CoV-2变体选自美国疾病控制与预防中心(CDC)“SARS-CoV-2变体分类和定义”所定义的关切变体(VOC)。在第二方面的实施方式中，包含在非融合或融合二聚抗原中的每个单体均衍生自相同的SARS-CoV-2变体，其中该变体选自包括但不限于以下的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或Linage B.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。在第二方面的实施方式中，包含在非融合或融合二聚抗原中的每个单体均衍生自相同的SARS-CoV-2变体，其中该变体选自包括以下或由以下组成的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或Linage B.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。
在另一个实施方式中，包含在非融合或融合二聚抗原中的两个单体中的每一个均衍生自不同的SARS-CoV-2变体。在实施方式中，非融合二聚抗原或融合二聚抗原中包含的每个单体衍生自不同的SARS-CoV-2变体，其中每种SARS-CoV-2变体选自美国疾病控制与预防中心(CDC)“SARS-CoV-2变体分类和定义”所定义的关切变体(VOC)。在实施方式中，包含在非融合或融合二聚抗原中的每个单体衍生自不同的SARS-CoV-2变体，其中每种SARS-CoV-2变体选自包括但不限于以下的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或Linage B.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。在实施方式中，包含在非融合或融合二聚抗原中的每个单体衍生自不同的SARS-CoV-2变体，其中每种SARS-CoV-2变体选自由以下组成的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或Linage B.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。应当理解，非融合或融合二聚抗原的每个单体中的不同SARS-CoV-2变体的任何组合都包含在本发明的范围内。
在第二方面的实施方式中，非融合二聚抗原和融合二聚抗原的两个单体之一或两者是来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。在第二方面的实施方式中，非融合二聚抗原和融合二聚抗原的两个单体之一或两者是刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，其包含SARS-CoV-2的氨基酸残基319至537、由或基本上由SARS-CoV-2的氨基酸残基319至537组成。在第二方面的实施方式中，非融合二聚抗原和融合二聚抗原的两个单体之一或两者是刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，其包含SARS-CoV-2的氨基酸残基319至541、由或基本上由SARS-CoV-2的氨基酸残基319至541组成。在优选的实施方式中，非融合二聚抗原和融合二聚抗原的两个单体都是来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，其中所述RBD单体在其全长序列上与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：4或其任何组合具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
在优选的实施方式中，抗原是包含来自SARS-CoV-2的至少一种变体的两个RBD单体的非融合或融合二聚体，其中SARS-CoV-2的至少一种变体选自关切变体(VOC)。
在优选的实施方式中，抗原是包含来自SARS-CoV-2的至少一种变体的两个RBD单体的非融合或融合二聚体，其中变体选自包括但不限于以下的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或LinageB.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。
在优选的实施方式中，抗原是包含来自SARS-CoV-2的至少一种变体的两个RBD单体的非融合或融合二聚体，其中SARS-CoV-2的至少一种变体选自由以下组成的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、LinageB.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、LinageB.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或Linage B.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。
在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种非融合二聚体或由至少一种非融合二聚体组成，并且该非融合二聚体包含第一单体和第二单体或由第一单体和第二单体组成，第一单体和第二单体均衍生自Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)，并且其中非融合二聚体的两个单体通过可逆键结合。在另一个实施方式中，非融合二聚体的第一单体和/或第二单体包含蛋白质、由蛋白质组成或基本上由蛋白质组成，该蛋白质与序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的任一个或其任意组合具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
在第二方面的实施方式中，融合二聚体由来自第一SARS-CoV-2变体的第一RBD单体和来自不同的第二SARS-CoV-2变体的第二RBD单体组成。优选地，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种抗原，其中该至少一种抗原是融合二聚体，并且其中该融合二聚体包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：衍生自Linage B.1.351(南非SARS-CoV-2变体)的第一单体，以及衍生自Linage B.1.1.7(英国SARS-CoV-2变体)的第二单体，并且其中融合二聚体的两个单体是单个多肽的一部分。优选地，融合二聚体包含两个RBD单体(下文称为融合二聚RBD抗原)。
在实施方式中，融合二聚RBD抗原包含衍生自B.1.351变体的第一单体和衍生自B.1.1.7变体的第二单体。更优选地，融合二聚RBD抗原包含第一RBD单体和第二RBD单体，所述第一RBD单体包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：4或在其全长上与SEQ ID NO：4具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，所述第二RBD单体包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO：3或在其全长上与SEQ ID NO：3具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，融合二聚RBD抗原包含第一RBD单体和第二RBD单体，第一RBD单体包含SEQ ID NO：4、由SEQ ID NO：4组成或基本上由SEQ ID NO：4组成，第二RBD单体包含SEQ ID NO：3、由SEQ ID NO：3组成或基本上由SEQ ID NO：3组成。更优选地，融合二聚RBD抗原包含蛋白质、由蛋白质组成或基本上由蛋白质组成，该蛋白质在其全长上与SEQ IDNO：5具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性。在一些实施方式中，融合二聚RBD抗原包含SEQ ID NO：5(融合二聚RBD抗原序列)、由SEQ ID NO：5(融合二聚RBD抗原序列)组成或基本上由SEQ ID NO：5(融合二聚RBD抗原序列)组成。
在另一个实施方式中，融合二聚RBD抗原由在其全长上与SEQ ID NO：7具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，融合二聚RBD抗原由包含SEQ IDNO：7(融合二聚RBD核苷酸序列)、由SEQ ID NO：7(融合二聚RBD核苷酸序列)组成或基本上由SEQ ID NO：7(融合二聚RBD核苷酸序列)组成的核苷酸编码。在另一个实施方式中，融合二聚RBD抗原由在其全长上与SEQ ID NO：8具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，融合二聚RBD抗原由包含SEQ ID NO：8(融合二聚RBD核苷酸序列)、由SEQ ID NO：8(融合二聚RBD核苷酸序列)组成或基本上由SEQ ID NO：8(融合二聚RBD核苷酸序列)组成的核苷酸编码。
在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗，优选融合二聚RBD抗原，能够诱导免疫原性和/或保护性免疫应答，而不增加或改变用疫苗免疫的对象的基础体温，基础体温的增加理解为免疫后基础体温增加0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃、1℃、1.2℃、1.4℃、1.6℃、1.8℃、2℃或超过2℃。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗，优选融合二聚RBD抗原，能够诱导免疫原性和/或保护性免疫应答而不产生显著的副作用。优选地，蛋白质亚单位疫苗，优选融合二聚RBD抗原，能够诱导免疫原性和/或保护性免疫应答，而不产生显著的副作用，例如疲劳、注射部位疼痛、或压痛，如实施例11中所示。
在实施方式中，本发明的第一或第二方面或来自其任何实施方式的抗原中包含的任何单体可以选自由刺突蛋白的S1亚单位或刺突蛋白的受体结合单体(RBD)或其任何免疫原性片段组成的组，它们的氨基酸序列中包含标签序列或信号肽序列或包含两者。在实施方式中，RBD单体在N末端包含信号肽序列。在实施方式中，信号肽位于N末端并且选自由SEQID NO：6或SEQ ID NO：10组成的组。在替代实施方式中，信号肽可以被任何使得至少一种抗原能够表达的信号肽替换。在替代实施方式中，加工的抗原不包含信号肽。在至少一个单体表达后，N端信号肽被切割。在实施方式中，单体包含标签序列，优选His标签序列。本文所述的单体和抗原还可以包括对天然序列的额外修饰，例如额外的内部缺失、添加和取代。这些修饰可能是有意的，如通过定点诱变，也可能是偶然的，如通过自然发生的突变事件。
在另一个实施方式中，本发明的第一或第二方面或来自其任何实施方式的任何抗原是重组表达产物。用于产生重组抗原的方法是本领域已知的，并且它们通常包括将至少一种抗原克隆到表达运载体、优选质粒中，用所述质粒运载体转染真核或原核细胞，在所述细胞中表达所述抗原并从细胞或其上清液纯化至少一种抗原。
在实施方式中，质粒运载体是哺乳动物表达运载体。更优选地，用于表达至少一种抗原的表达运载体骨架选自由pcDNA3.4(GENSCRIPT)或pD2610-v10(ATUM)组成的组。在优选的实施方式中，用于表达本发明抗原的DNA序列被密码子优化并插入到选自由pcDNA3.4或运载体pD2610-v10(ATUM)的运载体中。在实施方式中，用于表达至少一种抗原的细胞是真核细胞，优选CHO细胞或HEK293哺乳动物细胞。在优选的实施方式中，从培养物上清液中收集并纯化至少一种抗原。
应当理解，本文提供的蛋白质亚单位疫苗中包含的一种或多种抗原是在允许所述一种或多种抗原适当折叠的合适的培养基条件下产生和维持的。技术人员会知道在生产的所有阶段期间维持和保存抗原的所需结构(包括其单体和多聚形式)的物理和化学条件。在实施方式中，选择培养基条件使得抗原的二聚形式优于单体形式。自发二聚可以由非常弱、弱、强或非常强的键控制，并且可以是共价键(例如二硫桥)或非共价键。技术人员将知道如何优化培养基条件以获得所需比例的二聚抗原和/或单体抗原。例如，不建议使用高温(高于二聚体的熔解温度)或离子去污剂(例如SDS)来自发形成二聚体。
在实施方式中，抗原在氧化剂例如谷胱甘肽存在下产生。在实施方式中，产生抗原的培养基中不存在还原剂例如二硫苏糖醇。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗的一种或多种抗原在适合保存其结构或有利于二聚体形成的温度下产生。本领域技术人员也知道调节所述温度。在实施方式中，抗原生产的温度范围为30℃至40℃，优选33℃至37℃，最优选33℃。
在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗和/或产生抗原的培养基的pH保持在pH7或更低。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗和/或产生抗原的培养基的pH保持在pH7或以上。在实施方式中，pH是酸性pH(低于7)。在实施方式中，pH是碱性pH(7以上)。在实施方式中，pH是中性的(约7)。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗的pH为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗的pH范围为4至9、5至8、5至7.5、5至7、5至6.5、5.5至6.5或这些范围内包含的任何值。在实施方式中，pH范围为5至9、5.5至9、6至9、6.5至9、7至9、7至8、或包含在这些范围内的任何值。
选择合适的佐剂有助于在先天水平和适应性水平上促进针对目标病原体的适当免疫应答，从而在保持安全性的同时引发保护性免疫，这一点至关重要，但并不简单。选择错误的佐剂可能会导致特定的疫苗抗原不能胜任。因此，疫苗抗原的选择必须仔细考虑使用哪种佐剂或佐剂和/或免疫刺激剂的组合，以避免丢弃潜在有效的候选疫苗抗原并帮助疫苗开发。本文公开的发明还表明，角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂是包含在蛋白质亚单位SARS-CoV-2疫苗中、特别是在包含选自由刺突蛋白的S1亚单位或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)的至少一种抗原的疫苗中的合适佐剂。具体地，我们在此示出了包含至少一种抗原的蛋白质亚单位疫苗，其特征在于其用角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂作为佐剂并包含S1亚单位或RBD单体，该蛋白质亚单位疫苗能够引发针对SARS-CoV-2病毒的高中和抗体滴度，如图1所示，并产生细胞因子的释放，从而表明细胞免疫应答的存在，如图2所示。S1亚单位或RBD单体与角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和免疫刺激剂(例如MPLA)的组合也引发了高中和抗体滴度和甚至更高的细胞免疫应答(图2，C组和G组)。
因此，在第一或第二方面的另一个实施方式中，如上文第一方面或第二方面或其任何实施方式中所定义的蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种佐剂，优选MF59C.1。在进一步的实施方式中，至少一种佐剂优选是角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂。此外，在另一个实施方式中，如上文第一或第二方面或其任何实施方式中所定义的蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂。可能的佐剂和免疫刺激剂定义如下。
至少一种佐剂
如上所述，根据第一或第二方面的蛋白质亚单位疫苗还可包含至少一种佐剂。至少一种佐剂可以包括但不限于：铝盐(明矾)(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等)、水包油或油包水乳液的制剂(例如完全弗氏佐剂(CFA)以及不完全弗氏佐剂(IFA))、矿物质佐剂、嵌段共聚物、由细菌细胞壁成分形成的佐剂例如包括脂糖(例如脂质A或单磷酰脂A(MPLA)、海藻糖二霉菌酸(TDB))的佐剂和由细胞壁骨架(CWS)的成分形成的佐剂、热休克蛋白或其衍生物、衍生自ADP-核糖基化细菌毒素的佐剂，其中包括白喉毒素(DT)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热毒素(LT1和LT2)、假单胞菌内毒素A和外毒素、蜡样芽孢杆菌外泌酶B、球形芽孢杆菌毒素、肉毒梭状芽胞杆菌毒素C2和C3、石灰梭状芽胞杆菌外酶以及产气荚膜梭状芽胞杆菌、螺旋状梭状芽胞杆菌(Clostridium spiriforma)和艰难梭状芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌的毒素、EDIM和突变毒素的突变体，突变毒素如CRM-197、白喉毒素、趋化因子和细胞因子(例如，白介素-2、白细胞介素-7、白细胞介素-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-y、白细胞介素-1(IL-1p)和IL-1(3肽或Sclavo肽))的无毒突变体、含细胞因子的脂质体、三萜糖苷或皂苷(例如ISCOM、QuilA和QS-21)、角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、角鲨烷或角鲨烷水包油佐剂制剂(例如SAF、MF59和MF59C.1)、胞壁酰二肽(MDP)衍生物(例如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(苏氨酰-MDP)、GMDP、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺(MTP-PE))、未甲基化的CpG二核苷酸和寡核苷酸(例如细菌DNA及其片段)、寡脱氧核苷酸(ODN)和聚磷腈。
其他合适的矿物佐剂包括但不限于：氢氧化铝凝胶(ALHYDROGEL、REHYDRAGEL)、磷酸铝凝胶(包括铝羟基磷酸凝胶(AlPO4；Adju-Phos CRODA))、磷酸钙、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺。
在另一个实施方式中，使用微粒佐剂。微粒佐剂包括但不限于：可生物降解和生物相容性聚酯、乳酸(PLA)和乙醇酸(PGA)的均聚物和共聚物、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)微粒、自结合成颗粒的聚合物(泊洛沙姆颗粒)、可溶性聚合物(聚磷腈)、和病毒样颗粒(VLP)，例如重组蛋白颗粒，例如乙型肝炎表面抗原(HbsAg)。
还可以使用的另一种类型的佐剂包括粘膜佐剂，包括但不限于来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(LT)、来自霍乱弧菌的霍乱全毒素(CT)和霍乱毒素B亚单位(CTB)、突变毒素(例如，LTK63和LTR72)、微粒和聚合脂质体。粘液靶向佐剂的其他例子是具有降低毒性的大肠杆菌突变体不耐热毒素LT、结合胃肠道M细胞的活减毒生物体(例如霍乱弧菌和伤寒沙门氏菌、牛分枝杆菌(BCG))，以及粘膜靶向颗粒载体，如磷脂人工膜囊泡、共聚物微球、亲脂性免疫刺激复合物和细菌外膜蛋白制剂(蛋白酶体)。
本领域已知的其他佐剂也包括在本发明的范围内(参见，例如，Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach,Chap.7,Michael F.)。
优选地，所述至少一种佐剂选自由以下组成的列表：磷酸铝凝胶佐剂、优选AlPO4凝胶；Adju-Phos CRODA，或角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、优选MF59C.1或其衍生物。更优选地，至少一种佐剂是MF59C.1。更优选地，至少一种佐剂是角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂。
MF59佐剂是由角鲨烯(2,6,10,15,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四己烷)(4.3％)和两种非离子表面活性剂聚山梨酯80(也称为Tween 80)(0.5％)和脱水山梨糖醇三油酸酯85(也称为Span 85)(0.5％)组成的水包油乳液。该乳液是一种乳白色水包油乳液，由两种非离子表面活性剂(聚山梨酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯)稳定。基本过程包括将脱水山梨糖醇三油酸酯分散在角鲨烯中，将聚山梨酯80分散在水性缓冲液中，然后高速混合形成粗乳液。然后使粗乳液反复通过微流化器，产生均匀小液滴尺寸的o/w乳液，可将其无菌过滤并装入小瓶中以备后用。该过程在本领域中有大量描述，例如O’Hagan D.T.etal.,The history of adjuvant:a phoenix that arose from the ashes.ExpertRev Vaccines.2013Jan；12(1):13-30。MF59C.1佐剂是MF59原始佐剂的优化版本，由完全相同的成分组成，并进一步包含注射用柠檬酸盐的水缓冲液(柠檬酸一水合物，以及柠檬酸钠二水合物)，以提供比原MF59佐剂更高的稳定性。
制备MF59C.1佐剂的方法也是本领域技术人员已知的(参见O’Hagan D.T.et al.,supra or in U.S.App.No.2009/0208523)。
在实施方式中，佐剂可以与共聚物、病毒颗粒、脂质体(蜗牛壳状(cochleated))一起配制为乳液、水包油制剂，或与免疫刺激剂一起配制。在实施方式中，至少一种佐剂可以与蛋白质亚单位疫苗的其他组分混合(在施用之前或与施用同时)，或者可替代地，至少一种佐剂不与蛋白质亚单位疫苗的其他组分混合而是单独地与它们共同施用。在优选的实施方式中，佐剂MF59C.1与至少一种抗原混合。在优选的实施方式中，佐剂是角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂并且其与至少一种抗原混合。
优选地，在本发明的上下文中，当提到“角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂”时，具体指的是制作成由角鲨烯(2,6,10,15,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四己烷)(4.3％)和两种非离子表面活性剂聚山梨酯80(也称为Tween 80)(0.5％)和脱水山梨糖醇三油酸酯85(也称为Span 85)(0.5％)组成的水包油乳液。所述乳液是一种乳白色水包油乳液，由两种非离子表面活性剂(聚山梨酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯)稳定。优选地，过程包括将脱水山梨糖醇三油酸酯分散在角鲨烯中，将聚山梨酯80分散在水性缓冲液中，然后高速混合形成粗乳液。然后使粗乳液反复通过微流化器，产生均匀小液滴尺寸的o/w乳液，可将其无菌过滤并装入小瓶中以备后用。更优选地，值得注意的是，在本发明的上下文中，以下角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂是特别优选的并且选自以下列表，下文中称为“特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂”：
-优选地，特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂包含以下或优选由以下组成：每剂约1至15mg角鲨烯、每剂0.1至2mg聚山梨酯80、每剂0.1至2mg脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.08至1mg柠檬酸钠和每剂0.004至0.05的柠檬酸。
-优选地，特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂每0.1ml剂量包含以下或优选由以下组成：1.46mg角鲨烯、0.18mg聚山梨酯80、0.18mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.099mg柠檬酸钠和0.006mg柠檬酸。
-优选地，特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂每0.1ml剂量包含以下或优选由以下组成：1.95mg角鲨烯、0.235mg聚山梨酯80、0.235mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.132mg柠檬酸钠和0.008mg柠檬酸。
-优选地，特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂每0.5ml剂量包含以下或优选由以下组成：9.75mg角鲨烯、1.175mg聚山梨酯80、1.175mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.66mg柠檬酸钠和0.04mg柠檬酸。
-优选地，特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂包含以下或优选由以下组成：10至60mg/ml角鲨烯、1至6mg/ml聚山梨酯80、1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、0.5至6mg/ml柠檬酸钠、和0.01至0.5mg/ml柠檬酸。
-优选地，特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂包含以下或优选由以下组成：约19.5mg/ml角鲨烯、2.35mg/ml聚山梨酯80、2.35mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、1.32mg/ml柠檬酸钠、和0.08mg/ml柠檬酸。
-优选地，特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂包含以下或优选由以下组成：约39mg/ml角鲨烯、4.7mg/ml聚山梨酯80、4.7mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、2.64mg/ml柠檬酸钠、和0.16mg/ml柠檬酸。
在实施方式中，MF59C.1被配制为每剂约1至15mg角鲨烯、每剂0.1至2mg聚山梨酯80、每剂0.1至2mg脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.08至1mg柠檬酸钠和每剂0.004至0.05柠檬酸。在实施方式中，MF59C.1被配制为每0.1ml剂量约1.46mg角鲨烯、0.18mg聚山梨酯80、0.18mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.099mg柠檬酸钠和0.006mg柠檬酸。在实施方式中，MF59C.1被配制为每0.1ml剂量约1.95mg角鲨烯、0.235mg聚山梨酯80、0.235mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.132mg柠檬酸钠和0.008mg柠檬酸。在优选的实施方式中，MF59C.1被配制为每0.5ml剂量约9.75mg角鲨烯、1.175mg聚山梨酯80、1.175mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.66mg柠檬酸钠和0.04mg柠檬酸。
