JP2012509906A - ペプチドアジュバント - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図7
Description
本願は、2008年11月28日に出願された、米国仮特許出願第61/118,533号の利益を請求する。
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているこれらのものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法と材料が、これより記載される。以下に記載される全ての刊行物は、引用することによって本明細書に組み入れられる。
本発明を記載する際、以下の用語が使用され、以下の用語は、後述するように定義されることを意図される。
下記は、本発明を実行するための特定の実施形態の実施例である。該実施例は、説明目的のためにのみ提示されたもので、どのような方法においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
ペプチドの確認。プロテオーム・データベースは、一度、最大のものを生じるアミノ酸配列の短鎖5量体ペプチドを探すコンピュータアルゴリズムを使用してふるいにかけられた。この解析は、全ての既知のプロテオームから一度だけ発見された、5量体ペプチドの、決して得られなかった417と、固有の1288と、の配列を生成した。9および13量体の配列は、既知のプロテオームに欠けている、事前に417と同定された5量体配列からコンピュータによって生成されたものであった。6つの5量体、3つの9量体および3つの13量体の様々な予想された疎水性値が、関数解析に任意に選択された。免疫反応に対する各短鎖ペプチドの影響は、Balb/cマウス中のpCAGベースDNAワクチンから発現されたハノイ2005鳥インフルエンザウィスルの赤血球凝集素(HA)抗原に対するT細胞反応の評価により最初に分析された。各5量体、9量体および13量体の配列は、発現を促進し、可変純度の独立したペプチドの調合から生じる潜在的な実験の偏差を最小限にするために、HA抗原のC末端でフレームのクローン化が行われた。4匹のマウスのグループは、各短鎖ペプチド配列を伴うフレーム内のHAをコード化する各プラスミドDNAの、1マウス当たり50μgによって予防注射を筋肉内(I.M.)に受けた。そして、T細胞反応は、10日経過後の脾細胞からモニタされた。追加の配列(pCAG−HA)を伴わない同じプラスミドDNAコード化HAは、基準対照(benchmark control)として含まれていた。HAタンパク質全体を包含するオーバーラップペプチドのライブラリは、脾細胞を再刺激するのに使用され、およびIFN-g生成は、T細胞反応の測定値としてELISPOTによって評価された。図1は、pCAG−HA−5量体#4(SEQ ID No.4)および#6(DMCKW(SEQ ID No.13))が、他の修飾済のpCAG−HA−5、9または13量体と、または修飾されていないpCAG−HA対照によって比較された時、HAライブラリからのいくつかの個々のペプチドで刺激した後のIFNg生成を増加したことを示す。データから、T細胞反応の生成時、5量体が9量体または13量体よりよく機能したことが結論付けられ得る。データから、非常に驚くほどのT細胞反応の増加を導く疎水性または配列に関する任意のパターンは現われなかった。様々なペプチドの疎水性は、表1に列挙されている。
予防接種後の防御免疫反応の生成。誘発された、より高いT細胞反応に基づいて、5量体4(SEQ ID No.4)または5量体7(SEQ ID No.12)の、何れかへ融合されたpCAG−HAは、Balb/cマウスで更に研究された。抗体反応は、対照として、修飾されていないHAを含む各DNAワクチンによって筋肉内に予防接種された25日後の血清の、赤血球凝集阻止(HI)および中和(NAB)滴定アッセイによってモニタされた。pCAG−HA−5量体4および5量体7、又はpCAG−HAそれぞれに対し、平均のHIの相互の稀釈力価は、85±40、55±35または25±20である一方で、NABの力価は、25±30、22±10、あるいは検出できなかった。より高いTおよびB細胞反応が強化された保護によって相互に関連付けられるか否かを評価するために、Balb/cマウスは、各々HA−5量体4および5量体7によって筋肉内に予防接種された28日後にハノイ05の致死量投与によりチャレンジされた。選択されたDNAワクチン投与量は、生存率30%を誘発すると試験された最小量であることが見出された、修飾されていない1μgのpCAG−HAの投与量に基づいた。1μgのpCAG−HA-5量体7による予防接種は、5%の体重の減少を伴う死から80%の動物を保護した一方で、pCAG―HA−5量体#4は、統計的に有意な体重の減少および疾患の臨床徴候を何ら伴わず100%の生存率を誘発した。このことは、アジュバントとして抗原に取り付けられたペプチドを使用することで有効な免疫反応が生成されることを可能にし、インフルエンザ感染上で典型的には見出される影響から保護を与える、ことを実証する。
予防接種後の防御免疫反応の生成。誘発されたより高いT細胞反応に基づいて、5または50μgの遊離ペプチド5量体4(SEQ ID No.4)と組み合わせたpCAG−HAは、Balb/cマウスで更に研究された。抗体反応は、対照として、修飾されていないHAを含む各DNAワクチンによって筋肉内に予防接種された25日後の血清の、赤血球凝集阻止(HI)および中和(NAB)滴定アッセイによってモニタされた。より高いTおよびB細胞反応が強化された保護によって相互に関連付けられるか否かを評価するために、Balb/cマウスは、5または50μgの 5量体4(SEQ ID No.4)を加えた各HAによって筋肉内に予防接種された28日後にハノイ05の致死量投与によりチャレンジされた。選択されたDNAワクチン投与量は、製造率30%を誘発すると試験された最小量であると見出された、修飾されていない1μgのpCAG−HAの投与量に基づいた。5μgの5量体4(SEQ ID No.4)を加えた1μgのpCAG−HAによる予防接種は、最小の体重の減少を伴う死から動物を50%保護した一方で、50μgの5量体4を加えたpCAG―HAは、統計的に有意な体重の減少および疾患の臨床徴候を何ら伴わず90%の生存率を誘発した。処置されたワクチン接種をしていない対照動物は、100%死んだ。このことは、抗原と併用してアジュバントとして遊離ペプチドを使用することは、有効な免疫反応が生成されることを可能にし、インフルエンザ感染で典型的には見出される影響から保護を与える、ことを実証する。このデータは、異なるレベルのアジュバントに応じた投与量があることを、また実証する。
