CN118272282B

CN118272282B - 一种含有长双歧杆菌bl21菌株的促进发育及长高的益生菌剂及其应用

Info

Publication number: CN118272282B
Application number: CN202410712001.2A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 董瑶; 赵云蛟; 盖忠辉; 朱建国
Original assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2024-06-04
Filing date: 2024-06-04
Publication date: 2024-10-11
Anticipated expiration: 2044-06-04
Also published as: CN118272282A

Abstract

本发明涉及一种含有长双歧杆菌BL21菌株的促进发育及长高的益生菌剂及其应用，所述益生菌剂中的菌株包括长双歧杆菌BL21菌株和短双歧杆菌BBr16菌株。本发明发现上述两种菌株能够相互配合，在促进发育及长高的功效上协同增效，表现在：通过促进营养物质的吸收和利用或通过激活相关的生长因子来显著促进生长发育；显著增强骨骼健康，提高骨质密度和骨骼生长速度；有效调节肠道免疫功能，增强肠道局部免疫反应和黏膜防御机制，提高肠道对病原体的抵抗能力；增加肠道菌群多样性，提高肠道菌群的多样性，增强肠道的稳定性和功能性。

Description

一种含有长双歧杆菌BL21菌株的促进发育及长高的益生菌剂及其应用

技术领域

本发明属于益生菌剂技术领域，涉及一种含有长双歧杆菌BL21菌株的促进发育及长高的益生菌剂及其应用。

背景技术

益生菌是在适当摄入后能为宿主提供健康效益的活性微生物，其在婴幼儿的骨骼发育、肠道免疫与机械屏障的维护方面也表现出潜力。益生菌通过改善肠道对关键矿物质的吸收和代谢，间接促进骨骼健康。这些矿物质对于婴幼儿时期骨骼的形成和发育至关重要。此外，益生菌还能通过调节肠道黏膜下免疫细胞的活性，加强肠道黏膜屏障的功能，为婴幼儿提供抵御病原体和有害物质入侵的第一道防线。同时，益生菌还能通过增强肠道上皮细胞之间的紧密连接，改善肠道屏障的结构完整性，从而有效防止外界病原体和毒素的侵入，减少腹泻和其他肠道疾病的发生。

益生菌在婴幼儿健康领域的应用不仅能够促进其正常生理发育，还能通过多种机制提升婴幼儿的整体健康水平。现有技术中关于利用益生菌促进宿主生长发育的策略还相对鲜少。鉴于此，开发一种基于益生菌的促进宿主生长发育的方案，具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种含有长双歧杆菌BL21菌株的促进发育及长高的益生菌剂及其应用，具体提供一种含有长双歧杆菌BL21菌株的促进发育及长高的益生菌剂及其在制备促进宿主生长发育及长高的产品中的应用、在制备促进宿主骨骼生长和代谢的产品中的应用、在制备提高宿主免疫力的产品中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种含有长双歧杆菌BL21菌株的促进发育及长高的益生菌剂，所述益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和保藏编号为CGMCC No.24471的短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr16菌株。

本发明开发了一种全新的益生菌复配方式，是将长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr16菌株进行复配，发现两者存在潜在的相互作用，能够相互配合，在促进生长发育及长高的功效上协同增效，具体表现在：（1）通过促进营养物质的吸收和利用或通过激活相关的生长因子来显著促进生长发育；（2）显著增强骨骼健康，提高骨质密度和骨骼生长速度；（3）有效调节肠道免疫功能，增强肠道局部免疫反应和黏膜防御机制，提高肠道对病原体的抵抗能力；（4）增加肠道菌群多样性，提高肠道菌群的多样性，增强肠道的稳定性和功能性。

在使用菌量一致的情况下，与单一的BL21菌株或单一的BBr16菌株相比，两种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。因此，该益生菌剂为促进生长发育提供了新的策略。由于长双歧杆菌和短双歧杆菌均为益生菌，因此其在用于制备相关功效产品时，安全性高，且不易产生依赖性。

优选地，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株与短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr16菌株的活菌数之比为1:10-10:1，例如1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，在所述益生菌剂中，活菌总数不低于1×10⁸ CFU/mL或1×10⁸ CFU/g，例如1×10⁸CFU/mL（CFU/g）、1×10⁹CFU/mL（CFU/g）、5×10⁹CFU/mL（CFU/g）、1×10¹⁰CFU/mL（CFU/g）、5×10¹⁰CFU/mL（CFU/g）、1×10¹¹CFU/mL（CFU/g）、1×10¹²CFU/mL（CFU/g）、1×10¹³CFU/mL（CFU/g）等；该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述益生菌剂的剂型包括溶液剂、冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制，包括最常用的溶液剂、冻干粉剂，或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。