在实施方式中，MF59C.1被配制为约10至60mg/ml角鲨烯、1至6mg/ml聚山梨酯80、1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、0.5至6mg/ml柠檬酸钠和0.01至0.5mg/ml柠檬酸。在实施方式中，MF59C.1被配制为约19.5mg/ml角鲨烯、2.35mg/ml聚山梨酯80、2.35mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、1.32mg/ml柠檬酸钠和0.08mg/ml柠檬酸。在优选的实施方式中，MF59C.1被配制为约39mg/ml角鲨烯、4.7mg/ml聚山梨酯80、4.7mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、2.64mg/ml柠檬酸钠和0.16mg/ml柠檬酸。
在其他实施方式中，任何上述类别的佐剂可以彼此组合使用或与其他佐剂、抗原或免疫刺激剂组合使用。
至少一种免疫刺激剂
如上所述，根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗可以可选地进一步包含至少一种免疫刺激剂。至少一种免疫刺激剂可包括但不限于Toll样受体(TLR)激动剂、NOD样受体激动剂或细胞因子。Toll样受体主要在免疫细胞中表达，在免疫活性中发挥关键作用，并且已知通过活性药物成分的刺激来促进树突状细胞的成熟。Toll样受体激动剂可以包括选自由以下组成的组：例如，TLR-1激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂和TLR-9激动剂，但不限于此。NOD样受体是通过吞噬作用或孔进入细胞的病原体相关分子模式(PAMP)以及与细胞应激相关的损伤相关分子模式分子(DAMPS)的细胞内传感器，是模式识别受体的一部分并在先天免疫应答中发挥重要作用。NOD样受体激动剂可包括例如NLRA激动剂、NLRB激动剂、NLRC激动剂或NLRP激动剂，但不限于此。细胞因子是免疫细胞分泌的蛋白质的总称，已知诱导巨噬细胞和淋巴细胞的增殖或促进其分化。细胞因子可包括，例如，IL-1α、IL-113、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、TNF-α、TNF-β、IFNα或IFNβ。本发明中包括的免疫刺激剂还可以是聚(I:CU)、CpG、咪喹莫特、雷西莫特、dSLIM、Toll样受体激动剂如单磷酰脂A(MPLA)、鞭毛蛋白、质粒DNA双链DNA、单链DNA、皂苷如QS-21和白细胞介素细胞因子，但不限于此。
在优选的实施方式中，至少一种免疫刺激剂选自由Toll样受体激动剂(例如单磷酰脂A(MPLA))或皂苷(例如C92O46H148(QS-21))组成的组。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种免疫刺激剂，其中该免疫刺激剂选自由单磷酰脂A(MPLA)和/或C92O46H148(QS-21)组成的组。
QS-21是一种酰化3,28-双链三萜糖苷(3,28-bisdesmodic triterpeneglycoside)，分子式C92O46H148，分子量1990Da。它最初被指定为复杂RP-HPLC迹线中的一个特定级分，特别是皂树(Quillaja saponaria)的活性级分21(RP-HPLC峰)，如Kensil C.etal.Separation and characterization of saponins with adjuvant activity fromQuillaja saponaria Molina cortex.J Immunol 1991；146:431e7和Ragupathi etal.Natural and synthetic saponin adjuvant QS-21for vaccines againstcancer.Exp Rev Vaccin 2011；10:463e70所述。QS-21级分对一系列抗原表现出卓越的免疫刺激和佐剂特性。它能够增强抗体和T细胞针对多种传染病、退行性疾病和癌症对疫苗抗原的具有临床意义的应答。
单磷酰脂A(MPLA或MPL)是从细菌脂多糖获得的已知免疫刺激剂，通常从明尼苏达沙门氏菌(Salmonella Minnesota)的脂多糖获得，例如，由SIGMA公司以商品名“单磷酰脂A，来自明尼苏达沙门氏菌的Re 595(Re突变体)”(产品L 6895)商购获得的免疫刺激剂。在本发明的上下文中，单磷酰脂A还包括也适合作为免疫刺激剂的其衍生物和合成类似物，例如3-脱酰基化衍生物(3D-MPL或3D-MPLA)，例如由SIGMA公司以MPLTM命名的可商购的那些。还可以使用单磷酰脂A的合成类似物，例如专利申请WO2008/153541-A1中描述的那些或通过Avanti Polar Lipids公司(产品PHADTM)或AdipoGen(产品AG-CU1-0002)商购获得的那些。
制备免疫刺激剂的方法是本领域技术人员已知的。
在实施方式中，至少一种免疫刺激剂可以与蛋白质亚单位疫苗的其他组分混合(在施用之前或与施用同时)，或者可替代地，至少一种免疫刺激剂不与蛋白质亚单位疫苗的其他组分混合而是单独地与它们共同施用。在优选的实施方式中，将免疫刺激剂MPLA与至少一种抗原和与至少一种佐剂混合。在优选的实施方式中，将免疫刺激剂QS-21与至少一种抗原和与至少一种佐剂混合。
在另一个实施方式中，任何上述类别的免疫刺激剂可以彼此组合使用或与其他佐剂、抗原或免疫刺激剂组合使用。
用量
本领域技术人员可以容易地确定如上定义的蛋白质亚单位疫苗的每种组分的用量，例如通过确定有效引发预防性或治疗性免疫应答的剂量，例如通过测量疫苗特异性免疫球蛋白的血清滴度或通过测量血清样品与未接受该组分的对照相比的抑制率。此外，本领域技术人员还能够使蛋白质亚单位疫苗的每种组分的剂量适合施用蛋白质亚单位疫苗的对象。例如，通过包括在小鼠模型中测试的相同用量或将在小鼠模型中测试的用量乘以2、3、4、5、6、7或8倍，可以将在小鼠模型中测试的剂量外推到人。优选地，用于人的佐剂和免疫刺激剂调整剂量通过将小鼠模型中测试的用量乘以5来获得。
在实施方式中，根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗根据需要包含治疗有效量的至少一种或多种抗原。“治疗有效量”是指在施用疫苗的未感染的、感染的或未暴露的个体中诱导免疫原性和保护性免疫应答的量。“治疗有效量”是指足以诱导免疫应答的抗原的量，该免疫应答减轻与SARS-CoV-2感染或相关疾病有关的至少一种症状或临床体征。本文所用的术语“免疫原性和保护性免疫应答”、“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指接种疫苗的对象能够预防感染或疾病、预防该感染或疾病的症状或临床体征的发展、延迟感染或疾病或其症状或临床体征的发作，或降低随后的感染或疾病或症状或临床体征的严重程度。这种反应通常会导致对象产生针对疫苗的分泌介导的免疫应答、细胞介导的免疫应答和/或抗体介导的免疫应答。细胞介导的免疫应答包括CD4+T辅助细胞应答、细胞毒性T淋巴细胞CD8+、细胞抗病毒反应和抗病毒趋化因子反应。抗体介导的免疫应答包括通过血清学测定(例如病毒中和测定、ADCC测定、ELISA、免疫印迹测定以及其他已知测定)测量的免疫应答。因此，保护性免疫应答包括但不限于以下效应中的一种或多种效应：产生任何免疫学类别的抗体，例如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴细胞的增殖；向免疫细胞提供活化、生长和分化信号；辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞的扩增。本领域已知的几种方法可用于在临床前和临床试验中研究候选疫苗产生的保护性免疫。例如，可以通过计算接种疫苗的动物在感染致死或亚致死剂量的SARS-CoV-2后的存活百分比、识别指示疾病的症状的发展(体重下降、发烧)、或量化受感染器官中的病毒载量以在临床前水平分析保护性免疫。
如实施例10和图15所示，使用包含融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗，在用致死剂量的包含D614G突变的Wuhan-Hu-1样分离株攻击的免疫小鼠中实现了完全保护性免疫应答(100％存活且无体重减轻)(亚单位疫苗包含融合蛋白，该融合蛋白由第一单体和第二单体组成，第一单体包含衍生自B.1.351(南非)变体的RBD，第二单体包含衍生自B.1.1.7(英国)变体的RBD)。对照组体重减轻，死亡率为100％。重要的是，即使在亚单位疫苗的最低测试剂量(10μg)下也能实现这种完全保护。
因此，在实施方式中，根据第一或第二方面或其任何实施方式的亚单位疫苗能够预防SARS-CoV-2病毒感染。“预防”包括但不限于减少、降低或改善症状、病症、病况或疾病的风险或严重性，以及保护动物免受症状、病症、病况或疾病的影响。在实施方式中，预防性和/或治疗性地应用或施用本文提供的亚单位疫苗。在优选的实施方式中，如第一或第二方面或其任何实施方式中所定义的，包含至少一种抗原、优选包含至少一种融合二聚体的亚单位疫苗能够诱导免疫原性和/或保护性免疫应答，所述免疫原性和/或保护性免疫应答能够预防由至少一种或任何SARS-CoV-2变体引起的SARS-CoV-2病毒感染和/或与SARS-CoV-2感染相关的临床体征或表现。“与SARS-CoV-2感染相关的临床体征”包括但不限于：发烧、寒颤、疲劳、干咳、味觉或嗅觉丧失、皮疹、胸痛、体重减轻、厌食、头痛、肌痛、腹泻、产生痰液、咽喉痛、鼻塞、呼吸困难、流鼻涕、淋巴细胞减少等症状以及死亡。优选地，本文提供的亚单位疫苗能够诱导免疫原性和/或保护性免疫应答，所述免疫原性和/或保护性免疫应答能够预防由至少一种SARS-CoV-2变体引起的SARS-CoV-2病毒感染和/或与SARS-CoV-2感染相关的临床体征或表现，其中该变体选自包括但不限于以下的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或LinageB.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。更优选地，融合二聚体能够诱导免疫原性和/或保护性免疫应答，所述免疫原性和/或保护性免疫应答能够预防由至少一种或任一种SARS-CoV-2变体引起的SARS-CoV-2感染和/或与SARS-CoV-2感染相关的临床体征或表现，该融合二聚体是包含在其全长上与SEQ ID NO：5具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的蛋白质、由或基本上由在其全长上与SEQ ID NO：5具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的蛋白质组成的融合二聚RBD抗原，或者是由在其全长上与SEQ ID NO：7具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核苷酸序列编码的融合二聚RBD抗原。
在实施方式中，根据第一或第二方面或其任何实施方式的亚单位疫苗能够预防由SARS-CoV-2感染引起的死亡和体重减轻。在优选的实施方式中，如第一或第二方面或其任何实施方式中所定义的，包含至少一种抗原、优选包含至少一种融合二聚体的亚单位疫苗能够诱导免疫原性和/或保护性免疫应答，所述免疫原性和/或保护性免疫应答能够预防由至少一种或任何SARS-CoV-2变体的SARS-CoV-2病毒感染引起的死亡和体重减轻。优选地，本文提供的亚单位疫苗能够诱导免疫原性和/或保护性免疫应答，所述免疫原性和/或保护性免疫应答能够预防由至少一种SARS-CoV-2变体的SARS-CoV-2病毒感染引起的死亡和体重减轻，其中该变体选自包括但不限于以下的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、LinageB.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、LinageB.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或Linage B.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。更优选地，融合二聚体能够诱导免疫原性和/或保护性免疫应答，所述免疫原性和/或保护性免疫应答能够预防由至少一种或任何一种SARS-CoV-2变体的SARS-CoV-2病毒感染引起的死亡和体重减轻，该融合二聚体是包含在其全长上与SEQ ID NO：5具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的蛋白质、由或基本上由在其全长上与SEQ IDNO：5具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的蛋白质组成的融合二聚RBD抗原，或者是由在其全长上与SEQ IDNO：7具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的核苷酸序列编码的融合二聚RBD抗原。
在实施方式中，本文提供的亚单位疫苗能够诱导能够预防SARS-CoV-2病毒感染的免疫原性和/或保护性免疫应答，其中这种免疫原性和/或保护性免疫应答可以是同源免疫原性的和/或异源免疫原性的。“同源免疫原性”和“同源保护性免疫应答”在本文中是指在宿主暴露于一种病原体或抗原后针对相同病原体或变体产生的免疫或保护性免疫。“异源免疫原性”和“异源保护性免疫应答”在本文中是指在宿主暴露于一种病原体或抗原后针对不同病原体或变体产生的免疫或保护性免疫。
实施例10表明，包含分别衍生自ZA和UK变体的两个单体的融合二聚RBD变体SARS-CoV-2亚单位疫苗能够诱导针对异源攻击即针对疫苗中未使用的SARS-CoV-2变体(包含D614G突变的Wuhan-Hu-1样变体)的免疫原性和保护性免疫应答。这支持了以下观点：本文提供的亚单位疫苗，优选二聚亚单位疫苗，更优选融合二聚体，能够诱导异源免疫原性和/或异源保护性免疫应答。
在实施方式中，施用足以引起疾病症状的治疗或预防的有效量的根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗。本领域技术人员可以根据有需要的对象的年龄、性别、体重和其他身体和/或代谢状况容易地确定合适的有效量。“治疗有效量”可以落在可以通过常规试验确定的相对较宽的范围内。
更具体地，根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗的不同组分的可能用量详述如下：
关于一种或多种抗原的用量，在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗中包含的抗原的总量为约1μg/剂、2μg/剂、3μg/剂、4μg/剂、5μg/剂、6μg/剂、7μg/剂、8μg/剂、9μg/剂、10μg/剂、11μg/剂、12μg/剂、13μg/剂、14μg/剂、15μg每剂、16μg/剂、17μg/剂、18μg/剂、19μg/剂、20μg/剂、25μg/剂、30μg/剂、35μg/剂、40μg/剂、45μg/剂、50μg/剂、60μg/剂、70μg/剂、80μg/剂、90μg/剂或超过100μg/剂。优选地，根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗中包含的一种或多种抗原的总量为约10μg总抗原、15μg总抗原、20μg总抗原、25μg总抗原、30μg总抗原、35μg总抗原、40μg总抗原、45μg总抗原、50μg总抗原、55μg总抗原、60μg总抗原、70μg总抗原、80μg总抗原、90μg总抗原或100μg总抗原。优选地，一种或多种抗原的总量为每剂5至50μg，最优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg抗原。
关于佐剂的用量，在优选的实施方式中，MF59C.1佐剂以每剂约10％/90％、20％/80％、30％/70％、40％/60％、50％/50％、60％/40％、70％/30％、80％/20％，90％/10％的佐剂/抗原(v/v)的相对百分比存在于根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗中。优选地，蛋白质亚单位疫苗中存在的佐剂的量相对于一种或多种抗原的量(％佐剂/％抗原)(v/v)为60-40％/40-60％，优选75％/25％，更优选50％/50％。
在进一步优选的实施方式中，佐剂是特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂，并且以每剂约10％/90％、20％/80％、30％/70％、40％/60％、50％/50％、60％/40％、70％/30％、80％/20％，90％/10％的佐剂/抗原(v/v)的相对百分比存在于根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗中。优选地，蛋白质亚单位疫苗中存在的所述佐剂的量相对于一种或多种抗原的量(％佐剂/％抗原)(v/v)为60-40％/40-60％，优选75％/25％，更优选50％/50％。
在另一个实施方式中，磷酸铝佐剂，优选AlPO4凝胶，以每剂至少5mg、每剂10mg、每剂20mg、每剂30mg、每剂40mg、每剂50mg、每剂60mg、每剂70mg、每剂80mg、每剂90mg、每剂100mg或每剂超过100mg的剂量存在于根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗中。在实施方式中，磷酸铝佐剂，优选AlPO4凝胶，以约1-10mg/剂、5-15mg/剂、5-20mg/剂、10-20mg/剂、20-30mg/剂、30-40mg/剂、40-50mg/剂、50-60mg/剂、60-70mg/剂、或70-80mg/剂的剂量存在于根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗中。优选地，磷酸铝佐剂、更优选AlPO4凝胶以10至60mg/剂、优选约10mg/剂或50mg/剂的剂量配制。
关于免疫刺激剂，在实施方式中，可选地包含在根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗中的至少一种免疫刺激剂的总量为约5μg/剂、10μg/剂、15μg/剂、20μg/剂、25μg/剂、30μg/剂、35μg/剂、40μg/剂、45μg/剂、50μg/剂、60μg/剂、70μg/剂、80/剂、90/剂、100/剂。在优选的实施方式中，每剂免疫刺激剂的总量范围为1至100μg、10至90μg、20至80μg、20至70μg、优选5至60μg、或包含在这些范围内的任何值。更优选地，免疫刺激剂的总量为10μg或50μg。在另一优选的实施方式中，免疫刺激剂选自由MPLA或QS-21组成的组，其存在量为约每剂1μg、每剂2μg、每剂3μg、每剂4μg、每剂5μg、每剂6μg、每剂7μg、每剂8μg、每剂9μg、每剂10μg、每剂15μg、每剂20μg、每剂25μg、每剂30μg、35μg每剂、每剂40μg、每剂45μg、每剂50μg、每剂60μg、每剂70μg、每剂80μg、每剂90μg、每剂100μg。优选地，至少一种免疫刺激剂是MPLA或QS-21，其剂量范围为每剂1至100μg、每剂5至60μg、每剂10至90μg、每剂20至80μg、每剂20至70μg，优选每剂5至60μg，或包含在这些范围内的任何值。更优选地，MPLA或QS-21的总量为每剂10μg或每剂50μg。
在其他实施方式中，任何上述类别的免疫刺激剂可以彼此组合使用或与其他佐剂和抗原组合使用。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少两种免疫刺激剂。优选地，蛋白质亚单位疫苗包含两种免疫刺激剂MPLA和QS-21，它们混合在一起并且同时施用，或者分开在不同容器中但同时或依次施用。在优选的实施方式中，MPLA和QS-21每剂的总量为约1μg，优选2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg，其中两种免疫刺激剂的比例为以任何顺序(即，独立地，比如是QS-21:MPLA或MPLA:QS-21)的1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。优选地，两种免疫刺激剂之间的比例为1:1。在实施方式中，它们各自的总量范围为每剂5至30μg，优选每剂5至25μg。更优选地，它们各自的总量为每剂10μg，其中5μg来自QS-21，另外5μg来自MPLA。在另一个实施方式中，总量是50μg剂量，其中25μg来自QS-21，另外25μg来自MPLA。
在以下段落中，我们将指出根据第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗中的至少一种抗原、至少一种佐剂和可选的至少一种免疫刺激剂的进一步优选组合的非详尽列表。从下文开始，当提及术语“RBD抗原”时，应理解该术语涵盖任何“单体RBD抗原”或“二聚RBD抗原”，包括“非融合RBD抗原”和“融合RBD抗原”。从下文开始，当提及术语“S1抗原”时，应理解该术语涵盖任何“单体S1抗原”或“二聚S1抗原”，包括“非融合S1抗原”和“融合S1抗原”。
在实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗至少包含RBD抗原和至少一种佐剂或至少由RBD抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是MF59C.1。在进一步的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少包含S1亚单位抗原和至少一种佐剂或至少由S1亚单位抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是MF59C.1。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由RBD抗原和作为佐剂的MF59C.1组成。在另一个实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由S1亚单位抗原和作为佐剂的MF59C.1组成。
在实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗至少包含RBD抗原和至少一种佐剂或至少由RBD抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是特定角鲨烯或水包油角鲨烯佐剂制剂。在进一步的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少包含S1亚单位抗原和至少一种佐剂或至少由S1亚单位抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由RBD抗原和特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂组成。在另一个实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由S1亚单位抗原和特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂组成。
在实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗至少包含RBD抗原和至少一种佐剂或至少由RBD抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是AlPO4凝胶。在进一步的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少包含S1亚单位抗原和至少一种佐剂或至少由S1亚单位抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是AlPO4凝胶。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由RBD抗原和作为佐剂的AlPO4凝胶组成。在另一个实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由S1亚单位抗原和作为佐剂的AlPO4凝胶组成。
在优选的实施方式中，根据第一方面的蛋白质亚单位疫苗包含以下或由以下组成：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)作为佐剂的MF59C.1，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第一方面的蛋白质亚单位疫苗包含以下或由以下组成：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)作为佐剂的MF59C.1，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第一方面的蛋白质亚单位疫苗包含以下或由以下组成：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)佐剂，其包含每剂10至60mg/ml角鲨烯、每剂1至6mg/ml聚山梨酯80、每剂1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.5至6mg/ml柠檬酸钠，以及每剂0.01至0.5mg/ml柠檬酸，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第一方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)佐剂，其包含每剂10至60mg/ml角鲨烯、每剂1至6mg/ml聚山梨酯80、每剂1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.5至6mg/ml柠檬酸钠，以及每剂0.01至0.5mg/ml柠檬酸，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
根据第一方面或其任何实施方式，至少一种免疫刺激剂可以与如上所述的至少一种佐剂组合。在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含作为佐剂的MF59C.1和作为免疫刺激剂的MPLA或由作为佐剂的MF59C.1和作为免疫刺激剂的MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、MF59C.1和MPLA或由至少一种RBD抗原、MF59C.1和MPLA组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1和MPLA或由至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1和MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、MF59C.1和QS-21或由至少一种RBD抗原、MF59C.1和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1和QS-21组成。
