CN118272353A - 一种海洋几丁质酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种几丁质酶突变体及其应用。本发明挖掘了一种源于海洋热菌属细菌的几丁质酶TbChi52，将其成功表达并纯化制备，通过截去其N端的几丁质结合结构域(ChtBD3)，并在其C端融合来自于几丁质酶PbChi74C端的三个辅助结构域，包括两个纤连蛋白Ⅲ型结构域(Pb‑FN3)和一个几丁质结合结构域(Pb‑ChtBD3)，构建得到本发明所述几丁质酶突变体TbChi52‑PbC，所得突变体酶活力显著提升，且最适反应温度降低5℃，极大地提高了在工业应用中的可能性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及酶工程技术领域，具体是涉及一种海洋几丁质酶的突变体及其应用。
背景技术
几丁质(Chitin)又称甲壳素，是一种由N-乙酰-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接形成的线性直链同多糖。它的资源丰富，作为自然界存在的唯一带正电荷的碱性基团聚合物，是自然界仅次于纤维素的第二大生物质资源，每年的生物合成量约为100多亿吨，广泛分布于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳及鱿鱼等无脊椎动物的内部结构中。天然几丁质通常以结晶状态存在，根据晶胞排列方式的不同，分为α-几丁质、β-几丁质和γ-几丁质，其应用广泛，可被应用到化妆品、食品、医药、饲料、精细化工、农业等多种领域。
对几丁质的降解利用，不仅能够实现低值含氮生物质的高值化利用，还能避免大量的几丁质废弃物积累造成环境污染。但是受限于分子量大、结构致密、仅能溶于无机强酸等特点，目前几丁质的有效利用率较低。几丁质的降解方法包括化学法、物理法和生物法。目前工业中主要采用化学法进行几丁质的降解，即用强酸进行处理。化学法目前的问题在于易造成环境污染，产物专一性差及纯度低等。为此，众多研究者期望以物理法或生物法代替传统的化学处理，但是目前都仅限于实验室规模。结合本实验室研究方向，期望从酶法降解入手实现几丁质的降解利用。
几丁质酶(Chitinase，E.C.3.2.1.14)是一类切割β-1,4-糖苷键使几丁质水解为几丁寡糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖的糖苷水解酶。广大研究者已从细菌、真菌、放线菌、植物、昆虫、动物、人体、病毒中分离出几丁质酶，几丁质酶的来源已经扩展到几乎整个生物界。根据几丁质酶的作用位点，几丁质酶可以分为内切几丁质酶和外切几丁质酶，在降解几丁质过程中，内外切几丁质酶的降解产物存在明显差异，前者主要产生不同聚合度的几丁寡糖，对于不同聚合度几丁寡糖的功能性研究有意义，后者则通常产生高纯度的几丁二糖和N-乙酰氨基葡萄糖，对于工业生产有一定价值。几丁质酶通常是一种多结构域的酶，包含催化结构域及一个或多个辅助结构域。
目前几丁质酶的降解效果普遍不理想，且商业几丁质酶的成本较高。因此有必要挖掘新的几丁质酶。几丁质是海洋生态系统中最丰富的可再生高分子碳水化合物。尽管每年全球的水生生物圈会产生大量的几丁质，但海洋沉积物中并没有大量几丁质积累。因此推测海洋微生物在海洋几丁质的降解和循环中发挥着至关重要的作用。从海洋中挖掘降解能力强的几丁质酶切实可行。另一方面，深海海洋环境复杂，来源于这种极端环境的酶可能具有很多适于工业应用的优良特性，如pH稳定性、热稳定性等。热稳定性好的酶能适用工业生产中可能产生的高温环境，且高温下能加快反应速率同时避免其他微生物或杂蛋白的污染。目前常见的几丁质酶的最适反应温度在40℃-50℃，最适温度60℃以上的嗜热几丁质酶较少。挖掘热稳定性好的几丁质酶无论在丰富几丁质酶酶库还是扩充酶法降解几丁质废弃物方面都具有广泛前景。
本发明挖掘了一种来源于太平洋海底3650米深处的Auka热液喷口处的热菌属细菌Thermotogae phylum的几丁质酶TbChi52，将其成功表达并纯化制备，发现TbChi52的最适反应温度为90℃，属于一类新型超高温几丁质酶，该酶活力仅为163.67U/μmol，仍难以应用于工业生产。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种几丁质酶突变体及其应用，其为海洋来源的超高温几丁质酶TbChi52的突变体，该突变体水解几丁质的酶活力显著优于野生型，更具工业应用价值，可用于降解几丁质产生包括N-乙酰氨基葡萄糖等几丁寡糖。
实现上述目的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供一种几丁质酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二方面，提供上述几丁质酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO.5所示；或因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.5不同的序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第三方面，提供上述几丁质酶突变体或上述编码基因在水解几丁质中的应用。