优选地，所述益生菌剂的剂型为溶液剂，其由如下的方法制得：

将BL21菌株和BBr16菌株分别接种于培养基中依次进行活化和发酵培养，得到发酵液；发酵液分别离心，用溶剂重悬，得到BL21菌悬液和BBr16菌悬液；将BL21菌悬液和BBr16菌悬液按照活菌数配比进行混合，得到所述益生菌剂。

优选地，所述益生菌剂的剂型为冻干粉剂，其由如下的方法制得：

将BL21菌株和BBr16菌株分别接种于培养基中依次进行活化和发酵培养，得到发酵液；发酵液分别离心，与保护剂混合后进行冷冻干燥，得到BL21菌粉和BBr16菌粉；将BL21菌粉和BBr16菌粉按照活菌数配比进行混合，得到所述益生菌剂。

优选地，所述保护剂选自脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供第一方面所述的益生菌剂在制备促进宿主生长发育及长高的产品中的应用。

优选地，所述产品包括食品、药品或保健品。

优选地，所述产品中还包括辅料，所述辅料选自填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供第一方面所述的益生菌剂在制备促进宿主骨骼生长和代谢的产品中的应用。

优选地，所述产品包括食品、药品或保健品。

第四方面，本发明提供第一方面所述的益生菌剂在制备提高宿主免疫力的产品中的应用。

优选地，所述产品包括食品、药品或保健品。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的BL21菌株的分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年01月27日，保藏编号为CGMCC No.10452，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所涉及的BBr16菌株的分类命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年03月07日，保藏编号为CGMCC No.24471，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1是各组小鼠的身长测量结果统计图；

图2是各组小鼠的骨密度含量的结果统计图；

图3是各组小鼠的股骨长度的结果统计图；

图4是各组小鼠的血清胰岛素样生长因子1水平统计图；

图5是各组小鼠的血清骨钙素水平统计图；

图6是各组小鼠结肠组织中的γ干扰素水平统计图；

图7是各组小鼠结肠组织中的免疫球蛋白A水平统计图；

图8是各组小鼠肠道菌群分析的Chao1指数统计结果图；

图9是各组小鼠肠道菌群分析的香农指数统计结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中涉及的培养基配方如下：

MRS培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。

下述实施例所涉及的BL21菌株的分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏时间为2015年01月27日，保藏编号为CGMCC No.10452。

下述实施例所涉及的BBr16菌株的分类命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve，保藏时间为2022年03月07日，保藏编号为CGMCC No.24471。

下述涉及的菌悬液制备方法：将所需菌株接种于液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按5%（v/v）的接种量接种于液体培养基中，37℃下培养24 h，得到菌液；将菌液在4℃下5000rpm下离心10 min，过滤，得到菌体，使用PBS溶液重悬菌体，即得。

试验结果数据使用R语言的ggplot2进行统计分析，与对照组相比，***代表p<0.001，**代表p<0.01，*代表p<0.05，NS.代表无显著差异。

实施例

本实施例探究益生菌剂对小鼠的生长发育促进能力：

（1）试验动物：健康的SPF级6周龄Balb/c雌雄小鼠（雌鼠的初始体重为18 g ± 1g，雄鼠的初始体重为20 g ± 1 g，购自上海成喜生物有限公司），这些小鼠在受控环境下饲养，室温维持在20-24℃，湿度为50-60%，遵循12h光/暗循环。它们可以随意进食和饮水。

实验开始前，雌鼠和雄鼠合笼适应环境1周。确定雌鼠怀孕后，随即将雄鼠移出笼子。怀孕雌鼠在分娩前未接受任何形式的干预，且分娩期间均单独饲养，自由进食上海成喜生物有限公司提供的纯化型生长繁殖饲料。分娩后的前三周内，新生小鼠自由摄取母乳。整个哺乳期间，母鼠未接受任何额外处理。

（2）动物分组：将新生小鼠随机分配为6组，每组8只：对照组（CTL）、BL21菌株组（BL21组，记为S1组）、BBr16菌株组（BBr16组，记为S2组）、市售长双歧杆菌组（BNCC371780组，记为S3组）、复合菌组1（BL21+ BBr16组，活菌数比为2:1，记为S4组）、复合菌组2（BNCC371780+ BBr16组，活菌数比为2:1，记为S5组）。

（3）干预方法：新生小鼠从出生第1周至第3周，分别通过灌胃方式接受生理盐水（对照组）和各组益生菌菌液的干预（S1-S5组），各益生菌干预组小鼠的灌胃剂量为1×10⁸CFU/天/只。

（4）指标分析：

（4.1）小鼠身长测定：

实验结束时，各组小鼠在被轻度麻醉并处于舒展状态下进行身长的测量，来评估益生菌对其生长发育的潜在影响。结果如图1所示，由图可知，与CTL组相比，益生菌干预的S1组、S2组和S4组在促进小鼠身长增长方面表现出了显著的效果，且S4组效果最佳，表明本发明所涉及的益生菌剂具有促进骨骼生长和发育的潜力。

