CN118275518A - 系列电泳 - Google Patents

Abstract

公开了对两份或更多份核酸样品执行毛细管电泳的方法。所述方法采用正向电压将第一样品从入口前向移动到毛细管中的询问区域，然后采用反向电压将所述第一样品后向移动，并且随后再次采用正向电压将所述第一样品和第二样品前向移动。还提供用于执行毛细管电泳的系统和装置。

Description

系列电泳

本申请是申请号为201880047956.3、申请日为2018年5月22日、发明名称为“系列电泳”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2017年5月22日提交的题为“系列电泳(SERIALELECTROPHORESIS)”的美国临时专利申请第62/509,618号的优先权，其全部内容针对所有目的通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于执行毛细管电泳的技术。

背景技术

毛细管电泳系统用于分离例如PCR扩增子。在典型的工作流程中，将样品带到毛细管的一端，在这一端处，将一小部分样品作为塞子进样。通常，施加高电压，然后样品中的带电物种开始在毛细管内部迁移，其中凝胶基于速度来区分物种；所述物种迁移使得具有不同性质的物种被分离。选择高电压的极性使得驱动目标物种向毛细管的另一端迁移，在毛细管的另一端处，在所述端部之前一定距离处检测到目标物种。根据第一物种和目标物种的各自性质，第一物种在特定时间到达检测位置，然后目标物种随后到达。检测器的输出揭示了种群中任意物种的到达时间，从中可以识别出与所述物种有关的信息，诸如其大小。

在增加电泳系统的通过量方面将提供多种科学和研究上的益处。

发明内容

本公开涉及用于执行毛细管电泳的方法、系统和装置。

本公开的一方面涉及一种对多份样品执行毛细管电泳的方法。所述方法包括：引入第一样品至包含分离介质的毛细管的入口，所述第一样品包含具有多种不同大小的第一DNA片段；在所述毛细管中对所述第一样品执行电泳，其中所述电泳包含向所述毛细管施加第一基本恒定的正向极性电泳电压，同时在所述毛细管远端附近的询问区域中检测一些所述第一DNA片段；在全部所述第一DNA片段都已通过所述询问区域之前，向所述毛细管施加反向极性电压脉冲，由此将所述毛细管中的至少一些所述第一DNA片段朝向所述毛细管的所述入口传送，以及之后引入第二样品至所述毛细管的所述入口，所述第二样品包含具有多种不同大小的第二DNA片段；以及向所述毛细管施加第二基本恒定的正向极性电泳电压，以同时对所述第二DNA片段和所述第一DNA片段执行电泳。

在一些实施方案中，所述方法进一步包含引入多个内部校准物连同所述第一样品至所述毛细管的所述入口，其中每个内部校准物包含标记的不同大小的DNA片段。在一些实施方案中，所述第一DNA片段包含来自DNA源中STR的基因座的扩增子。

在一些实施方案中，所述方法进一步包含扩增所述DNA源以从所述STR的所述基因座产生所述扩增子。

在一些实施方案中，对包含所述毛细管的系统执行所述扩增。

在一些实施方案中，所述系统包含了包含流体通道的盒，以及配置为执行聚合酶链反应的热循环仪。

在一些实施方案中，引入所述第二样品至所述毛细管的所述入口包含：引入所述第二样品至与所述毛细管的所述入口接触的入口区域；施加进样正向极性电压脉冲以在所述毛细管的所述入口附近产生所述第二DNA片段的塞子；以及从所述入口区域冲洗所述第二样品。

在一些实施方案中，施加所述反向极性电压脉冲使所述第一DNA片段中已经通过所述询问区域的一些第一DNA片段移动到所述询问区域上游的位置。

在一些实施方案中，所述方法进一步包含引入所述第二样品至所述毛细管的所述入口之前，终止所述反向极性电压脉冲。

在一些实施方案中，所述方法进一步包含向所述毛细管施加所述第二基本恒定的正向极性电泳电压之前，终止所述反向极性电压脉冲。

在一些实施方案中，所述方法进一步包含：(i)在所述毛细管中对所述第一样品执行电泳的同时，在所述询问区域处检测内部校准物；(ii)向所述毛细管施加所述反向极性电压脉冲的同时，在所述询问区域处第二次检测所述内部校准物；以及(iii)向所述毛细管施加所述第二基本恒定的正向极性电泳电压的同时，在所述询问区域处第三次检测所述内部校准物。

在一些实施方案中，所述方法进一步包含解读所述第一DNA片段和所述第二DNA片段的所述电泳，其中所述解读包含忽略在所述询问区域处所述第一次和所述第三次检测所述内部校准物之间的时间段期间获得的信号。

在一些实施方案中，所述方法进一步包含在所述询问区域处检测全部所述第二DNA片段之前：向所述毛细管施加第二反向极性电压脉冲，由此将所述毛细管中的至少一些所述第二DNA片段朝向所述毛细管的所述入口传送；引入第三样品至所述毛细管的所述入口，所述第三样品包含具有多种不同大小的第三DNA片段；以及向所述毛细管施加第三基本恒定的正向极性电泳电压，以同时对所述第三DNA片段和所述第二DNA片段执行电泳。

在一些实施方案中，当施加所述反向极性电压脉冲到所述毛细管中的位置时，施加所述反向极性电压脉冲移动尚未通过所述询问区域的全部所述第一DNA片段，从而当施加所述第二基本恒定的正向极性电泳电压时，尚未通过所述询问区域的所述第一DNA片段仍未通过所述询问区域。

在一些实施方案中，所述方法进一步包含通过将施加所述反向极性电压脉冲之前和之后获得的所述第一样品的局部电泳图拼接在一起来产生所述第一样品的电泳图。

在一些实施方案中，拼接在一起包含去除在施加所述反向极性电压脉冲之前获得的第一局部电泳图中参考点之后获得的数据，以及去除在施加所述反向极性电压脉冲之后获得的第二局部电泳图中参考点之前获得的数据。在一些实施方案中，所述方法进一步包含通过识别与所述参考点关联的电泳图峰来识别所述参考点。