根据第一方面或其任何实施方式，至少一种免疫刺激剂可以与如上所述的至少一种佐剂组合。在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和作为免疫刺激剂的MPLA或由特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和作为免疫刺激剂的MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和MPLA，或由至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和MPLA组成。在另一个优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和MPLA，或由至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和QS-21，或由至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和QS-21组成。在另一个优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和QS-21，或由至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和QS-21组成。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含作为佐剂的AlPO4凝胶和作为免疫刺激剂的MPLA，或由作为佐剂的AlPO4凝胶和作为免疫刺激剂的MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶和MPLA或由至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶和MPLA组成。在另一优选实施方式中，所述蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶和MPLA或由至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶和MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶和QS-21或由至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、A1PO4凝胶和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶和QS-21组成。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、MF59C.1、MPLA和QS-21或由至少一种RBD抗原、MF59C.1、MPLA和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1、MPLA和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1、MPLA和QS-21组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21或由至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21组成。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、MPLA和QS-21，或由至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、MPLA和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、MPLA和QS-21，或由至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、MPLA和QS-21组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21，或由至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21组成。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)作为佐剂的MF59C.1，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)作为佐剂的MF59C.1，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)佐剂，其包含每剂约10至60mg/ml角鲨烯、每剂1至6mg/ml聚山梨酯80、每剂1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.5至6mg/ml柠檬酸钠，以及每剂0.01至0.5mg/ml柠檬酸，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)佐剂，其包含每剂约10至60mg/ml角鲨烯、每剂1至6mg/ml聚山梨酯80、每剂1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.5至6mg/ml柠檬酸钠，以及每剂0.01至0.5mg/ml柠檬酸，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在实施方式中，根据第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗至少包含RBD抗原和至少一种佐剂或至少由RBD抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是MF59C.1。在进一步的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少包含S1亚单位抗原和至少一种佐剂或至少由S1亚单位抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是MF59C.1。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由RBD抗原和作为佐剂的MF59C.1组成。在另一个实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由S1亚单位抗原和作为佐剂的MF59C.1组成。
在实施方式中，根据第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗至少包含RBD抗原和至少一种佐剂或至少由RBD抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是特定角鲨烯或水包油角鲨烯佐剂制剂。在进一步的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少包含S1亚单位抗原和至少一种佐剂或至少由S1亚单位抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由RBD抗原和特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂组成。在另一个实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由S1亚单位抗原和特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂组成。
在实施方式中，根据第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗至少包含RBD抗原和至少一种佐剂或至少由RBD抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是AlPO4凝胶。在进一步的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少包含S1亚单位抗原和至少一种佐剂或至少由S1亚单位抗原和至少一种佐剂组成，其中至少一种佐剂是AlPO4凝胶。在实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由RBD抗原和作为佐剂的AlPO4凝胶组成。在另一个实施方式中，蛋白质亚单位疫苗至少由S1亚单位抗原和作为佐剂的AlPO4凝胶组成。
在优选的实施方式中，根据第二方面的蛋白质亚单位疫苗包含以下或由以下组成：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)作为佐剂的MF59C.1，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第二方面的蛋白质亚单位疫苗包含以下或由以下组成：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)作为佐剂的MF59C.1，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第二方面的蛋白质亚单位疫苗包含以下或由以下组成：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)佐剂，其包含每剂约10至60mg/ml角鲨烯、每剂1至6mg/ml聚山梨酯80、每剂1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.5至6mg/ml柠檬酸钠，以及每剂0.01至0.5mg/ml柠檬酸，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
在优选的实施方式中，根据第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)佐剂，其包含每剂约10至60mg/ml角鲨烯、每剂1至6mg/ml聚山梨酯80、每剂1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.5至6mg/ml柠檬酸钠，以及每剂0.01至0.5mg/ml柠檬酸，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg。
根据第二方面或其任何实施方式，至少一种免疫刺激剂可以与如上所述的至少一种佐剂组合。在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含作为佐剂的MF59C.1和作为免疫刺激剂的MPLA或由作为佐剂的MF59C.1和作为免疫刺激剂的MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、MF59C.1和MPLA或由至少一种RBD抗原、MF59C.1和MPLA组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1和MPLA或由至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1和MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、MF59C.1和QS-21或由至少一种RBD抗原、MF59C.1和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1和QS-21组成。
根据第二方面或其任何实施方式，至少一种免疫刺激剂可以与如上所述的至少一种佐剂组合。在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和作为免疫刺激剂的MPLA或由特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和作为免疫刺激剂的MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和MPLA，或由至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和MPLA组成。在另一个优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和MPLA，或由至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和QS-21，或由至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和QS-21组成。在另一个优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和QS-21，或由至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂和QS-21组成。
在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含作为佐剂的AlPO4凝胶和作为免疫刺激剂的MPLA，或由作为佐剂的AlPO4凝胶和作为免疫刺激剂的MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、AlPO44凝胶和MPLA或由至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶和MPLA组成。在另一优选实施方式中，所述蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶和MPLA或由至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶和MPLA组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶和QS-21或由至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、A1PO4凝胶和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶和QS-21组成。
在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、MF59C.1、MPLA和QS-21或由至少一种RBD抗原、MF59C.1、MPLA和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1、MPLA和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、MF59C.1、MPLA和QS-21组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21或由至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21组成。
在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、MPLA和QS-21，或由至少一种RBD抗原、特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、MPLA和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、MPLA和QS-21，或由至少一种S1亚单位抗原、特异性角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、MPLA和QS-21组成。在优选的实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21，或由至少一种RBD抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21组成。在另一优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21或由至少一种S1亚单位抗原、AlPO4凝胶、MPLA和QS-21组成。
在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)作为佐剂的MF59C.1，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)作为佐剂的MF59C.1，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)特定角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂，比例(v/v)为40-60％佐剂和60-40％抗原，优选50％佐剂和50％抗原，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的S1亚单位，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)佐剂，其包含每剂约10至60mg/ml角鲨烯、每剂1至6mg/ml聚山梨酯80、每剂1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.5至6mg/ml柠檬酸钠，以及每剂0.01至0.5mg/ml柠檬酸，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
在第二方面或其任何实施方式的优选实施方式中，蛋白质亚单位疫苗包含：至少一种变体SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD抗原，每剂5至50μg，优选每剂10μg、每剂20μg或每剂40μg，以及
i)佐剂，其包含每剂10至60mg/ml角鲨烯、每剂1至6mg/ml聚山梨酯80、每剂1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、每剂0.5至6mg/ml柠檬酸钠，以及每剂0.01至0.5mg/ml柠檬酸，或
ii)作为佐剂的AlPO4凝胶，每剂10-60mg、优选每剂10mg或每剂50mg，
并且其中蛋白质亚单位疫苗还包含至少一种免疫刺激剂，其中至少一种免疫刺激剂由以下组成：
a)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的MPLA，或
b)5-60μg/剂、优选10μg/剂或50μg/剂的QS-21，或，
c)5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的MPLA，和5-30μg/剂、优选5μg/剂或25μg/剂的QS-21。
本文在第一或第二方面或其任何实施方式中描述的疫苗通常可包含一种或多种“药学上可接受的赋形剂或溶媒”，例如水、盐水、甘油、乙醇等。另外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可以存在于此类溶媒中。通常，蛋白质亚单位疫苗被制备成注射剂，可以是液体溶液或悬浮液；还可以制备适合在注射前溶解于或悬浮于液体溶媒中的固体形式。可选地存在载体，这种载体是本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的分子。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(例如油滴或脂质体)和失活的病毒颗粒。这种载体是本领域普通技术人员众所周知的。在另一个实施方式中，组合物可以在囊泡中例如在脂质体中递送。药物制剂的制备方法是本领域技术人员众所周知的，例如在雷明顿手册TheScience and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,2000[ISBN:0-683-306472]中所描述的。
施用方案
本领域技术人员可以以已知的方式选择和优化施用途径和时间表。
施用途径可以是全身的或局部的。可以使用许多施用方法，包括但不限于：口服、经肠胃外(例如皮内、肌内、静脉内和皮下)、经透皮、经粘膜(例如鼻内和口服或肺部途径或通过阴道栓剂)、经肺部递送、经栓剂、经划痕(划破皮肤表层，例如使用分叉针)。在具体实施方式中，本发明的蛋白质亚单位疫苗经肌内、静脉内、皮内或皮下途径肠胃外施用，或者通过透皮途径施用。优选地，所述蛋白质亚单位疫苗通过肌内或皮下途径施用。更优选地，所述蛋白质亚单位疫苗以约0.10ml至10ml、或0.10ml至1ml的体积肌内施用。优选地，所述蛋白质亚单位疫苗以0.25ml至1.0ml的体积施用。更优选地，所述蛋白质亚单位疫苗以约0.1ml的体积施用。甚至更优选地，所述蛋白质亚单位疫苗以约0.5ml的体积施用。
在某些实施方式中，第一或第二方面或其任何实施方式中提供的蛋白质亚单位疫苗按照包含单剂量或可选择的多(即2、3、4等)剂量的疫苗方案或时间表施用至对象。优选地，将蛋白质亚单位疫苗分两剂施用于有需要的对象。在某些实施方式中，所述蛋白质亚单位疫苗按照包括第一剂量(初免)和第二剂量(加强)的时间表施用给有需要的对象。
如本文所用，初免是指首次施用本文所述的蛋白质亚单位疫苗允许产生对靶抗原的免疫应答的任何方法。一旦对象被初免，第二次施用第二种疫苗会诱导第二免疫应答，其持续时间比第一免疫所实现的更强或更长。初免涵盖包括第一单剂量或多剂量的方案。在实施方式中，用SARS-CoV-2进行首次感染可被视为初免免疫，并且首次施用单剂量的蛋白质亚单位疫苗作为加强剂。
初免和加强施用之间的时间间隔可以是数小时、数天、数周、数月或数年。在其他实施方式中，本文描述的蛋白质亚单位疫苗可以作为加强剂施用以增加对象初免后实现的免疫应答。加强组合物通常在施用初免组合物后数周或数月，例如约1或2周或3周、或4周、或6周、或8周、或16周、或20周、或24周、或28周或32周或一到两年，施用一次或多次。优选地，在初免后1-12周或2-12周、更优选在初免后1、2、3或4周施用加强接种。在优选的实施方式中，第二剂量或加强剂量在第一剂量或初免后一周、优选二周、三周或四周施用。在另外的实施方式中，第二剂量在初免后至少2周或至少4周进行。在另一个优选的实施方式中，第二次剂量在初免后约4-12周或4-8周进行。
另外，第三加强剂量或随后的加强剂量可以在第二剂量之后以及初次施用后三个月至两年，或甚至更长，优选4至6个月，或6个月至一年内施用。当第二剂量后在对象的血清和/或尿液或粘膜分泌物中没有检测到特异性免疫球蛋白或检测到低水平的特异性免疫球蛋白时，可以可选地施用第三剂量。
在实施方式中，本文提供的蛋白质亚单位疫苗可以作为初免剂并作为随后的加强剂施用。在其他实施方式中，所述蛋白质亚单位疫苗可以与其他疫苗组合用于初免和/或加强，例如mRNA疫苗、质粒疫苗、运载体疫苗、其他蛋白质亚单位疫苗或其组合。
在实施方式中，第一或第二方面或其任何实施方式中提供的蛋白质亚单位疫苗可以作为加强剂以单剂量施用至先前已经接种过本文提供的蛋白质亚单位疫苗或其他疫苗的对象。在这种情况下，本文提供的蛋白质亚单位疫苗在之前的疫苗已经施用给对象之后的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或多于十周、数月或数年施用。
在一些实施方式中，在暴露于SARS-CoV-2病毒之前，例如暴露于SARS-CoV-2之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时或1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，将本文提供的蛋白质亚单位疫苗以本文定义的任何剂量、途径或时间表施用于对象。在某些实施方式中，在暴露于SARS-CoV-2病毒之后，例如暴露于SARS-CoV-2之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时或1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、或1周、2周、3周、或4周、或6周、或8周、或16周、或20周、或24周、或28周、或32周，将本文提供的蛋白质亚单位疫苗以本文定义的任何剂量、途径或时间表施用于对象。
试剂盒
本文还提供了包含第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗的试剂盒。因此，本发明的第三方面涉及包含一剂、优选两剂或更多剂本发明的第一或第二方面或其任何实施方式中定义的蛋白质亚单位疫苗的试剂盒。因此，试剂盒可以包括如第一或第二方面或其任何实施方式中所定义的至少一种抗原、至少一种佐剂和可选的至少一种免疫刺激剂。所述蛋白质亚单位疫苗的各组分可以独立提供，即分开在单独的容器中，或混合提供，即全部一起在一个或多个容器中。
因此，在实施方式中，试剂盒可以包含本发明的蛋白质亚单位疫苗的一个或多个容器或小瓶，或者包含蛋白质亚单位疫苗的一个或多个容器或小瓶以及用于向处于SARS-CoV-2感染风险的对象施用的说明书。在某些实施方式中，说明书指示将本发明的蛋白质亚单位疫苗以单剂量或多剂量(即2、3、4剂等)剂量施用于对象，如上文施用时间表部分中所定义。在某些实施方式中，说明书指示将本发明的蛋白质亚单位疫苗以首次(初免)和随后(加强)施用的方式施用于初次或非初次施用的对象。优选地，试剂盒包含至少两个用于初免/加强免疫的小瓶，其在第一小瓶/容器中包含第一接种或第一剂量(“初免接种”)的本发明的蛋白质亚单位疫苗，在第二和/或另外的小瓶/容器中包含至少第二和/或第三和/或另外的接种或剂量(“加强接种”)的本发明的蛋白质亚单位疫苗。
优选地，试剂盒包含用于第一施用或第一剂量(初免)的在第一小瓶或容器中的和用于第二施用或第二剂量(加强)的在第二小瓶或容器中的免疫学有效量的根据本发明的第一或第二方面或其任何实施方式的蛋白质亚单位疫苗。
在本发明第二方面的另一个实施方式中，本文提及的任何试剂盒可包含用于第三、第四或进一步施用的第三、第四或另外的小瓶或容器，所述小瓶或容器包含本发明全文所指定的蛋白质亚单位疫苗。
在进一步优选的实施方式中，前述任一方面中提供的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于产生针对SARS-CoV-2病毒的至少一种变体的免疫应答。
在另一个优选的实施方式中，前述任一方面中提供的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于产生针对SARS-CoV-2病毒的至少一种变体的保护性免疫应答。
蛋白质亚单位疫苗的方法和用途