（4.2）小鼠股骨长度和骨密度测定：

实验结束后，小鼠麻醉后放置在X线骨密度检查床上，采用动物全身扫描模式，逐一对实验小鼠的全身进行骨密度扫描与分析，并记录相应的实验数据，结果如图2所示。小鼠处死并解剖以分离出双侧股骨，左侧股骨密封后在-20℃条件下保存，右侧股骨则使用多聚甲醛进行固定，以便后续检测；使用游标卡尺精确测量股骨的长度，结果如图3所示。

由图可知，与CTL组相比，益生菌干预的S1组、S2组和S4组小鼠显示出股骨长度的显著增加，且S4组效果更佳。进一步地，益生菌干预的S1组、S2组和S4组小鼠的骨密度含量也显著提高，且S4组效果更佳。这一结果证明了本发明所涉及的益生菌剂在增加骨质密度、改善骨骼健康、促进骨骼生长方面的潜力。

（4.3）小鼠血清指标检测：

实验结束后，对各组小鼠进行采血，血液静置1小时后，离心10分钟以分离血清。采用试剂盒，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）方法测定小鼠的血清胰岛素样生长因子1（IGF-1）水平和血清骨钙素（OCN）水平。

结果如图4和图5所示，由图可知，与CTL组相比，各益生菌干预组不同程度地增加了幼鼠的血清胰岛素样生长因子1（IGF-1）水平和血清骨钙素（OCN）水平，且S4组效果最优。这一结果表明本发明所涉及的益生菌剂可能通过激活内分泌途径来促进生长因子的表达，从而影响骨骼生长和代谢。胰岛素样生长因子1是一种促生长激素，其在骨骼发育和维持骨骼密度中起着重要作用；同时，骨钙素是一种与骨代谢相关的蛋白，通常与骨形成过程相关联。

（4.4）小鼠结肠指标检测：

实验结束后，处死小鼠，并解剖以分离出结肠组织。结肠组织加入PBS后进行匀浆处理；接着，在4℃下以4000 g的速度离心15 min，收集上清液，并将其保存于-80℃的冰箱中以备后用。采用试剂盒，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）方法测定小鼠结肠组织中的γ干扰素（IFN-γ）水平和免疫球蛋白A（IgA）水平。

结果如图6和图7所示，由图可知，与CTL组相比，各益生菌干预组不同程度地增加了小鼠结肠组织中的γ干扰素（IFN-γ）水平和免疫球蛋白A（IgA）水平，且S4组效果最优。γ干扰素是一种重要的免疫调节因子，主要由Th1细胞产生，它在调控炎症反应和细胞介导的免疫中起核心作用；免疫球蛋白A是主要的黏膜免疫球蛋白，对于维持肠道黏膜的免疫防御至关重要。这些结果表明本发明所涉及的益生菌剂可能通过增强肠道黏膜的免疫屏障功能来促进免疫健康，抵御病原体侵袭。

（4.5）肠道菌群分析：

采用16S rRNA基因测序及其随后的生物信息学分析来评估小鼠粪便样本中的肠道微生物群落。首先，从粪便样本中提取微生物DNA，然后使用特异性引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增16S rRNA基因的V3-V4区域。PCR反应如下：95℃变性3 min，94℃变性0.5min，58℃退火0.5 min，72℃变性0.5 min，共21个循环，72℃最终延伸5 min。将不同样本的产物进行索引，并根据生产商的说明，以等比例混合，使用Illumina Miseq平台（2×300bp）进行测序。

结果如图8和图9所示，由图可知，与CTL组相比，各益生菌组干预后幼鼠肠道菌群α多样性（Chao1指数和香农指数）有不同程度的升高，尤其是S4组升高最为显著。Chao1指数和香农指数的提升表明益生菌干预后，肠道微生物群中物种的丰富度（Chao1指数）和多样性（香农指数）都有了提升。一个多样性较高的肠道微生物群落通常与较好的健康状况相关，能够提高宿主对病原体的抵抗力，优化营养物质的吸收和代谢，以及增强免疫调节。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种含有长双歧杆菌BL21菌株的促进发育及长高的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的菌株由保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和保藏编号为CGMCC No.24471的短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr16菌株组成；所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株与短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr16菌株的活菌数之比为2:1，在所述益生菌剂中，活菌总数不低于1×10⁸ CFU/mL或1×10⁸ CFU/g。

2.根据权利要求1所述的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括溶液剂、冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

3.根据权利要求2所述的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型为溶液剂，其由如下的方法制得：

4.根据权利要求2所述的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型为冻干粉剂，其由如下的方法制得：

5.根据权利要求4所述的益生菌剂，其特征在于，所述保护剂选自脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。

6.权利要求1-5中任一项所述的益生菌剂在制备促进宿主生长发育及长高的药品中的应用。