本公开的另一方面涉及一种对多份样品执行毛细管电泳的方法。所述方法包含：在包含分离介质的毛细管中发起第一样品的电泳，所述第一样品包含具有多种不同大小的第一DNA片段；通过向所述毛细管施加基本恒定的正向极性电泳电压，实施从所述第一样品稳态传送所述第一DNA片段；在完成所述第一样品的电泳之前，停止施加所述基本恒定的正向极性电泳电压，并且由此中断所述毛细管中所述第一DNA片段的所述稳态传送；向所述毛细管施加反向极性电压以驱动所述第一DNA片段朝向所述毛细管的入口传送；停止施加所述反向极性电压；引入第二样品至与所述毛细管入口接触的入口区域，其中所述第二样品包含具有多种不同大小的第二DNA片段；施加进样正向极性电压脉冲以在所述毛细管中所述毛细管入口附近产生所述第二DNA片段的塞子；施加第二基本恒定的正向极性电压以引起所述毛细管中所述第一DNA片段和所述第二DNA片段的稳态传送；以及当所述第一DNA片段和所述第二DNA片段到达所述毛细管的远端附近的询问区域时，询问所述第一DNA片段和所述第二DNA片段。

本公开的又一方面涉及一种用于对多份样品执行毛细管电泳的系统。所述系统包含：(a)毛细管，其包含分离介质并具有入口和远端；(b)入口，其与所述毛细管入口连通并且配置为接收包含具有多种不同大小的DNA片段的样品；(c)询问区域，其配置为检测穿过所述毛细管移动的DNA片段；(d)电源，其配置为在所述毛细管的所述入口和所述远端之间施加正向极性电压和反向极性电压；以及(e)逻辑。所述控制逻辑配置用于引导以下操作：引入第一样品至所述毛细管入口，所述第一样品包含具有多种不同大小的第一DNA片段；通过向所述毛细管施加第一基本恒定的正向极性电泳电压，在所述毛细管中对所述第一样品执行电泳，同时在所述询问区域中检测一些所述第一DNA片段；在全部所述第一DNA片段都已通过所述询问区域之前，向所述毛细管施加反向极性电压脉冲，由此将所述毛细管中的至少一些所述第一DNA片段朝向所述毛细管入口传送；之后引入第二样品至所述毛细管入口，所述第二样品包含具有多种不同大小的第二DNA片段；以及向所述毛细管施加第二基本恒定的正向极性电泳电压，以同时对所述第二DNA片段和所述第一DNA片段执行电泳。

在一些实施方案中，所述系统进一步包含底盘，所述底盘包围所述毛细管、所述入口区域、所述询问区域、所述电源和所述逻辑。

在一些实施方案中，所述系统进一步包含底盘，所述底盘包围所述毛细管、所述入口区域、所述询问区域和所述电源，但不包围所述逻辑。

在一些实施方案中，所述系统进一步包含逻辑，所述逻辑用于通过将施加所述反向极性电压脉冲之前和之后获得的所述第一样品的局部电泳图拼接在一起来产生所述第一样品的电泳图。

在一些实施方案中，所述系统进一步包含所述逻辑进一步配置为引导扩增DNA源以从STR的基因座产生扩增子。在一些实施方案中，所述系统进一步包含了包含流体通道的盒，以及配置为执行聚合酶链反应的热循环仪。

在一些实施方案中，所述系统进一步包含所述逻辑进一步配置为通过以下方式引导所述第二样品引入至所述毛细管的所述入口：引入所述第二样品至与所述毛细管的所述入口接触的入口区域；施加进样正向极性电压脉冲以在所述毛细管的所述入口附近产生所述第二DNA片段的塞子；以及从所述入口区域冲洗所述第二样品。

在一些实施方案中，所述逻辑进一步配置为在引入所述第二样品至所述毛细管的所述入口之前，终止所述反向极性电压脉冲。

在一些实施方案中，所述逻辑进一步配置为向所述毛细管施加所述第二基本恒定的正向极性电泳电压之前，终止所述反向极性电压脉冲。

在一些实施方案中，所述逻辑进一步配置为引导以下操作：(i)在所述毛细管中对所述第一样品执行电泳的同时，在所述询问区域处检测内部校准物；(ii)向所述毛细管施加所述反向极性电压脉冲的同时，在所述询问区域处第二次检测所述内部校准物；以及(iii)向所述毛细管施加所述第二基本恒定的正向极性电泳电压的同时，在所述询问区域处第三次检测所述内部校准物。

在一些实施方案中，所述逻辑进一步配置为引导以下操作：解读所述第一DNA片段和所述第二DNA片段的所述电泳，其中所述解读包括忽略在所述询问区域处所述第一次和所述第三次检测所述内部校准物之间的时间段期间获得的信号。

在一些实施方案中，所述逻辑进一步配置为在所述询问区域处检测全部所述第二DNA片段之前引导以下操作：向所述毛细管施加第二反向极性电压脉冲，由此将所述毛细管中的至少一些所述第二DNA片段朝向所述毛细管的所述入口传送；引入第三样品至所述毛细管的所述入口，所述第三样品包含具有多种不同大小的第三DNA片段；以及向所述毛细管施加第三基本恒定的正向极性电泳电压，以同时对所述第三DNA片段和所述第二DNA片段执行电泳。

在一些实施方案中，所述逻辑进一步配置为引导以下操作：通过将施加所述反向极性电压脉冲之前和之后获得的所述第一样品的局部电泳图拼接在一起来产生所述第一样品的电泳图。在一些实施方案中，拼接在一起包含去除在施加所述反向极性电压脉冲之前获得的第一局部电泳图中参考点之后获得的数据，以及去除在施加所述反向极性电压脉冲之后获得的第二局部电泳图中参考点之前获得的数据。