在其中一些实施例中，所述应用包括水解几丁质生产几丁寡糖。
在其中一些实施例中，所述应用包括水解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖。
在其中一些实施例中，所述应用包括水解几丁质生产N,N'-二乙酰氨基壳二糖。
本发明的第四方面，提供一种插入有上述编码基因的重组表达载体。
在其中一些实施例中，上述重组表达载体选自质粒、表达盒、重组载体或重组质粒中的至少一种。
在其中一些优选的实施例中，上述重组表达载体为质粒pET-28a(+)。
本发明的第五目的在于提供一种转入有上述重组表达载体的重组工程菌。
将上述几丁质酶TbChi52的编码基因或几丁质酶突变体TbChi52-PbC的编码基因克隆到表达载体上，转化感受态细胞，获得重组基因工程菌。
在其中一些实施例中，上述重组工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第六方面，提供上述重组表达载体和/或重组工程菌在水解几丁质中的应用。
或，上述重组载体和/或上述重组工程菌在制备上述几丁质酶突变体中的应用。
本发明的第七方面，提供一种几丁质酶突变体的制备方法，其是将上述重组工程菌进行表达、纯化，即得。
本发明针对现有高温几丁质酶种类少的问题，通过截去超高温几丁质酶TbChi52的N端的几丁质结合结构域，并对C端结构域进行杂合突变的方法，构建得到其突变体，命名为TbChi52-PbC，该几丁质酶突变体TbChi52-PbC对胶体几丁质的酶活提升至262.93U/μmol、最适反应温度为85℃。与野生型相比，酶活显著提高了0.6倍，并降低了最适反应温度，提高了工业应用的可能性。应用该突变体水解胶体几丁质，可以在更高效获得主要为N-乙酰氨基葡萄糖和N,N'-二乙酰氨基壳二糖的水解产物。
附图说明
图1为实施例1和实施例2中经纯化的海洋热菌属细菌几丁质酶野生型TbChi52及其突变体TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC的质粒图谱。
图2为实施例1和实施例2中经纯化的海洋热菌属细菌几丁质酶野生型TbChi52及其突变体TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC的电泳检测图，其中各泳道中分别是：泳道1：TbChi52总菌液；泳道2：TbChi52上清液；泳道3：TbChi52纯酶；泳道4：TbChi52-PbC总菌液；泳道5：TbChi52-PbC上清液；泳道6：TbChi52-PbC纯酶；泳道7：PC-TG总菌液；泳道8：PC-TG上清液；泳道9：PC-TG纯酶；泳道10：TG-PC总菌液；泳道11：TG-PC上清液；泳道12：TG-PC纯酶；泳道13：TC-TG-PC总菌液；泳道14：TC-TG-PC上清液；泳道15：TC-TG-PC纯酶。
图3为本发明实施例3中海洋热菌属细菌几丁质酶野生型TbChi52及其突变体TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC的酶活力对比。
图4本发明实施例4中海洋热菌属细菌几丁质酶野生型TbChi52及其突变体TbChi52-PbC的最适反应温度。
图5本发明实施例4中海洋热菌属细菌几丁质野生型TbChi52及其突变体TbChi52-PbC的圆二色谱测定。
图6为本发明实施例5中海洋热菌属细菌几丁质酶突变体TbChi52-PbC降解胶体几丁质的产物分析图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
酶活力定义和计算：1个酶活力单位(U)定义为：在一定反应条件下，每分钟释放1μmol N-乙酰氨基葡萄糖当量的还原糖所需的酶量。
酶活力计算公式如下：
式中：
A1:实验组OD540
A0:空白组OD540
b：标准曲线的截距
K：标准曲线的斜率值
V：反应体系总体积，mL
T：反应时间，min
热熔融温度(Tm)：指的是热变性中光吸收达到最大吸收(完全变性)一半(双螺旋结构失去一半)时的温度；通过圆二色谱仪测定样品的圆二色性(Circular Dichroism，CD)光谱，以表征蛋白质的二级结构及其Tm。
在本发明中，通过在NCBI数据库中进行同源序列分析得到来源于太平洋海底3650米深处的Auka热液喷口处的热菌属细菌Thermotogae phylum的几丁质酶TbChi52的基因序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)，通过全基因合成获得TbChi52基因，将其构建至pET-28a(+)载体上，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主进行表达并纯化(氨基酸序列为SEQ IDNO.2)，获得良好的纯化效果，探究其基本酶学性质。该酶的最适反应温度为90℃，比酶活力为163.67U/μmol，是一种新型超高温几丁质酶，具有工业应用潜力。
