CN118275698A - 一种心肌肌钙蛋白i免疫层析检测卡、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡、试剂盒及其应用，所述心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡包括试纸条，所述试纸条由底板和底板上依次粘贴的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；所述第一结合垫结合有生物素标记的cTnI抗体1#和生物素标记的cTnI抗体2#；所述第二结合垫结合有AIE荧光微球标记的cTnI抗体3#和AIE荧光微球标记的二硝基苯酚牛血清白蛋白偶联物；所述cTnI抗体1#、cTnI抗体2#和cTnI抗体3#识别cTnI抗原的位点不重合。本发明采用2种生物素化抗体结合1种AIE荧光抗体的模式，有助于提高检测卡准确度。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测领域，涉及一种心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡、试剂盒及其应用。
背景技术
心肌钙蛋白I（cTnI）是一种心肌肌钙蛋白家族中的成员，由210个氨基酸组成的多肽链，对于心肌收缩过程中的调节起着重要作用。它与肌钙蛋白C（cTnC）和肌钙蛋白T（cTnT）一起形成心肌肌钙蛋白复合物，参与调控心肌肌纤维的收缩和舒张。由于cTnI主要在心脏组织中表达，它在临床上被广泛用作心肌梗塞的标志物。心肌细胞受损后，cTnI会释放到血液中，因此测量血清中的cTnI水平可以用于心肌梗塞的早期诊断和监测。
cTnI多肽链的两端容易被蛋白酶水解，而位于肽链中心区域的第30～110位氨基酸区域与TnC形成的复合物相对较为稳定。选择能够识别该区域的检测抗体或捕获抗体，可以有效解决cTnI分子两端氨基酸残基容易降解而影响cTnI漏检的问题。在心肌细胞损伤后，释放的cTnI会引起机体免疫系统产生抗cTnI自身抗体。这些自身抗体能够特异性地封闭cTnI多肽链第30～110位中心区域的氨基酸残基的抗原位点。这与检测试剂中的cTnI检测抗体竞争性结合cTnI，导致检测结果低于实际值，甚至出现假阴性。因此，cTnI分子末端的水解以及中间区域的自身抗体均可能对试剂检测结果产生影响，可能导致样本出现假阴性的问题。
传统的荧光生色团在高浓度下存在荧光减弱的现象，甚至不发光，这被称为“聚集导致荧光猝灭”效应。这一效应限制了传统荧光材料在免疫诊断领域的应用，对诊断试剂的性能产生制约。2001年，唐本忠课题组观察到一种奇特的现象：某些噻咯分子在溶液中几乎没有荧光，但在聚集状态下，荧光会显著增强。这种荧光增强是由于聚集引起的，因此形象地将这一现象定义为“聚集诱导发光（Aggregation-InducedEmission，AIE）”。基于AIE分子研发的AIE荧光微球具有Stokes位移大、耐光漂白、背景噪声低等特点。这些特性应用于免疫诊断领域有助于提升诊断产品试剂的灵敏度和准确性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡、试剂盒及其应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡，所述心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡包括试纸条，所述试纸条由硬质底板和硬质底板上依次粘贴的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；所述第一结合垫结合有生物素标记的cTnI抗体1#和生物素标记的cTnI抗体2#；所述第二结合垫结合有AIE荧光微球标记的cTnI抗体3#和AIE荧光微球标记的二硝基苯酚多克隆抗体（DNP-BSA）；所述cTnI抗体1#、cTnI抗体2#和cTnI抗体3#识别cTnI抗原的位点不重合。
本发明中采用多种不同识别位点的cTnI抗体组合使用，可以最大限度地降低cTnI降解和自身抗体干扰导致的异常情况。
本发明中AIE荧光微球进行蛋白标记作为荧光检测信号，生物素化抗体与链霉亲和素反应，达到信号放大作用；本发明采用2种生物素化抗体结合1种AIE荧光抗体的模式，有助于提高检测卡准确度。
优选地，所述第一结合垫、第二结合垫的材质均为玻璃纤维素膜。