在一些实施方案中，所述逻辑进一步配置为引导以下操作：通过识别与所述参考点关联的电泳图峰来识别所述参考点。

附图说明

图1A是描绘适用于与本文所述的过程结合使用的电泳装置的框图。

图1B是在本文所述的系统中有用的分析模块的示意图。

图2是描绘常规电泳过程的时序图。

图3是描绘根据本文所述的某些实施例的电泳过程的时序图。

图4A是在两条迹线中提供的两份样品的局部电泳图。

图4B是在三条迹线中提供的三份样品的局部电泳图。

具体实施方式

术语

本公开的每个实施例可以选用地与本文所述的与该实施例一致的任何一个或多个其它实施例组合。

每当术语“约”或“大约”在一系列两个或更多个数值或一系列两个或更多个数值范围中位于第一数值之前时，术语“约”或“大约”适用于这一系列数值或这一系列数值范围中的每一个数值。在某些实施例中，术语“约”或“大约”是指在指定值的10％或5％以内。

每当术语“至少”或“大于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”或“大于”适用于这一系列数值中的每一个数值。

每当术语“不超过”或“小于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“不超过”或“小于”适用于这一系列数值中的每一个数值。

如本文所使用的，术语“样品”是指含有生物材料的样品。样品可以是例如流体样品(例如，血液样品)或者组织样品(例如，面颊拭子)。样品可以是较大样品的一部分。样品可以是具有核酸的生物样品，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或蛋白质。样品可以是法医样品或环境样品。样品可以在引入系统之前进行预处理；预处理可以包含从不适合系统的材料中进行提取，对细胞量、DNA或其它生物聚合物或分子的数量进行量化，浓缩样品，将诸如精子之类的细胞类型与上皮细胞相分离，使用Aurora系统(北方基因组学(Boreal Genomics))或珠粒处理或其它浓缩方法对DNA进行浓缩，或者其它样品操纵方式。样品可以在载体中携带，诸如拭子、擦拭物、海绵、刮刀、材料冲压件、目标分析物飞溅其上的材料、食物样品、分析物在其中溶解的液体，诸如水、苏打水。样品可以是直接的生物样品，诸如血液、精液、唾液之类的液体；或者是诸如固体组织样品、肉或骨的固体。

所公开的实施例还可以例如通过从诸如床单或椅子之类的大物体中提取DNA以及其它处理而应用于处理和分析先前已经预处理过的样品，所述其它处理可以包含对DNA浓度、细胞浓度的定量，或在将预处理后样品输入样品盒之前的其它操作。

对电泳系统通过量的限制是毛细管多长时间可以接受一个新样品。传统上，下一份样品要等到第一样品中所有目标物种都通过检测位置后才被进样。例如，在典型的STR分析中，第一物种到达检测器的时间约为最慢物种到达检测器的时间的三分之一，因此在三分之一的时间期间，没有收集到任何目标信息。

可以考虑使用一种系统，所述系统中断正在进行的样品迁移并将下一份样品进样到毛细管中使得当恢复迁移时，下一份样品中最快物种在第一样品的最慢物种到达检测位置之后才能到达检测位置。通过这种方式，没有目标物种到达检测器的时间被最小化。然而，在中断第一样品的迁移时，在检测位置处收集的重要时序信息受到损害。具体地，进样本身涉及施加一系列电压。此外，认为样品中的一些片段可能保留在毛细管中，因此在引入下一份样品之前完全清除当前样品是安全的。

由于例如用于控制和检测高压的各种未表征的系统时间常数、与毛细管中施加高压产生的焦耳热有关的热时间常数以及由于施加电压引起的迁移速度的任何非线性，因此这种方法可能容易出错。如下文所解释的，可以通过补偿初始高压脉冲(通常称为进样脉冲)和与引入下一份样品相关联的其它变化来解决此类挑战。

装置

在某些实施例中，装置的相关部件和操作相当简单，并且结合图1A和2进行描述。图1A表示装置的框图，并且图2提供了常规的电泳图时序图。

如图1A中所示，电泳装置101包括毛细管，所述毛细管具有凝胶103和位于毛细管的入口处的入口区域105(例如，入口室)。在操作期间，将DNA样品提供至入口区域105。样品可以在缓冲溶液中提供。在入口区域105中，样品在毛细管的近端接触凝胶。装置101还包括电泳电极107和109。如所示，电极109设置有正电荷并且被设置在毛细管103的远端，而电极107设置有负电荷并设置在毛细管的近端。这种极性有时被称为“正向”电泳电压；电极处的电势的绝对量级与其电势的相对差相比相关性较小。电源111配置为向电极107和109中的一者或两者施加一个或多个定义的电压电平。电源通过导电线和/或其它电路元件连接到电极。最后，电泳装置101包括检测系统113，所述检测系统113配置为检测穿过毛细管103的远端附近的询问区域115的样品物种。检测系统检测询问区域中物种发出的信号。在某些实施例中，检测系统检测物种发出的荧光信号。在一些实施方案中，所述装置包括不直接连接以执行电泳的部件。这些可以包含了包含流体通道的盒和配置为执行聚合酶链反应的热循环仪。适用于与本公开结合使用的装置、模块和系统的实例在2014年11月25日发布的美国专利第8,894,946号中提出，其全部内容通过引用并入本文。

在某些实施例中，毛细管电泳系统是图1B中所示的分析和检测模块的一部分。在所述实施例中，样品(例如，扩增的DNA或对照物)和缓冲液(例如，电泳缓冲液)从路径中的分析物制备模块流过流体导管(诸如，管道)，并且流出以废弃，所述路径可以包含变性加热器，用于将分析物进样到毛细管的阴极组合件。变性加热器加热含有DNA的流体并使双链DNA中的链变性。阴极组合件可以包含连接到电压源的电极，诸如叉形电极。当定位待分析的样品以便进样时，电极可以提供电压以将分析物进样到毛细管中。毛细管填充有分离介质，诸如线性聚丙烯酰胺(例如，LPA V2e，可从加利福尼亚州普莱森顿IntegenX公司购得)。毛细管端部电连接到电压源，例如两个电极，用作正电极(标记为阳极)和负电极(标记为阴极)，并且能够反向供电，例如当电源向电极施加正电势时，负电极变成正电极。使用检测模块检测分离的分析物。检测模块可以采用例如激光器和检测器，诸如CCD相机、CMOS、光电倍增管或光电二极管。这些中的任何一个都可以被设置为在询问区域中检测通过的DNA片段。阳极组合件(例如，阳极盒接口)可以包括与毛细管电连接的阳极和电压源。阳极组合件还可以包含分离介质源和用于将分离介质引入毛细管中的压力源。阳极组合件可以包含电泳缓冲液。分离介质和/或电泳缓冲液可以包含在阳极盒中。阳极盒可以配置成可移除地插入阳极组合件中。其可以含有足以进行一次或多次运行的分离介质和/或电泳缓冲液。