在第四方面，本发明还提供了使用如本发明的第一、第二和第三方面或其任何实施方式中所述的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于针对SARS-CoV-2病毒的至少一种变体对对象进行免疫的方法。第四方面还涉及如第一、第二和第三方面或其任何实施方式中所述的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于在有需要的对象中产生针对SARS-CoV-2病毒的至少一种变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的用途。优选地，第四方面涉及如第一、第二和第三方面或其任何实施方式中所述的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于在有需要的对象中产生针对SARS-CoV-2病毒的至少一种不同变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的用途，其中变体选自疾病控制和预防中心(CDC)所描述的关切变体(VOC)。优选地，第四方面涉及如第一、第二和第三方面或其任何实施方式中所述的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于在有需要的对象中产生针对SARS-CoV-2病毒的至少一种不同变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的用途，其中该变体选自包括以下或由以下组成的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或LinageB.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。优选地，第四方面涉及如第一、第二和第三方面或其任何实施方式中所述的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于在有需要的对象中产生针对SARS-CoV-2病毒的至少两种不同变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的用途。优选地，第四方面涉及如第一、第二和第三方面或其任何实施方式中所述的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于在有需要的对象中产生针对SARS-CoV-2病毒的至少两种不同变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的用途，其中变体选自疾病控制和预防中心(CDC)所描述的关切变体(VOC)。优选地，第四方面涉及如第一、第二和第三方面或其任何实施方式中所述的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于在有需要的对象中产生针对SARS-CoV-2病毒的至少两种不同变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的用途，其中该变体选自包括以下或由以下组成的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)、Linage B.1.1.7(英国变体)、Linage B.1.617.2或G/478K.V1(德尔塔变体)或Linage B.1.1.529或GR/484A(奥密克戎变体)或其任意组合。
还包括上面所述的蛋白质亚单位疫苗和试剂盒用于制备用于免疫对象的药物或蛋白质亚单位疫苗的用途，特别是用于制备用于在对象中治疗和/或预防SARS-CoV-2引起的疾病的药物或疫苗，其中SARS-CoV-2疾病是由SARS-CoV-2病毒的至少一种变体引起的。本文还提供了用于引发或加强针对SARS-CoV-2感染的免疫应答的根据本文任何实施方式的所述蛋白质亚单位疫苗和试剂盒，其中施用所述蛋白质亚单位疫苗一次、两次、三次或四次。优选地，蛋白质亚单位疫苗施用两次。本文还提供了根据本文任何实施方式的所述蛋白质亚单位疫苗和试剂盒，其用于在先前已接种针对SARS-CoV-2的对象中加强针对SARS-CoV-2感染的免疫应答，其中蛋白质亚单位疫苗以单剂量施用。
因此，本发明的第四方面还提供了在有需要的对象中、优选在人对象中产生针对SARS-CoV-2病毒的至少一种变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的方法，该方法包括向对象施用本发明第一或第二方面或其任何实施方式中所述的蛋白质亚单位疫苗。术语“免疫原性和保护性免疫应答”、“保护性免疫”或“保护性免疫应答”已在上文定义。
在某些实施方式中，对象是哺乳动物或鸟类物种。对象可以是人、伴侣动物例如狗和猫，家养动物例如鸡和鹅、马、牛和羊、雪貂、猪物种例如猪、仔猪、母猪或后备母猪，以及动物园哺乳动物例如非人灵长类动物、猫科动物、犬科动物和牛科动物。
在实施方式中，该方法包括向对象施用至少一剂本发明的蛋白质亚单位疫苗，优选对象是人。
在本发明第四方面的某些实施方式中，对象是人。在某些实施方式中，对象是新生儿(至多2个月)、婴儿(出生至2岁)、儿童(2岁至14岁)、青少年(15岁至18岁)、成人(18岁以上)或老年人(约65岁或以上)。在某些实施方式中，成人是免疫功能受损的。
在进一步的实施方式中，如本发明的第一、第二或第三方面或其任何实施方式中定义的蛋白质亚单位疫苗或试剂盒用于在对象中产生针对SARS-CoV-2的至少一种变体的免疫原性和/或保护性免疫应答。
在进一步的实施方式中，如本发明的第一、第二或第三方面或其任何实施方式中定义的蛋白质亚单位疫苗或试剂盒用于在对象中产生针对SARS-CoV-2的至少两种不同变体的免疫原性和/或保护性免疫应答。
序列表
SEQ ID NO：1：RBD单体：SARS-CoV-2刺突蛋白(Wuhan-Hu-1变体)的氨基酸残基319至541：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFK
CYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNS
NNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQ
PTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
SEQ ID NO：2：S1亚单位单体：SARS-CoV-2刺突蛋白(Wuhan-Hu-1变体)的氨基酸残基13至685：
SQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSG
TNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCE
FQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREF
VFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPG
DSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGI
YQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSA
SFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC
VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPL
QSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVL
TESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLY
QDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICA
SYQTQTNSPRRAR
SEQ ID NO：3：B1.1.7变体的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD单体的氨基酸残基319至537：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL
NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLY
RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP
ATVCGPKKSTNLVKNK
SEQ ID NO：4：B.1.351变体的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD单体的氨基酸残基319至537：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL
NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLY
RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP
ATVCGPKKSTNLVKNK
SEQ ID NO：5：融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的氨基酸序列，其包含衍生自B.1.351变体的第一单体(SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD的第319至537位)和衍生自B.1.1.7变体的第二单体(SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的第319至537位)：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL
NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLY
RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP
ATVCGPKKSTNLVKNKRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYN
SASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWN
SNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVG
YQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNK
SEQ ID NO：6：信号肽：
MGWSCIILFLVATATGVHS
SEQ ID NO：7：DNA序列，其编码Kozak序列、信号肽、融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原(其是编码B.1.351变体的RBD单体的第319至537位氨基酸和B.1.1.7变体的RBD单体的第319至537位氨基酸的核苷酸序列的串联)、组氨酸标签和终止密码子：
GCCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCTACCGGCGTGCACAGTAG
AGTGCAGCCTACCGAGTCTATCGTGCGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGTCCTTTCGGCGAGG
TGTTCAACGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCTCTAACTGCGTG
GCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCC
TACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGAGGCGAC
GAAGTGCGGCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGCAATATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCG
ACGACTTCACCGGCTGTGTGATCGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAA
CTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAACCTGAAGCCTTTCGAGCGGGACATCTCCA
CCGAGATCTACCAGGCTGGCAGCACCCCTTGTAATGGCGTGAAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCA
CTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCTACCTATGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCT
GTCCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACCGTGTGCGGCCCTAAGAAATCTACCAACCTGGTCA
AGAACAAGCGGGTGCAGCCCACTGAGAGCATTGTGCGCTTCCCTAATATCACAAATCTGTGCCCC
TTCGGGGAAGTCTTTAATGCTACCCGCTTCGCTTCCGTGTATGCTTGGAATAGAAAGCGGATCAG
CAATTGCGTCGCCGATTACAGCGTCCTGTACAATAGCGCCAGCTTCTCCACCTTTAAGTGTTATGG
CGTCAGCCCCACAAAGCTCAACGATCTCTGTTTTACCAATGTCTACGCCGATAGCTTTGTGATTCG
CGGAGATGAAGTCCGCCAGATCGCACCAGGCCAGACTGGAAAGATCGCTGATTACAATTATAAG
CTCCCTGATGATTTCACAGGATGCGTTATCGCCTGGAATAGCAACAACCTCGACAGCAAAGTTGG
AGGGAATTACAACTACCTCTACCGCCTCTTCAGAAAGAGCAACCTCAAGCCATTTGAGAGAGAC
ATCAGTACAGAAATCTATCAGGCCGGCTCTACCCCTTGCAACGGCGTCGAGGGGTTTAACTGTTA
CTTTCCCCTGCAATCTTATGGGTTTCAGCCCACATACGGCGTGGGGTATCAACCCTATCGCGTGGT
GGTTCTGAGTTTCGAACTCCTGCACGCCCCAGCCACAGTGTGTGGCCCAAAAAAGAGCACCAAT
CTCGTTAAGAACAAGCACCATCACCATCACCATTAG
SEQ ID NO：8：编码融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原(其是编码B.1.351变体的RBD单体的第319至537位氨基酸和B.1.1.7变体的RBD单体的第391至537位氨基酸的核苷酸序列的串联)的DNA序列：
AGAGTGCAGCCTACCGAGTCTATCGTGCGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGTCCTTTCGGCGA
GGTGTTCAACGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCTCTAACTGC
GTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTC
CCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGAGGC
GACGAAGTGCGGCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGCAATATCGCCGACTACAACTACAAGCTGC
CCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATCGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGG
CAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAACCTGAAGCCTTTCGAGCGGGACATCT
CCACCGAGATCTACCAGGCTGGCAGCACCCCTTGTAATGGCGTGAAGGGCTTCAACTGCTACTTC
CCACTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCTACCTATGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGAGTGGTGGT
GCTGTCCTTCGAGCTGCTGCATGCTCCTGCTACCGTGTGCGGCCCTAAGAAATCTACCAACCTGG
TCAAGAACAAGCGGGTGCAGCCCACTGAGAGCATTGTGCGCTTCCCTAATATCACAAATCTGTGC
CCCTTCGGGGAAGTCTTTAATGCTACCCGCTTCGCTTCCGTGTATGCTTGGAATAGAAAGCGGATC
AGCAATTGCGTCGCCGATTACAGCGTCCTGTACAATAGCGCCAGCTTCTCCACCTTTAAGTGTTAT
GGCGTCAGCCCCACAAAGCTCAACGATCTCTGTTTTACCAATGTCTACGCCGATAGCTTTGTGATT
CGCGGAGATGAAGTCCGCCAGATCGCACCAGGCCAGACTGGAAAGATCGCTGATTACAATTATA
AGCTCCCTGATGATTTCACAGGATGCGTTATCGCCTGGAATAGCAACAACCTCGACAGCAAAGTT
GGAGGGAATTACAACTACCTCTACCGCCTCTTCAGAAAGAGCAACCTCAAGCCATTTGAGAGAG
ACATCAGTACAGAAATCTATCAGGCCGGCTCTACCCCTTGCAACGGCGTCGAGGGGTTTAACTGT
TACTTTCCCCTGCAATCTTATGGGTTTCAGCCCACATACGGCGTGGGGTATCAACCCTATCGCGTG
GTGGTTCTGAGTTTCGAACTCCTGCACGCCCCAGCCACAGTGTGTGGCCCAAAAAAGAGCACCA
ATCTCGTTAAGAACAAG
SEQ ID NO：9：Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2的刺突蛋白序列(UniProt No.P0DTC2)：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFS
NVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIV
NNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLE
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SEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO：10：信号肽。
MGWSLILLFLVAVATRVLS
通过考虑本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。说明书和实施例意在仅被视为示例性的，本发明的真实范围和精神由所附权利要求来指示。
实施例
实施例1：测试2种不同候选抗原与4种不同佐剂的组合的小鼠体内免疫研究。
本研究评估了针对SARS-CoV-2的不同蛋白质亚单位候选疫苗。该研究评估了不同疫苗制剂中SARS-CoV-2的不同重组亚单位抗原、以及不同蛋白质亚单位疫苗制剂在小鼠中的免疫原性能力。
总共86只6-7周龄的BALB/c小鼠被选用于该研究。小鼠被分配到9个不同的组，分别接受不同的疫苗制剂。除对照组(A组)包括6只小鼠外，每组分配10只小鼠。根据治疗组，动物接受皮下施用的两剂0.1ml的以下疫苗制剂。这些疫苗被配制为“即用型”疫苗。第一剂在第0天施用于动物，第二剂则相隔3周(第21天)。
-A组：该组为对照组。该组中的动物接受了包含PBS的模拟疫苗。
-B组：该组中的动物接受了每剂包含20μg SARS-CoV-2的重组RBD抗原的疫苗。该疫苗以0.1ml剂量用水包油佐剂以75％佐剂和25％抗原的v/v比例配制。水包油佐剂配制如下：19.5mg/ml角鲨烯、2.35mg/ml聚山梨酯80、2.35mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、1.32mg/ml柠檬酸钠和0.08mg/ml柠檬酸。因此，施用的0.1ml剂量的疫苗包含1.46mg角鲨烯、0.18mg聚山梨酯80、0.18mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.099mg柠檬酸钠和0.006mg柠檬酸。
-C组：该组中的动物接受了每剂包含20μg SARS-CoV-2的重组RBD抗原的疫苗。该疫苗用与B组相同的佐剂配制，在0.1ml剂量的疫苗组合物中比例为v/v 75％佐剂和25％抗原，以及加上10μg/剂的MPLA免疫刺激剂(L6895，SIGMA)，MPLA免疫刺激剂添加到抗原相中。
-D组：该组中的动物接受了每剂包含20μg SARS-CoV-2的重组RBD抗原的疫苗。该疫苗用每剂10mg佐剂AlPO4凝胶(Adju-Phos CRODA)配制，在0.1ml剂量的疫苗组合物中比例为v/v 75％佐剂和25％抗原，以及加上10μg/剂的MPLA免疫刺激剂(L6895，SIGMA)，MPLA免疫刺激剂添加到抗原相中。
-E组：该组中的动物接受了每剂包含20μg SARS-CoV-2的重组RBD抗原的疫苗。该疫苗用每剂10mg佐剂AlPO4凝胶(Adju-Phos CRODA)配制，在0.1ml剂量的疫苗组合物中比例为v/v 75％佐剂和25％抗原，以及加上5μg/剂的免疫刺激剂MPLA免疫刺激剂(L6895，SIGMA)和5μg/剂的免疫刺激剂QS-21(QS-21，DESERT KING)，两种免疫刺激剂添加到抗原相中。
-F组：该组中的动物接受了每剂包含20μg SARS-CoV-2的重组S1抗原的疫苗。该疫苗用与B组相同的佐剂配制，在0.1ml剂量的疫苗组合物中比例为v/v 75％佐剂和25％抗原。
-G组：该组中的动物接受了每剂包含20μg SARS-CoV-2的重组S1抗原的疫苗。该疫苗用与B组相同的佐剂配制，在0.1ml剂量的疫苗组合物中比例为v/v 75％佐剂和25％抗原，以及加上10μg/剂的MPLA免疫刺激剂(L6895，SIGMA)，MPLA免疫刺激剂添加到抗原相中。
-H组：该组中的动物接受了每剂包含20μg SARS-CoV-2的重组S1抗原的疫苗。该疫苗用每剂10mg佐剂AlPO4凝胶(Adju-Phos CRODA)配制，在0.1ml剂量的疫苗组合物中比例为v/v 75％佐剂和25％抗原，以及加上10μg/剂的MPLA免疫刺激剂(L6895，SIGMA)，MPLA免疫刺激剂添加到抗原相中。
-I组：该组中的动物接受了每剂包含20μg SARS-CoV-2的重组S1抗原的疫苗。该疫苗用每剂10mg佐剂AlPO4凝胶(Adju-Phos CRODA)配制，在0.1ml剂量的疫苗组合物中比例为v/v 75％佐剂和25％抗原，以及加上5μg/剂的免疫刺激剂MPLA免疫刺激剂(L6895，SIGMA)和5μg/剂的免疫刺激剂QS-21(QS-21，DESERT KING)，两种免疫刺激剂添加到抗原相中。
该研究中用于产生RBD亚单位抗原的SARS-CoV-2RBD序列由SARS-CoV-2刺突糖蛋白(UniProtNo.P0DTC2)的第319至541位组成。
该研究中用于产生S1亚单位抗原的SARS-CoV-2S1序列由SARS-CoV-2刺突糖蛋白(UniProt No.P0DTC2)的第16至682位组成。
为了制备疫苗，RBD和S1编码基因针对CHO细胞表达进行了密码子优化，并连同用于瞬时表达的N端信号肽序列MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：10)和C端六组氨酸标签进一步克隆到表达质粒pD2610-v10(瞬时表达运载体，来自ATUM)中。
将脱水山梨糖醇三油酸酯分散在角鲨烯中以获得油相来制备水包油佐剂。然后，通过将聚山梨酯80与柠檬酸钠在柠檬酸中的水性缓冲液混合来获得水相。油相和水相均经过过滤，然后进行高速混合，以形成尺寸低于1μm的均匀小液滴的水包油乳液。
本实施例中，生产水包油佐剂，得到19.5mg/ml角鲨烯、2.35mg/ml聚山梨酯80、2.35mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、1.32mg/ml柠檬酸钠和0.08mg/ml柠檬酸的水包油佐剂制剂。
SARS-CoV-2RBD和S1抗原是在ExpiCHO-S细胞系(ThermoFisher)中产生的。ExpiCHO-S细胞系在ExpiCHO表达培养基(ThermoFisher)中于37℃、80％湿度和8％CO2下培养，并以125rpm搅拌，进行扩增。然后，用在OptiPRO SFM复合培养基(ThermoFisher)中与ExpiFectamine CHO试剂(ThermoFisher)预混合的1μg/ml表达质粒瞬时转染密度为6x106个细胞/ml的细胞。培养第5天，室温下以300g离心5分钟除去细胞，保留上清液。
然后用5ml HiScreen Ni FF(Cytiva)柱通过固定化金属亲和层析纯化上清液。用包含20mM磷酸钠、500mM NaCl、500mM咪唑的pH7.2的缓冲液洗脱目标蛋白。纯化的目标蛋白用PBS(10kDa RC膜)透析，浓缩至1mg/ml，并使用0.22μm孔径的PES过滤器(Millex-GP)过滤，并保存在-80℃备用。
为了评估给动物接种疫苗后针对SARS-CoV-2的免疫应答，分析了两个不同的参数：(i)血清中的中和抗体，和(ii)细胞应答(细胞因子和活性淋巴细胞)。结果在实施例2中提供。
实施例2：中和抗体和免疫细胞应答的评估。
评估血清中的中和抗体。为此，在进行第二剂疫苗后20至21天(第40-41天)，从所有接种疫苗的动物中提取血清样本。
使用SARS-CoV-2假病毒通过假病毒中和测定(PBNA)来测定血清中的中和抗体，如Nie J.et al.Quantification of SARS-CoV-2neutralizing antibody by apseudotyped virus-based assay.Nat Protoc.2020Nov；15(11):3699-3715中所述。为此测定生成了表达SARS-CoV-2S蛋白以及荧光素酶的假病毒。
对于中和测定，将200TCID50的假病毒上清液与热灭活血清样品的连续稀释液在37℃下预孵育1小时，然后添加到人ACE-2过表达的HEK293T细胞上。48小时后，用BritelitePlus荧光素酶试剂(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)裂解细胞。使用EnSight多模式酶标仪(Perkin Elmer)测量发光0.2秒。所有测定均以双复孔进行。通过比较从用每种血浆处理的感染细胞计算出的实验RLU(相对光单位)与最大RLU(从未处理的感染细胞计算出的最大感染力)和最小RLU(从未感染细胞计算出的最小感染力)来计算血浆样品的中和能力，并表示为中和百分比：
使用Graph Pad Prism(v8.3.0)将标准化剂量反应中和曲线拟合为具有可变斜率的四参数曲线。所有IC50值均以稀释度倒数表示(抑制50％感染所需的浓度)。
样品按以下稀释度进行测试：1/60、1/180、1/540、1/1620、1/4860和1/14580。可以量化60至14580之间的中和滴度。低于或高于定量限的更低和更高滴度分别表示为＜60和＞14580。
为了评估细胞免疫应答，在接受第二剂疫苗21天后对动物实施安乐死。然后，提取脾脏以获得脾细胞。根据脾细胞所来自的治疗组，用与疫苗制剂中存在的抗原(RBD或S1)相对应的抗原体外刺激脾细胞。刺激后培养脾细胞66至72小时。然后，测定上清液中获得的细胞因子INF-γ、IL-4、IL-10和IL-6的培养物浓度。通过标准ELISA技术测定细胞培养物上清液中的细胞因子浓度(pg/ml)。
血清中的中和抗体的结果显示，与对照组(A组)相比，所有接种组中的中和抗体的滴度更高。结果表明，与包含S1抗原的疫苗相比，包含RBD抗原的疫苗诱导了更高的体液反应，具有更高的中和抗体(图1)。接种包含RBD抗原的疫苗的组(B组至E组)中的大多数动物的体液反应在测试的稀释度范围内均高于PBNA测定的定量限(＞14580)。该结果令人惊讶地显示出所有测试的疫苗、特别是包含RBD抗原的疫苗强大的产生中和抗体的能力。