优选地，所述生物素为已活化的N-羟基琥珀酰亚胺-生物素。
优选地，所述AIE荧光微球的粒径为100nm～300nm，例如100nm、130nm、150nm、180nm、200nm、230nm、250nm、280nm或300nm。
本发明中所述AIE荧光微球为聚合物包裹AIE分子得到的微球。
本发明的AIE荧光微球可通过购买获得，或者自制获得，例如，所述AIE荧光微球可以采用无皂乳液聚合法和溶胀法制备，主要包括以下步骤：（1）利用无皂乳液聚合法制备羧基化聚合物微球；（2）利用所述羧基化聚合物微球和AIE分子通过溶胀法制备得到AIE荧光微球。
优选地，所述硝酸纤维素膜上分别设有包被链霉亲和素的检测线(T线)和包被有二硝基苯酚多克隆抗体（DNP-Ab）的质控线(C线)。
优选地，所述检测线和质控线相互平行，间隔距离为4～7mm（例如4mm、5mm、6mm或7mm），其中检测线靠近第二结合垫，质控线远离第二结合垫。
优选地，所述检测线上链霉亲和素包被浓度为0.5～2mg/mL（0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL或2mg/mL）、用量为0.8～1.2μL/cm（例如0.8μL/cm、0.9μL/cm、1.0μL/cm、1.1μL/cm或1.2μL/cm）。
优选地，所述质控线DNP-Ab的包被浓度为0.5～1.0mg/mL（例如0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1.0mg/mL）、用量为0.8～1.2μL/cm（例如0.8μL/cm、0.9μL/cm、1.0μL/cm、1.1μL/cm或1.2μL/cm）。
优选地，所述硝酸纤维素膜的孔径为3μm~12μm（例如3μm、5μm、7μm、8μm、10μm或12μm），长度为2cm~3cm（例如2cm、2.3cm、2.5cm、2.8cm或3cm），宽度为3.0mm~4.0mm（例如3.0mm、3.2mm、3.5mm、3.8mm或4mm）。具体的，所述硝酸纤维素膜的孔径为3.0μm，所述硝酸纤维素膜的长度为2cm、2.5cm，所述硝酸纤维素膜的宽度为3.0mm、3.9mm或4.0mm。
优选地，所述样品垫为利用样品垫处理液处理过的样品垫。
优选地，所述样品垫处理液包括糖类、表面活性剂、惰性蛋白和阻断剂。
优选地，所述糖类选自蔗糖。
优选地，所述表面活性剂选自S9。
优选地，所述惰性蛋白选自酪蛋白钠盐。
优选地，所述阻断剂选自鼠IgG或抗RBC抗体（抗红细胞抗体）。
优选地，所述吸水垫的材质为木浆。
优选地，所述硝酸纤维素膜固定在所述硬质底板上；
优选地，所述硬质底板包括聚氯乙烯(PVC)板、聚乙烯(PE)板、聚氨酯(PU)板或聚酰亚胺(PI)板中的一种。
优选地，所述心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡还包括设置在试纸条外侧的卡壳，所述卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，所述下卡壳设有放置试纸条的卡槽，所述上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口、对应于试纸条的硝酸纤维素膜处设有观察窗，硝酸纤维素膜上的检测线和质控线均暴露于观察窗处。
在本发明中，所述心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡的制备方法包括以下步骤：
（1）样品垫的制备
用样品垫处理液处理玻璃纤维膜，用量为0.04~0.05mL样品垫处理液/cm2玻璃纤维膜，平铺玻纤，然后用滚轮涂抹液体至均匀，反面再涂抹均匀。处理后的样品垫置于烘箱中，（50±2）℃烘干（12~24）h。
优选地，所述样品垫处理液为含0.008mg/mL的RBC抗体、0.2mg/mL鼠IgG、0.5%酪蛋白钠盐、1%S9、0.2%EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠）、0.5%PEG20000、3%蔗糖的10mM、pH7.4的PBS溶液。
（2）第一结合垫的制备
在第一结合垫上将生物素标记的抗体（生物素标记的cTnI抗体1#和生物素标记的cTnI抗体2#）用稀释液分别稀释20～50倍，均匀喷涂两条线（间距3~4mm），用量为2～3μL/cm。置于烘箱中，（37±2）℃烘干（12~24）h。