在某些实施例中，毛细管电泳组合件包含：注射组合件，其可以包含变性组合件，阴极组合件；毛细管组合件；阳极组合件；毛细管填充组合件，其用于为毛细管填充分离介质；定位组合件，其用于定位用于毛细管进样的分析物(或样品)；以及用于在阳极和阴极之间施加电压的电源。

毛细管电泳系统可以包含一个或多个毛细管，以促进样品或产物分离，这可以协助分析。在一些实施例中，流体流动路径将样品或产物从盒引导至流体流动路径和分离通道之间的交叉点。(参见图1B)引导样品从流体流动路径至分离通道，并借助于电场(如可以在系统的阳极和阴极上施加电势时产生)通过分离通道(见下文)。美国专利第2011/0005932号公开(“通用样品制备系统及其在综合分析系统中的用途(UNIVERSAL SAMPLEPREPARATION SYSTEM AND USE IN AN INTEGRATED ANALYSIS SYSTEM)”)提供了可以结合本文的系统使用的用于分析的电泳毛细管的实例，所述美国专利公开通过引用整体并入本文。毛细管可以插入流体导管中以进行流体连通和电连通。

阴极也可以通过与流体导管中的流体的电连通而与毛细管电连通。阴极可以设置在与毛细管连接点的附近的流体导管中。例如，阴极可以被定位成与毛细管与流体导管连接的点相对(例如，既不在连接上游也不在下游)。这可以帮助将样品进样到毛细管和/或为电泳运行提供电压。在某些实施例中，阴极可以包括叉形电极，其中一个叉位于毛细管与流体导管的连接点的上游而一个叉位于下游。在其它实施例中，阴极包括位于流体导管与毛细管之间的连接点附近的叉形电极和第三电极。

可以通过任何合适的方法制备电泳样品(例如，扩增产物)以进样到分离通道(例如，毛细管)中。作为实例，可以通过在电泳样品通道中放置介于包括较高盐浓度或较高离子强度的电泳缓冲液的区域之间的包括较低盐浓度或较低离子强度的样品的稀释混合物来执行场扩增堆叠(FAS)。作为另一个实例，可以在样品通道中将大块材料(例如，空气)放置在样品的下游，其中所述材料的电导率不同于电泳缓冲液或样品的电导率，如下所述。当样品跨过分离通道放置时，可以在适当时间量(例如，约10秒到约20秒，或约15秒)内在适当电压(例如，约3kV至约5kV或约4kV)下将样品电动地进样到分离通道中。

所述系统可以包括用于调节一个或多个电泳毛细管的温度的设备。毛细管可以被设置在电绝缘电路板中，所述电路板具有用于放置毛细管的大致弯曲的路径或大致笔直的路径。在一些实施例中，毛细管以诸如例如大致S形路径之类的曲线路径设置。路径可以分布到多个部分中。每个部分单独地调节与所述部分热连通的毛细管的一部分的温度。尽管可以借助于电阻加热来调节温度，但是也可以使用其它温度控制元件(例如，加热元件和/或冷却元件)或设备。可以在每个部分中借助于诸如热电偶、热敏电阻或电阻温度设备(RTD)之类的温度感测设备来测量温度。每个不同的部分都包括穿越每个部分的毛细管的电气路径。在一些情况下，电气路径来回穿越(例如，在该部分中呈蛇形穿越)。电气路径包括用于向毛细管提供热量的一个或多个温度控制元件(例如，加热元件和/或冷却元件)(例如，电阻加热器)。

热传感器与路径的每个经单独热调节的区域或部分接触。温度传感器的实例是热敏电阻或其它随温度变化的电阻，或热电偶或其它随温度变化的电压源。在一些情况下，经单独热调节的部分的温度数据不是通过离散温度传感器收集的，而是通过电气路径本身(诸如通过电气路径的电阻)收集的。也可以使用外部温度传感器。

电泳过程

电泳通常根据定义的规程进行，所述规程可以经由时序图表示。参见图2的图式201。在电泳过程的初期，引入样品至系统。参见时序图201的样品引入部分203。样品可以从各种来源获得，诸如犯罪现场样品(例如，骨头、牙齿)、体液(痰、尿液、血液、精液、头发等)以及从脸颊或已知个人获取的面颊拭子样品。在一些实施例中，根据诸如在2016年4月28日公开的美国专利申请公开2016/0116439(Kindwall等人)中描述的标准对样品进行预处理，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。预处理可以包括诸如裂解、DNA提取和DNA扩增之类的操作。在一些应用中，预处理包含扩增DNA以从STR的基因座产生扩增子。在一些实施方案中，进行电泳的第一DNA片段是来自DNA源中STR的基因座的扩增子。

在一些实施方案中，在引入入口区域(例如，图1A的区域105)之前，将样品的DNA片段浓度调整为标准浓度和/或标准体积。一旦进入入口区域，缓冲液中的样品DNA片段可能会接触毛细管(例如，图1A的毛细管103)的入口，但样品不会显著进入毛细管凝胶。在将样品装入毛细管入口处的腔室或其它区域之后，施加大量级的进样电压脉冲以将DNA从入口区域驱动到凝胶中，其中样品中的全部DNA会在入口附近形成塞子。参见时序图201的进样电压部分205。

跨两个电极(例如，图1A中的电极107和109)施加进样脉冲，一个电极位于毛细管的入口，而另一个电极位于毛细管的出口(远端)。如所提及的，对于带负电荷的分析物(诸如DNA)，更正电势被施加到出口，而更负电势被施加到入口。