SEQ ID NO.1(所述的超高温几丁质酶TbChi52的核苷酸序列，1329bp)：ATGGGCGAATCCGGCGGTATGTATAGCACCGGTGATCTGGTTAAATACGATGGCAAAATTTACCGTTGTCTGCGTGTTCACAAAGCTGTTGCGGGTACTGAACCGGCGATCGCGGGTGAATTTTGGAAACCGGTTAAAGATAAAATCATCGGCGCGTACTACCCGTCTTGGGGTATCTACGCTCGTAACTTCAACGTTATGGACATCGATGGCAGCAAACTGACCCACCTGTTCTACGCATTCGCGAACATCTCTGATGATGGTCTGTGCGTTCTGGCGGATCCGTGGGCCGATGTGGATAAACCGTTTCCGGGTGATTCCGACGCGCCGGGCACCCTGCGTGGCAACTTCAACCAGCTGCGCAAACTGAAAGAAAAACACCCGCACCTGAAAGTTCTGATTTCCGTTGGTGGCTGGACCCTGTCTAAAAACTTCCCGAAAGTTGCTGCGACCGAAGAAAGCCGTAAACGTTTCGTGAAATCTTGCATCGACCTGTTCATCAAAGGCGAGTTCGGTGAAAAATATGGCACTCATCCGGGTATCTTCGACGGTATTGATGTTGATTGGGAATACCCGGTGGAAGGCGGCATGCACCCAGGCACCCCGGAAGATAAACGTAACTTCACCCTGCTGATCGCGGAGTTCCGTAAACAGCTGGATGAACTGTCTAAACAGACCGGCAAACAGTATCTGCTGACCATTGCGGGCGCCGCAAAACCGGATTACATCTTCAAAAACACCGAAATCGCCGAAGTGGCGAAATACCTGGATTTCATCGTTGTGATGACCTACGATTTCCACGGCGCGTGGGATCCGACCACCAACTTCCACTGCAACCTGTACTATGATCCGGCGGATACCTCTCCGGGCGCGGAAGATCTGAACGTTGAAGCGGTTATCCGTAACTACATCAAAGCAGGCGTTAGCCCGGAAAAACTGGTTCTGGGTATCCCGTTCTACGGTCGTTCTTGGAAAGGTGTTGAAAACGTTGATAACGGCCTGTACCAGAAAGCGGACGGCGCGGGTCCGGGCACCTGGGAACCGGGCGTTCTGGATTACCGTGACATCGTTAAAAACTACGAACCGAAATTTAAAAAATTCTTCCACCCGAAAACCCAGTCTCCGTGGCTGTTTGATGGTGATGTTTTCATTACCTATGATGATCCGGATAGCGTTACCCTGAAAGCAAAATACGTCCTTGAACATGATCTAGCAGGGGTAGCGATCTGGGAGATTAGCGCTGACATTAGAGGCGTCCCGGCGCCTGAAGATAGCCTGATTAACACCATCTATGAGGTGCTGAAAGGTGAACACCATCACCACCACCAT。
SEQ ID NO.2(所述的超高温几丁质酶TbChi52的氨基酸序列，GenBank accessionnumber：MCD6462138)：
MGESGGMYSTGDLVKYDGKIYRCLRVHKAVAGTEPAIAGEFWKPVKDKIIGAYYPSWGIYA
RNFNVMDIDGSKLTHLFYAFANISDDGLCVLADPWADVDKPFPGDSDAPGTLRGNFNQLR
KLKEKHPHLKVLISVGGWTLSKNFPKVAATEESRKRFVKSCIDLFIKGEFGEKYGTHPGIFD
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KKFFHPKTQSPWLFDGDVFITYDDPDSVTLKAKYVLEHDLAGVAIWEISADIRGVPAPEDSLINTIYEVLKGEHHHHHH。
截去TbChi52 N端的几丁质结合结构域(ChtBD3)，并在其C端融合来自于几丁质酶PbChi74(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)C端的三个辅助结构域，包括两个纤连蛋白Ⅲ型结构域(Pb-FN3)和一个几丁质结合结构域(Pb-ChtBD3)；通过结构域替换融合，构建得到几丁质酶突变体(以下命名为TbChi52-PbC)，通过Ni-NTA亲和层析纯化得到TbChi52-PbC纯酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示)。
TbChi52-PbC对胶体几丁质的酶活力显著提升，且最适反应温度降低5℃，极大地提高了其工业应用的可能性。