优选地，所述稀释液为含0.5%酪蛋白钠盐、1%Tween20、20%海藻糖的50mM、pH7.5的Tris-Hcl缓冲液。
优选地，所述生物素标记抗体制备如下：
a.将待生物素标记的抗体用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液置换原有缓冲液，确保抗体中无叠氮钠、BSA（牛血清白蛋白）、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物；
b.用DMF溶解N-羟基琥珀酰亚胺-生物素，现配现用；
c.向抗体溶液中缓慢加入生物素溶液，抗体与生物素摩尔比为1:5～20，室温避光下旋转反应1-4h；
d.用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液在50kDa超滤管中置换上述反应液6-8次，去除游离的生物素，7500×g、4℃离心5min，收集纯化抗体，4℃避光保存。
（3）第二结合垫的制备
在第二结合垫上将AIE荧光微球标记的cTnI抗体和AIE荧光微球标记的DNP-BSA用微球稀释液分别稀释20～50倍和200~500倍，均匀喷涂两条线（间距3~4mm），用量为2～3μL/cm。置于烘箱中，37℃烘干24h。
优选地，所述微球稀释液为含0.5%甘氨酸、0.5%酪蛋白钠盐、2%Tween20、20%海藻糖的50mM、pH7.5的Tris-Hcl缓冲液。
优选地，所述AIE荧光微球标记的cTnI抗体和AIE荧光微球标记的DNP-BSA制备包括以下步骤：
a.取0.1mLAIE荧光微球加入到0.2mL0.05M、pH6.0的MES缓冲液中，旋涡震荡混匀，用20000×g、4℃离心15min，去上清，用0.3mL0.05M、pH6.0的MES缓冲液复溶，超声分散（2%功率，超声2秒，间隔1秒，超声5次）。
b.取出交联剂N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS），分别溶解于0.05M、pH6.0的MES（2-(N-吗啉基)乙磺酸）中至终浓度各为100mg/mL，先添加0.01mLSulfo-NHS，充分混匀后，迅速添加0.005mLEDC，涡旋混匀后置于圆盘旋转混匀仪中混匀30min。20000×g、4℃离心20min，去上清，用0.3mL0.005M、pH6.0的MES复溶，超声分散。再次用20000×g、4℃离心20min，去上清，用0.3mL0.005M、pH6.0的MES复溶，重复超声分散。
c.在活化的AIE荧光微球中加入0.05~0.5mg的cTnI抗体或DNP-BSA，涡旋混匀，置圆盘旋转混匀仪上反应2h，用20000×g、4℃离心20min，去上清，用0.3mL含0.5%酪蛋白钠盐、0.5%BSA、1%甘氨酸的0.01M、pH7.0的PBS封闭液超声复溶，圆盘旋转混匀1h。用20000×g、4℃离心15min，去上清，用0.1mL含3%海藻糖、0.5%酪蛋白钠盐、0.1%Tween20的0.05M、pH7.8的Tris-Hcl的保存液超声复溶，2~8℃保存。
（4）包被膜的制备
分别用10mM、pH7.4的PBS缓冲液将链霉亲和素和DNP-Ab稀释至0.5～2mg/mL，以速度500mm/s，用量为0.8～1.2μL/cm，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线与检测线间隔4～7mm，置于烘箱中，37℃烘干72h。
（5）检测卡的组装
在底板上顺次相互搭接地粘贴包被膜、吸水垫、第二结合垫、第一结合垫和样品垫得到试纸大板，用可编码切条机切割得到所述试纸条。所述检测卡由检测试纸条固定在塑料底板上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。
本发明采用“2+1”模式，即2种生物素标记抗体结合1种AIE荧光微球标记抗体的模式，该技术方案提高了检测卡检测灵敏度，降低了样本中cTnI漏检带来的假阴率；
本发明将生物素-链霉亲和素信号放大系统与Stokes位移大、光稳定性好、背景噪声低、发光效率高的AIE荧光微球以及免疫层析技术结合，且无需对样本进行预处理和稀释，该技术方案提高了检测卡稳定性、灵敏度、检测速度，降低了非特异性反应带来的假阳率；