关于细胞免疫应答，可以清楚地观察到佐剂的选择在获得强免疫应答中起着关键作用(图2A-H)。在接受包含配制为19.5mg/ml角鲨烯、2.35mg/ml聚山梨酯80、2.35mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、1.32mg/ml柠檬酸钠和0.08mg/ml柠檬酸的水包油佐剂和作为免疫刺激剂的MPLA的疫苗的组(C组和G组)中，无论是用RBD抗原还是S1抗原治疗，都令人惊奇地显示，与其余组相比，在用相应抗原刺激的脾细胞的培养物中细胞因子的产量更高。结果还表明，与仅包含水包油佐剂的疫苗(B组和F组)相比，在水包油佐剂中进一步包含免疫刺激剂、特别是MPLA(C组和G组)显著增加了细胞因子(IFN-γ、IL-4和IL-6)的产生。还证明了，无论动物用RBD抗原还是S1抗原处理，与仅包含AlPO4凝胶和MPLA的制剂(D组和H组)相比，将免疫刺激剂QS-21加入到包含AlPO4凝胶和MPLA的制剂(E组和I组)中还增加了细胞因子(IFN-γ、IL-4和IL-6)的产生。
据描述，SARS-CoV-2感染中的“抗体依赖性增强”(ADE)与巨噬细胞大量产生IL-6以及IL-10产生减少有关(Iwasaki and Yang,2020)。因此，该研究还表明，水包油佐剂和MPLA制剂将适合降低可能接触病毒的接种疫苗人群的ADE风险，因为它显示出脾细胞刺激后IFN-γ/IL-6细胞因子比率增加和高IL-10产量。
总体而言，结果表明，包含SARS-CoV-2的亚单位RBD抗原或S1抗原以及佐剂并且还包含免疫刺激剂的针对SARS-CoV-2的亚单位疫苗为对象提供了更高的免疫应答。
如前所述，两种水包油佐剂(配制为19.5mg/ml角鲨烯、2.35mg/ml聚山梨酯80、2.35mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、1.32mg/ml柠檬酸钠和0.08mg/ml柠檬酸)和MPLA用于人疫苗。从结果可以看出，水包油佐剂足以诱导接种疫苗的对象产生针对SARS-CoV-2的免疫应答。由于其已知的安全性，该佐剂也适合用于疫苗组合物中。此外，当水包油佐剂疫苗制剂中进一步包含免疫刺激剂时，免疫应答显著增强。因此，在疫苗组合物中使用免疫刺激剂进一步增强了接受所述疫苗组合物的对象的免疫应答。
实施例3：恢复期人血清收集物的抗原产生和分析
用于产生RBD亚单位抗原的SARS-CoV-2RBD序列由SARS-CoV-2刺突糖蛋白(UniProt No.P0DTC2)的第319至541位组成。
为了制备疫苗，RBD编码基因针对CHO细胞和HEK293细胞表达进行了密码子优化，并连同用于瞬时表达的N端信号肽序列MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：10)和C端六组氨酸标签进一步克隆到表达质粒pD2610-v10(瞬时表达运载体，来自ATUM)中。
SARS-CoV-2RBD抗原是在ExpiCHO-S细胞系(ThermoFisher)中产生的。ExpiCHO-S细胞系在ExpiCHO表达培养基(ThermoFisher)中于37℃、80％湿度和8％CO2下培养，并以125rpm搅拌，进行扩增。然后，用在OptiPRO SFM复合培养基(ThermoFisher)中与ExpiFectamine CHO试剂(ThermoFisher)预混合的1μg/ml表达质粒瞬时转染密度为6x106个细胞/ml的细胞。培养第5天，室温下以300g离心5分钟除去细胞，保留上清液。
然后用5ml HiScreen Ni FF(Cytiva)柱通过固定化金属亲和层析纯化上清液。用包含20mM磷酸钠、500mM NaCl、500mM咪唑的pH7.2的缓冲液洗脱目标蛋白。纯化的目标蛋白用PBS(10kDa RC膜)透析，浓缩至1mg/ml，并使用0.22μm孔径的PES过滤器(Millex-GP)过滤，并保存在-80℃备用。
对于SARS-CoV-2的RBD和S1抗原在HEK293细胞系中的表达，使用与CHO细胞表达所述相同的方法。用于HEK293表达的组分是Expi293F(ThermoFisher)细胞系、Expi293表达培养基(ThermoFisher)、ExpiFectamine 293试剂(ThermoFisher)和Opti-MEM复合培养基(ThermoFisher)。
收集了两种不同的血清集合：一种是从Ray Biotech购买的(Ref.CoV-PosSet-S1)，另一种是从赫罗纳地区(西班牙加泰罗尼亚)的恢复期住院患者中获得的，两者具有不同水平的抗SARS-CoV-2抗体。从PCR确诊的阳性患者中获得的三十(30)份血清，与HEK293或CHO中产生的候选RBD抗原同时进行测试。此外，该研究还纳入了大流行爆发前获得的10份阴性血清样本。测定了每个样本的人SARS-CoV-2RBD IgG总抗体滴度(log10 EC50)，结果表明，无论抗原来源如何，所有恢复期血清样本的RBD抗体水平均明显高于阴性样本(图3)。恢复期样本中对RBD的一致反应表明了RBD作为COVID-19疫苗候选抗原的重要性。
通过ELISA测定人SARS-CoV-2RBD IgG总抗体滴度。Nunc Maxisorp ELISA板(ThermoFisher，ref.10547781)每孔用100ng SARS-CoV-2RBD蛋白(SARS-CoV-2刺突糖蛋白(UniProt No.P0DTC2)的第319至541位)包被，在4℃下过夜。用含有0.05％Tween缓冲液的磷酸盐缓冲盐水洗涤板，并用Stabilblock免疫测定稳定缓冲液(Surmodics IVD，ref.ST01-1000)进行封闭。从小鼠获得的血清样品连续稀释4倍并添加到包被的孔中，在37℃、5％CO2和潮湿气氛下进行1小时。用PBS洗涤板。接下来，添加与抗小鼠(JacksonImmunoResearch，ref.115-035-003)缀合的稀释的辣根过氧化物酶(HRP)，并通过添加2,2'-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)过氧化物酶底物(ABTS，CIVTEST)进行显色。使用Gene5酶标仪(Synergy HTX，多模式酶标仪)在405nm OD处读取板，并使用SoftMax软件分析数据。使用GraphPad Prism软件通过4-参数拟合计算产生半最大结合的抗体浓度(EC50值)。
就IgG抗体滴度而言，两种表达系统之间存在高度等效性。比较HEK293细胞中产生的针对SARS-CoV-2RBD的分组IgG抗体滴度或CHO细胞中产生的针对SARS-CoV-2RBD的分组IgG抗体滴度，没有检测到显著差异(图4)。此外，每个血清样本的HEK293细胞中产生的针对SARS-CoV-2RBD的成对IgG抗体滴度与CHO细胞中产生的针对SARS-CoV-2RBD的成对IgG抗体滴度显示出非常好的相似性(图6)。总之，这些结果支持两种哺乳动物表达系统中抗原的产生之间的等效性。
绘制了针对SARS-CoV-2RBD的IgG抗体滴度与首次PCR阳性结果到各血清样本捐赠间经过的天数之间的相关性(图5)。在样本收集期间(36至105天)，两个因素之间没有发现明显的相关性。这一结果表明，在恢复期患者中专门针对SARS-CoV-2RBD产生的抗体可至少持续几个月。
实施例4：使用不同候选疫苗的小鼠的免疫原性研究。
本研究评估了针对SARS-CoV-2的不同RBD亚单位候选疫苗。该研究还评估了不同的RBD亚单位疫苗制剂。此外，本研究评估了不同蛋白质亚单位候选疫苗的免疫原性能力。
总共46只5-6周龄的BALB/c小鼠被选用于该研究。小鼠被分到5个不同的组，分别接受不同的疫苗制剂。除对照组(A组)包括6只小鼠外，每组分配10只小鼠。动物肌内施用接受两剂0.1ml的以下蛋白质亚单位疫苗制剂之一。这些疫苗被配制为“即用型”疫苗。第一剂(初免)在第0天向动物施用，第二剂(加强)在第一剂后18天(第18天)施用。
给小鼠施用的不同疫苗制剂如下：
-A组：对照组。该组中的动物接受了包含PBS的模拟疫苗。
-B组：该组中的动物接受了包含20μg SARS-CoV-2的重组RBD抗原的疫苗。重组抗原基于12％的非融合二聚RBD抗原和88％的单体RBD抗原的比例。非融合二聚体:单体的比例通过尺寸排阻色谱HPLC(Agilent Technologies)测定。该疫苗用水包油佐剂配制，该水包油佐剂配制为19.5mg/ml角鲨烯、2.35mg/ml聚山梨酯80、2.35mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、1.32mg/ml柠檬酸钠和0.08mg/ml柠檬酸，比例为v/v 75％佐剂和25％抗原。
-C组：该组中的动物接受了包含20μg SARS-CoV-2的重组RBD抗原的疫苗。重组抗原基于12％的非融合二聚RBD抗原和88％的单体RBD抗原的比例(非融合二聚体:单体的比例如B组中确定)。该疫苗用与B组相同的佐剂配制，比例为v/v 75％佐剂和25％抗原，以及加上10μg/剂的MPLA(L6895，SIGMA)，MPLA添加到抗原相中。
-D组：该组中的动物接受了包含20μg SARS-CoV-2的重组RBD抗原的疫苗。重组抗原基于12％的非融合二聚RBD抗原和88％的单体RBD抗原的比例(非融合二聚体:单体的比例如B组中确定)。该疫苗用与B组相同的佐剂配制，比例为v/v 75％佐剂和25％抗原，以及加上10μg/剂的QS-21(QS-21，DESERT KING)，QS-21添加到抗原相中。
-E组：该组中的动物接受了包含10μg SARS-CoV-2的重组RBD抗原的疫苗。该组中使用的重组RBD被调整为包含更高比例的非融合二聚RBD抗原。该组中使用的重组抗原包含56％的非融合二聚RBD抗原和44％的单体RBD抗原。为了调整二聚SARS-CoV-2RBD抗原的比例，通过尺寸排阻色谱(HiPrep 26/60Sephacryl S-100HR,Cytiva ref.17119401)分离二聚RBD抗原级分和单体RBD抗原级分。用酶标仪(Synergy HTX，多模式酶标仪)在OD 280nm处读取，确定每个级分的最终抗原浓度。最后，将包含单体RBD抗原和非融合二聚RBD抗原的级分以不同体积混合以获得特定比例的二聚RBD抗原。用与B组相同的佐剂以比例v/v 75％佐剂和25％抗原配制疫苗。
如上所述，该研究中使用的水包油佐剂配制如下：19.5mg/ml角鲨烯、2.35mg/ml聚山梨酯80、2.35mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、1.32mg/ml柠檬酸钠和0.08mg/ml柠檬酸。因此，当以75％佐剂与25％抗原的比例混合时，所施用疫苗的每0.1ml剂量包含1.46mg角鲨烯、0.18mg聚山梨酯80、0.18mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.099mg柠檬酸钠和0.006mg柠檬酸。
水包油佐剂的制备方法与实施例1中相同。
重组RBD抗原是在ExpiCHO-S细胞系中如下产生的：该研究中用于产生RBD亚单位抗原的SARS-CoV-2RBD序列由SARS-CoV-2刺突糖蛋白(UniProt No.P0DTC2)的第319至541位组成。为了制备疫苗，RBD基因针对CHO细胞表达进行了密码子优化，并连同用于瞬时表达的N端信号肽序列MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：10)和C端六组氨酸标签进一步克隆到表达质粒pD2610-v10(瞬时表达运载体，来自ATUM)中。
SARS-CoV-2RBD抗原是在ExpiCHO-S细胞系(ThermoFisher)中产生的。ExpiCHO-S细胞系在ExpiCHO表达培养基(ThermoFisher)中于37℃、80％湿度和8％CO2下培养，并以125rpm搅拌，进行扩增。然后，用在OptiPRO SFM复合培养基(ThermoFisher)中与ExpiFectamine CHO试剂(ThermoFisher)预混合的1μg/ml表达质粒瞬时转染密度为6x106个细胞/ml的细胞。培养第5天，室温下以300g离心5分钟除去细胞，保留上清液。
然后用5ml HiScreen Ni FF(Cytiva)柱通过固定化金属亲和层析纯化上清液。用包含20mM磷酸钠、500mM NaCl、500mM咪唑的pH7.2的缓冲液洗脱目标蛋白。纯化的目标蛋白用PBS(10kDa RC膜)透析，浓缩至1mg/ml，并使用0.22μm孔径的PES过滤器(Millex-GP)过滤，并保存在-80℃备用。
为了评估疫苗接种方案后针对SARS-CoV-2的免疫应答，在研究的第18天(第二剂疫苗之前)(图7A)和第30天(图7B)提取每只小鼠的血清样本。通过ELISA分析血清样本的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度。每组抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体的log10 EC50滴度如图7所示。
Nunc Maxisorp ELISA板(ThermoFisher，ref.10547781)每孔用100ng SARS-CoV-2RBD蛋白(SARS-CoV-2刺突糖蛋白(UniProt No.P0DTC2)的第319至541位)包被，在4℃下过夜。用含有0.05％Tween缓冲液的磷酸盐缓冲盐水洗涤板，并用Stabilblock免疫测定稳定缓冲液(Surmodics IVD，ref.ST01-1000)进行封闭。从小鼠获得的血清样品连续稀释4倍并添加到包被的孔中，在37℃、5％CO2和潮湿气氛下进行1小时。用PBS洗涤板。接下来，添加与抗小鼠(Jackson ImmunoResearch，ref.115-035-003)缀合的稀释的辣根过氧化物酶(HRP)，并通过添加2,2'-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)过氧化物酶底物(ABTS，CIVTEST)进行显色。使用Gene5酶标仪(Synergy HTX，多模式酶标仪)在405nm OD处读取板，并使用SoftMax软件分析数据。使用GraphPad Prism软件通过4-参数拟合计算EC50值。
结果清楚地表明，与对照组(A组)相比，所有按照两剂方案用候选疫苗免疫的动物(B组至E组)在第30天的抗SARS-CoV-2RBD抗体显著更高。因此，结果显示出包含RBD抗原的组合物产生免疫应答的能力。结果还证明了在包含RBD抗原的亚单位SARS-CoV-2疫苗中使用水包油佐剂的适用性。此外，清楚地观察到，当将疫苗制剂与免疫刺激剂、特别是MPLA组合(C组)时，获得了更高的体液反应。令人惊讶的是，C组动物在第一剂后第18天实现了高免疫应答。与其他组相比，该组在第30天时的抗SARS-CoV-2RBD抗体滴度也最高。
结果还表明，当疫苗制剂中存在的RBD抗原的非融合二聚RBD抗原相对于单体RBD抗原具有高比例(E组)时，体液应答显著增强，即使疫苗组合物不包含免疫刺激剂。据观察，当与接受了包含低比例的非融合二聚RBD抗原且不含免疫刺激剂的制剂疫苗的组(B组)、以及包含低比例的非融合二聚RBD抗原且含有免疫刺激剂QS-21的制剂疫苗的组(D组)相比时，包含半剂量RBD抗原(10μg/剂)、以高比例的非融合二聚RBD抗原配制并具有水包油佐剂的疫苗在第30天时提供了增强的体液反应(E组)。还观察到，施用至E组动物的疫苗(包含10μg SARS-CoV-2抗原的重组RBD，非融合二聚RBD抗原的比例增加，并且不含免疫刺激剂)产生的抗SARS-CoV-2RBD抗体滴度与C组动物(接受了包含20μg SARS-CoV-2抗原的重组RBD的疫苗，其中非融合二聚RBD抗原与单体RBD抗原的比例降低，并且还具有MPLA作为免疫刺激剂)中获得的抗体滴度相当。
结果出人意料地表明，基于非融合二聚RBD抗原的制剂、和基于RBD抗原中非融合二聚RBD抗原相对于单体RBD抗原比例增加的制剂具有很强的产生抗SARS-CoV-2RBD抗体的能力。
实施例5：用融合二聚RBD抗原在小鼠中进行的免疫原性研究。
该研究评估了SARS-CoV-2的新的重组亚单位抗原。新的重组亚单位抗原是融合二聚RBD抗原，其含有两个单体，第一单体包含衍生自B.1.351(南非)变体的RBD，第二单体包含衍生自B.1.1.7(英国)变体的RBD。SARS-CoV-2的这种新的重组亚单位抗原在本文中被命名为融合二聚RBD变体抗原。该研究评估了不同的亚单位疫苗制剂以及这种重组融合二聚RBD变体抗原在小鼠中的免疫原性能力。该研究还包括融合二聚RBD变体抗原与先前描述的SARS-CoV-2的重组非融合二聚体:单体RBD抗原(由衍生自Wuhan-Hu-1变体并以不同的二聚体:单体比例配制的非融合二聚RBD抗原和单体RBD抗原的组合组成)之间的比较。后一种蛋白质亚单位疫苗在本文中被命名为非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原。
该研究中使用的重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原是串联体，其包含衍生自B.1.351变体的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD单体的第319至537位氨基酸序列(如SEQ ID NO：4中定义)作为第一单体，随后是衍生自B.1.1.7变体的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD单体的第319至537位的氨基酸序列(如SEQ ID NO：3中定义)作为第二单体。作为串联融合抗原的该重组融合二聚RBD变体抗原的氨基酸序列定义于SEQ ID NO：5中。
为了制备疫苗，融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原针对CHO细胞表达进行了密码子优化(SEQ ID NO：8)，并连同用于瞬时表达的N端信号肽序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ IDNO：6)和C端六组氨酸标签进一步克隆到表达质粒pcDNA3.4(GENSCRIPT)中。包含信号肽、密码子优化的SARS-CoV-2RBD二聚变体和C端组氨酸标签的DNA构建体在SEQ ID NO：7中定义。
该研究中使用的重组非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原由Wuhan-Hu-1变体的SARS-CoV-2刺突糖蛋白(UniProt No.P0DTC2)的第319至541位组成。为了制备重组非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原，RBD基因针对CHO细胞表达进行了密码子优化，并连同用于瞬时表达的N端信号肽序列MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：10)和C端六组氨酸标签进一步克隆到表达质粒pD2610-v10(ATUM)中。
重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原和重组非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原在ExpiCHO-S细胞系(ThermoFisher)中产生。ExpiCHO-S细胞系在ExpiCHO表达培养基(ThermoFisher)中于37℃、80％湿度和8％CO2下培养，并以125rpm搅拌，进行扩增。然后，用在OptiPRO SFM复合培养基(ThermoFisher)中与ExpiFectamine CHO试剂(ThermoFisher)预混合的1μg/ml表达质粒瞬时转染密度为6x106个细胞/ml的细胞。培养第5天，室温下以300g离心5分钟除去细胞，保留上清液。
然后用5ml HiScreen Ni FF(Cytiva)柱通过固定化金属亲和层析纯化上清液。用包含20mM磷酸钠、500mM NaCl、500mM咪唑的pH7.2的缓冲液洗脱目标蛋白。纯化的目标蛋白用PBS-0.01％Tween 80(30kDa RC膜)透析，浓缩至1mg/ml，并使用0.22μm孔径的PES过滤器(Millex-GP)过滤，并保存在-80℃备用。
总共86只5-6周龄的BALB/c小鼠被选用于该研究。小鼠被分配到9个不同的组。每组接受如下所述的不同疫苗制剂。除对照组(A组)仅包括6只小鼠外，每组包括10只小鼠。所有动物均通过肌内途径施用一剂0.1ml的以下疫苗制剂。这些疫苗被配制为“即用型”疫苗。在该研究的第0天向动物施用疫苗。
给小鼠施用的不同疫苗制剂如下：
-A组：对照组。该组中的动物接受了包含PBS的模拟疫苗。
-B组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原，1倍剂量)：该组的动物接受包含1μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该疫苗用水包油佐剂以比例v/v 50％佐剂和50％抗原配制。
-C组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原，5倍剂量)：该组的动物接受包含5μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该疫苗用水包油佐剂以比例v/v 50％佐剂和50％抗原配制。
-D组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原，20倍剂量)：该组的动物接受包含20μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该疫苗用水包油佐剂以比例v/v 50％佐剂和50％抗原配制。
-E组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原，20倍剂量，加上免疫刺激剂1)：该组的动物接受包含20μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该疫苗用以下配制：水包油佐剂，比例为v/v50％佐剂和50％抗原，以及10μg/剂的MPLA(L6895，SIGMA)，MPLA添加到抗原相中。
-F组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原，20倍剂量，加上免疫刺激剂2)：该组的动物接受包含20μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该疫苗用以下配制：水包油佐剂，比例为v/v50％佐剂和50％抗原，以及10μg/剂的QS-21(QS-21，DESERT KING)，QS-21添加到抗原相中。
-G组(非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原，20倍剂量)：该组的动物接受包含20μg重组非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该重组抗原基于非融合二聚形式的重组SARS-CoV-2RBD抗原，其比例为80％:20％非融合RBD二聚体:RBD单体。为了调整非融合二聚SARS-CoV-2RBD抗原的比例，通过尺寸排阻色谱(HiPrep 26/60Sephacryl S-100HR,Cytiva ref.17119401)分离非融合二聚RBD抗原级分和单体RBD抗原级分。用酶标仪(Synergy HTX，多模式酶标仪)在OD 280nm处读取，确定每个级分的最终抗原浓度。最后，将包含单体RBD抗原和非融合二聚RBD抗原的级分以不同体积混合以获得特定比例的非融合二聚RBD抗原。该疫苗用水包油佐剂以比例v/v 50％佐剂和50％抗原配制。
-H组(非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原，20倍剂量，加上免疫刺激剂1)：该组的动物接受包含20μg非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该重组抗原基于非融合二聚形式的重组SARS-CoV-2RBD抗原，比例为80％:20％非融合RBD二聚体:RBD单体(二聚体:单体的比例调整的执行方式与G组相同)。该疫苗用以下配制：水包油佐剂，比例为v/v 50％佐剂和50％抗原，以及10μg/剂的MPLA(L6895，SIGMA)，MPLA添加到抗原相中。
-I组(非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原，20倍剂量，加上免疫刺激剂2)：该组的动物接受包含20μg非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该重组抗原基于非融合二聚形式的重组SARS-CoV-2RBD抗原，比例为80％:20％非融合RBD二聚体:RBD单体(二聚体:单体的比例调整的执行方式与G组相同)。该疫苗用以下配制：水包油佐剂，比例为v/v 50％佐剂和50％抗原，以及10μg/剂的QS-21(QS-21，DESERT KING)，QS-21添加到抗原相中。
该研究中使用的水包油佐剂配制如下：39mg/ml角鲨烯、4.7mg/ml聚山梨酯80、4.7mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、2.64mg/ml柠檬酸钠和0.16mg/ml柠檬酸。因此，当以50％佐剂与50％抗原的比例混合时，0.1ml剂量的所施用疫苗包含1.95mg角鲨烯、0.235mg聚山梨酯80、0.235mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.132mg柠檬酸钠和0.008mg柠檬酸。该制剂类比于以0.5ml剂量施用给人的已知水包油佐剂的标准浓度，为9.75mg角鲨烯、1.175mg聚山梨酯80、1.175mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.66mg柠檬酸钠和0.04mg柠檬酸。
为了评估接种本研究的不同疫苗制剂后针对SARS-CoV-2的免疫应答，在第21天提取每只小鼠的血清样本，并通过ELISA分析抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度。抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度的log10EC50值如图8所示。
通过ELISA测定抗SARS-CoV-2IgG抗体滴度如下：Nunc Maxisorp ELISA板(ThermoFisher,ref.10547781)每孔用100ng SARS-CoV-2RBD蛋白包被，在4℃下过夜。为了分析从A组至F组的动物提取的血清，如上所述，用重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原包被ELISA板，为了分析从G组至I组的动物提取的血清，如上所述，用重组非融合80％二聚:20％单体RBD非变体SARS-CoV-2RBD抗原包被ELISA板。用含有0.05％Tween缓冲液的磷酸盐缓冲盐水洗涤板，并用Stabilblock免疫测定稳定缓冲液(Surmodics IVD，ref.ST01-1000)进行封闭。从小鼠获得的血清样品连续稀释4倍并添加到包被的孔中，在37℃、5％CO2和潮湿气氛下进行1小时。用PBS洗涤板。接下来，添加与抗小鼠(Jackson ImmunoResearch，ref.115-035-003)缀合的稀释的辣根过氧化物酶(HRP)，并通过添加2,2'-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)过氧化物酶底物(ABTS，CIVTEST)进行显色。使用Gene5酶标仪(Synergy HTX，多模式酶标仪)在405nm OD处读取板，并使用SoftMax软件分析数据。使用GraphPad Prism软件通过4-参数拟合计算EC50值。