SEQ ID NO.3(所述几丁质酶PbChi74的核苷酸序列，2079bp)：ATGGCGCCGGCTGATCAGGCGTATAAAGTTGTCGGCTATTTCACCAACTGGAGCATGTATGACCCGAACTTTCAGGTTGAACACATTGATGCTTCTAAACTGACGCACCTGAACTATGCGTTCGCAGACCTGTGCTGGAACGGTAAACACGGTAACCCGAGCAACGATCCGGGTAACCCGAACCAGACTACCTGGAACTGCCGTGACGCTGGTGTGCCGACCCAGACCGGTAACGTGCCGAACGGTGCGATCGTTCTGGGCGATCCGTGGGCTGATGTTAACCACAACGAAGGTGTGCCGCTGGAATGGGAAGATTGCGAAAAAGGTAAATGCGGTAACTTCTACAAACTGAACAAACTGAAACAGTCTAACCCGAACCTGAAAACCCTGCTGTCGGTTGGCGGCTGGACCTGGTCCAACCACTTCTCCGATGTTGCGGCGGATCCGGCGGCGCGCTCCAACTTCGCGAACAGCGCTGTTCAGGTTATTCGTGCGTACGGTTTCGACGGCATTGACATCGATTGGGAATATCCGGTTGAAGGTGGTTTGCCGGATAATAGCACCCGCCCTGAAGATAAACACAACTTTACCCTGCTGCTGCAGGAAACCCGTGAAAAACTGACTGCGGCGGGCGCCCAGGACGGCCGTAGCTACCTCCTGACCATTGCGGGTCATGCCAACCCGTCTTACGCTAGCACCACCGAACTGGATGCGATCGCAGAAATCCTGGACTGGATTAACATTATGACCTATGACTTCCACGGCGATTGGGAACAGACCACTAACCACAACGCATCCCTGTACTCCGATCCGAACGATCCGGATACCGCTAACAAATTCTCTGCTGATATGTCTATTAACGCGTACCTGAACGCGGGTGTGCCGGCATCTAAAATCGTGATGGGCATCCCGCTGTACGGCCGTGGCTGGAAAAACTGCGCGCCGGGCCCGCGTGGTGATGGCCTGTACCAGGCGTGCACCCCGGATTACAACGGTTCTGTTGTTCCTAACGGTACCTGGGACAACTATGAAAGCGGCCCGACCGGCATGTTCGATTACGGTGATCTGGCGGCGGCTTACGTGAACAAAAACGGTTACACCCGTTACTGGTCCGAAACCAGCCAGGTACCGTACCTGTATAACCCGAGCAGCAAAATCTTCATCTCTTACGAGGACCCGCAGAGCATCGCGGCGAAAGCGGCTTATATCAAAAACCGTTCCCTGGGTGGTGCCATGATCTGGGAACTGTCTGAGGACTGCCGTACCAGCCCGAAATTTGCTTGCACCGGCACTAAACTGCTGGATCAGCTGAGCAGTGATCTGCGTAGTGACTCTACCCGTCCGGATACCACCGCGCCGACCACCCCGAGCCATCTGAAATCTCCGTCCCAGACCGCGAACAGCATCTCTCTGCAGTGGGATGCGTCCATTGATGATGTGGGTGTTGTTGGCTACGATGTGTACCGTGATCAGACCCTGCTGACCCGTGTTAGCGGTACTGCATACACCGTTAGCGGTCTGGAACCGCAGACCTCCTACACCTTTACCGTTCGTGCGGCCGACGCAGCCGGTAACGTAAGCAACCCGTCCAGCCCGCTGACCGTTAGCACCCTGGCGCAGGGTACCGACCCGCGCCTGCCGGCCGCGCCGGCAAACCTGCGTGTGACCGCACACAGCGATACCACCGTTTCTCTGCAGTGGGAACCGTCCGCAGACCATGCGGCGGTTACCGCGTATGAAATCTACCAGGGTGACGCACTGGCGGATACCGTGCCGGCTAGCTCCAACTCCTATACCGTTAACGGCCTGACCCCGGAAACCGAATACACCTTCAGCGTAAAAGCTCGTGACGCTGCGGGTAACCTGAGCCCGGCGTCTAACGCGGTGCGTGTGACCACCGATGCGTCTGCGCCGGGCACCGTTCCGGTTTGGAGCCCGAACACCGCGTATAACGTTGGTGCGGAAGTTTCGTATGGTGGTACCGTTTACCAGTGTCGTATCGCACATACCTCTCTGCCGGGCTGGGAACCGCCGAACGTCCCGGCGCTGTGGCTGAAAAAACACCACCACCACCACCAT。
SEQ ID NO.4(所述几丁质酶PbChi74的氨基酸序列，GenBank accession number：KJ626399)：
MAPADQAYKVVGYFTNWSMYDPNFQVEHIDASKLTHLNYAFADLCWNGKHGNPSNDPGN
PNQTTWNCRDAGVPTQTGNVPNGAIVLGDPWADVNHNEGVPLEWEDCEKGKCGNFYKL