本发明采用2种结合垫，生物素标记抗体和荧光微球标记抗体分别位于结合垫1、结合垫2，样本中的cTnI可以充分与生物素标记抗体、荧光微球标记抗体结合反应。
另一方面，本发明提供了一种心肌肌钙蛋白I免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡。
另一方面，本发明提供了如上所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡或者如上所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析试剂盒在检测心肌钙蛋白I中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的检测卡的检测原理是双抗体夹心法，定量测定人血清、血浆、全血样本中cTnI的含量。样本中存在待测物时，首先与第一结合垫上的生物素标记cTnI抗体1#、cTnI抗体2#充分结合，再与第二结合垫上的AIE荧光微球标记的cTnI抗体3#结合，形成生物素-双抗体夹抗原-AIE荧光微球复合物，通过毛细管作用，复合物沿着硝酸纤维素膜向前移动，被硝酸纤维素膜检测线上包被的链霉亲和素所捕获。样本中的待测物越多，检测线上积聚的复合物越多，AIE荧光信号越强，荧光抗体的信号强度反映了待测物浓度。通过配套的荧光免疫分析仪，可检测出血清、血浆、全血样本中cTnI的浓度。
附图说明
图1为本发明的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡试纸条的结构示意图，其中1为样品垫、2为第一结合垫、3为第二结合垫、4为NC膜、5为检测线、6为质控线、7为吸水垫、8为底板；
图2为实施例检测卡1线性回归曲线图；
图3为对比例检测卡1线性回归曲线图；
图4为对比例检测卡2线性回归曲线图；
图5为对比例检测卡3线性回归曲线图；
图6为实施例和对比例的检测卡线性曲线对比图；
图7为本发明实施例以及对比例检测卡与贝克曼参照试剂盒检测临床样本的相关性图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：“2+1”模式的cTnI检测卡制备
在该实施例中，心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡的制备包括以下步骤：
1.样品垫的制备
用样品垫处理液(含0.008mg/mLRBC抗体、0.2mg/mL鼠IgG、0.5%酪蛋白钠盐、1%S9、0.2%EDTA-Na2、0.5%PEG20000、3%蔗糖的10mM、pH7.4的PBS)处理玻璃纤维膜，0.045mL样品垫处理液/cm2玻璃纤维膜，平铺玻纤，然后用滚轮涂抹液体至均匀，反面再涂抹均匀。处理后的样品垫置于烘箱中，50℃烘干24h。
2.结合垫1（即第一结合垫）的制备
（S1）生物素混合标记cTnI抗体1#和cTnI抗体2#
a.取待生物素标记的0.1mg的cTnI抗体1#（购自海肽生物科技有限公司，货号：4TC2-20C6cc）和0.1mg的cTnI抗体2#（购自广东菲鹏生物有限公司，货号：cTnI-McAb-30）混匀，采用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液置换原有缓冲液，终体积为0.2mL；
b.用DMF溶解N-羟基琥珀酰亚胺-生物素，浓度为2mg/mL；
c.向0.2mg抗体溶液中缓慢加入2.25μL(4.5μg)生物素溶液（购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：N103916），抗体与生物素摩尔比为1：10，室温避光下旋转反应2h；
d.用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液在50kDa超滤管中置换上述反应液6次，去除游离的生物素，7500×g、4℃离心5min，收集纯化抗体，调整浓度为1mg/mL，4℃保存。
（S2）结合垫1的制备
在结合垫1上用稀释液(含0.5%酪蛋白钠盐、1%Tween20、20%海藻糖的50mM、pH7.5的Tris-Hcl缓冲液)进行处理，所述稀释液中含有2%生物素标记的cTnI抗体1#、cTnI抗体2#混合物，均匀喷涂两条线（间距3mm），用量为2μL/cm，速度为500mm/s。置于烘箱中，37℃烘干24h。