在进样电压脉冲结束之后--例如，在电压变为零之后--将样品冲出入口区域，并引入缓冲液至所述区域。缓冲液可以用作通过毛细管的长度传送DNA片段的介质。参见时序图201的缓冲液进样部分207。

在引入缓冲液至入口区域之后，施加新的电泳电压，被称为主电泳电压，并保持所述电压持续电泳过程的持续时间。通常，其具有比进样电压脉冲更低的量级和更长的持续时间。参见时序图201的电泳电压施加部分209。

电泳电压设置缓冲液和DNA片段通过毛细管的稳态传送。稳态流确保具有不同长度的不同等位基因在合理可预测的时间到达毛细管远端附近的询问区域。

常规STR电泳采用多个内部校准物，其中每个校准物都是定义大小的DNA片段，所述DNA片段用内部校准物特有的特定染料进行标记。使用校准物检测与样品片段传播时间的组合，常规系统确定在询问区域读取的等位基因的片段大小。

电泳方法的一些实施例的进一步细节在美国专利第8,894,946号中提供，所述专利先前通过引用并入本文。

交错电泳

所公开的系统和相关联的方法在单个凝胶中(例如，在单个毛细管中)循序地处理多份样品。由于上文提及的原因，将多份样品放入单个凝胶中被认为是不可接受的做法。有一种看法是，在处理前一样品之后，一些DNA片段可能会残留在凝胶中，并且残留在凝胶中的片段可能会干扰进行电泳的下一份样品。然而，在本公开的实施例中，这没有被观察到是成问题的。

1.交错引入样品

连续处理两份或更多份样品。如本文其它地方所指示的，本公开涉及两份循序处理的样品(“当前”样品和“下一份”样品)。引入样品使得在当前样品在同一凝胶中完成电泳之前，引入下一份样品至凝胶中。换句话说，在当前样品中的所有核酸片段都已通过毛细管的询问区域之前，引入下一份样品至凝胶。然而，下一份样品没有被引入得太早，以至于其移动最快的片段可以捕获当前样品中移动最慢的片段。换句话说，在询问当前样品的片段与下一份样品的片段之间没有重叠。然而，因为在当前样品的电泳完成之前引入下一份样品，所以与仅在前一样品运行完成之后才引入下一份样品的情况相比，样品通过量增加了。

这种交错引入，尤其是在前一样品运行完成之前引入下一份样品的事实，带来了某些技术挑战。值得注意的是，下一份样品的引入需要提前终止当前样品的电泳电压施加。还需要对下一份样品施加进样高压脉冲。来自恒定电泳电压的这两种变化都会影响当前样品的DNA片段的传送时间，并且可能使当前样品的基于时序的询问变得不可靠。为了减少对传送时间的依赖，可以设计一种带有多个额外的内部校准物的系统，但是这些内部校准物很昂贵。

现在将更详细地解释交错电泳的潜在问题。如所解释的，在将新样品加入毛细管入口处的入口区域中之后，跨电泳电极之间施加大量级的进样电压脉冲以将DNA从样品进样到凝胶中。通过该进样电压脉冲，样品的DNA片段在毛细管入口附近形成窄宽度的塞子。在电压脉冲结束之后--例如，电压变为零或接近零--引入缓冲液至所述区域。然后施加电泳运行电压，并保持所述电压持续电泳过程的持续时间。该电泳运行电压设置缓冲液和DNA片段通过毛细管的稳态传送。稳态流确保具有不同长度的不同等位基因在合理可预测的时间到达毛细管远端处的询问区域。

然而，凝胶与特定长度的核酸片段相互作用的方式存在非线性。具体地，行进速率不是片段大小的线性函数。对于任何给定的凝胶，都存在某些明确表征的片段大小区域，在所述区域中，线性度有相当大的偏差。为了解决这种挑战，常规电泳采用多个内部校准物，其中每个校准物都是定义大小的片段，所述片段用内部校准物特有的特定染料进行标记。使用校准物检测与样品片段传播时间的组合，常规系统确定在询问区域读取的等位基因的片段大小。对于给定的过程设计，内部校准物的数量应最小化以降低成本。

注意，相邻内部校准物之间的间距的数量和模式是明确定义的，并且可以用作确定通过询问区域的任何等位基因片段长度的标尺。为了解决上述非线性问题，内部校准物的间距不均匀。

因为电泳分析依赖于样品的稳态流，所以在第一样品完成之前引入第二样品可能会引入误差。这是因为在装载第二样品时第二样品需要一定的时间段不施加电压。当冲洗样品时，还需要引入电压脉冲和不施加电压的第二时间段。所有这些都会导致第一样品脱离稳态流。理论上，第一样品可以在如此偏离稳态流量的情况下进行处理。通过采用多个额外的内部校准物，这将是可能的。换句话说，连续校准物之间的间隔将始终足够小以提供所需的分辨率，以在不依赖传送时间的情况下唯一地识别全部目标样品片段。

不幸的是，内部校准物价格昂贵，并且使用多个内部校准物会大大增加样品分析的成本。因此，在各种实施例中，很少使用(如果有的话)额外的校准物。在某些实施例中，内部校准物的片段的大小范围跨约20个碱基对至1000个碱基对，或约50个碱基对至700个碱基对，或约100个碱基对至约500个碱基对。

概括地说，某些公开的实施例采用系列电泳样品的交错引入，并且它们以不使用超过定义的且相对较低数量或密度的内部校准物的方式进行。在实施例中，在这种约束下，当下一份样品开始时，系统补偿片段在询问区域附近的非稳态传送。在一些情况下，系统通过在引入下一份样品之前施加反向电压脉冲来实现这一点。

2.反向极性电压脉冲

因为一些实施例仅使用有限数量的内部校准物，所以电泳运行必须依赖于DNA片段行进穿过毛细管到达询问区域的相应传送时间。这意味着所述过程必须补偿DNA片段通过毛细管的非稳态传送。如所解释的，非稳态传送是由在下一份样品引入和电泳的初始阶段施加于毛细管的电场的变化引起的。