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SEQ ID NO.5(所述几丁质酶突变体TbChi52-PbC的核苷酸序列，1950bp)：ATGGGCGCGGGTACTGAACCGGCGATCGCGGGTGAATTTTGGAAACCGGTTAAAGATAAAATCATCGGCGCGTACTACCCGTCTTGGGGTATCTACGCTCGTAACTTCAACGTTATGGACATCGATGGCAGCAAACTGACCCACCTGTTCTACGCATTCGCGAACATCTCTGATGATGGTCTGTGCGTTCTGGCGGATCCGTGGGCCGATGTGGATAAACCGTTTCCGGGTGATTCCGACGCGCCGGGCACCCTGCGTGGCAACTTCAACCAGCTGCGCAAACTGAAAGAAAAACACCCGCACCTGAAAGTTCTGATTTCCGTTGGTGGCTGGACCCTGTCTAAAAACTTCCCGAAAGTTGCTGCGACCGAAGAAAGCCGTAAACGTTTCGTGAAATCTTGCATCGACCTGTTCATCAAAGGCGAGTTCGGTGAAAAATATGGCACTCATCCGGGTATCTTCGACGGTATTGATGTTGATTGGGAATACCCGGTGGAAGGCGGCATGCACCCAGGCACCCCGGAAGATAAACGTAACTTCACCCTGCTGATCGCGGAGTTCCGTAAACAGCTGGATGAACTGTCTAAACAGACCGGCAAACAGTATCTGCTGACCATTGCGGGCGCCGCAAAACCGGATTACATCTTCAAAAACACCGAAATCGCCGAAGTGGCGAAATACCTGGATTTCATCGTTGTGATGACCTACGATTTCCACGGCGCGTGGGATCCGACCACCAACTTCCACTGCAACCTGTACTATGATCCGGCGGATACCTCTCCGGGCGCGGAAGATCTGAACGTTGAAGCGGTTATCCGTAACTACATCAAAGCAGGCGTTAGCCCGGAAAAACTGGTTCTGGGTATCCCGTTCTACGGTCGTTCTTGGAAAGGTGTTGAAAACGTTGATAACGGCCTGTACCAGAAAGCGGACGGCGCGGGTCCGGGCACCTGGGAACCGGGCGTTCTGGATTACCGTGACATCGTTAAAAACTACGAACCGAAATTTAAAAAATTCTTCCACCCGAAAACCCAGTCTCCGTGGCTGTTTGATGGTGATGTTTTCATTACCTATGATGATCCGGATAGCGTTACCCTGAAAGCAAAATACGTCCTTGAACATGATCTAGCAGGGGTAGCGATCTGGGAGATTAGCGCTGACATTAGAGGCGTCCCGGCGCCTGAAGATAGCCTGATTAACACCATCTATGAGGTGCCGACCACCCCGAGCCATCTGAAATCTCCGTCCCAGACCGCGAACAGCATCTCTCTGCAGTGGGATGCGTCCATTGATGATGTGGGTGTTGTTGGCTACGATGTGTACCGTGATCAGACCCTGCTGACCCGTGTTAGCGGTACTGCATACACCGTTAGCGGTCTGGAACCGCAGACCTCCTACACCTTTACCGTTCGTGCGGCCGACGCAGCCGGTAACGTAAGCAACCCGTCCAGCCCGCTGACCGTTAGCACCCTGGCGCAGGGTACCGACCCGCGCCTGCCGGCCGCGCCGGCAAACCTGCGTGTGACCGCACACAGCGATACCACCGTTTCTCTGCAGTGGGAACCGTCCGCAGACCATGCGGCGGTTACCGCGTATGAAATCTACCAGGGTGACGCACTGGCGGATACCGTGCCGGCTAGCTCCAACTCCTATACCGTTAACGGCCTGACCCCGGAAACCGAATACACCTTCAGCGTAAAAGCTCGTGACGCTGCGGGTAACCTGAGCCCGGCGTCTAACGCGGTGCGTGTGACCACCGATGCGTCTGCGCCGGGCACCGTTCCGGTTTGGAGCCCGAACACCGCGTATAACGTTGGTGCGGAAGTTTCGTATGGTGGTACCGTTTACCAGTGTCGTATCGCACATACCTCTCTGCCGGGCTGGGAACCGCCGAACGTCCCGGCGCTGTGGCTGAAAAAACTGAAAGGTGAACACCATCACCACCACCAT。