3.结合垫2（即第二结合垫）的制备
（S1）AIE微球标记的cTnI抗体3#和AIE微球标记的DNP-BSA制备
a.取0.1mLAIE荧光微球（购自广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院，货号：NAYPC-020）加入到0.2mL0.05M、pH6.0的MES缓冲液中，旋涡震荡混匀，用20000×g、4℃离心15min，去上清，用0.3mL0.05M、pH6.0的MES缓冲液复溶，超声分散（2%功率，超声2秒，间隔1秒，超声5次）。
b.取出交联剂N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS），分别溶解于0.05M、pH6.0的MES中至终浓度各为100mg/mL，先添加0.01mLSulfo-NHS，充分混匀后，迅速添加0.005mLEDC，涡旋混匀后置于圆盘旋转混匀仪中混匀30min。20000×g、4℃离心20min，去上清，用0.3mL0.005M、pH6.0的MES复溶，超声分散。再次用20000×g、4℃离心20min，去上清，用0.3mL0.005M、pH6.0的MES复溶，重复超声分散。
c.在活化的AIE荧光微球中加入0.5mg的cTnI抗体3#（购自广东菲鹏生物有限公司，货号：cTnI-McAb-29）或0.5mg的DNP-BSA，涡旋混匀，置圆盘旋转混匀仪上反应2h，用20000×g、4℃离心20min，去上清，用0.3mL含0.5%酪蛋白钠盐、0.5%BSA、1%甘氨酸的0.01M、pH7.0的PBS封闭液超声复溶，圆盘旋转混匀1h。用20000×g、4℃离心15min，去上清，用0.1mL含3%海藻糖、0.5%酪蛋白钠盐、0.1%Tween20的0.05M、pH7.8的Tris-Hcl的保存液复溶，4℃保存。
（S2）结合垫2的制备
在结合垫2上用标记稀释液(含0.5%甘氨酸、0.5%酪蛋白钠盐、2%Tween20、20%海藻糖的50mM、pH7.5的Tris-Hcl缓冲液)进行处理，所述标记稀释液中含有2%AIE荧光微球标记的cTnI抗体3#和0.5%AIE荧光微球标记的DNP-BSA，均匀喷涂两条线（间距3mm），用量为2μL/cm，速度为500mm/s。置于烘箱中，37℃烘干24h。
4.包被膜的制备
分别用10mM、pH7.4的PBS缓冲液将链霉亲和素（购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：S274235）和DNP-Ab浓度分别稀释2mg/mL、0.5mg/mL，速度500mm/s，用量为1μL/cm，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线与检测线间隔4～7mm，置于烘箱中，37℃烘干72h。
5.检测卡的组装
在底板上顺次相互搭接地粘贴包被膜、吸水垫、结合垫2、结合垫1和样品垫得到试纸大板，用可编码切条机切割为4mm宽的试纸条。将试纸条固定在塑料底卡上，试纸表面用卡面压紧，其结构如图1所示。
完成实施例1的检测卡组装，即实施例检测卡1：“生物素化cTnI抗体1#+生物素化cTnI抗体2#”+“荧光抗体3#”。
对比例1：“1+1”模式（2层结合垫）的cTnI检测卡制备
1.样品垫的制备
同上述实施例1。
2.结合垫1的制备
（S1）生物素标记cTnI抗体1#或cTnI抗体2#
a.取待生物素标记的0.2mg的cTnI抗体1#或0.2mg的cTnI抗体2#，分别采用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液置换原有缓冲液，终体积为0.2mL；
b.用DMF溶解N-羟基琥珀酰亚胺-生物素，浓度为2mg/mL；
c.向0.2mg抗体溶液中缓慢加入2.25μL(4.5μg)生物素溶液，抗体与生物素摩尔比为1：10，室温避光下旋转反应2h；
d.用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液在50kDa超滤管中置换上述反应液6次，去除游离的生物素，7500×g、4℃离心5min，收集纯化抗体，调整浓度为1mg/mL，4℃保存。
（S2）结合垫1的制备