在各种实施例中，电泳系统通过在完全分析当前样品之前和引入下一份样品之前停止电泳并向毛细管施加反向极性电压脉冲来补偿非稳态传送。换句话说，将电势施加到电极，使得在毛细管的远端的电极的电势与在毛细管的近端的电极的电势相比是相对负的。这会使DNA片段反向运行，有效地将它们在毛细管中后退，使得当下一份样品启动时(此时系统会产生所需的大电压变化，诸如进样脉冲)，毛细管中已经存在的DNA片段必须恢复其在反向极性脉冲之前的位置之前前向移动一定距离。因此，在下一份样品运行的初始阶段期间，DNA片段将恢复前向运行，从而追踪它们迁移通过毛细管的一部分。在这些片段到达询问区域时，它们在针对下一份样品施加的运行电泳电压的影响下行进。换句话说，它们在稳态条件下行进。在一些实施例中，在片段到达施加反向极性电压脉冲的点时，它们在运行电泳电压的影响下行进。

在一个实施例中，在反向极性下，当前样品的片段后向移动足够的距离使得电泳图的前沿在下一份样本进样并恢复运行电泳电压之后与电泳图停止前的后边缘重叠使得可以将停止前后的电泳图拼接在一起。

以确保从下一份样品中检测片段不会干扰当前样品的电泳图的方式施加反向脉冲。在某些实施例中，对反向脉冲计时使得下一份样品的最快片段在询问区域不捕获当前样品的最慢片段。这可以通过仅在检测到来自当前样品的DNA片段的定义部分之后才开始反向脉冲和/或在有限的持续时间(和/或有限的量级下)运行反向脉冲来确保。在某些实施例中，在引入下一份样品之前，将当前样品运行完成大约20％至80％。在某些实施例中，在引入下一份样品之前，将当前样品运行完成大约50％至80％。

考虑到当前样品中的DNA片段总数，全部片段(a)在反向极性脉冲之前使用常规电泳处理进行传送和检测(即，使用稳定运行电泳电压而不暴露于下一份样品的启动条件将它们一直通过毛细管传送到询问区域)，或(b)从下一份样品启动便承受不稳定电压，但仅当它们位于暴露于反向极性电压脉冲的位置上游时的位置时才承受不稳定电压。当反向极性脉冲足够大时，第二类型的片段会在到达询问区域之前恢复稳定传送，由此在停止前和停止后电泳检测数据之间提供一定的时间重叠。这允许系统产生复合电泳图，其中有效地消除由停止、反向、进样和重新运行引起的失真，或者不会显著干扰对复合电泳图上峰的检测。

在一些实施例中，通过去除在起始于反向极性电压脉冲开始之前或刚好在反向极性电压脉冲开始之前并结束于DNA片段恢复其在施加反向极性脉冲时获得的位置的时间范围内产生的所有峰来操纵所得的询问数据。在其它实施例中，在反向脉冲期间和/或在下一份样品的初始阶段(例如，进样)期间根本不收集电泳图数据。当反向脉冲之前的电泳图数据与下一份样品进样后的电泳图数据对齐时，有时会将所述过程称为拼接两个电泳图迹线，并且将参考图4A和B进行更详细的描述。

在诸如图3中所描绘的某些实施例中，操作序列(时序图301)如下：

a.开始在毛细管中对当前样品进行电泳；

b.实施从当前样品稳态传送DNA片段；这涉及施加恒定的电泳电压(操作305)；

c.在完成当前样品的电泳之前，停止施加电泳电压；这中断了当前样品中的DNA片段的稳态传送(操作307)；

d.允许系统休眠定义时间，在此期间不施加电压(操作309)；

e.向毛细管施加反向极性电压以驱动DNA片段沿相反方向的传送(操作311)；

f.停止施加反向极性电压(操作313)；

g.执行下一份样品的开始步骤：引入下一份样品至入口区域，施加初始正向电压脉冲以在毛细管的入口附近产生下一份样品的塞子，结束起始脉冲，从入口区域冲洗样品(操作315)；

h.施加稳态运行电压以驱动DNA片段从当前样品以及针对电泳毛细管中的下一份样品的传送(操作317)；

i.完成对当前样品的询问；以及

j.拼接电泳图迹线以消除所述过程的不稳定部分。

反向脉冲中断电泳过程的某些实施例可以如下理解。通过中断第一样品的迁移，然后在原始条件下恢复迁移之前将迁移反转一段时间，一些样品片段可能会多次通过询问位置：首先是在中断之前，然后是在施加反向极性时，最后是当原始条件恢复后，再次通过。可以进行该过程，使得在第一和最后一次通过期间，即，在中断之前以及在恢复原始条件之后，在稳态条件下发生迁移。直到并包括第一次通过的电泳数据以及从其最后一次通过到随后任何其它物种通过的电泳数据都不会受损。通过简单地去除或忽略第一次通过与最后一次通过之间的任意数据，可以重建在稳态传送下获得的全部电泳图，就好像中断从未发生过一样。在这样的过程中，可以在不损害第一样品的时序信息的情况下根据需要将下一份样品过早地进样到当前样品的精加工中。

在某些实施例中，在询问区域中检测到可以明确识别的已知物种之后，所述过程立即中断当前样品的稳态电泳。然后，所述过程将迁移反转到一定程度，使得可以执行下一份样品的引入和高压脉冲的施加，并且随后在最后一次检测到明确可识别的物种之前达到稳态。可明确识别的物种的一个实例是内部泳道标准(ILS)中的一个，诸如280bp ILS标记。

3.反向极性电压脉冲的特性

在检测到当前样品片段的一部分之后，反向极性电压脉冲开始。如所提及的，在一些实施例中，反向极性电压脉冲在检测到易于识别的片段或内部校准物后立即或不久后开始。这允许轻松连接反向极性脉冲之前和之后的电泳图迹线。在某些实施例中，仅在至少约50％的片段已经通过询问区域之后才起始反向脉冲。

在将当前样品的未检测到的片段后向发送足够的距离使得在执行下一份样品起始时来自当前样品的全部先前未被检测到的片段在稳态条件(经由稳定运行电泳电压针对下一次样品施加的那些稳态条件)下到达询问区域通之后，反向极性电压脉冲终止。换句话说，全部DNA片段在稳定运行电泳电压的影响下移动穿过整个询问区域，其中一些重复了两次；即，反向电压脉冲会在询问位置的一定提前时间或距离建立。