从研究结果来看，令人惊讶的是，在施用一次单剂量的重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原后，接种疫苗的动物表现出增强的免疫应答。即使接受包含低剂量的融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原且不含任何免疫刺激剂的疫苗制剂的动物(B组和C组)，也比接受包含以下的疫苗制剂的组产生更高的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度：包含20μg剂量的非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原加上单独的水包油佐剂(G组)、或加上进一步包括QS-21免疫刺激剂的水包油佐剂(I组)。在疫苗组合物中存在相同剂量(例如20μg)的总抗原时，还观察到，当与接受包含与水包油佐剂和MPLA免疫刺激剂一起配制的非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原的疫苗组合物的组(H组)相比时，接受重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的那些组(D-F组)的应答增强，即使该组合物不包含任何免疫刺激剂(D组)。总体而言，结果出乎意料地表明，重组二聚RBD抗原(融合和非融合二聚RBD)产生针对SARS-CoV-2的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体的潜力增加。
此外，结果确认了使用在最终疫苗制剂中配制为39mg/ml角鲨烯、4.7mg/ml聚山梨酯80、4.7mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、2.64mg/ml柠檬酸钠和0.16mg/ml柠檬酸的水包油佐剂的适用性。最后，用包含与免疫刺激剂(特别是与MPLA)组合的水包油佐剂的疫苗组合物进行疫苗接种的动物显示出比用不含免疫刺激剂的水包油佐剂免疫的动物更高的抗体滴度，表明了当接种疫苗的对象同时接受佐剂和免疫刺激剂两者与融合二聚RBD变体抗原或非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原时，他们具有更好的免疫应答。
实施例6：用两剂融合二聚RBD抗原在小鼠中进行的免疫原性研究。
考虑到如实施例5中描述的用包含融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的一剂疫苗接种动物后获得的意外的良好结果，本研究在两剂量方案中评估了新的重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原。
在本研究中，属于实施例5中描述的不同组的动物接受第二剂疫苗。在第21天，即第一剂量后21天，动物通过肌内途径接受第二剂量的每组(A至I组，如实施例5中所述)0.1ml的相应疫苗制剂。
为了评估本研究的不同疫苗制剂的第二剂后针对SARS-CoV-2的免疫应答，在第35天(第二剂后14天)提取每只小鼠的血清样本，并通过ELISA分析抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度，如实施例5中描述的。第二剂施用后14天，动物血清中存在的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度的log10 EC50值显示在图9中。
在第二剂蛋白质亚单位疫苗后，与单剂后的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度相比，在所有疫苗接种组中均观察到抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度有所增加。因此，初免/加强或两剂量方案增加了免疫原性应答。此外，与接受包含非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原的疫苗的动物(G组至I组)相比，接受包含融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗的动物(B组至F组)表现出抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度的增加。与接受包含非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原的疫苗的动物(G组至I组)相比，即使是接受以低剂量融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原配制并且不含任何免疫刺激剂的疫苗的动物(B组至C组)也表现出抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度的增加。总体而言，这些结果证实了产生实施例5中获得的二聚RBD抗原、特别是融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的抗SARS-CoV-2IgG抗体的出乎意料的潜力。
从结果中可以得出结论，蛋白质亚单位疫苗，特别是基于二聚RBD抗原的蛋白质亚单位疫苗，也适合用作与其他疫苗组合或每年重新接种的加强疫苗，因为它显著增加了抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度。
实施例7：与市售疫苗相比，在具有非融合二聚RBD抗原的小鼠中进行的免疫原性研究。
本研究评估了基于非变体SARS-CoV-2RBD抗原的亚单位候选疫苗的免疫原性，其被配制为包含相对于单体RBD抗原高比例的非融合二聚RBD抗原。候选疫苗用水包油佐剂配制，水包油佐剂配制为39mg/ml角鲨烯、4.7mg/ml聚山梨酯80、4.7mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、2.64mg/ml柠檬酸钠和0.16mg/ml柠檬酸，其中含或不含MPLA作为免疫刺激剂，将免疫原性与市售SARS-CoV-2疫苗Spikevax、COVID-19mRNA疫苗(Moderna Biotech Spain,S.L.)进行比较。
总共46只6-7周龄的BALB/c小鼠被分为4个不同组。每组接受如下所述的不同疫苗制剂。动物通过肌内途径接受两剂0.1ml疫苗，间隔三周，第一剂在第0天注射(初免)，第二剂(加强)在第21天注射。
-A组(对照组，10只动物)：该组中的动物接受了包含PBS的模拟疫苗。
-B组(非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原，12只动物)：该组中的动物接受包含20μg重组非融合二聚:单体RBD非变体抗原(非融合RBD二聚体:RBD单体的比例为80％:20％)的疫苗制剂。重组非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原的制备以及非融合二聚SARS-CoV-2RBD抗原的二聚体:单体的比例如实施例5中所述进行。该疫苗用水包油佐剂以比例v/v 50％佐剂和50％抗原配制。因此，当以50％佐剂与50％抗原的比例混合时，0.1ml剂量的疫苗包含1.95mg角鲨烯、0.235mg聚山梨酯80、0.235mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.132mg柠檬酸钠和0.008mg柠檬酸。
-C组(非融合二聚:单体RBD非变体SARS-CoV-2抗原，加上免疫刺激剂，12只动物)：该组中的动物接受包含20μg重组非融合二聚:单体RBD非变体抗原(非融合RBD二聚:RBD单体的比例为80％:20％)的疫苗制剂(该研究中抗原的制备以及二聚体:单体的比例如实施例5中所述进行)。该疫苗用与B组相同的佐剂配制，比例为v/v 50％佐剂和50％抗原，以及加上10μg/剂的MPLA作为免疫刺激剂(L6895，SIGMA)，MPLA添加到抗原相中。
-D组(商业疫苗，12只动物)：该组的动物接受了包含Spikevax疫苗、COVID-19mRNA疫苗(Moderna Biotech Spain,S.L.)的1μg mRNA(嵌入SM-102脂质纳米颗粒)的疫苗制剂。本研究中给小鼠注射的商业疫苗的剂量是从公共卫生机构在对人群进行疫苗接种后提供的小瓶的保存完好的剩余体积获得的。剂量(1μg mRNA)是根据论文Corbett K.S.,etal.SARS-CoV-2mRNAvaccine design enabled by prototype pathogenpreparedness.Nature,2020,vol.586,no 7830,p.567-571来选择的，其中在剂量反应研究中显示该剂量接近小鼠的饱和检测限。
为了评估接种本研究的不同疫苗制剂后针对SARS-CoV-2的免疫原性应答，在第21天(第二剂之前)和第35天(第二剂之后14天)提取所有动物的血清样本，并通过ELISA分析其抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度。此外，还对第35天提取的血清样本进行了分析，通过基于假病毒的中和测定(PBNA)确定针对SARS-CoV-2分离株Wuhan-1(Wuhan-Hu-1)的中和抗体。由于实验室限制，一些样本无法在第35天进行分析，因此最终提取了一半的血清样本，并在第37天测试了其抗SARS-CoV-2RBD IgG滴度和针对SARS-CoV-2的中和抗体。
通过ELISA测定抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体滴度如下：
Nunc Maxisorp ELISA板(ThermoFisher，ref.10547781)每孔用100ng重组SARS-CoV-2RBD(Sino Biologicals，ref.40592-V08B)包被，并用PBS中5％脱脂奶粉(Sigma)封闭。用含有0.05％Tween缓冲液的磷酸盐缓冲盐水洗涤板，并用Stabilblock免疫测定稳定缓冲液(Surmodics IVD，ref.ST01-1000)封闭。将孔与从小鼠获得的血清样品的连续稀释液在37℃、5％CO2和潮湿气氛下孵育1小时。然后，用PBS洗涤板。接下来，添加过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Sigma，ref.AP308P)。最后，将孔与K-Blue Advanced Substrate(Neogen，ref.379175)一起孵育，并使用Gene5酶标仪(Synergy HTX，多模式酶标仪)测量450nm处的吸光度，并使用SoftMax软件分析数据。一式两份计算血清样品的每个稀释度的吸光度的平均值。SARS-CoV-2RBD特异性总IgG结合抗体的终点滴度确定为最后血清稀释度的倒数，其是技术阴性对照(未添加血清的孔)的平均光密度的3倍。
PBNA测定基于表达SARS-CoV-2的S蛋白的HIV报告假病毒的使用以及荧光素酶的产生，如Nie J.et al.Quantification of SARS-CoV-2neutralizing antibody by apseudotyped virus-based assay.Nat Protoc.2020Nov；15(11):3699-563715所描述的。生成了一种表达来自Wuhan-1(Wuhan-Hu-1)的SARS-CoV-2S蛋白和荧光素酶的HIV报告假病毒。
对于中和测定，将200TCID50的假病毒上清液与热灭活血清样品的连续稀释液在37℃下预孵育1小时，然后添加到ACE2过表达的HEK293T细胞上。48小时后，用Britelite Plus荧光素酶试剂(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)裂解细胞。使用EnSight多模式酶标仪(Perkin Elmer)测量发光0·2秒。通过比较从用每种血清处理的感染细胞计算出的实验RLU与最大RLU(从未处理的感染细胞计算出的最大感染力)和最小RLU(从未感染细胞计算出的最小感染力)来计算血清样品的中和能力，并表示为中和百分比：
％中和＝(RLUmax–RLU实验)/(RLUmax–RLUmin)*100。
使用Graph Pad Prism(v8.3.0)将标准化剂量反应中和曲线拟合为具有可变斜率的四参数曲线。所有IC50值均以稀释度倒数表示(抑制50％感染所需的浓度)。
研究结果显示，与未接种疫苗的对照组(A组)相比，接种疫苗的B组至D组诱导了显著更高的抗SARS-CoV-2RBD IgG抗体应答。此外，施用至C组和D组的疫苗制剂在第21天诱导了相似的抗体滴度。还观察到，在接受第二剂后，所有接种疫苗的组(包括不含MPLA的B组)在第35天和第37天之间诱导了相似的抗体滴度(接受加强剂后14-16天)。值得注意的是，与D组相比，接种疫苗的C组表现出更高IgG抗体应答的趋势(图10B)。
这一结果证实了非融合RBD二聚:单体非变体SARS-CoV-2抗原(以高比例的二聚RBD作为抗原配制而成)能够产生针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的免疫应答，从而证实了用于制备针对SARS-CoV-2感染的疫苗的适用性。
此外，本研究的不同疫苗制剂获得的中和抗体应答的结果表明，在第二剂后，所有疫苗接种组(B组至D组)都获得了同等的中和抗体水平，再次证明了非融合RBD二聚:单体非变体SARS-CoV-2抗原(以高比例的二聚体RBD为抗原)用于制备针对SARS-CoV-2感染的疫苗组合物的适用性。进一步观察到，在疫苗制剂中添加免疫刺激剂，例如C组中的MPLA，对产生中和抗体滴度的能力产生积极影响(图11)，证实了上面图10B中提到的趋势。
实施例8：针对SARS-CoV-2变体的融合二聚RBD抗原的血清中和测定
该研究评估了基于包含衍生自B.1.351(南非)变体的RBD的第一单体和包含衍生自B.1.1.7(英国)变体的RBD的第二单体的新的重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原针对不同的SARS-CoV-2关切变体的中和能力。这种新的SARS-CoV-2重组亚单位抗原被命名为融合二聚RBD变体抗原。重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原与实施例5中B组至F组中描述的相同。
进一步选择实施例5和6的D组、E组和F组来进行该研究。这些组包括5-6周龄的BALB/c小鼠，它们接种了20μg剂量的融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原。根据实施例5中的描述，D组采用实施例5中所用的水包油佐剂配制，E组采用与D组相同的佐剂加上10μg/剂的MPLA作为免疫刺激剂来配制，F组采用与D组相同的佐剂加上10μg/剂的QS-21作为免疫刺激剂来配制。
在本研究中，在第45天(接受第二剂后24天)提取实施例5和6的D、E和F组中的每只小鼠的血清样本，并分析针对不同SARS-CoV-2变体的中和能力：Wuhan-Hu-1、英国(阿尔法；B.1.1.7)、南非(贝塔；B.1.351)、巴西(伽马；P.1)和印度(德尔塔；B.1.617.2)变体。
血清中针对SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1分离株、英国(阿尔法；B.1.1.7)、南非(贝塔；B.1.351)、巴西(伽马；P.1)和印度(德尔塔；B.1.617.2)变体的中和抗体通过基于假病毒的中和测定(PBNA)来确定。针对印度变体(德尔塔；B.1.617.2)的中和抗体仅在D组(无免疫刺激剂)的血清中进行了测定。
使用SARS-CoV-2假病毒通过假病毒中和测定(PBNA)来测定血清中的中和抗体，如Nie J.et al.Quantification of SARS-CoV-2neutralizing antibody by apseudotyped virus-based assay.Nat Protoc.2020Nov；15(11):3699-563715中所述。为此测定，产生了五种表达SARS-CoV-2S蛋白以及荧光素酶的假病毒，每种假病毒表达不同变体(即Wuhan-Hu-1分离株、英国(阿尔法；B.1.1.7)变体、南非(贝塔；B.1.351)变体、巴西(伽马；P1)变体和印度(德尔塔；B.1.617.2)变体)的相应SARS-CoV-2S蛋白。变体之间刺突蛋白的差异是已知的并且在美国疾病控制与预防中心(CDC)的“SARS-CoV-2变体分类和定义”中明确定义。
对于中和测定，将200TCID50的各变体假病毒上清液与D、E和F组的热灭活血清样品的连续稀释液在37℃下预孵育1小时，然后添加到ACE2过表达的HEK293T细胞上。48小时后，用Britelite Plus荧光素酶试剂(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)裂解细胞。使用EnSight多模式酶标仪(Perkin Elmer)测量发光0·2秒。通过比较从用每种血清处理的感染细胞计算出的实验RLU与最大RLU(从未处理的感染细胞计算出的最大感染力)和最小RLU(从未感染细胞计算出的最小感染力)来计算血清样品的中和能力，并表示为中和百分比：
％中和＝(RLUmax–RLU实验)/(RLUmax–RLUmin)*100。
使用Graph Pad Prism(v8.3.0)将标准化剂量反应中和曲线拟合为具有可变斜率的四参数曲线。所有IC50值均以稀释度倒数表示(抑制50％感染所需的浓度)。
这项研究的结果令人惊讶地表明，用重组融合二聚RBD SARS-CoV-2抗原对动物进行免疫，在所有组别中引发了针对四种不同SARS-CoV-2变体(例如Wuhan-Hu-1、英国、南非和巴西变体)的相当的假病毒中和抗体滴度。没有观察到它们之间存在显著差异(图12)。这证明用融合二聚RBD抗原接种小鼠产生的中和抗体滴度保持在高水平，无论测试的变体如何以及在疫苗制剂中是否存在免疫刺激剂例如MPLA(E组)或QS.21(F组)。
关于D组中针对印度变体(德尔塔)获得的假病毒中和抗体滴度，图12A中所示的结果还表明针对该变体也产生了高水平的中和抗体滴度。
总而言之，结果表明，重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原能够诱导相似水平的抗体应答，而无需免疫刺激剂。因此，再次证明了重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原在诱导免疫应答方面的增加的潜力，如之前的实施例中已经显示的。
总体而言，结果证实，基于新的重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗组合物诱导了针对不同SARS-CoV-2变体(包括新的德尔塔变体)的高水平免疫应答。
实施例9：与市售疫苗相比，在猪中进行针对不同SARS-CoV-2变体的融合二聚RBD抗原的安全性和免疫原性研究。
该研究评估了SARS-CoV-2的新的重组亚单位抗原。新的重组亚单位抗原是融合二聚RBD抗原，其含有两个单体，第一单体包含衍生自B.1.351(南非)变体的RBD，第二单体包含衍生自B.1.1.7(英国)变体的RBD。这种新的SARS-CoV-2重组亚单位抗原被命名为融合二聚RBD变体抗原。重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原与实施例5中B组至F组中描述的相同。
该研究评估了该重组融合二聚RBD变体抗原在猪中的免疫原性和安全性。猪已被证明是比小动物模型更适合准确预测人的疫苗结果的动物模型。
总共13头8-9周龄的大白长白杂交猪(large white-landrace cross-breedingpig)被分配到3个不同的组。每组接受如下所述的不同疫苗制剂。A组包括5头猪，B组和C组各包括4头猪。动物在第0天和第21天间隔21天接受两剂疫苗。每只动物通过肌内途径接受每剂0.5ml的以下疫苗制剂。
给猪施用的不同疫苗制剂如下：
-A组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原)：该组的动物接受包含20μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该疫苗用以下配制：水包油佐剂，配制为39mg/ml角鲨烯、4.7mg/ml聚山梨酯80、4.7mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、2.64mg/ml柠檬酸钠和0.16mg/ml柠檬酸，比例为v/v 50％佐剂和50％抗原。因此，当以50％佐剂与50％抗原的比例混合时，0.5ml剂量的疫苗包含9.75mg角鲨烯、1.175mg聚山梨酯80、1.175mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.66mg柠檬酸钠和0.04mg柠檬酸。
-B组(商业疫苗)：该组的动物接受了商业疫苗Spikevax、COVID-19mRNA疫苗(ModernaBiotech Spain,S.L.)。0.5ml每剂量的Spikevax包含100μg编码SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白的mRNA(嵌入SM-102脂质纳米颗粒中)。本研究中给猪注射的商业疫苗的剂量是从公共卫生机构在对人群进行疫苗接种后提供的小瓶的保存完好的剩余体积获得的。
-C组(对照组)：该组中的动物接受包含PBS的模拟疫苗。
为了评估使用本研究的不同疫苗制剂接种后的安全性，记录了每剂疫苗接种前一天(第-1天和第20天)、接种时(第0天)、接种后4小时和6小时以及第一次和第二次疫苗接种后三天内每天的直肠温度。计算每组的平均直肠温度(图13)。
接受第一次施用后，B组的动物(商业疫苗)表现出平均体温升高，接种后6小时被认为异常升高，尽管动物在一天后恢复。接种第一剂后，A组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原)和B组(商业疫苗)在接种后6小时观察到统计学上的显著差异。B组的平均体温被认为异常较高，并且在动物正常状态下具有临床症状(图13)。第二剂量后观察到类似的平均温度升高结果。相反，在所有研究期间，A组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原)和C组(对照组)的平均体温被认为在基础值内，并且两组之间没有观察到临床相关差异。因此，本研究的结果表明，基于融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的亚单位疫苗比mRNA疫苗具有更好的安全性(图13)。
为了评估本研究不同疫苗制剂针对不同SARS-CoV-2变体的免疫原性应答，对猪血清中的SARS-CoV-2中和抗体进行了分析。血清中针对SARS-CoV-2英国(阿尔法；B.1.1.7)、南非(贝塔；B.1.351)、巴西(伽马；P.1)和印度(德尔塔；B.1.617.2)变体的中和抗体通过基于假病毒的中和测定(PBNA)来确定。
为了进行该分析，在第35天(第二施用后的疫苗接种后14天)提取不同组中所有动物的血液样本用于血清收集。
使用的PBNA基于表达SARS-CoV-2的S蛋白的HIV报告假病毒以及荧光素酶的产生，如Nie J.et al.Quantification of SARS-CoV-2neutralizing antibody by apseudotyped virus-based assay.Nat Protoc.2020Nov；15(11):3699-563715所描述的。产生了四种表达SARS-CoV-2S蛋白以及荧光素酶的假病毒，每种假病毒表达不同变体(即英国(阿尔法；B.1.1.7)变体、南非(贝塔；B.1.351)变体、巴西(伽马；P1)变体和印度(德尔塔；B.1.617.2)变体)的相应SARS-CoV-2S蛋白。变体之间刺突蛋白的差异是已知的并且在美国疾病控制与预防中心(CDC)的“SARS-CoV-2变体分类和定义”中明确定义。
对于中和测定，将200TCID50的各变体假病毒上清液与A至C组的热灭活血清样品的连续稀释液在37℃下预孵育1小时，然后添加到ACE2过表达的HEK293T细胞上。48小时后，用Britelite Plus荧光素酶试剂(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)裂解细胞。使用EnSight多模式酶标仪(Perkin Elmer)测量发光0·2秒。通过比较从用每种血清处理的感染细胞计算出的实验RLU与最大RLU(从未处理的感染细胞计算出的最大感染力)和最小RLU(从未感染细胞计算出的最小感染力)来计算血清样品的中和能力，并表示为中和百分比：
％中和＝(RLUmax–RLU实验)/(RLUmax–RLUmin)*100。
使用Graph Pad Prism(v8.3.0)将标准化剂量反应中和曲线拟合为具有可变斜率的四参数曲线。所有IC50值均以稀释度倒数表示(抑制50％感染所需的浓度)。
结果表明，对A组和B组进行的初免-加强免疫方案均诱导了针对含有英国(阿尔法；B.1.1.7)、南非(贝塔；B.1.351)、巴西(伽马；P.1)和印度(德尔塔；B.1.617.2)的SARS-CoV-2变体的假病毒的高中和抗体滴度(图14)。两组均针对英国(P＝0.190)、巴西(P＝0.412)和印度(P＝0.111)变体引发了相当的中和抗体滴度，但与B组(商业疫苗)相比，基于融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的A组诱导了显著更高的针对南非变体(P＝0.015)的滴度。使用曼惠特尼检验进行成对比较；p＜0.05。
因此，结果清楚地表明，基于融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗诱导了针对不同变体的中和抗体，特别是针对英国(阿尔法)、南非(贝塔)、巴西(伽马)和印度(德尔塔)变体的中和抗体。在接种疫苗的动物(A组)中，融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原产生的中和抗体滴度与市售疫苗组(B组)相当，甚至在针对南非(贝塔)变体的中和测定中更高。
这项研究表明，在水包油佐剂中配制的融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原在免疫原性和安全性之间实现了最佳平衡，并且其针对某些VOC(例如南非变体)的表现甚至比现有的商业疫苗更好。
实施例10：在小鼠中评估融合二聚RBD抗原针对异源SARS-CoV-2感染的保护功效。
该研究评估了SARS-CoV-2的新的重组亚单位抗原。新的重组亚单位抗原是融合二聚RBD抗原，其含有两个单体，第一单体包含衍生自B.1.351(南非)变体的RBD，第二单体包含衍生自B.1.1.7(英国)变体的RBD。这种新的SARS-CoV-2重组亚单位抗原被命名为融合二聚RBD变体抗原。重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原与实施例5中B组至F组中描述的相同。
本研究评估了小鼠中该重组融合二聚RBD变体抗原对COVID-19疾病的保护作用以及衍生自异源SARS-CoV-2感染的致病结果。为了评估功效，本研究使用了基于K18-hACE2转基因小鼠的攻击模型。