在结合垫1上用稀释液(含0.5%酪蛋白钠盐、1%Tween20、20%海藻糖的50mM、pH7.5的Tris-Hcl缓冲液)进行处理，所述稀释液中含有1%生物素标记的cTnI抗体1#或1%生物素标记的cTnI抗体2#，均匀喷涂两条线（间距3mm），用量为2μL/cm，速度为500mm/s。置于烘箱中，37℃烘干24h。
3.结合垫2的制备
同上述实施例1。
4.包被膜的制备
同上述实施例1。
5.检测卡的组装
同实施例1，完成对比例1的2种检测卡组装，即对比例检测卡1：“生物素化cTnI抗体1#”+“荧光抗体3#”和对比例检测卡2：“生物素化cTnI抗体2#”+“荧光抗体3#”，在2层垫上的“1+1”模式。
对比例2：“2+1”模式（1层结合垫）的cTnI检测卡制备
1.样品垫的制备
同实施例1。
2.结合垫的制备
（S1）生物素混合标记cTnI抗体1#和cTnI抗体2#
同实施例1步骤2（S1）。
（S2）AIE微球标记的cTnI抗体3#和AIE微球标记的DNP-BSA制备
同实施例1步骤3（S1）。
（S3）结合垫的制备
在结合垫上用标记稀释液(含0.5%甘氨酸、0.5%酪蛋白钠盐、2%Tween20、20%海藻糖的50mM、pH7.5的Tris-Hcl缓冲液)进行处理，所述标记稀释液中含有2%生物素标记的cTnI抗体1#、cTnI抗体2#混合物、2%AIE荧光微球标记的cTnI抗体3#和0.5%AIE荧光微球标记的DNP-BSA，均匀喷涂两条线（间距3mm），用量为2μL/cm，速度为500mm/s。置于烘箱中，37℃烘干24h。
3.包被膜的制备
同实施例1。
4.检测卡的组装
同实施例1，完成对比例2的检测卡组装，即对比例检测卡3：“生物素化cTnI抗体1#+生物素化cTnI抗体2#+荧光抗体3#”，在一层垫上的“2+1”模式。
实施例2：检测卡性能评价
1.灵敏度、重复性、线性范围确定
采用阴性牛血清稀释cTnI抗原，配制浓度为0ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.2ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的校准品。
在同一台仪器上，分别采用实施例检测卡1、对比例检测卡1和对比例检测卡2和对比例检测卡3共4种检测卡对每个样本重复测试10次，测出实施例检测卡1的低端灵敏度为0.02ng/mL、低端重复性（CV）小于10.0%、线性范围为0.02ng/mL~50ng/mL；对比例检测卡1的低端灵敏度为0.05ng/mL、低端重复性（CV）小于10.0%、线性范围为0.05ng/mL~50ng/mL；对比例检测卡2的低端灵敏度为0.05ng/mL、低端重复性（CV）小于10.0%、线性范围为0.05ng/mL~50ng/mL；对比例检测卡3的低端灵敏度为0.05ng/mL、低端重复性（CV）大于10.0%、线性范围为0.05ng/mL~50ng/mL。实施例检测卡1的灵敏度优于对比例检测卡1、对比例检测卡2、对比例检测卡3的灵敏度。结果见表1~表4和图2~图6。
表1实施例检测卡1试剂性能评估
表2对比例检测卡1试剂性能评估
表3对比例检测卡2试剂性能评估
表4对比例检测卡3试剂性能评估
2.临床样本检测
采集cTnI血清样本150例，采用本发明的实施例检测卡1、对比例检测卡1、对比例检测卡2、对比例检测卡3以及参照试剂盒（贝克曼cTnI电化学发光法试剂盒）同时检测血清样本，取血清样本85μL加入到检测卡加样孔中，层析8min后通过干式荧光免疫分析仪（定制苏州和迈精密仪器有限公司，型号：FIC-Q100N）读取浓度。
本发明的实施例检测卡1、对比例检测卡3与贝克曼参照试剂盒相比，均无异常样本，实施例检测卡1与参照试剂相关性（r=0.9901＞0.9900）优于对比例检测卡3（r=0.9742＜0.9900）；对比例检测卡1出现2例异常样本，对比例检测卡2出现3例异常样本，这5例样本测试浓度值偏低，与贝克曼参照试剂盒测试浓度相差较大，易造成漏检导致的假阴问题，结果见图7。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡，其特征在于，所述心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡包括试纸条，所述试纸条由硬质底板和硬质底板上依次粘贴的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；所述第一结合垫结合有生物素标记的cTnI抗体1#和生物素标记的cTnI抗体2#；所述第二结合垫结合有AIE荧光微球标记的cTnI抗体3#和AIE荧光微球标记的二硝基苯酚牛血清白蛋白偶联物；所述cTnI抗体1#、cTnI抗体2#和cTnI抗体3#识别cTnI抗原的位点不重合。