在某些实施例中，施加反向极性脉冲的持续时间和量级应足以将当前样品DNA片段后向驱动一定距离，使得当它们暴露于下一份样品处理的起始脉冲和样品冲洗部分时，仍然没有到达询问区域。当它们最终到达询问区域时，它们再次以稳态行进，这允许它们和全部后续片段都可以正确读取。在某些实施例中，整个电泳图的至少约5％(对于当前样品)在反向脉冲期间后退。在某些实施例中，整个电泳图的至少约10％(对于当前样品)在反向脉冲期间后退。

如上所述，确保反向脉冲的量级和持续时间足够的一种方法涉及在第一次通过期间从内部校准物检测特定峰，然后在施加反向极性脉冲期间再次从同一校准物检测峰，最后在对下一份样品施加正向电泳电压期间从同一校准物中检测第三峰。

负电压脉冲具有足以实现上述一个或多个目标的量级和持续时间。如果其量级相对较低，则可能必须施加相对较长的时间。相反，如果其量级相对较高，则可能施加相对较短的持续时间。

使用反向极性脉冲毛细管的硬件可以类似于现有的毛细管电泳硬件。然而，在某些实施例中，硬件采用反向运行或施加反向偏置的电源。

拼接电泳图迹线

图4A和4B显示了在电泳运行期间检测器的输出，在电泳运行中，将两个含DNA的样品相继引入电泳装置。输出显示多个峰，每个峰都与穿过所述装置的询问区域的特定DNA片段相关联。在颜色表示中，峰可以基于其颜色来区分，峰的颜色对应于固定在单份样品或片段上的染料。在图4A中，示出了两条迹线403和405，每条迹线在检测器的恒定操作期间呈现检测器输出。当检测器关闭时(或者不收集和/或使用来自询问区域的数据)，第一迹线结束。这是“停止点”，其应与“拼接点”区分开。当再次开启检测器(或者再次收集或使用来自查询区域的数据)时，第二条迹线开始。如果样品的DNA片段用荧光染料标记，则可以关闭刺激染料荧光(在询问区域中)的激光器，然后再次开启以结束并起始迹线。

在所描绘的实施例中，第一迹线403在第一或当前样品的DNA片段完成其通过毛细管之前停止。同样，第二迹线405在第一样品的片段完成其通过之前开始。在第一迹线结束与第二迹线开始之间，电泳装置的电压改变极性并反向运行。此外，在两条迹线之间，第二样品被装载并承受其进样电压脉冲。在所描绘的实例中，已知的DNA片段峰411出现在两条迹线上。在图中将其称为“参考峰”。这可以用作拼接点，因为它允许将迹线“拼接”在一起以有效地提供一个连续的电泳图。在一些实施例中，峰411是已知存在于全部样品中的峰；例如，它可能是大小已知的在引入下一份样品时或即将引入下一份样品之前通过询问区域的校准物峰。扩增的迹线段413示出了如何在适当的时间点将峰411对齐以将迹线403和405拼接在一起。

所描绘的实例的过程可以如下操作。首先，引入第一样品至入口区域并按照常规的电泳设置进行处理(例如，对其进行进样电压脉冲处理)。然后对第一样品进行稳态电泳，直到记录至少参考峰411的时刻。这产生第一迹线403。此时，所述过程准备接收第二样品。这通过选用地关闭电泳仪检测器(例如，关闭荧光激发激光器)、然后反向运行电泳来完成。在反向运行持续足以使第一样品后退使得其至少一些片段在其第二次到达询问区域之前再次达到正向稳态传送的时间段之后，将第二样品装载到入口区域并承受进样电压脉冲。在向第二样品施加正常运行的电泳电压之前、之时或之后不久的某个时刻，电泳检测器再次开始收集信号(或至少使所述信号可用于进一步处理)。在所描绘的实例中，这涉及开启荧光激发激光器。这开始捕获第二迹线405的过程。此后，电泳照常进行，第一样品完成其运行通过询问区域，而第二样品开始其运行通过询问区域。为了处理检测到的片段数据并允许正确解读第一样品，两条迹线在参考峰411上对齐。

图4B示出了将所述过程扩展到三份样品。当然，只要凝胶保持不降解并且有足够的试剂可用，所述过程就可以扩展到任意数量的样品。图4B示出了三条单独的电泳图迹线，第一迹线421覆盖第一样品片段的第一部分，第二迹线423覆盖第一样品片段的剩余部分以及第二样品的第一部分，并且第三迹线425覆盖第二样品片段的剩余部分以及第三样品片段的第一部分。当然，将至少存在第四迹线(未示出)以捕获第三样品片段的剩余部分。注意，每条迹线都包含允许两条连续迹线对齐的参考峰411。还应注意，每份样品都包含比等位基因峰小的多个引物峰427，因此引物峰较早出现在电泳图中。

控制系统

本文提供的系统包含各种计算硬件和软件。在一些实施例中，一种用于样品制备、处理和分析的系统(或本文提供的任何其它系统)包含具有中央处理单元的控制器，存储器(随机存取存储器和/或只读存储器)，通信接口，数据存储单元和显示器。通信接口包含网络接口，用于使系统能够与内联网(包含其它系统和子系统)以及因特网(包含万维网)进行交互。数据存储单元包含用于数据传输和存储的一个或多个硬盘和/或高速缓存器。数据存储单元可以包含一个或多个数据库，诸如关系数据库。在一些情况下，系统进一步包含数据仓库，用于存储信息，诸如用户信息(例如，档案)和结果。在一些情况下，数据仓库驻留在远离系统的计算机系统上。在一些实施例中，系统可以包含关系数据库和一个或多个服务器，诸如，例如数据服务器。系统可以包含一个或多个通信端口(COM端口)，一个或多个输入/输出(I/O)模块，诸如I/O接口。处理器可以是中央处理单元(CPU)或用于并行处理的多个CPU。

系统能够配置成用于数据挖掘和提取转换加载(ETL)操作，这可以允许系统将信息从原始数据源(或挖掘的数据)加载到数据仓库中。数据仓库能够配置成与商业智能系统(例如，Microstrategy.RTM.，Business Objects.RTM.)一起使用。其还能够配置成与法医数据库一起使用，例如美国国家DNA检索系统(NDIS)或英国NDAD，州DNA检索系统(SDIS)或本地DNA检索系统(LDIS)或其它包含来自已知和未知受试者、法医样品或其它样品类型(诸如生物体识别)的档案的数据库。

本文提供的系统和方法的各方面可以在编程中实施。所述技术的各个方面可以采取在某种类型的机器可读介质上承载或体现的可执行代码和/或相关数据的形式。“存储”型介质可以包含任何或所有的计算机有形存储器、处理器等，或可以随时提供非临时性存储用于软件编程的其相关联的模块，诸如，各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其它电信网络进行通信。例如，这种通信可以使软件能够从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器，例如，从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包含光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口中使用，通过有线和光学陆线网络使用和通过各种空中链路使用。携带此类波的物理元件(诸如，有线或无线链路，光链路等)也可以被视为承载软件的介质。如本文所使用的，除非限定为非临时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”之类的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，诸如计算机可执行代码之类的机器可读介质可以采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包含例如光盘或磁盘，诸如任何计算机等中任何存储设备，诸如可以用于实现在附图中示出的数据库等。易失性存储介质包含动态存储器，诸如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包含同轴电缆；铜线和光纤，包含计算机系统内包括总线的线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号，或声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此，常见形式的计算机可读介质包含：例如，软盘，可折叠磁盘，硬盘，磁带，任何其它磁介质，CD-ROM，DVD或DVD-ROM，任何其它光学介质，穿孔卡纸磁带，具有孔图案的任何其它物理存储介质，RAM，ROM，PROM和EPROM，FLASH-EPROM，任何其它存储芯片或盒式磁带，载波传输数据或指令，传输此类载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其它介质。多种这些形式的计算机可读介质可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以便执行。

在一些实施例中，系统包含用于样品处理和/或分析的一个或多个模块，以及用于促进样品处理和/或分析的控制器。控制器可以包含一个或多个处理器，诸如中央处理单元(CPU)，多个CPU或多核CPU，用于执行机器可读代码以实现样品处理和/或分析。在一些情况下，系统将样品从一个模块依次引导至另一个模块，诸如从样品制备模块到电泳模块。

结论

通过最大程度地提高单个毛细管的通过量本质上减少最后一份样品的总应答时间，降低了另外的毛细管满足样品的应答需求的需要。例如，单个毛细管系统可以服务于多份样品制备模块。即使全部模块都同时完成了样品的制备，最后一份样品被完全分析之前的时间仍然相对较短。

本文提供的系统和方法(包含此类系统的部件和此类方法的各种程序)可以与其它系统和方法组合或被其它系统和方法修改。在一些情况下，上述系统可以通过Jovanovich等人发布的美国专利公开第2011/0005932号(“通用样品制备系统及其在综合分析系统中的用途(UNIVERSAL SAMPLE PREPARATION SYSTEM AND USE IN AN INTEGRATEDANALYSIS SYSTEM)”)(“Jovanovich”)中描述的系统进行组合或被所述系统修改，所述美国专利公开的全部内容通过引用整体并入本文。

从前述内容应当理解，尽管已经示出和描述了特定的实施方案，但是可以对其进行各种修改并且在本文中可以预期各种修改。本发明也并不旨在局限于说明书内提供的特定实例。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中对本发明的实施例的描述和示出并不意味着以限制性的意义来解释。此外，应当理解，本发明的全部方面不限于本文所阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。本发明的实施例的形式和细节上的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，可以预期，本发明还将涵盖任何此类修改、变化和等同形式。

Claims (8)

1.一种用于输出电泳图的系统，所述系统包括：

毛细管，其包含分离介质并包括入口端、远端以及所述入口端和所述远端之间的询问区域；

入口，与所述毛细管的所述入口端连通并被配置为接收多个样品，所述样品包含具有多个不同大小的DNA片段；

电源，被配置为在所述毛细管的所述入口端和所述远端之间选择性地施加正向极性电压和反向极性电压；和

检测器，被配置为检测与移动通过所述毛细管的所述询问区域的DNA片段相关联的信号；和

处理器，通信地耦合至所述检测器并被配置为处理由所述检测器检测到的信号并在电泳运行期间输出电泳图，所述电泳图对应于从所述入口连续引入到所述毛细管的所述多个样品，其中所述电泳图中的一个或多个是局部电泳图。

2.根据权利要求1所述的系统，其中每个局部电泳图包括参考峰。

3.根据权利要求2所述的系统，其中所述参考峰允许针对含有DNA片段的所述多个样品中的第一样品的两个连续局部电泳图进行对齐。

4.根据权利要求3所述的系统，其中所述检测器被配置成检测由所述电源施加所述反向极性电压之前和之后的信号，并且其中所述电泳图包括分别在施加所述反向极性电压之前和之后针对包含DNA片段的所述第一样品的两个连续的局部电泳图。

5.权利要求4的系统，其中针对含有DNA片段的第一样品的第一局部电泳图的第一迹线在所述第一样品的DNA片段完成通过所述毛细管之前停止，并且第二局部电泳图的第二迹线在所述第一样品的DNA片段完成通过所述毛细管之前开始。

6.根据权利要求5所述的系统，其中所述处理器被配置为将所述第一局部电泳图和第二局部电泳图拼接在一起以形成针对包含DNA片段的所述第一样品的完整电泳图。

7.根据权利要求6所述的系统，其中所述完整电泳图包括：

在由所述电源施加所述反向极性电压之前获得的第一局部电泳图中的第一参考峰之前的第一数据，以及

在由所述电源施加所述反向极性电压之后获得的第二局部电泳图中的第二参考峰之后的第二数据。

8.根据权利要求1所述的系统，其中所述处理器还被配置为输出针对含有DNA片段的所述多个样品中的每一个的局部电泳图。