SEQ ID NO.6(所述几丁质酶突变体TbChi52-PbC的氨基酸序列)：MGAGTEPAIAGEFWKPVKDKIIGAYYPSWGIYARNFNVMDIDGSKLTHLFYAFANISDDGLCVLADPWADVDKPFPGDSDAPGTLRGNFNQLRKLKEKHPHLKVLISVGGWTLSKNFPKVAATEESRKRFVKSCIDLFIKGEFGEKYGTHPGIFDGIDVDWEYPVEGGMHPGTPEDKRNFTLLIAEFRKQLDELSKQTGKQYLLTIAGAAKPDYIFKNTEIAEVAKYLDFIVVMTYDFHGAWDPTTNFHCNLYYDPADTSPGAEDLNVEAVIRNYIKAGVSPEKLVLGIPFYGRSWKGVENVDNGLYQKADGAGPGTWEPGVLDYRDIVKNYEPKFKKFFHPKTQSPWLFDGDVFITYDDPDSVTLKAKYVLEHDLAGVAIWEISADIRGVPAPEDSLINTIYEVPTTPSHLKSPSQTANSISLQWDASIDDVGVVGYDVYRDQTLLTRVSGTAYTVSGLEPQTSYTFTVRAADAAGNVSNPSSPLTVSTLAQGTDPRLPAAPANLRVTAHSDTTVSLQWEPSADHAAVTAYEIYQGDALADTVPASSNSYTVNGLTPETEYTFSVKARDAAGNLSPASNAVRVTTDASAPGTVPVWSPNTAYNVGAEVSYGGTVYQCRIAHTSLPGWEPPNVPALWLKKLKGEHHHHHH。
以下实施例中，空载质粒pET-28a(+)为常规获得的质粒pET-28a(+)；质粒pET-28a(+)-TbChi52由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，购自唯地生物科技有限公司；质粒提取试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他所用的化学药品均购自Sigma或阿拉丁公司。
几丁质酶野生型TbChi52及其突变体TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC的质粒图谱参见图1。
本发明的一些实施例中，涉及到针对现有高温几丁质酶种类少的问题，挖掘并表达制备TbChi52，该酶的最适反应温度为90℃，其是一种新型超嗜热几丁质酶。
同时，在本发明中，发明人通过杂合突变，构建得到超高温几丁质酶TbChi52的突变体，该酶对胶体几丁质的酶活为262.93U/μmol，与野生型相比，提高至1.6倍，提高了其工业应用的可能性。应用该突变体水解胶体几丁质，75℃反应4h后，产物主要为N-乙酰氨基葡萄糖和N,N'-二乙酰氨基壳二糖，含量分别为169.83(mg/g胶体几丁质)和357.92(mg/g胶体几丁质)，水解率为53.51％。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：TbChi52@E.coli的制备
将含质粒pET-28a-TbChi52的重组E.coli BL21(DE3)菌株于37℃在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，当OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，并将细胞在16℃下孵育20h。
在4℃下，8000rpm离心20min收菌，用适量上样缓冲液：buffer A，含有500mM NaCl和30mM咪唑的50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，重悬，超声破碎，4℃，11000rpm离心20min收集上清粗酶液。
粗酶液通过AKTA蛋白纯化仪以2mL/min的流速上样至预先用buffer A平衡的Ni离子亲和层析柱，上样完成后，用buffer A冲至平衡，用除杂缓冲液：含90％buffer A，及10％洗脱缓冲液：buffer B，含有500mM NaCl和500mM咪唑的50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，除杂，待洗脱平衡后，用buffer B进行洗脱，收集出峰样品。超滤浓缩并换盐，换盐缓冲液为(50mM柠檬酸盐缓冲液，pH5.5)。换盐结束后，即得到了野生型几丁质酶TbChi52纯酶，通过SDS-PAGE分析蛋白纯度，并分装放置-80℃保存备用。
实施例2：TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC突变体的构建
TbChi52基因全长1329bp，编码443个氨基酸，由N端的几丁质结合结构域和C端的催化结构域组成。分别通过4种方式构建突变体：(1)截去TbChi52N端的几丁质结合结构域(ChtBD3)(从N端起第3个氨基酸至第30个氨基酸)，并在其C端(第405个氨基酸至第406个氨基酸之间)融合来自于几丁质酶PbChi74 C端的三个辅助结构域(从N端第453个氨基酸至第687个氨基酸，包括两个纤连蛋白Ⅲ型结构域(Pb-FN3)和一个几丁质结合结构域(Pb-ChtBD3))构建突变体TbChi52-PbC；(2)用PbChi74 C端的几丁质结合结构域(从N端第453个氨基酸至第687个氨基酸)替换TbChi52 N端的几丁质结合结构域，构建突变体PC-TG；(3)截去TbChi52 N端的几丁质结合结构域，并在其C端(第405个氨基酸至第406个氨基酸之间)融合来自于几丁质酶PbChi74 C端的几丁质结合结构域，构建突变体TG-PC；(4)在TbChi52的C端(第405个氨基酸至第406个氨基酸之间)融合来自于几丁质酶PbChi74C端的几丁质结合结构域，构建突变体TC-TG-PC。