2.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡，其特征在于，所述第一结合垫和第二结合垫的材质为玻璃纤维素膜；
所述生物素为已活化的N-羟基琥珀酰亚胺-生物素；
所述AIE荧光微球的粒径为100nm～300nm。
3.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上分别设有包被链霉亲和素的检测线和包被有二硝基苯酚多克隆抗体的质控线；
所述检测线和质控线相互平行，间隔距离为4～7mm，其中检测线靠近第二结合垫，质控线远离第二结合垫。
4.根据权利要求3所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测线上链霉亲和素包被浓度为0.5～2mg/mL、用量为0.8～1.2μL/cm；
所述质控线DNP-Ab的包被浓度为0.5～1.0mg/mL、用量为0.8～1.2μL/cm。
5.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的孔径为3μm~12μm，长度为2cm~3cm，宽度为3.0mm~4.0mm。
6.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡，其特征在于，所述样品垫为利用样品垫处理液处理过的样品垫；
所述样品垫处理液包括糖类、表面活性剂、惰性蛋白和阻断剂；
所述糖类选自蔗糖；所述表面活性剂选自S9；所述惰性蛋白选自酪蛋白钠盐；所述阻断剂选自鼠IgG或抗RBC抗体。
7.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡，其特征在于，所述吸水垫的材质为木浆；
所述硝酸纤维素膜固定在所述硬质底板上；
所述硬质底板包括聚氯乙烯板、聚乙烯板、聚氨酯板或聚酰亚胺板中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡，其特征在于，所述心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡还包括设置在试纸条外侧的卡壳，所述卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，所述下卡壳设有放置试纸条的卡槽，所述上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口、对应于试纸条的硝酸纤维素膜处设有观察窗，硝酸纤维素膜上的检测线和质控线均暴露于观察窗处。
9.一种心肌肌钙蛋白I免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-8中任一项所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析检测卡或者权利要求9所述的心肌肌钙蛋白I免疫层析试剂盒在检测心肌钙蛋白I中的应用。
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| WO2022077930A1 (zh) * | 2020-10-16 | 2022-04-21 | 广东菲鹏生物有限公司 | 心肌肌钙蛋白i检测方法和试剂盒 |
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| CN116990505A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-03 | 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 | 一种白介素-6aie荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其应用 |
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