自宣布大流行以来，已经描述了若干种小型哺乳动物物种的攻击模型。由于ACE2人受体的转基因表达，K18-hACE2转基因小鼠容易受到SARS-CoV-2病毒的感染，如WinklerE.S.et al.SARS-CoV-2infection of human ACE2-transgenic mice causes severelung inflammation and impaired function.Nature immunology,2020,vol.21,no 11,p.1327-1335和Yinda C.K.et al.K18-hACE2 mice develop respiratory diseaseresembling severe COVID-19.PLoS pathogens,2021,vol.17,no 1,p.e1009195中所述。该攻击模型在K18-hACE2小鼠中建立，以临床疾病为基础，以在感染SARS-CoV-2后具有中等的临床、病理和病毒学结果为特征。
总共18只4-5周龄的K18-hACE2转基因小鼠(杰克逊实验室，ref.034860)被分配到3个不同的组。每组接受如下所述的不同疫苗制剂。A组至C组每组包括6只小鼠。动物在第0天和第21天间隔21天接受两剂疫苗。每只动物通过肌内途径接受每剂0.1ml的以下疫苗制剂。
给小鼠施用的不同疫苗制剂如下：
-A组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原，20μg)：该组的动物接受包含20μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。该疫苗用水包油佐剂以比例v/v 50％佐剂和50％抗原配制。水包油佐剂被配制为约39mg/ml角鲨烯、4.7mg/ml聚山梨酯80、4.7mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、2.64mg/ml柠檬酸钠和0.16mg/ml柠檬酸。因此，当以50％佐剂与50％抗原的比例混合时，0.1ml剂量的疫苗包含1.95mg角鲨烯、0.235mg聚山梨酯80、0.235mg脱水山梨糖醇三油酸酯、0.132mg柠檬酸钠和0.008mg柠檬酸。
-B组(融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原，10μg)：该组的动物接受包含10μg重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗制剂。用与A组相同的佐剂以比例v/v 50％佐剂和50％抗原配制疫苗。
-C组(对照组)：该组中的动物接受包含PBS的模拟疫苗。
随后在第35天(第二剂后2周)通过鼻内感染对动物进行攻击。使用微量移液器使动物的每个鼻孔接受25μl包含滴度为106TCID50/ml的SARS-CoV-2病毒的溶液。因此，每只动物接受了103TCID50 SARS-CoV-2病毒的剂量。用于攻击的SARS-CoV-2分离株是Wuhan/Hu-1/2019样分离株，即hCoV-19/Spain/CT-IrsiCaixa-JP/2020(GISAID ID EPI_ISL_471472)，命名为Cat02，其于2020年3月从来自西班牙的人患者中分离出来。与Wuhan/Hu-1/2019毒株相比，Cat02分离株的刺突蛋白存在D614G点突变。
报告候选疫苗的保护能力的主要终点是攻击后的体重减轻和/或死亡。
因此，为了评估用本研究的不同疫苗制剂攻击后的保护功效，在攻击后一周(第42天)期间监测体重和死亡率。易受SARS-CoV-2病毒感染的未受保护的动物预计在研究结束时会出现体重减轻。因此，在攻击阶段每天都会监测体重。
还监测了次要终点，包括病毒在整个生物体中的传播(通过RT-PCR和病毒滴定进行评估)，特别是在属于呼吸系统的器官和组织内，这是病毒感染和复制的主要目标。
结果令人惊讶地表明，所有接受包含重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗(10或20μg/剂)的动物在实验感染后7天均存活(A组和B组)。另一方面，对照组(C组)的死亡率为100％。对照组中的所有动物在攻击后5-6天内死亡(图15)。
此外，接受包含重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗(无论是10μg/剂还是20μg/剂)的动物在实验感染后均未出现体重减轻(A组和B组)。相反，对照组(PBS模拟疫苗接种，C组)中的所有动物在实验感染后观察到明显的体重减轻。
因此，结果清楚地表明，重组融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原能够防范异源SARS-CoV-2感染，并且还能够预防SARS-CoV-2感染的临床症状，例如体重减轻和死亡。
实施例11：评估成年对象中针对SARS-CoV-2使用基于融合二聚RBD变体的重组蛋白疫苗组合物进行加强疫苗接种的免疫原性和安全性。
本研究总结了在用两剂参考疫苗例如(BioNTech ManufacturingGmbH)进行抗COVID-19的完全接种的健康成年对象中评估加强剂量的新的融合异二聚体RBD变体SARS-CoV-2抗原组合物(名为PHH-1V)的免疫原性和安全性后获得的临床数据。该研究是一项2b期、双盲、随机、活性对照、多中心、非劣效性试验，以确定和比较对于加强疫苗接种前至少182天以及最多365天已经用Pfizer-BioNTech疫苗接受完全疫苗接种(包括同源加强剂)的对象，PHH-1V在基线(第0天)和第14天的免疫原性和安全性。大约602名18岁及以上的成年人被随机分配到PHH-1V组或组。
总体而言，功效研究最终对752名对象进行了评估。他们按照2:1的比例随机分配到两个不同的治疗组。队列1(n＝504)在第0天通过肌内途径接受单次加强剂量的0.5ml疫苗(PHH-1V)。一剂(0.5ml)PHH-1V疫苗包含40μg新的融合异二聚体RBD变体SARS-CoV-2抗原，其基于包含衍生自B.1.351SARS-CoV-2变体的RBD的第一单体和包含衍生自B.1.1.7SARS-CoV-2变体的RBD的第二单体，如实施例3中所述，其是通过重组DNA技术在针对稳定生产而优化的CHO细胞系中使用质粒表达运载体生产的。PHH-1V还佐有0.25ml佐剂，每0.5ml剂量包含：角鲨烯(9.75mg)、聚山梨酯80(1.175mg)、脱水山梨糖醇三油酸酯(1.175mg)、柠檬酸钠(0.66mg)和柠檬酸(0.04mg)。重组融合异二聚体RBD变体SARS-CoV-2抗原与实施例5(B组至F组)中描述的相同。队列2(n＝248)在第0天通过肌肉注射途径接受单次加强剂量的0.3ml疫苗(BioNTech Manufacturing GmbH)。
据此，对象根据治疗分配在第0天接受单次加强剂量。
在第0天加强疫苗接种后，对每个对象进行了52周(364天)的随访。每个对象的总临床研究持续时间长达56周。
在基线和接受加强疫苗接种后第14天评估了用两种疫苗进行加强疫苗接种的免疫原性。针对VOC变体如贝塔(B.1.351)、德尔塔(B.1.617.2)和奥密克戎(B.1.1.529)的SARS-CoV-2变体的中和抗体滴度，通过基于假病毒的中和测定(PBNA)测量为半最大抑制浓度(IC50)，如实施例2中所述，并报告为治疗组的几何平均滴度(GMT)(表1)。还确定了结合中和抗体滴度相对于基线(第0天)和第14天的几何平均倍数增加(GMFR)。还计算了在加强剂量后结合抗体滴度相对于基线(第0天)和第14天发生≥4倍变化的对象百分比。
使用LS均值(最小二乘均值)由log10尺度上的拟合模型MMRM(混合模型重复测量)并进行反向转换来估计治疗平均值的GMT和几何平均倍数增加(GMFR)比率。
表1：在基线(第0天)和第14天时针对关切变体(VOC)的中和抗体的几何平均滴度(GMT)：队列1和队列2。
用PHH-1V或治疗14天后，获得以下结果：
SARS-CoV-2贝塔变体(B.1.351)：在基线时，队列1和队列2之间的log10转换几何平均中和抗体水平相似(分别为66.92和60.76)。第14天，两个队列的中和抗体水平均有所增加，其中PHH-1V疫苗组(4352.89)的增加幅度大于疫苗组(2665.33)。
SARS-CoV-2德尔塔变体(B.1.617.2)：在基线时，队列1和队列2之间的log10转换几何平均中和抗体水平相似(分别为44.88和41.17)。第14天，两个队列的中和抗体水平均增加至相似水平：PHH1-V疫苗组(1471.78)，疫苗组(1487.11)。
SARS-CoV-2奥密克戎变体(B.1.1.529)：在基线时，队列1和队列2之间的log10转换几何平均中和抗体水平相似(分别为32.87和29.06)。第14天，两个队列的中和抗体水平均有所增加，其中PHH-1V疫苗组(2063.44)的增加幅度大于疫苗组(1222.00)。
加强接种后第14天的中和抗体滴度结果清楚地表明，基于PHH-1V的新的融合异二聚体RBD变体SARS-CoV-2抗原的疫苗加强剂量诱导了高水平的针对不同SARS-CoV-2关切变体(VOC)的中和抗体。
令人惊讶的是，针对贝塔(1.351)变体和奥密克戎(B.1.1.529)变体，PHH-1V的新的融合异二聚体RBD抗原诱导的中和抗体滴度(GMT)高于参考Covid-19疫苗诱导的中和抗体，并且针对德尔塔变体，得到了相似的高水平的中和抗体滴度(GMT)。同样，针对Wuhan SARS-CoV-2的PHH-1V的PBNA测定结果也证实了针对该变体的高中和抗体滴度。总体而言，结果表明，与接受的比较组相比，PHH-1V针对所关注的SARS-CoV-2变体的免疫原性反应增强且更好。
同样，第14天的中和抗体滴度相对于基线的倍数增加证实了之前的数据。
因此，贝塔和奥密克戎SARS-CoV-2变体的中和抗体滴度的几何平均倍数增加(GMFR)比率证明，队列1/PHH-1V优于队列2/比较疫苗对于贝塔SARS-CoV-2变体，GMFR比率为0.69(p值0.0003)，对于奥密克戎SARS-CoV-2变体，GMFR比率为0.68(p值0.0001)。对于德尔塔SARS-CoV-2变体，中和抗体滴度倍增的结果表明，队列1/PHH-1V不劣于队列GMFR比率为1.11(p值0.2446)。
滴度的平均倍数增加表明，针对新的SARS-CoV-2关切变体，与对比组(队列2，)相比，包含新的融合异二聚体RBD变体SARS-CoV-2抗原的PHH-1V疫苗具有更高且更好的免疫原性。
为了评估SARS-CoV-2特异性T细胞应答，使用了重叠SARS-CoV-2肽的不同肽池，每个肽池均涵盖SARS-CoV-2区域S(两个池)、RBD、核蛋白、膜和包膜。
分析基线和第14天存在或不存在T细胞应答，并报告为每个时间点对每个肽池做出应答的对象的数量和比例。总ELISpot反应被描述为每个肽池所有阳性反应的SFC/106PBMC(外周血单核细胞)(扣除背景后)的总和。对于每个对象，如果在任何时间中针对任何SARS-CoV-2肽池至少有一个呈阳性，则该对象被归类为应答者；如果ELISpot反应均为阴性，则被归类为无应答者。
此外，在不同时间点测定了基于细胞内细胞因子染色(ICS)的T细胞测定。ICS测定包括使用流式细胞术测定Th1/Th2途径(例如，IL-2、IL-4、INFγ)CD4+和CD8+T细胞。在第14天测量基线处的CD4+和CD8+T细胞应答。
如果刺激样品中细胞因子阳性细胞的百分比是未刺激对照中获得的值的三倍，并且背景扣除后的幅度高于0.02％，则ICS被认为是阳性的。对于每个对象，如果在确定的时间点针对任何SARS-CoV-2肽池存在至少一个阳性IFN-γICS反应，则该对象被归类为应答者；如果在这些时间点的反应均为阴性，则被归类为无应答者。
在对随机分在队列1和队列2的一组对象进行外周血单核细胞(PBMC)的体外肽刺激，随后进行IFN-γ酶联免疫吸附斑点(IFN-γELISpot)后，评估针对SARS-CoV-2的T细胞介导的免疫应答，其中两个队列的对象先前接种了两剂然后用一剂PHH-1V(队列1)或一剂(队列2)进行加强。
使用重叠SARS-CoV-2刺突蛋白的不同肽池，即刺突蛋白SA和刺突蛋白SB池，RBD阿尔法、RBD贝塔和RBD德尔塔变体池。具体来说，用于刺激PBMC的肽是：SPIKE SA(与刺突蛋白的S1-2016至S1-2196区域重叠的194个肽)、SPIKE SB(与刺突蛋白的S1-2197至S2-2377区域重叠的168个肽)、RBD阿尔法变体(与SARS-CoV-2阿尔法变体的RBD区域重叠的84个肽)和RBD贝塔变体(与SARS-CoV-2贝塔变体的RBD区域重叠的84个肽)、以及RBD德尔塔变体(与SARS-CoV-2德尔塔变体的RBD区域重叠的84个肽)。
T细胞应答结果显示，与基线观察到的水平相比，在加强后2周用肽池进行体外再刺激时，产生IFN-γ的淋巴细胞显著增加。有趣的是，在用来自阿尔法、贝塔和德尔塔关切变体的RBD肽池再刺激后，PHH-1V疫苗加强剂量(队列1)诱导了表达IFN-γ的CD4+T细胞的显著活化。此外，与那些用加强的对象(队列2)相比，这种反应明显更强。对于PHH-1V加强疫苗，体外再刺激后，在活化的CD4+T细胞中未检测到IL-4表达，表明该疫苗诱导了Th1偏向的T细胞应答。此外，PHH-1V(队列1)疫苗的异源加强被证明诱导了表达IFN-γ的CD8+T细胞的活化。
为了评估PHH-1V的耐受性和安全性，评估了疫苗接种后第0天至第7天引起的局部反应和全身事件的数量、百分比和特征。总体来说，接受对比疫苗(队列2)的对象报告的局部和全身不良事件的频率更高，队列2中记录的在所有情况下百分比都高于队列1(PHH-1V疫苗)。
从第0天至第7天，最常报告引起的局部反应是疼痛和压痛。队列1中有51.1％的对象报告疼痛，队列2中有68.8％的对象报告疼痛。队列1中有48.5％的对象报告压痛，队列2中有63.5％的对象报告压痛。从第0天、12小时到第二天，最常报告的引起的全身性不良事件是疲劳。与队列1(PHH-1V疫苗)(16.0％、16.0％和7.6％)相比，队列2在12小时(18.7％)、第1天(35.3％)和第2天(13.1％)时更频繁地报告疲劳。
总体而言，PHH-1V在成人对象中始终表现出良好的安全性概况，并且针对不同SARS-CoV-2关切变体(VOC)的中和抗体水平高且有所增加。值得注意的是，PHH-1V也比比较疫苗表现出较高且增加的针对奥密克戎SARS-CoV-2变体的中和滴度，即便在这种新的B.1.1.529变体中观察到了高度突变的刺突蛋白。这些结果支持基于新的融合异二聚体SARS-CoV-2变体抗原的PHH-1V候选疫苗与比较疫苗相比具有更高且更好的免疫原性。因此，结果支持PHH-1V对不同的SARS-CoV-2变体有效，并且有可能针对未来SARS-CoV-2关切变体提供保护。
实施例12：通过表面等离子体共振评估类天然结构。
如先前实施例所示和讨论的，PHH-1候选疫苗通过高滴度的中和抗体引发强烈的体液反应。生成类天然蛋白质亚单位疫苗至关重要，因为天然结构是能够更好地引发对野生型病毒中存在的抗原具有更高亲和力的中和抗体的有力标志。为了确认融合异二聚体RBD变体SARS-CoV-2抗原具有类天然结构，通过ACROBiosystems采用人ACE2进行了表面等离子共振(SPR)分析。使用人抗体捕获试剂盒(Cytiva)将Fc标记的ACE2(AC2-H5257，ACROBiosystems)在Biacore T200(Cytiva)上的S系列传感器芯片CM5(Cytiva)中固定化。使用8种不同的RBD异二聚体浓度获得亲和力测量值。使用UCSF ChimeraX进行抗原结构模拟。
具体材料与方法：
人运行缓冲液：
IxHEPES(10mM HEPES，150mM NaCl，3mMEDTA)，含0.005％Tween-20，pH7.4。人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39，Cytiva)：抗人IgG(Fc)抗体(500μg/mL)，固定化缓冲液(10mM乙酸钠，pH5.0)。再生缓冲液(3M氯化镁)。
芯片制备
在固定化缓冲液10mM乙酸钠(pH5.0)中将抗人IgG(Fc)抗体稀释至25μg/mL(对于8个通道，将50μL抗人IgG(Fc)抗体添加到950μL固定化缓冲液中)。该活化剂是通过在注射前混合400mM EDC和100mM NHS(GE)来制备的。使用流速为10μL/min的混合物活化CM5传感器芯片420秒。然后将在固定化缓冲液10mM乙酸钠(pH5.0)中的25μg/mL抗人IgG(Fc)抗体以10μL/min的流速注入FC2样品通道420秒，这通常会导致9000至14000RU的固定化水平。使用3M氯化镁(Cytiva)以20μL/min的流速使芯片失活30秒。参考表面FC1通道的准备方法应与活性表面FC2通道相同。
(参阅GE人抗体捕获试剂盒说明书29237227AB)。
配体蛋白重构
按照COA重构人ACE2/ACEH蛋白。为了避免表面吸附损失和失活，重构蛋白的分装量不得少于每小瓶10μg，参见表2。
表2：配体蛋白的重构信息
| 名称 | Cat.No. | 浓度(mg/mL) |
| 人ACE2/ACEH蛋白，Fc Tag | AC2-H5257 | 0.355 |
捕获的配体
用运行缓冲液将人ACE2稀释至10μg/mL，然后以10μL/min的流速注入样品通道(FC2)，以达到约300RU的捕获水平。参考通道(FC1)不需要配体捕获步骤。
通过多循环方法进行分析物分析
用运行缓冲液将客户样品稀释至相应浓度(表6)。将稀释后的样品以30pL/min的流速注入通道FC1-FC2，进行90秒的缔合阶段，然后进行210秒的解离。
缔合和解离过程都在运行缓冲液中进行。每个相互作用循环分析后，传感器芯片表面应使用3M氯化镁作为注射缓冲液以20pL/min的流速完全再生30s，以去除配体和任何结合的分析物。
表3：抗体样品与人ACE2蛋白结合的亲和力测试参数。
其他详情
整个过程都在运行缓冲液中进行。SPR分析过程中使用的其他缓冲液与注射缓冲液相同，放置在样品室的架盘中。
结果
动力学亲和力(SPR)
通过Biacore T200中的Biacore Insight Evaluation来分析亲和力。参考通道(FC1)用于背景扣除。
表4：抗体样品与人ACE2蛋白之间的亲和力测定总结。
结论：
如表4所示，融合异二聚体RBD变体SARS-CoV-2抗原对hACE2的亲和力常数为98.5pM，表明与其天然配体具有出色的结合亲和力，这是类天然结构的明显标志，这解释了针对不同SARS-CoV-2病毒变体引发的强效中和抗体。
条款
本发明还包括以下条款：
1、一种蛋白质亚单位疫苗，包含至少一种抗原，所述至少一种抗原包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的两个单体，其中每个单体选自由刺突蛋白的S1亚单位、或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、或其任何免疫原性片段组成的组，并且其中两个单体可选地通过接头彼此化学结合，从而形成二聚体。
2、根据条款1的蛋白质亚单位疫苗，其中抗原包含两个单体或由两个单体组成，其中两个单体包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)或由来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)组成。
3、根据条款2的蛋白质亚单位疫苗，其中刺突蛋白的所述受体结合结构域(RBD)在其全长上与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的任一个具有至少90％的序列同一性。
4、根据条款1至3中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体选自由以下组成的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)或Linage B.1.1.7(英国变体)或其任意组合。
5、根据条款1至4中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中二聚体是包含两个单体或由两个单体组成的融合二聚体，其中两个单体是单个多肽的一部分。
6、根据条款5所述的蛋白质亚单位疫苗，其中融合二聚体由来自第一SARS-CoV-2变体的第一RBD单体和来自不同的第二SARS-CoV-2变体的第二RBD单体组成。
7、根据条款6所述的蛋白质亚单位疫苗，其中融合二聚体由第一单体和第二单体组成，第一单体衍生自Linage B.1.351(南非SARS-CoV-2变体)，第二单体衍生自LinageB.1.1.7(英国SARS-CoV-2变体)。
8、根据条款7所述的蛋白质亚单位疫苗，其中融合二聚体在其全长上与SEQ IDNO：5具有至少90％的序列同一性。
9、根据条款8所述的蛋白质亚单位疫苗，其中融合二聚体包含SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5组成。
10、根据条款1至4中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中二聚体由非融合二聚体组成，非融合二聚体包含两个单体或由两个单体组成，其中两个单体通过可逆键结合。
11、根据条款10所述的蛋白质亚单位疫苗，其中非融合二聚体由第一单体和第二单体组成，第一单体和第二单体均衍生自Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)。
12、根据条款10和11中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中第一单体和第二单体在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同一性。
13、根据条款12所述的蛋白质亚单位疫苗，其中非融合二聚体包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。
14、根据条款1至13中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗包含每剂总量为5至50μg的抗原。
15、根据条款1至14中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其进一步至少包含佐剂。
16、根据条款15所述的蛋白质亚单位疫苗，其中佐剂包含约10至60mg/ml角鲨烯、1至6mg/ml聚山梨酯80、1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、0.5至6mg/ml柠檬酸钠和0.01至0.5mg/ml的柠檬酸。
17、根据条款1至16中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中所述蛋白质亚单位疫苗还包含单磷酰脂A(MPLA)和/或C92O46H148(QS-21)作为免疫刺激剂。
18、用于在有需要的对象中产生针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)病毒的至少一种变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的根据条款1至17中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗。
19、根据条款18所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗以单剂量或多剂量、优选以两剂量施用于有需要的对象。
20、根据条款18和19中任一项所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗以包括第一剂或初免和第二剂或加强的时间表施用于有需要的对象。
21、根据条款18至20中任一项所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中第二剂在第一剂后一周、优选两周、三周或四周施用。
22、根据条款18至21中任一项所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中所述蛋白质亚单位疫苗肌内或皮下施用。
23、一种试剂盒，包含至少一剂、优选两剂或更多剂根据条款1至17中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗。
24、一种包含至少一种抗原的蛋白质亚单位疫苗，其特征在于该至少一种抗原包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的至少一个单体，其中至少一个单体选自由刺突蛋白的S1亚单位、或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、或其任何免疫原性片段组成的组，并且其中蛋白亚单位疫苗还包含至少一种佐剂，其中所述佐剂包含约10至60mg/ml角鲨烯、1至6mg/ml聚山梨酯80、1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、0.5至6mg/ml柠檬酸钠、以及0.01至0.5mg/ml柠檬酸。
25、根据条款24所述的蛋白质亚单位疫苗，其中至少一个单体包含刺突蛋白的重组受体结合结构域(RBD)或其免疫原性片段，或由刺突蛋白的重组受体结合结构域(RBD)或其免疫原性片段组成。
26、根据条款25所述的蛋白质亚单位疫苗，其中受体结合结构域(RBD)在其全长上与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的任一个具有至少90％的序列同一性。
27、根据条款24所述的蛋白质亚单位疫苗，其中至少一个单体是刺突蛋白的重组S1亚单位或其免疫原性片段。
28、根据条款27所述的蛋白质亚单位疫苗，其中S1亚单位在其全长上与SEQ IDNO：2具有至少90％的序列同一性。
29、根据条款24至28中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗还包含单磷酰脂A(MPLA)和/或C92O46H148(QS-21)作为免疫刺激剂。
30、根据条款25和26中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中至少一个单体是刺突蛋白的RBD并且免疫刺激剂是单磷酰脂A(MPLA)。
31、根据条款27和28中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中至少一个单体是刺突蛋白的S1亚单位并且免疫刺激剂是单磷酰脂A(MPLA)。
32、根据条款24至31中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中至少一种抗原是单体或多聚体，优选二聚体。
33、根据条款24所述的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗包含至少一种抗原，该至少一种抗原包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的两个单体或由来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的两个单体组成，其中每个所述单体选自由刺突蛋白的S1亚单位、或刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)、或其任何免疫原性片段组成的组，并且其中两个单体可选地通过接头彼此化学结合，从而形成二聚体。
34、根据条款33的蛋白质亚单位疫苗，其中两个单体是来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体的刺突蛋白的RBD。
35、根据条款33和34中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中第一单体来自第一SARS-CoV-2变体，第二单体来自不同的第二SARS-CoV-2变体。
36、根据条款24至35中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一种变体选自由以下组成的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)或Linage B.1.1.7(英国变体)或其任意组合。