異種のチャレンジ用の遊離外来ペプチドによる免疫処置後の予防効果。10匹のBALB/cマウスのグループは、1マウスあたりの遊離ペプチドとして、50または100μgの5量体4(SEQ ID No.4)の何れかを加えた100μgのpCAGα-HAの1回投与によって、予防注射を筋肉内に受けた。対照マウスは、50μgの5量体4又はPBSのみによって免疫化された。28日後、それらは、100LD50の、マウスに適用されたH5N1型A/香港/483/1997によってチャレンジされた。50または100μgの5量体4(SEQ ID No.4)の何れかを加えたpCAGα-HAにより免疫化されたマウスのグループは、両方が100%の生存を示した一方で、対照PBSグループは、チャレンジ後18日で100%死んだ。このことは、抗原と共にアジュバントとして遊離ペプチドを使用することは、有効な免疫反応が生成されることを可能にし、関連ウィスルを使用するインフルエンザ感染上で典型的には見出される影響から保護を与える、ことを実証する。このことは、強く広範囲にわたる防御免疫反応が生成されたことを示唆する。
多数の抗原と共に機能するアジュバント。作用がインフルエンザワクチンに限定されないことを実証するために、BALB/cマウスは、50μgの遊離ペプチドと共に、または対照としてペプチドを伴わない、1μgのB型肝炎ワクチン(Engerix−B)Engerix−Bワクチンの均等物によって予防注射を筋肉内に受けた。血清は、予防接種後、第2、4、6および8週にマウスから得られた。抗HBS抗体の全ては、市販のELISAキットを用いて検出された。反応率は、かなり劇的であり、対照Engerix Bグループは、免疫処置後第8週では非常に小さな反応を示し、50μgのペプチドを加えたEngerix Bは、免疫処置後第6週、第8週の両方で強い反応を示した。免疫処置後、第6週乃至第8週での抗体反応の生成は、予防接種により生成された特有の反応タイプである。これは、遊離ペプチドは、広範囲の抗原タイプにより機能することを、実証する。
多数の抗原により機能するアジュバント。作用がインフルエンザワクチンに限定されないことを実証するために、BALB/cマウスは、5μgのfiuviraiワクチンの相当物により予防注射を筋肉内に受けた。Fluviralワクチンは、(A)50μgの遊離ペプチドを備えているもの、または(B)対照としてペプチドを備えていないもの、がある。血清は、予防接種後に、第2、4、6および8週でマウスから得られた。抗HBS抗体の全ては、市販のELISAキットを用いて検出された。反応率は、かなり劇的であり、対照fiuviralグループは、免疫処置後第8週では小さな反応を示し、50μgのペプチドを加えたfiuviralは、免疫処置後第6週、第8週の両方でより強い反応を示した。この研究が比較的高いレベルの抗原により実行されたので、要求される抗原の量が典型的には強い免疫反応を生成することが予想されたものよりも、より少ないかもしれないことを示唆する。これは、また遊離ペプチドが広範囲の抗原タイプによって機能することを実証する。
Claims (28)
- 有効な量のアジュバントペプチドを含む組成物であって、
前記アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
KYMCW(SEQ ID No.12)と、
CYWWW(SEQ ID No.14)と、
EHWCM(SEQ ID No.15)と、
FCCWW(SEQ ID No.16)と、
TCCMW(SEQ ID No.17)と、
TCWWH(SEQ ID No.18)と、
TCYWW(SEQ ID No.19)と、
WMICM(SEQ ID No.20)と、
YWHMW(SEQ ID No.21)と、
所望の抗原と、
から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含んでいる、ことを特徴とする組成物。 - アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
KYMCW(SEQ ID No.12)と、
TCCMW(SEQ ID No.17)と、
TCWWH(SEQ ID No.18)と、
TCYWW(SEQ ID No.19)と、
から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項1記載の組成物。 - アジュバントペプチドは、
FCCWW(SEQ ID No.16)と、
TCCMW(SEQ ID No.17)と、
TCWWH(SEQ ID No.18)と、
TCYWW(SEQ ID No.19)と、
WMICM(SEQ ID No.20)と、
から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項1記載の組成物。 - アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
KYMCW(SEQ ID No.12)と、
から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項1記載の組成物。 - アジュバントペプチドは、KWCEC(SEQ ID No.4)であることを特徴とする請求項1記載の組成物。
- 有効な量のアジュバントペプチドは、約50μgと約5mgの間にあることを特徴とする請求項1記載の組成物。
- 有効な量のアジュバントペプチドは、約50μgと約500μgの間にあることを特徴とする請求項1記載の組成物。
- 抗原に対する免疫反応を刺激し、または、免疫反応を強める方法であって、有効量のアジュバントペプチドをそのような処置を必要とするまたは望む固体に投与する工程を含んでおり、
前記アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
KYMCW(SEQ ID No.12)と、
CYWWW(SEQ ID No.14)と、
EHWCM(SEQ ID No.15)と、
FCCWW(SEQ ID No.16)と、
TCCMW(SEQ ID No.17)と、
TCWWH(SEQ ID No.18)と、
TCYWW(SEQ ID No.19)と、
WMICM(SEQ ID No.20)と、
YWHMW(SEQ ID No.21)と、
から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。 - アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
KYMCW(SEQ ID No.12)と、
TCCMW(SEQ ID No.17)と、
TCWWH(SEQ ID No.18)と、
TCYWW(SEQ ID No.19)と、
から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項8記載の方法。 - アジュバントペプチドは、
FCCWW(SEQ ID No.16)と、
TCCMW(SEQ ID No.17)と、
TCWWH(SEQ ID No.18)と、
TCYWW(SEQ ID No.19)と、
WMICM(SEQ ID No.20)と、
から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項8記載の方法。 - アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
KYMCW(SEQ ID No.12)と、
から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項8記載の方法。 - アジュバントペプチドは、KWCEC(SEQ ID No.4)であることを特徴とする請求項8記載の方法。
- 有効な量は、約50μgと約5mgの間にあることを特徴とする請求項8記載の方法。
- 有効な量は、約50μgと約500μgの間にあることを特徴とする請求項8記載の方法。
- 固体が非ヒト動物であることを特徴とする請求項8記載の方法。
- アジュバントペプチドの使用であって、処置を必要とする又は望む固体において、抗原に対する免疫反応を刺激し、又は免疫反応を強めるために、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
KYMCW(SEQ ID No.12)と、
CYWWW(SEQ ID No.14)と、
EHWCM(SEQ ID No.15)と、
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から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする使用。 - アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
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TCCMW(SEQ ID No.17)と、
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TCYWW(SEQ ID No.19)と、
から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項16記載の使用。 - アジュバントペプチドは、
FCCWW(SEQ ID No.16)と、
TCCMW(SEQ ID No.17)と、
TCWWH(SEQ ID No.18)と、
TCYWW(SEQ ID No.19)と、
WMICM(SEQ ID No.20)と、
から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項16記載の使用。 - アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
KYMCW(SEQ ID No.12)と、
から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項16記載の使用。 - アジュバントペプチドは、KWCEC(SEQ ID No.4)であることを特徴とする請求項16記載の使用。
- 固体が非ヒト動物であることを特徴とする請求項16記載の使用。
- 抗原に対する免疫反応を刺激し、又は免疫反応を強めるための薬を調合する方法であって、有効な量のアジュバントペプチドを混合する工程を含んでおり、
前記アジュバントペプチドは、適切な賦形剤を備える、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
KYMCW(SEQ ID No.12)と、
CYWWW(SEQ ID No.14)と、
EHWCM(SEQ ID No.15)と、
FCCWW(SEQ ID No.16)と、
TCCMW(SEQ ID No.17)と、
TCWWH(SEQ ID No.18)と、
TCYWW(SEQ ID No.19)と、
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YWHMW(SEQ ID No.21)と、
から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。 - アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
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から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項22記載の方法。 - アジュバントペプチドは、
FCCWW(SEQ ID No.16)と、
TCCMW(SEQ ID No.17)と、
TCWWH(SEQ ID No.18)と、
TCYWW(SEQ ID No.19)と、
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から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項22記載の方法; - アジュバントペプチドは、
KWCEC(SEQ ID No.4)と、
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から成るグループから選択されていることを特徴とする請求項22記載の方法。 - アジュバントペプチドは、KWCEC(SEQ ID No.4)であることを特徴とする請求項22記載の方法。
- 有効な量が約50μgと約5mgの間にあることを特徴とする請求項22記載の方法。
- 有効な量が約50μgと約500μgの間にあることを特徴とする請求項22記載の方法。
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