利用设计引物(如表1所示)，以pET-28a(+)-TbChi52质粒为模板，通过PCR扩增(反应体系及程序如表2所示)，得到目的基因片段-。
扩增后的基因片段通过上海生工的SanPrep柱式PCR产物胶回收试剂盒进行胶回收，测定DNA片段浓度，通过无缝克隆试剂盒Master Assembly Mix进行无缝克隆(反应体系及程序如表2所示)，完成后将质粒转化至E.coli Top10，涂板培养，并挑菌送样测序，测序正确后提质粒，转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。诱导表达及纯化方法与实施例1中制备TbChi52的方法一致。
制备得到几丁质酶突变体TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC纯酶，以备进一步对比各突变体与野生型TbChi52的酶活力差异。
表1用于构建TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC的引物
表2PCR及无缝克隆体系及程序
图1为实施例1和实施例2中经纯化的海洋热菌属细菌几丁质酶野生型TbChi52及其突变体TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC的质粒图谱。
图2为实施例1和实施例2中经纯化的海洋热菌属细菌几丁质酶野生型TbChi52及其突变体TbChi52-PbC的电泳检测图，其中各泳道中分别是：泳道1：TbChi52总菌液；泳道2：TbChi52上清液；泳道3：TbChi52纯酶；泳道4：TbChi52-PbC总菌液；泳道5：TbChi52-PbC上清液；泳道6：TbChi52-PbC纯酶；泳道7：PC-TG总菌液；泳道8：PC-TG上清液；泳道9：PC-TG纯酶；泳道10：TG-PC总菌液；泳道11：TG-PC上清液；泳道12：TG-PC纯酶；泳道13：TC-TG-PC总菌液；泳道14：TC-TG-PC上清液；泳道15：TC-TG-PC纯酶。
实施例3：TbChi52及TbChi52-PbC的酶活测定
本实施例通过水解实验分别测定野生型TbChi52及突变体TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC的酶活力，并对比各突变体与野生型的酶活力差异。
(1)胶体几丁质的制备：称取1g几丁质粉末于研钵中，将研钵置于冰上，研磨几丁质粉末至糊状，其间反复多次加入适量丙酮，直至将粉末充分研细。边研磨边分次缓慢加入40mL浓HCl。研磨至无明显固体颗粒后，用八层纱布过滤，将滤液缓慢加入至剧烈搅拌的5倍体积的50％乙醇中，使胶体几丁质絮状物析出，4000rpm离心10min收集胶体几丁质沉淀，用预冷的纯水洗涤沉淀，反复离心重悬直至接近中性。抽滤收集胶体几丁质沉淀，加入适量50mM pH5.5的柠檬酸盐缓冲液重悬胶体几丁质。通过水分测定仪测定胶体几丁质溶液的质量分数，然后将胶体几丁质溶液定容至2％，4℃冰箱冷藏备用。
(2)酶活力测定方法：将100μL 1％(w/v)的胶体几丁质和90μL 50mM pH5.5的柠檬酸盐缓冲液，分别与10μL2.5mg/mL的野生型TbChi52或突变体TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC酶溶液在2mL EP管中混合，试管在Thermo Shaker中以1100rpm，90℃反应2min。反应完成后，加入200μL DNS显色液终止反应，立即沸水浴10min，置于冰上冷却，冷却至室温，25℃，11000rpm离心10min，取200μL上清液用酶标仪测定540nm处的吸光度值，进行3次重复实验。以N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)作为标准品，根据绘制的标准曲线确定生成的还原糖含量。
(3)酶活力定义和计算：1个酶活力单位(U)定义为：在一定反应条件下，每分钟释放1μmol N-乙酰氨基葡萄糖当量的还原糖所需的酶量。
酶活力计算公式如下：
式中：
A1:实验组OD540
A0:空白组OD540
b：标准曲线的截距
K：标准曲线的斜率值
V：反应体系总体积，mL
T：反应时间，min
图3为海洋热菌属细菌几丁质酶野生型TbChi52及其突变体TbChi52-PbC、PC-TG、TG-PC、TC-TG-PC的酶活力对比，其中野生型TbChi52酶活力163.67±4.99U/μmol，突变体TbChi52-PbC的酶活力为262.93±5.38U/μmol，突变体PC-TG的酶活力为193.02±10.41U/μmol，突变体TG-PC的酶活力为170.49±8.89U/μmol，突变体TC-TG-PC的酶活力为176.89±5.04U/μmol。突变体TbChi52-PbC的比酶活力显著提升至野生型的1.6倍，效果最佳。
实施例4：TbChi52和TbChi52-PbC的最适反应温度研究及Tm值测定
本实施例通过测定野生型TbChi52及突变体TbChi52-PbC的最适反应温度及Tm值，对比两者稳定性差异。
(1)最适反应温度研究：在50mM pH 5.5的柠檬酸盐缓冲液条件下，以胶体几丁质为底物，在不同温度下(40℃-110℃)测定TbChi52和TbChi52-PbC的酶活力，反应时间为2min，反应体系为：100μL 1％(W/V)胶体几丁质+90μL50mM pH5.5的柠檬酸盐缓冲液+10μL2.5mg/mL酶液，以热失活的酶作为空白对照。取测得的最大酶活力为100％，分别计算不同温度下的相对酶活力。
由图4可知，海洋热菌属细菌几丁质酶野生型TbChi52最适反应温度为90℃，其突变体TbChi52-PbC的最适反应温度为85℃。
(2)Tm值测定：通过CD光谱法测量TbChi52和TbChi52-PbC的Tm值，该CD光谱法使用Chirascan圆二色光谱仪动态多模式光谱实验对热变性实验进行测定。在0.1cm路径长度的石英比色皿(Hellma)中收集远紫外圆二色光谱，扫描速度为50nm/min，响应时间为4s，带宽为1nm，范围为190nm-260nm，蛋白质浓度为0.2mg/mL。对于热扫描，蛋白质样品以2℃/min的加热速率从20℃加热到96℃。每1℃记录一次圆二色性吸收光谱数值，平均测量时间为0.5s，Tm值由Global 3软件确定。
经测定，突变体TbChi52-PbC的圆二色谱测定的Tm值为79.6±0.3℃(如图5A和图5B所示)，野生型几丁质酶TbChi52的Tm值为86.6±0.3℃(如图5C所示，其圆二色谱图未展示)。
实施例5：突变体TbChi52-PbC水解胶体几丁质的应用
以胶体几丁质为底物分析TbChi52-PbC的水解特性。反应体系中TbChi52-PbC的添加量为5U/mL，底物的终浓度为2％(w/v)，在75℃，1100rpm条件下反应4h，按不同时间间隔取样，通过沸水浴20min终止反应，沸水浴后11000rpm离心10min，上清液过0.22μm滤膜。通过HPLC分析水解产物，水解胶体几丁质的产物分析使用的液相色谱系统为配有waters2489紫外检测器的Waters Alliance e2695系统，使用的色谱柱为Alltech chrom PrevailCarbohydrate ES 5μcolumn(4.6mm×250mm)。设置检测波长为210nm，柱温40℃，进样量10μL，流速1mL/min，流动相由乙腈和纯水组成，采用梯度洗脱程序：0min，75％乙腈；7min，75％乙腈，8min，65％乙腈，15min，65％乙腈，16min，75％乙腈，18min，75％乙腈。采用购自青岛博智汇力生物科技有限公司的N-乙酰氨基葡萄糖和N,N'-二乙酰基壳二糖标准品配制不同浓度标准溶液，通过液相检测得到标准曲线，进行定量计算。时间曲线的水解率按反应中释放的几丁寡糖的总含量与胶体几丁质初始含量的百分比计算。
图6为海洋热菌属细菌几丁质酶突变体TbChi52-PbC降解胶体几丁质的产物分析，反应4h后，体系中N-乙酰氨基葡萄糖产量为169.83(mg/g胶体几丁质)，N,N'-二乙酰氨基壳二糖产量为357.92(mg/g胶体几丁质)，水解率为53.51％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种几丁质酶突变体，其特征在于，所述几丁质酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
2.一种权利要求1所述几丁质酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；或因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.5不同的序列，所述编码基因为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的几丁质酶突变体或权利要求2所述的编码基因在水解几丁质中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括水解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括水解几丁质生产N,N'-二乙酰氨基壳二糖。
6.一种重组表达载体，其特征在于，其由将权利要求2所述的编码基因克隆到表达载体上获得，所述表达载体选自质粒、表达盒、重组载体或重组质粒中的至少一种。
7.一种转入有权利要求6所述重组表达载体的重组工程菌。
8.根据权利要求7所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
9.权利要求6所述的重组表达载体和/或权利要求7-8任一项所述的重组工程菌在水解几丁质中的应用；
或，权利要求6所述的重组表达载体和/或权利要求7-8任一项所述的重组工程菌在制备权利要求1所述的几丁质酶突变体中的应用。
10.一种几丁质酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求7-8任一项所述的重组工程菌进行表达、纯化，得到。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118272353A true CN118272353A (zh) | 2024-07-02 |
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