37、根据条款33至35中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中二聚体是融合二聚体，该融合二聚体包含以下或由以下组成：衍生自Linage B.1.351(南非SARS-CoV-2变体)的第一单体，以及衍生自Linage B.1.1.7(英国SARS-CoV-2变体)的第二单体，其中融合二聚体的两个单体是单个多肽的一部分。
38、根据条款37的蛋白质亚单位疫苗，其中融合二聚体在其全长上与SEQ ID NO：5具有至少90％的序列同一性。
39、根据条款33至35中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中二聚体是非融合二聚体，该非融合二聚体包含第一单体和第二单体或由第一单体和第二单体组成，第一单体和第二单体均衍生自Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)，其中非融合二聚体的两个单体通过可逆键结合。
40、根据条款39所述的蛋白质亚单位疫苗，其中第一单体和第二单体在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同一性。
41、根据条款24至36、39和40所述的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗包含至少单体RBD抗原和至少二聚RBD抗原的混合物，其中包含在蛋白质亚单位疫苗中的总抗原的至少45％是二聚RBD抗原。
42、根据条款33至41中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗还包含单磷酰脂A(MPLA)和/或C92O46H148(QS-21)作为免疫刺激剂。
43、根据条款24至42中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗包含每剂总量为5至50μg的抗原。
44、根据条款24至43中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中佐剂包含约39mg/ml角鲨烯、4.7mg/ml聚山梨酯80、4.7mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、2.64mg/ml柠檬酸钠和0.16mg/ml柠檬酸。
45、用于在有需要的对象中产生针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)病毒的至少一种变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的根据条款24至44中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗。
46、根据条款45所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗以单剂量或多剂量、优选以两剂量施用于有需要的对象。
47、根据条款46项所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中蛋白质亚单位疫苗以包括第一剂或初免和第二剂或加强的时间表施用于有需要的对象。
48、根据条款45至47中任一项所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中第二剂在第一剂后一周、优选两周、三周或四周施用。
49、根据条款45至48中任一项所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中所述蛋白质亚单位疫苗肌内或皮下施用。
50、一种试剂盒，包含至少一剂、优选两剂或更多剂根据条款24至45中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗。
序列表
<110> 海博莱科学有限公司
海博莱实验室有限公司
<120> SARS-CoV-2亚单位疫苗
<130> 907 116
<150> EP21 382 750.4
<151> 2021-08-09
<150> EP21 382 411.3
<151> 2021-05-06
<160> 10
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RBD单体:SARS-CoV-2刺突蛋白(武汉变体)的氨基酸残基319-541
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 2
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1亚单位单体: SARS-CoV-2刺突蛋白(武汉变体)的氨基酸残基13-685
<400> 2
Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg
20 25 30
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser
35 40 45
Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr
50 55 60
Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe
65 70 75 80
Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr
100 105 110
Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
115 120 125
Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu
130 135 140
Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
145 150 155 160
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn
165 170 175
Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
180 185 190
Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe
195 200 205
Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
210 215 220
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
245 250 255
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
260 265 270
Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys
275 280 285
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
290 295 300
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
305 310 315 320
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
325 330 335
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
340 345 350
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
355 360 365
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
370 375 380
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
385 390 395 400
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
405 410 415
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
420 425 430
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
435 440 445
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
450 455 460
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
485 490 495
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
500 505 510
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
515 520 525
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
530 535 540
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
545 550 555 560
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
565 570 575
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
580 585 590
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val
595 600 605
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
610 615 620
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
625 630 635 640
Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
645 650 655
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala
660 665 670
Arg
<210> 3
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B1.1.7变体的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD单体的氨基酸残基319-537
<400> 3
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
210 215
<210> 4
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B.1.351变体的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD单体的氨基酸残基319-537
<400> 4
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
210 215
<210> 5
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原
<400> 5
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro Thr
210 215 220
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
225 230 235 240
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
245 250 255
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
260 265 270
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
275 280 285
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
290 295 300
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala
305 310 315 320
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
325 330 335
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
340 345 350
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
355 360 365
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
370 375 380
Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro
385 390 395 400
Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
405 410 415
Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr
420 425 430
Asn Leu Val Lys Asn Lys
435
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 6
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 7
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Kozak序列、信号肽、组氨酸标签和终止密码子的融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原
<400> 7
gccaccatgg gctggtcctg catcatcctg tttctggtgg ctaccgctac cggcgtgcac 60
agtagagtgc agcctaccga gtctatcgtg cggttcccca acatcaccaa cctgtgtcct 120
ttcggcgagg tgttcaacgc caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg 180
atctctaact gcgtggccga ctactccgtg ctgtacaact ccgcctcctt cagcaccttc 240
aagtgctacg gcgtgtcccc taccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc 300
gactccttcg tgatcagagg cgacgaagtg cggcagatcg ctcctggaca gaccggcaat 360
atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat cgcttggaac 420
tccaacaacc tggactccaa agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg 480
aagtccaacc tgaagccttt cgagcgggac atctccaccg agatctacca ggctggcagc 540
accccttgta atggcgtgaa gggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttc 600
cagcctacct atggcgtggg ctaccagcct tacagagtgg tggtgctgtc cttcgagctg 660
ctgcatgctc ctgctaccgt gtgcggccct aagaaatcta ccaacctggt caagaacaag 720
cgggtgcagc ccactgagag cattgtgcgc ttccctaata tcacaaatct gtgccccttc 780
ggggaagtct ttaatgctac ccgcttcgct tccgtgtatg cttggaatag aaagcggatc 840
agcaattgcg tcgccgatta cagcgtcctg tacaatagcg ccagcttctc cacctttaag 900
tgttatggcg tcagccccac aaagctcaac gatctctgtt ttaccaatgt ctacgccgat 960
agctttgtga ttcgcggaga tgaagtccgc cagatcgcac caggccagac tggaaagatc 1020
gctgattaca attataagct ccctgatgat ttcacaggat gcgttatcgc ctggaatagc 1080
aacaacctcg acagcaaagt tggagggaat tacaactacc tctaccgcct cttcagaaag 1140
agcaacctca agccatttga gagagacatc agtacagaaa tctatcaggc cggctctacc 1200
ccttgcaacg gcgtcgaggg gtttaactgt tactttcccc tgcaatctta tgggtttcag 1260
cccacatacg gcgtggggta tcaaccctat cgcgtggtgg ttctgagttt cgaactcctg 1320
cacgccccag ccacagtgtg tggcccaaaa aagagcacca atctcgttaa gaacaagcac 1380
catcaccatc accattag 1398
<210> 8
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合二聚RBD变体SARS-CoV-2抗原
<400> 8
agagtgcagc ctaccgagtc tatcgtgcgg ttccccaaca tcaccaacct gtgtcctttc 60
ggcgaggtgt tcaacgccac cagattcgcc tctgtgtacg cctggaaccg gaagcggatc 120
tctaactgcg tggccgacta ctccgtgctg tacaactccg cctccttcag caccttcaag 180
tgctacggcg tgtcccctac caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac 240
tccttcgtga tcagaggcga cgaagtgcgg cagatcgctc ctggacagac cggcaatatc 300
gccgactaca actacaagct gcccgacgac ttcaccggct gtgtgatcgc ttggaactcc 360
aacaacctgg actccaaagt cggcggcaac tacaattacc tgtaccggct gttccggaag 420
tccaacctga agcctttcga gcgggacatc tccaccgaga tctaccaggc tggcagcacc 480
ccttgtaatg gcgtgaaggg cttcaactgc tacttcccac tgcagtccta cggcttccag 540
cctacctatg gcgtgggcta ccagccttac agagtggtgg tgctgtcctt cgagctgctg 600
catgctcctg ctaccgtgtg cggccctaag aaatctacca acctggtcaa gaacaagcgg 660
gtgcagccca ctgagagcat tgtgcgcttc cctaatatca caaatctgtg ccccttcggg 720
gaagtcttta atgctacccg cttcgcttcc gtgtatgctt ggaatagaaa gcggatcagc 780
aattgcgtcg ccgattacag cgtcctgtac aatagcgcca gcttctccac ctttaagtgt 840
tatggcgtca gccccacaaa gctcaacgat ctctgtttta ccaatgtcta cgccgatagc 900
tttgtgattc gcggagatga agtccgccag atcgcaccag gccagactgg aaagatcgct 960
gattacaatt ataagctccc tgatgatttc acaggatgcg ttatcgcctg gaatagcaac 1020
aacctcgaca gcaaagttgg agggaattac aactacctct accgcctctt cagaaagagc 1080
aacctcaagc catttgagag agacatcagt acagaaatct atcaggccgg ctctacccct 1140
tgcaacggcg tcgaggggtt taactgttac tttcccctgc aatcttatgg gtttcagccc 1200
acatacggcg tggggtatca accctatcgc gtggtggttc tgagtttcga actcctgcac 1260
gccccagcca cagtgtgtgg cccaaaaaag agcaccaatc tcgttaagaa caag 1314
<210> 9
<211> 1273
<212> PRT
<213> Coronaviridae
<220>
<223> Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2的刺突蛋白序列（UniProt No. P0DTC2）:
<400> 9
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽.
<400> 10
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
Val Leu Ser
Claims (13)
1.一种蛋白质亚单位疫苗，其包含至少一种抗原，所述至少一种抗原的特征在于其包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一个系的至少一个单体，其中所述至少一个单体是刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，并且其中所述蛋白亚单位疫苗还包含至少一种佐剂，其中所述佐剂包含约10至60mg/ml角鲨烯、1至6mg/ml聚山梨酯80、1至6mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯、0.5至6mg/ml柠檬酸钠、和0.01至0.5mg/ml柠檬酸。
2.根据权利要求1所述的蛋白质亚单位疫苗，其中所述受体结合结构域(RBD)在其全长上与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的任一个具有至少90％的序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质亚单位疫苗，其中所述蛋白质亚单位疫苗包含至少一种抗原，所述至少一种抗原包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一个系的两个单体，其中每个所述单体是刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，并且其中所述两个单体彼此化学结合，可选地通过接头彼此化学结合，从而形成二聚体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的至少一个系选自由以下组成的组：Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)、Linage B.1.1.28(巴西变体)、Linage B.1.351(南非变体)、Linage B.1.427或Linage B.1.429(加利福尼亚变体)、Linage B.1.617(印度变体)或Linage B.1.1.7(英国变体)或其任意组合。
5.根据权利要求3所述的蛋白质亚单位疫苗，其中所述二聚体是融合二聚体，所述融合二聚体由第一单体和第二单体组成，所述第一单体衍生自Linage B.1.351(南非SARS-CoV-2变体)，所述第二单体衍生自Linage B.1.1.7(英国SARS-CoV-2变体)，其中所述融合二聚体的两个单体是单个多肽的一部分。
6.根据权利要求5所述的蛋白质亚单位疫苗，其中所述融合二聚体由SEQ ID NO：5组成。
7.根据权利要求3所述的蛋白质亚单位疫苗，其中所述二聚体是非融合二聚体，所述非融合二聚体由第一单体和第二单体组成，所述第一单体和所述第二单体均衍生自Wuhan-Hu-1肺炎病毒分离株(GenBank登录号：MN908947)，其中所述非融合二聚体的两个单体通过可逆键结合。
8.根据权利要求1至4和7中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中所述蛋白质亚单位疫苗包含至少单体RBD抗原和至少二聚RBD抗原的混合物，其中包含在所述蛋白质亚单位疫苗中的总抗原的至少45％是二聚RBD抗原。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗，其中所述蛋白质亚单位疫苗还包含单磷酰脂A(MPLA)和/或C92O46H148(QS-21)作为免疫刺激剂。
10.用于在有需要的对象中产生针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)病毒的至少一个系的免疫原性和/或保护性免疫应答的根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗。
11.根据权利要求10所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中所述蛋白质亚单位疫苗以单剂量或多剂量、优选以两剂量施用于所述有需要的对象。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的用途的蛋白质亚单位疫苗，其中所述蛋白质亚单位疫苗作为加强剂施用于所述对象。
13.一种试剂盒，包含至少一剂、优选两剂或更多剂根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白质亚单位疫苗。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21382411.3 | 2021-05-06 | ||
| EP21382750.4 | 2021-08-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118284431A true CN118284431A (zh) | 2024-07-02 |
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |